Vigilância de drogas de alto rendimento e abrangente utilizando espectrometria de massa Multisegment eletroforese capilar-injeção

Summary

Aqui nós descrevemos um método de alta produtividade para a fiscalização de drogas abrangente que permite a resolução melhorada e detecção de grandes painéis de drogas de abuso e seus metabolitos, com controle de qualidade baseado na injeção multisegment-capilar eletroforese / espectrometria de massa.

Abstract

Novos métodos analíticos são urgentemente necessários para permitir a triagem de drogas de alto rendimento, mas abrangente, deu uma crise de droga opioide e prescrição alarmante em saúde pública. Teste de drogas urina convencional com base em uma tela de imunoensaio dualista seguido de uma espectrometria de massa em tandem-cromatografia gasosa (GC-MS/MS) ou método líquido espectrometria de massa em tandem-cromatografia (LC-MS/MS) são caros e propenso a viés estando limitada ao alvo painéis de conhecidas drogas de abuso (DoA). Neste documento, descrevem um método melhorado para vigilância de drogas que permite a resolução e a detecção de um painel expandido de DoA e seus metabólitos quando usando multisegment injeção-capilar eletroforese / espectrometria de massa (MSI-CE-MS). Multiplexado separações de dez amostras de urina com um controle de qualidade por CE (< 3 min/amostra) em conjunto com a aquisição de dados de verificação total usando um tempo-de-voo espectrômetro de massa (TOF-MS) sob detecção do modo de íon positivo permite a identificação e quantificação de DoA acima dos níveis recomendados de corte. Uma excelente resolução de isómeros de droga e isóbaras, incluindo interferências de fundo, são alcançados quando usando o MSI-CE-MS com um espaçador electrokinetic entre segmentos da amostra, onde exata fórmula molecular/massa juntamente com o comigration de um deuterado correspondência de padrão interno e a detecção de um ou mais metabólitos bio-transformadas facilitam a identificação DoA sobre uma ampla janela de deteção. Além disso, amostras de urina podem ser analisadas diretamente sem deconjugação de enzima para a seleção rápida sem exame de amostra complicado. MSI-CE-MS permite a vigilância de um amplo espectro de DoA que é necessário para o acompanhamento do tratamento de pacientes de alto risco, incluindo confirmando a aderência de droga prescrita, revelando o uso de drogas ilícitas/substituição e avaliando regimes de dosagem ideal conforme necessário para novos avanços na medicina de precisão.

Introduction

Um aumento alarmante do uso indevido de e a dependência de opiáceos para a gestão da dor crônica representa uma ameaça crescente para a saúde pública, com mais de 70.000 mortes por overdose drogas nos EUA estima-se em 2017¹. Da mesma forma, vários outros medicamentos psicotrópicos são também amplamente prescritos para crianças e jovens adultos para o tratamento da ansiedade, depressão e problemas de saúde mental². Como resultado, métodos, amplamente desenvolvidos para o local de trabalho e toxicologia forense, de testes de drogas de urina é de vital importância para o acompanhamento terapêutico dos medicamentos prescritos que são propensos a tolerância e dependência de^3,4. Isto é necessário para garantir a aderência, ótima eficácia terapêutica e segurança do paciente, enquanto revelam potencial substituição, incluindo o uso indevido de drogas ilícitas ou almoçamos. Atualmente, testes de drogas urina para DoA dependem de uma abordagem de duas camadas, composto de um imunoensaio competitivo inicial tela através de dispositivos point-of-care ou analisadores de laboratório, seguido por um teste de confirmação com maior especificidade, com base em GC-MS/MS e, cada vez mais, LC-MS/MS⁵. No entanto, os imunoensaios são propensos a viés, como reagentes de anticorpo nonspecifically bind várias classes de drogas para gerar um resultado presuntivo de tela-positivo, que impede uma identificação fiável e quantificação de drogas específicas ou complexa droga as misturas⁶. Neste contexto, mais precisos testes de drogas de urina são urgentemente necessárias tendo em conta os custos exorbitantes de policonsumo abrangente telas,⁷ , incluindo as drogas sintéticas e produtos de urina sintética que iludem convencional alvo de ensaios.

Separações de alta eficiência em conjunto com o MS de alta resolução (HRMS) usando analisadores de massa TOF ou orbitrap têm sido propostas como traduzir estratégia para vigilância de drogas em uma época de polifarmácia e expandir painéis de DoA^8,9 . No entanto, separações de LC convencionais são lento (> 15 min) devido às vezes tempo de eluição para a resolução de quimicamente diversas classes de DoA e seus metabolitos usando programas de gradiente de eluição, que limita a taxa de transferência de amostra para triagem de drogas de rotina. Alternativamente, métodos de análise direta baseiam a dessorção de ionização (DESI)¹⁰ e desorção térmica do diodo do laser (LDTD) permitem mais rápido sem separação¹¹de despistagem de drogas. No entanto, estes métodos de ionização de ambiente são propensos a isobárica/isoméricos interferências ao analisar amostras de urina complexo, exigindo teste de confirmação independente.

Nosso laboratório desenvolveu recentemente uma plataforma de separação multiplexada para aumentar a taxa de transferência de amostra, mantendo a fidelidade de dados e a resolução de uma separação de alta eficiência com base no MSI-CE-MS¹². Fluxos de trabalho novos dados podem ser projetados em MSI-CE-MS para o metabólito traduzir perfis (i.e., metabolomics) de biospecimens volume restrito, Considerando que os controlos de qualidade (QC) permitem a correção do lote conforme necessário para a população em grande escala estudos de¹³. Neste caso, as separações são executadas usando um buffer isocrática com soluto ionização ocorrendo sob condições de estado estacionário solventes quando usando uma interface líquido bainha convencional, que permite a seriais injeções de 10 ou mais amostras dentro de um único Corra para o rastreio rápido ainda seletivo de diversas classes de DoA e seus metabolitos¹⁴. O foco deste estudo é validar ainda mais MSI-CE-MS para a análise direta de amostras de urina autêntica de uma coorte representativa dos pacientes clinicamente deprimidos, usando um método de "diluir-and-shoot" que evita a necessidade de hidrólise enzimática¹⁵. Além disso, a implementação de um espaçador electrokinetic entre amostra serial plugues em MSI-CE-MS¹⁶ realizou-se ainda mais melhorar a resolução de várias drogas isómeros/isóbaras, urinárias interferências, de fundo e/ou Cruz-interferências quando rastreio grandes painéis de DoA. A quantificação absoluta DoA em amostras de urina quando deuterado usando a correspondência de padrões internos (d-é) é demonstrado quando usando o MSI-CE-MS. Essa abordagem também facilita a identificação de drogas, bem como a deduzir a posição correta da amostra dos casos de tela positivo quando comparado com uma mistura de painel de drogas ao recomendado nível de corte que funciona também como um referência interno/QC dentro de triagem a execução do mesma.

Protocol

Amostras de urina cegos foram gentilmente cedidas pelo Dr. Zainab Samaan da clínica de transtorno de humor no Hospital St. Joseph (Hamilton, ON, Canadá), cujo estudo foi aprovado pelo Conselho de ética de pesquisa integrada de Hamilton.

1. reagentes e preparação de soluções de amostra

1. Preparação do eletrólito de fundo
   1. Prepare 50 mL de fundo eletrólito (BGE) quinzenal, 1m de ácido fórmico, pH 1.8, com 15% v/v de acetonitrilo como um modificador orgânico.
   2. Alíquota 1,9 mL de concentrado ácido fórmico estoque (26,5 M) para um balão aferido de 50 mL e adicione 7,5 mL de acetonitrilo e 40,6 mL de água desionizada para trazer o volume total de 50 mL. Em seguida, proceda à sonicação a solução por 15 min e transferir para um frasco esterilizado com vedação.
2. Preparação líquida da bainha
   1. Prepare 200 mL de bainha solução líquida semanalmente, compreendendo a 0,1% de ácido fórmico em 60: 40 (MeOH:H₂O).
   2. Alíquotas de 200 µ l de ácido fórmico (estoque de 26,5 M) em um frasco contendo 120 mL de MeOH e 80 mL de H₂O para fazer bainha líquido e desgaseificá-lo por 15 min.
   3. Em seguida, adicionar 10 µ l de cada um dos seguintes íons de referência, Purina e hexaquis (2,2,3,3-tetrafluoropropoxy) phosphazine (HP-921), para o líquido de bainha para fornecer sinais de massa constantes em m/z 121.05087 e m/z 922.00979, respectivamente.
      Nota: Esses íons de referência permitem a correção de massa em tempo real e também monitorar para potenciais efeitos de supressão ou realce do íon induzida por matriz durante a separação.
3. Preparação-padrão
   1. Prepare uma solução-padrão contendo uma mistura de painel de 84-droga nos 3 x triagem clínica corte nível (L6)¹⁴ em 1 mL de metanol, usando os padrões de drogas adquiridos de um fornecedor de produtos químico. Prepare separadamente uma mistura de 48 correspondência de padrão de droga interno deuterado (d-ISs) em uma 10 vezes concentrações mais elevadas que a mistura de 84-droga em 1 mL de metanol. Além disso, preparar uma solução contendo 200 µM de 4-fluoro -L-fenilalanina (Phe-F) e 3-cloro -L-tirosina (Tyr-Cl) em 1 mL de deionizada H₂O.
   2. Realizar uma diluição quíntuplo de mistura de 84-droga acima mencionada (20 µ l) e a 48 d-ISs (20 µ l), bem como uma diluição dez vezes de 4-fluorophenylalanine (F-Phe, 10 µ l) e 3-chlorotyrosine (Cl-Tyr, 10 µ l) em uma matriz de urina sintética certificada (40 µ l) tornar-se um total volume de 100 µ l em um tubo de centrífuga de 250 µ l.
4. Preparação de curva de calibração externa
   1. Preparar as curvas de calibração externa de cinco pontos (como descrito abaixo), em quatro exemplares (n = 4) sobre uma 20-fold gama dinâmica usando a mistura padrão de 84-drogas e 48 de sua correspondente d-ISs feita na etapa 1.3.1. Por exemplo, para fazer uma curva de calibração externa de cinco pontos, certifique-se de diluir a mistura de droga-84 (L6, passo 1.3.1) para 2, 4, 10-, 20-e 40-fold, Considerando que é necessário preparar uma diluição quíntuplo de correspondência d-ISs (20 µ l) e uma diluição dez vezes de (4-F-Phe 10 µ l) e Cl-Tyr (10 µ l) como é um adicional em uma matriz de urina sintética tornar-se um volume total de 100 µ l. Em casos quando um d-IS correspondente não está disponível para uma droga específica, é uso 4-F-Phe, como um substituto para normalização de dados.
      Nota: Evitar a inclusão de d-ISs que Cruz-interferir (isobárica) com outros DoA dentro do painel, se eles não são totalmente resolvidos pela separação CE.
5. Preparação da amostra de urina
   1. Descongele amostras de urina deidentified manhã de uma coorte representativa dos dez pacientes clinicamente deprimidos com uma história de drogas de prescrição conhecido. Armazene as amostras de urina a-80 ° C após a coleta, até que eles têm que ser descongelados para análise.
      Nota: Evite múltiplos ciclos de congelamento e descongelamento de urina ou um atraso armazenamento à temperatura ambiente após a coleção devido a seu efeito sobre a estabilidade química de determinados metabólitos DoA e seus conjugados.
   2. Vórtice a urina da manhã deidentified amostras por 30 s e, em seguida, centrifugar--los por 1 min a 14.000 x g por sedimentação. Depois disso, a alíquota 10 µ l do referido processado urina, 10 µ l de d-é e 5 µ l de F-Phe/Cl-Tyr e 25 µ l de H₂O desionizada e vórtice para 1 min (repita essas etapas em triplicado para avaliar a precisão técnica). Transferi uma alíquota de 20 µ l da mistura acima descrita para um frasco de polipropileno para análise.

2. instalação do sistema de CE-TOF-MS

1. Sem revestimento capilar de sílica fundida, parâmetros de condicionamento
   1. Certifique-se de que todas as normas, as curvas de calibração externa e amostras de urina preparadas nas secções 1.3-1.5 são separadas usando um capilar de poliimida-revestido de silicone não revestidos de fundido aberto-tubular com diâmetro interno de 50 μm, diâmetro exterior de 360 µm e um comprimento total capilar de 135 cm.
      Nota: Uma ferramenta de corte de diamante é usada para garantir capilares consistentes que mais são inspecionados para garantir um corte rente e suave.
   2. Remova cerca de 7 mm do revestimento poliimida de ambos os capilares extremidades distais, usando um fazedor de janela capilar para reduzir ao reporte de amostra e evitar potencial poliimida inchaço quando em contato com o solvente orgânico.
   3. Certifique-se de se projetam cerca de 2 mm da saída do capilar fora a agulha do pulverizador de CE e instalar a entrada capilar no cartucho CE por um loop duas voltas de 360 °. Então, cuidadosamente instale o cartucho de CE na CE e coloque o pulverizador CE fora a fonte de íon quando condicionamento capilar.
      Nota: Corte a saída capilar consistentemente como é crucial para assegurar uma electrospray estável atual quando acoplado ao MS. Duas bombas diferentes foram usadas neste trabalho: utilizou-se um pulverizador de CE para a análise da amostra, e um pulverizador de LC foi usado para a calibração de massa.
   4. Certifique-se de executar com o pulverizador de CE não colocado na fonte de íons de condicionamento capilar. Colocar o pulverizador de LC na fonte de íons.
      Nota: Isto permite a calibração de massa, evitando qualquer contaminação da interface líquido coaxial bainha que é posteriormente acoplado para o TOF-MS.
   5. Condição de novos capilares, selecionando a função embutida (940 mbar) no software do fornecedor, usado para controlar o instrumento e definir a duração do flush em 30 min. cada para quatro diferentes solventes na seguinte ordem: metanol, 1 M de NaOH, água deionizado água e BGE. Certifique-se de colocar a bomba isocrática no modo de espera durante o período de condicionamento capilar.
   6. Limpe o pulverizador de CE-MS com uma toalhita de tecido embebida em MeOH/H₂O para remover quaisquer resíduos de sal residuais.
   7. Execute a manutenção preventiva diária do sistema CE-MS antes de analisar as amostras. Use o metanol a limpar do eletrodo de CE (na entrada), mas usar um isopropanol e mistura (50: 50) para limpar a interface CE-MS, que é importante para evitar o acúmulo de sal e limitar potenciais ao reporte de amostra de água.
   8. Remover o pulverizador LC fora a fonte de íon e posicionar o pulverizador limpo com um capilar recém condicionado na interface líquido bainha coaxial para CE-MS.
   9. Ligue a bomba isocrática e aplique uma tensão de 30 kV para 15 min para assegurar que um perfil atual do CE estável é alcançado antes da análise de urina.
2. Condições de injeção e separação usando CE
   1. Abra o software de fornecedor, usado para controlar o instrumento para definir os parâmetros de CE e selecionar o passo de pré-condicionamento. Definir função de descarga para 600 s e especificar uma posição de frasco BGE.
      Nota: Um refrigerador de água externa pode precisar de ser ligados aos sistemas de CE que falta bandeja de amostra refrigerar características, como isto é necessário para evitar a evaporação de amostra ao analisar grandes lotes de amostras de volume restrito.
   2. Definir a função de injeção para injetar direccionado as amostras a 100 mbar para 5 s e injetar electrokinetically espaçadores BGE em 30 kV para 75 s.
      Nota: Este processo é repetido com cada injeção de amostra (a partir de uma posição diferente do frasco), seguida por um espaçador BGE (da posição do frasco mesmo) que é executado automaticamente dentro de um programa de método sobre o software para um total de 11 amostras discretas analisados na mesmo qdo usando um formato MSI. Analisar 10 amostras de urina em ordem aleatória depois de uma mistura de drogas 84-painel no recorte triagem nível é injetada como a primeira posição de amostra para cada execução de MSI-CE-MS.
   3. Definir o aplicada tensão de 30 kV, a temperatura de cartucho para ser 25 ° C e o tempo de execução total ser de 40 min., usando o calendário, aplicar um gradiente de pressão de 2 mbar/min de 0 min a 40 min durante a separação.
      Nota: Uma pressão gradiente é aplicada durante a separação para permitir a eluição de lento-migrando de drogas, que inclui algumas benzodiazepinas fracamente, básicas e neutro/ácidas drogas (por exemplo, paracetamol, barbitúricos). No entanto, DoA mais básicos e seus metabolitos migram como cátions dentro de 25 min, incluindo as anfetaminas, opioides e outras classes de alcaloides.
   4. Após a aquisição da amostra for concluída, certifique-se de enxaguar o capilar a baixa pressão (50 mbar) com BGE, até o dia seguinte. Caso contrário, enxágue o capilar para 600 s a alta pressão (900 mbar) com água e, em seguida, para 600 s com ar e armazená-lo em um suporte de pulverizador até a próxima utilização.
3. Bomba isocrática e bainha líquido
   1. Use uma bomba isocrática de infinito e um infinito desgaseificador para entregar o líquido de bainha (60: MeOH:H₂O 40 com ácido fórmico a 0,1% v/v) a uma taxa de 10 µ l/min para o pulverizador de CE-MS.
4. Configurações de TOF-MS
   1. Certifique-se de que um TOF-MS, com uma fonte de íon coaxial electrospray bainha-líquido e gás nitrogênio aquecida, está equipado com uma unidade de CE.
   2. Operar o TOF-MS sob a deteção de íon positivo que atravessavam uma massa de m/z 50-1.700, com uma taxa de aquisição de dados de 500 ms/spectrum. Certifique-se que tanto o perfil e o centroide de dados são armazenados em um formato de arquivo ".d".
   3. Definir as condições de ionização electrospray ser: tensão CV e bocal em 2.000 V, o gás de nebulização a 10 psi e o gás de secagem entregaram a 8 L/min a 300 ° C, com um fluxo de gás de bainha de 3,5 L/min a 195 ° C. Além disso, defina as configurações de tensão de MS do fragmentor, do skimmer e Oct1 RF 120, 65 e 750 V, respectivamente.
      Nota: Tensão de capnografia e bocal, bem como gás de nebulização foram desligados durante a sequência de injeção de amostra serial usada no MSI-CE-MS, mas o electrospray foi programado para ser transformado de volta em 1 min após o início da separação eletroforética para impedir a corrente erros devido a efeitos de sucção.
   4. Execute a instrumento controle e aquisição de dados utilizando o software do fornecedor (Tabela de materiais).
5. Análise de dados
   1. Analise os dados de MSI-CE-MS usando o software de fornecedor, incluindo processamento, dados de suavização e a integração do íon extraído electropherograms (EIEs) para representante DoA e seus metabólitos.
   2. Abra o software e definir os seguintes parâmetros.
      1. Em cromatogramas, selecione o formato de dados de extraçãoe formato de dados espectrais cromatograma e massa para o modo de perfil .
      2. Selecione Quadrática/cúbicos Savitzky Golay sob a função de suavização e largura de função a 15 pontos.
      3. Em seguida, clique em Integrar (MS), definir o integrador para ser ágile selecione o número máximo de limite de picos para os 11 maiores sob filtros de pico.
      4. Clique em Exibir, clique em lista de pico de integraçãoe selecione o número de pico, tempo de retenção (RT), a área do pico, altura do picoe relação sinal-ruído (SNR).
      5. Salve esses parâmetros sob o nome de um único método. Aplicar esse método para o processo e interpretar cada conjunto de dados.
         Nota: Um quadro-resumo com número de pico, o RT, a área do pico e altura e o SNR exibe no lado direito. Executar a normalização de dados para RT medido e integrado a área do pico para cada DoA para qualquer um correspondente d-é ou (se não estiver disponível) para F-Phe para melhorar a precisão analítica.

3. análise de amostras de urina e curvas de calibração externa

1. Configurações de injeção serial diferente usadas em MSI-CE-MS
   1. Para o primeiro serial exemplo de configuração de injeção, usado para demonstrar a resolução de isômero/isobar drogas (figura 1A), certifique-se de que cinco repetidas injecções são executadas em uma mistura de 84 padrões de droga com d-é e 4-F-Phe/Cl-Tyr, seguido por um sexto injeção, que é uma amostra em branco na urina sintética, e cinco injeções adicionais de mistura de drogas padrão.
   2. Para o segundo série exemplo de configuração de injeção, usado para demonstrar a detecção de DoA em amostras de urina individual de pacientes com uma receita conhecida (Figura 2A), certifique-se de que a primeira tomada de amostra é uma mistura de mistura padrão de 84-droga a um 1 x nível de rastreio de Cut-off (controle positivo) seguido por uma injeção randomizada de 10 amostras de urina diluída de pacientes: #293, #88, #309, #43, #281, #64, #221, #208, #183 e #50.
   3. Para o terceiro série exemplo de configuração de injeção, usado para ilustrar a aquisição de curvas de calibração externa em uma única corrida, certifique-se de que calibrant soluções para DoA estão dispostas ao longo de uma faixa dinâmica linear 20-fold correspondente a 0,25 x, 0.5 x, 1 x, 2.5 x, e 5 x níveis de concentração de Cut-off, juntamente com correspondência d-IS e F-Phe/Cl-Tyr como adicional está numa matriz de urina sintética (n = 4).

Representative Results

MSI-CE-MS permite a injeção série de dez ou mais amostras discretas dentro de uma única corrida, que aumenta muito a taxa de transferência (< 3 min/amostra) sem modificações instrumentais complicadas, programas de troca de coluna ou dispendiosa infra-estrutura investimentos (figura 1A). Uma série alternada hidrodinâmicas injeções da amostra e do espaçador electrokinetic do BGE é executada dentro de um capilar de sílica fundida sem modificações, onde zonal separação eletroforética de íons ocorre sob condições de eletrólito fortemente ácidas (pH 1.8). ionização de soluto também ocorre sob condições de estado estacionário. Neste caso um líquido de bainha coaxial, com uma massa calibrant, é usado como uma interface para CE-MS sob a detecção do modo de íon positivo com íon mínimo supressão ou realce efeitos como monitorado pelo sinal de íons calibrant em massa. TOF representa um HRMS robusto ainda cost-effective com uma aquisição rápida de dados ideal para aplicações de vigilância a traduzir triagem/droga quando usando o MSI-CE-MS. Por exemplo, resolução impressionante é alcançada por vários isobárica/isoméricos DoA e seus metabólitos, incluindo os isómeros estruturais de três isómeros estruturais opioides, ou seja norhydrocodone, hidromorfona e morfina (figura 1B). Nesse caso, 30 resolvido picos de 10 amostras independentes de uma mistura de drogas são detectados sem reporte de amostra. Um controle de espaço em branco/negativo urina urina sintética também está incluído dentro da série de injeção serial (posição #6 da amostra). Além disso, dois outros opioides isobárico, ou seja, 6-acetylmorphine (um metabólito inativo de heroína) e naloxona (um antagonista dos receptores opioides usado para o tratamento de emergência de overdose de opiáceos) são totalmente resolvidos como 20 picos distintos com (aquisição de dados de exame completo A Figura 1). Da mesma forma, dois isômeros posicionais de anfetaminas são totalmente resolvidos no MSI-CE-MS para distinguir abuso de metanfetamina ilícito o abuso potencial de fentermina, um estimulante prescrito que é usado como um supressor do apetite para perda de peso.

Figura 1: uma série de íons extraídos electropherograms (EIE) para representante DoA isómeros/isóbaras que são resolvidas pela MSI-CE-MS, analisando amostras de dez e um espaço em branco dentro de um único. (A) esquemático da MSI-CE-MS que retrata a configuração de injeção serial usada para um painel de 84-DoA na urina sintética. Este método de separação multiplexada usa uma série alternada de hidrodinâmicas injeções de 11 amostras discretas e em branco com uma injeção electrokinetic de um buffer para iniciar a separação eletroforética zonal de íons, seguido de um exame completo de dados aquisição por TOF-MS com detecção do modo de íon positivo. (B) três isômeros de opioides isobárica grupo funcional (m/z 286.1438), separados por CE, compreendendo 30 resolvidos picos de 10 injeções de amostra discretos, incluindo norhydrocodone, hidromorfona e morfina. (C) dois isobárica opioides drogas e seus metabólitos (m/z 328.1543), separados por CE, compreendendo 20 resolvidos picos de 10 injeções de amostra discretos, incluindo 6-acetylmorphine (metabólito de heroína) e naloxona. (D) dois isobárica grupo funcional isómeros de anfetamina, separados por CE, compreendendo 20 resolvidos picos de 10 injeções de amostra discretos, incluindo a metanfetamina e fentermina. Em todos os casos, urina negativa controles/espaços em branco apresentados na sexta posição amostra no MSI-CE-MS tinha insignificante evidência de reporte de amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para tela DoA, uma configuração de injeção serial no MSI-CE-MS usado uma mistura de painel de 84-droga no recomendados níveis de concentração da corte de triagem (como a primeira posição de injeção para todas as execuções) seguido por uma análise de estudo randomizada de urina representativa 10 amostras de pacientes clinicamente deprimidos com uma história conhecida de prescrição. Por exemplo, um rastreio positivo teste resultado para metadona (m/z 310.2165) do paciente #208 (Figura 2A) é deduzida por uma detecção de um pico de sinal grande (originários de injeção #9), que comigrates com metadona-d3 com um baixo erro de massa (< 5 ppm). Não há outros sinais são detectados em qualquer outras amostras de urina dentro do mesmo executado. Concentração de metadona excede 13 x o limite de corte recomendada ao comparar sua proporção de resposta medida de íon na amostra (injeção #9) com a mistura de drogas referência/QC (injeção #1) e corrigido por um fator de diluição de urina quádrupla. Assim, este resultado confirma a adesão do paciente à terapia de manutenção de metadona. Evidência de ingestão de anfetamina almoçamos (Figura 2B) é mostrada por níveis elevados de anfetamina (m/z 136.1121) que só foi detectada em um paciente (paciente #50, na injeção #11) dentro da MSI-CE-MS. A concentração medida ultrapassou ligeiramente os níveis de corte recomendada (1.3 x). Esta comigrates com anfetamina-d5 e tinha um erro de massa baixo com uma partida de ranking molecular fórmula. Um resultado de teste positivo para o antidepressivo venlafaxina (m/z 278.2115), um inibidor de recaptação seletiva de serotonina-noradrenalina, também é demonstrado no paciente #281 (injeção #6). Neste caso, a concentração excede os níveis recomendados de corte (15 x), isto é identificado por sua exata massa ou fórmula molecular-correspondência, juntamente com comigrating venlafaxine-d6 (Figura 2). O último critério não for atendido por um desconhecido isobar que também é detectado no rastreamento EIE, que destaca a necessidade de cautela quando depender exclusivamente de sua massa exata. Também, uma detecção definitiva de pregabalina prescrita, o que é prescrita para o tratamento da dor neuropática, bem como de ansiedade generalizada, é demonstrada também pela paciente #309, baseada em sua concentração extremamente elevada (x 64) acima do recomendado níveis de corte (Figura 2D). Não é, no entanto, detectado em nove outras amostras de urina de pacientes analisadas dentro do mesmo executado. Semelhante os outros casos de tela positivo, injeção #4, comigrates com pregabalina-d6, que está incluído em todas as amostras de urina analisadas pelo MSI-CE-MS.

Figura 2: uma série de íons extraídos electropherograms (EIE) para resultados de teste de drogas urina representativa de tela-positivo de uma coorte de 10 pacientes clinicamente deprimidos como confirmado quando usar o MSI-CE-MS, que inclui um painel de 84-droga a recomendado nível de corte, injetada como a primeira posição de injeção de amostra, servindo como referência interno/QC. (A) EIE sobreposição correspondente a metadona-d3, que comigrates com metadona, destacando que apenas um exame de urina (injeção posição #9) elevou-se concentrações de metadona, excedendo o nível de corte. (B) EIE sobreposição correspondente a anfetamina-d3, que comigrates com anfetamina, destacando que apenas um exame de urina (injeção posição #11) elevou as concentrações acima dos níveis de corte. (C) EIE sobreposição correspondente à venlafaxina-d6, que comigrates com venlafaxina, destacando que apenas um exame de urina (posição #6 de injeção) elevou as concentrações acima dos níveis de corte. (D) EIE sobreposição correspondente a pregabalina-d6, que comigrates com pregabalina, destacando que apenas uma amostra de urina (injeção posição #4) grosseiramente elevou as concentrações excedam os níveis de corte. Todas as amostras de urina foram analisadas diretamente após uma diluição quintuplicou em água desionizada, juntamente com a adição de uma correspondência de um d-é (quando disponível). Um resultado positivo-screen no MSI-CE-MS corresponde a uma droga que comigrates com d-ISs com um erro de baixa massa (< 5 ppm) e a fórmula molecular correta, cuja concentração excede o limite que é analisado dentro do mesmo executar como referência interno/QC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A quantificação absoluta DoA e seus metabólitos também é conseguida MSI-CE-MS com base nas curvas de calibração externa, usando padrões de calibrant de referência para DoA que são adquiridas rapidamente dentro de um único. Por exemplo, a diluição serial de uma mistura de drogas-84 calibrant junto com uma correspondência d-está em uma concentração fixa fornece uma análise quantitativa fiável em amostras de urina complexo. Isto compensa para o potencial supressão induzida por matriz íon ou aperfeiçoamento, mas também para as variações do volume de injeção no capilar entre as amostras. Em casos quando um correspondente d-IS é comercialmente disponível ou custo proibitivo para certos DoA, é um substituto é utilizado para a normalização de dados, tais como um d-IS de dentro da mesma classe de drogas ou composta sintética não encontrado em urina (F-Phe), como demonstrado anteriormente ¹⁴. representante EIEs e curvas de calibração externa de oxicodona são mostradas na Figura 3A, B. e para citalopram na Figura 3, D. Estas são amplamente prescritas analgésicos e antidepressivos, respectivamente, com potencial de abuso. Relativa do íon resposta rácios para sua correspondência d-é são medidos. Neste caso, uma configuração de injeção serial no MSI-CE-MS, composto por cinco diferentes drogas calibrants, são analisados em duplicado dentro de um único juntamente com uma amostra de urina sintética em branco. No geral, boa linearidade (R² > 0.990) sobre uma 20-fold concentração gama foi alcançada com sensibilidade adequada para a deteção da maioria dos DoA e seus metabólitos (ou seja, alcaloides catiônicas) dentro do painel de 84-drogas ¹⁴. em todos os casos, metabólitos de drogas são detectados como limita sua protonado Íon molecular [MH⁺] acima de seu limite de triagem (> 50 ng/mL), com excepção de certas drogas ácido/neutro que têm uma eficiência de ionização pobre sob a modo de íon positivo, como canabinoides (por exemplo, THC-COOH), barbitúricos (por exemplo, secobarbital) e carbamatos (por exemplo, carisoprodol).

Figura 3: uma série de extraídos do íon electropherograms (EIE) para a quantificação do representante DoA. Isto é feito através da geração de curvas de calibração externa, com base na sua relação de resposta relativa do íon com um um correspondente d-é uma 20-fold gama dinâmica linear. (A) duplicar a injeção de uma curva de calibração de cinco pontos para oxicodona calibrants juntamente com oxicodona-d3 e um espaço em branco. (B) curva de calibração externa de oxicodona, após a regressão linear para derivar a sensibilidade (inclinação) e linearidade (R²), com barras de erro que representa ±1σ (n = 4). (C) duplicar a injeção de uma curva de calibração de cinco pontos para calibrants citalopram, juntamente com citalopram-d6 e um espaço em branco. (D) curva de calibração externa para citalopram, após a regressão linear para derivar a sensibilidade (inclinação) e linearidade (R²), com erro barras representando ± 1 SD (n = 4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Separações cromatográficas convencionais normalmente contam com uma injeção única amostra por execução, que é seguida por uma gradiente eluição para a resolução de misturas complexas de droga e recondicionamento de coluna. Esses requisitos fundamentalmente limitam a taxa de transferência de amostra e dever ciclo mesmo quando usando programas de troca de coluna ideais. Neste contexto, análise de drogas de alto volume de urina para o local de trabalho, toxicologia ou aplicações de monitorização terapêuticas por GC-MS/MS e, cada vez mais, LC-MS/MS, portanto, são executadas em paralelo, mas usado preferencialmente como um segundo-tier ou confirmação quando testar necessário (ou seja, contexto jurídico ou médico). Isto é devido a investimentos de capital muito mais elevados e custos operacionais, bem como complicações com a análise dos dados quando se comparam amostras analisadas através de múltiplas plataformas instrumentais dentro de um laboratório acreditado. Como resultado, os imunoensaios ainda permanecem o principal método para triagem de drogas de rotina apesar de ser propenso a falso-positivos e falso-negativos entre muitas classes de drogas, com acesso limitado aos reagentes de anticorpo para drogas emergentes de designer. Estudos anteriores demonstraram que separações multiplexadas com base no MSI-CE-MS oferecem uma solução simples para aumentar a taxa de transferência de amostra até uma ordem de magnitude. Além disso, esta abordagem permite o design de dados novos fluxos de trabalho para descoberta de biomarker com fidelidade de dados alta, baseada na aplicação da correção do lote eficaz e controle de qualidade^12,13,14. No entanto, a introdução de 10 ou mais seriais injeções hidrodinâmicas em MSI-CE-MS encurta o comprimento efectivo capilar necessário para manter as separações de alta eficiência, que podem comprometer a seletividade quando analisando DoA e seus metabólitos em urina humana.

Neste documento, apresentamos uma injeção electrokinetic da BGE após cada injeção de amostra hidrodinâmica, tal que a separação tira proveito do comprimento total capilar (120 cm), melhorando assim a resolução de droga importante isóbaras/isómeros quando usando exame completo de aquisição de dados por TOF-MS (figura 1A). Em comparação com um recente relatório¹⁴, melhor resolução é alcançada por vários importantes isobárica/isoméricos DoA e seus metabolitos, que é crítico quando rastreio para painéis de grande droga. Por exemplo, a resolução de vários isómeros de grupo funcional/estrutural importante foi realizada, incluindo três análogos opioides drogas/metabolitos (figura 1B), dois independentes opioides isóbaras (Figura 1) e dois de metanfetamina isômeros posicionais (Figura 1). Em todos os casos, reporte de amostra de serial injeção de soluções de calibrant diferentes dentro do mesmo executar não é significativo, como confirmado por um controle de urina negativa/em branco. Além disso, melhor resolução também é realizada para várias Cruz-interferências envolvendo certa d-ISs com isobárica drogas dentro do painel, como cotinine-d3 e 3,4-metilenodioxianfetamina (MDA), EDDP-d3 e imipramina, norfentanyl-d5 e cetamina, codeína-d6 e sertralina e cocaína-d3 e zolpidem. Este resultado é estendido a outras interferências isobárica dentro do painel de drogas que foram resolvidas melhor neste estudo (p. ex., noroxycodone/oxymorphone, normeperidine/metilfenidato), bem como interferências urinária de grande fundo (por exemplo, , de origem fragmento íons de creatinina com anfetamina)¹⁴. De fato, acesso aos dois parâmetros ortogonais para satisfazer a identificação putativa de um DoA específicas é fundamental para reduzir falsos positivos devido a interferências isobárica, nomeadamente precisos massa combinados com comigration com d-ISs. Além disso, a detecção de um ou mais metabólitos biotransformado da droga pai dentro a mesma amostra, tais como glicuronídeo hidroxilado, desmetilado ou intacta drogas conjugate(s), adiciona ainda mais confiança para identificação de drogas ao mesmo tempo, expandir a janela para a deteção.

Os níveis de corte recomendado para triagem de drogas de urina variam para diferentes classes de DoA (variando de 50 a 1.000 ng/mL), dependendo de sua farmacocinética, toxicidade e interferências de fundo, a fim de reduzir o viés de método com base em diretrizes de o abuso de substâncias e Saúde Mental dos serviços de administração (SAMHSA)¹⁴. O potencial para MSI-CE-MS para detectar e identificar as diversas classes de DoA diretamente na urina com pré-tratamento da amostra mínima foi aplicado a um grupo de pacientes clinicamente deprimidos com um recorde de receita conhecida. A identificação definitiva de metadona (prescrito), anfetamina (almoçamos/ilícito), Venlafaxina (prescrito) e pregabalina (prescrito) em amostras de urina diluída, ainda nonhydrolyzed, foi demonstrada quando usando o MSI-CE-MS. Isto foi baseado em uma comparação direta de uma droga detectada em uma posição de injeção específico em relação a mistura de 84-droga introduzida na posição da primeira amostra para o recomendado nível de corte que serve como uma referência interno/QC e controle positivo de triagem (Figura 2). Também, a quantificação absoluta drogas é viável quando usar as curvas de calibração externa (Figura 3) com base na relação de resposta íon medido para uma droga de sua d-é. Ao contrário de separações cromatográficas mais, não há nenhum efeito de deutério, impactando as diferenças de tempo de migração entre um d-é e sua nondeuterated droga desde que eles possuem mobilidades eletroforética análogas na solução livre em CE. Com efeito, o comportamento de migração de DoA é modelado com precisão em CE, com base na sua estrutura fundamental de química/propriedades físico-químicas, ou seja, volume molecular e carga efetiva (pK_um)¹⁴. Uma vez que muitas drogas também passam por metabolismo secundário significativo antes da excreção na urina (por exemplo, morfina glicuronídeo), corte de rastreio níveis exigem ajuste como suas concentrações medidas são menores do que esperado quando comparado com métodos que utilizam a hidrólise enzimática para a deteção da droga total. Um grande benefício de urina "diluir-and-shoot" testar da droga, além de reduzir custos/tempo, manipulação de amostra e um potencial viés ou variações de lote, devido à hidrólise enzimática incompleta, é que presuntivo positivo tela casos são ainda mais confirmados pela deteção de um ou mais metabólitos de drogas relacionadas dentro da mesma amostra. Isso também fornece mais profundos insights sobre drogas farmacocinética ou optimum requisitos de dosagem para pacientes individuais, melhorando a detecção para "rápidos" metabolizadores ou drogas ilícitas/prescrito com meia-vida curta. Além disso, comigration com um correspondente d-é desempenha duas funções importantes para confiável quando de despistagem de drogas usando MSI-CE-MS — ou seja, identifica a posição de injeção de amostra exata (ou seja, paciente #) enquanto também corrigir diferenças de íon volumes de injeção/respostas para maior precisão e exatidão.

Futuro trabalho tem como objetivo desenvolver ferramentas de software personalizado para facilitar o tratamento automatizado de dados de separações multiplexados acoplado ao HRMS conforme necessário para testes com QA/QC de drogas de alto volume de urina. Validação rigorosa de MSI-CE-MS para o rastreio de amplo espectro de DoA também será investigada entre uma maior coorte de pacientes de alto risco para avaliar objetivamente a droga prescrita aderência e potencial uso indevido/substituição que possam comprometer eficácia terapêutica, segurança do paciente e/ou avaliação/diagnóstico psiquiátrico. Uma análise complementar de classes ácida/aniônica de DoA e seus metabolitos será também realizada por MSI-CE-MS sob condições alcalinas com detecção de modo íon negativo conforme exigido para o rastreio abrangente de canabinoides naturais/sintéticas. Isto é importante, tendo em conta as implicações de saúde pública iminente da legalização da maconha recreativa através de Canadá e de vários Estados dos EUA. Uma grande vantagem da aquisição de dados de verificação total por TOF-MS é que a análise retrospectiva das amostras pode ser executada mesmo quando as amostras de urina não estão mais disponíveis para testes de acompanhamento, Considerando que o estilo de vida ou outros riscos alimentares podem ser avaliados para melhor Entenda o diferenciais respostas à terapia medicamentosa. Em resumo, um método de vigilância droga rápida ainda precisos por MSI-CE-MS oferece vantagens significativas para imunoensaios alvo convencionais, bem como infusão direta/ambiente métodos de ionização-MS/MS que são propensos a interferências/viés ao resolver painéis expandidos de DoA e seus metabólitos em amostras biológicas complexas em custos incrementais.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
7100 Capillary Electrophoresis System	Agilent Technologies Inc.	G7100A	CE instrument used for separation of drug mixtures, desalting and anotation
6230 Series Time-of-Flight Mass Spectrometer	Agilent Technologies Inc.	G6230B	HRMS mass analyzer used for drug detection and anotation
CE-ESI-MS Sprayer Kit	Agilent Technologies Inc.	G1603A	CE/MS coaxial sheath liquid interface and capillary casette
1260 Infinity Isocratic Pump and Degasser	Agilent Technologies Inc.	G1310B	Isocratic pump to deliver sheath liquid/mass calibrant
MassHunter Workstation Data Acquisition Software (B.06.01)	Agilent Technologies Inc.	--	Software used for control of CE-MS system
MassHunter Qualitative Analysis Software (B.06.01)	Agilent Technologies Inc.	--	Software used for processing of CE-MS data
Shortix Capillary Cutter	Agilent Technologies Inc.	5813-4620	Cutting tool with diamond blade used to cut capillaries
Capillary Window Maker	Microsolv Inc.	07200-S	Burner with 7 mm window size to remove polyimide coating from CE capillary
Flexible Fused-silica Capillary Tubing	Polymicro Technologies Inc.	TSP05375	Standard polyimide coated fused-silica capillary for CE separation (50 micron ID; 360 micron OD)
Drug standards, deuterated internal standards, synthetic urine matrix (SURINE)	Cerilliant Inc.	Miscellaneous	Certified drugs of abuse reference standards (86 drug panel) with 48 deuterated internal standards and negative urine control (Surine)