Biology

Приложения пространственно временных карт и методы анализа частиц для количественного определения внутриклеточных Ca^{2 +} сигнализации в Situ

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58989

Bernard T. Drumm¹, Grant W. Hennig², Salah A. Baker¹, Kenton M. Sanders¹

¹Department of Physiology and Cell Biology, University of Nevada Reno School of Medicine, ²Department of Pharmacology, The Robert Larner, M.D. College of Medicine, University of Vermont

Summary

Генетически закодированный Ca^{2 +} показателей (GECIs) радикально изменили как на месте Ca^{2 +} изображения производится. Для максимального восстановления данных от таких записей, необходим соответствующий анализ Ca^{2 +} сигналов. Протоколы в настоящем документе облегчить количественную оценку Ca^{2 +} сигналов, записанная на месте с помощью пространственно-временных сопоставления и анализа на основе частиц.

Abstract

CA^{2 +} изображений изолированных клеток или определенные типы клеток в неповрежденной ткани часто показывает сложные узоры Ca^{2 +} сигнализации. Эта деятельность требует тщательного и углубленного анализа и количественной оценки, чтобы захватить как можно больше информации об основных событиях как можно скорее. Пространственных, временных и интенсивности параметров присущих Ca^{2 +} сигналов, таких как частота, продолжительность, распространения, скорости и амплитуды может предоставить некоторые биологические информацию, необходимую для внутриклеточной сигнализации. Высоким разрешением Ca^{2 +} обычно визуализации результатов в приобретении данных большого размера файлов, которые отнимают много времени процесса с точки зрения перевода изображений информации в количественные данные, и этот процесс может быть восприимчивым к человеческой ошибки и предвзятости. Анализ Ca^{2 +} сигналов от клеток на месте обычно основывается на простой интенсивности измерения из произвольно выбранных областей интереса (ROI) в поле зрения (FOV). Этот подход игнорирует большую часть важных сигналов информацию, содержащуюся в ПЗ. Таким образом чтобы максимизировать восстановления информации из такого высокого разрешения записи, полученные с Ca^{2 +}красителей или optogenetic Ca^{2 +}требуется изображений, соответствующих пространственных и временных анализ Ca^{2 +} сигналов. Протоколы, изложенных в настоящем документе будет описывать, как можно получить большой объем данных от Ca^{2 +} изображений записи для облегчения более полный анализ и количественная оценка Ca^{2 +} сигналов, записанная из клеток, используя комбинацию пространственно-временных карта (СТМ)-на основе анализа и анализа на основе частиц. Протоколы также описывают как различные модели Ca^{2 +} сигнализации наблюдаемых в различных клеток, которые население на местах могут быть проанализированы надлежащим образом. Для иллюстрации, метод будет проверять Ca^{2 +} сигнализации в специализированных популяции клеток в тонком кишечнике, интерстициальных клеток Кахаля (МУС), с помощью GECIs.

Introduction

CA^{2 +} является вездесущий внутриклеточным messenger, который контролирует широкий спектр клеточных процессов, таких как мышцы сжатия¹^,², метаболизм³, клетки распространения³^,⁴^, ⁵, стимулирование нейромедиатора релиз на нерв терминалы⁶^,⁷и активация транскрипции факторы в ядре. ⁷ внутриклеточных Ca^{2 +} сигналы часто принимают форму переходных фасады в цитозольной Ca^{2 +}, и они могут быть спонтанным или возникают от стимуляции агонистов в зависимости от типа ячейки⁸. Пространственных, временных и интенсивности параметров присущих Ca^{2 +} сигналов, таких как частота, продолжительность, распространения, скорости и амплитуды может предоставить биологической информации, необходимой для внутриклеточных сигнальных⁵^, ⁷ ^, ⁹. сигналы цитоплазматических Ca^{2 +} может быть результатом притока Ca^{2 +} из внеклеточного пространства или через Ca^{2 +} освобождение от эндоплазменный ретикулум (ER) через Ca^{2 +} релиз каналы, такие как рианодиновыми рецепторы (RyRs) и рецепторов инозит tri фосфат (IP₃Rs)¹⁰. RyRs и IP₃Rs может как способствовать поколения Ca^{2 +} сигналов и согласованные открытие этих каналов, которые в сочетании с различными Ca^{2 +} приток механизмов может привести к множество Ca^{2 +} сигнализации модели которые формируются в цифрах и открыть вероятность Ca^{2 +} приток каналов, выражение профиль Ca^{2 +} релиз каналов, близость между Ca^{2 +} приток и выпуска каналы и выражение и распространение Ca^{2 +} белков reuptake и экструзии. CA^{2 +} сигналы могут принимать форму единообразных, длительный, высокой интенсивности глобальных колебаний, которые может длиться несколько секунд или даже минут, распространяющихся межклеточной и внутриклеточной Ca^{2 +} волны, которые могут пересекать внутриклеточных расстояния более 100 мкм в¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,^,¹⁵¹⁶или более краткий, пространственно-локализованных событий как Ca^{2 +}искры и Ca^{2 +} затяжек, которые происходят на десятки миллисекунд сроками и распространения менее 5 мкм¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰.

Люминесцентная микроскопия широко используется для мониторинга Ca^{2 +} сигнализации в изолированных и культивируемых клеток и неповрежденной ткани. Традиционно эти эксперименты связаны с использованием флуоресцентных Ca^{2 +} показателей, ratiometric и не ratiometric красители например Fura2, Fluo3/4 или Rhod2, среди других ²¹^,^,²²-²³. Эти показатели были разработаны для быть проницаемой мембраны клетки и затем стать в ловушке клеток путем расщепления эфирную группу через эндогенные эстераз. Связывание Ca^{2 +} с высоким сродством показателями вызвали изменения в флуоресценции, когда клетки и ткани были освещены соответствующие длин волн света. Использование показателей клеток проницаемых Ca^{2 +} значительно расширить наше понимание Ca^{2 +}сигнализации в живых клетках и пространственное разрешение и количественной оценки этих сигналов, что не было возможно, опробование Ca^{2 +} сигналов через другие средства, такие как электрофизиологии. Однако традиционные Ca^{2 +} показатели имеют ряд ограничений, таких как Фотообесцвечивание, которое происходит через расширенный записи периодов²⁴. В то время как новые Ca^{2 +}индикатор красителей, таких, как Cal520/590 значительно улучшить сигнал шум соотношения и способность обнаруживать местных Ca^{2 +} сигналы²⁵, проблемы с Фотообесцвечивание может по-прежнему остаются проблемой для некоторых исследователей²⁶^,²⁷^,²⁸. Резкий Фотообесцвечивание также ограничивает масштаб, скорость загрузки изображений, и резолюции, который может использоваться для записи, как увеличение мощности объективных и более высокие темпы захвата изображений требуется увеличение интенсивности света возбуждения, увеличивает Фотообесцвечивание.

Эти ограничения традиционных Ca^{2 +} индикатор красители усугубляются при записи Ca^{2 +} сигналов на местах, например при записи внутриклеточных Ca^{2 +} сигналы от нетронутыми тканей. Из-за выше проблемы, Визуализация Ca^{2 +} сигналов на месте с использованием клеток проницаемых Ca^{2 +}показателей была ограничена увеличения малой мощности и сниженные ставки захвата изображения, ограничивает возможности следователей для записи и количественно височно или пространственно ограниченных субцеллюлярные Ca^{2 +} сигналов. Таким образом было трудно захватить, проанализировать и оценить пространственные и временные сложности Ca^{2 +} сигналов, которые могут быть важны в поколение желаемого биологических реакций, как описано выше. Анализ Ca^{2 +} сигналов от клеток на месте обычно основывается на простой интенсивности измерения из выбранных областей интереса (ROI) в поле зрения (FOV). Произвольный выбор количество, размер и положение трансформирования, зависит от прихоти исследователя, может серьезно смещения полученные результаты. А также присущи предвзятости с анализом ROI, этот подход игнорирует большую часть важных сигналов информация, содержащаяся в ПЗ, как динамический Ca^{2 +} события в пределах произвольно выбранной ROI отбираются для анализа. Кроме того анализ Руа не для предоставления сведений о пространственных характеристик Ca^{2 +} сигналов наблюдается. Например, это не возможно провести различие между увеличением Ca^{2 +} в результате распространения Ca^{2 +} волна и высоко локализованных Ca^{2 +} релиз событий из таблицы Ca^{2 +} сигналов в пределах ROI.

С появлением генетически закодированный Ca^{2 +} показателей (GECIs), радикально изменилась, как Ca^{2 +} изображений может быть выполненной в situ²⁹^,³⁰^,^,³¹³²^,³³. Есть несколько преимуществ использования GECIs над красители. Наиболее важным, возможно, что выражение ГЕЧИ может быть выполнена определенным образом клеток, что уменьшает нежелательные фон загрязнения от клеток не интерес. Еще одним преимуществом GECIs над традиционными Ca^{2 +} показателей является, что Фотообесцвечивание уменьшается (флуоресценции и, как следствие, Фотообесцвечивание происходит только когда клетки являются активные), по сравнению с краситель загружены образцы, особенно на высоких увеличение и высокие показатели образа захвата³⁴. Таким образом, формирование изображений с GECIs, такие, как GCaMP серии optogenetic датчиков, предоставляет следователям возможность записи краткие, локализованные субклеточном Ca^{2 +} сигналов в situ и расследовать Ca^{2 +} сигнализации в клетках в течение их родной среды, которые ранее не удалось. Для максимального восстановления информации из такого высокого разрешения записи, соответствующие пространственной и временной анализ Ca^{2 +} сигналов не требуется. Следует отметить, что, хотя GECIs может предложить некоторые ясные преимущества, недавние исследования показали, что Ca^{2 +} изображений могут быть успешно выполнены из больших популяций различных классов нейрохимических нейронов одновременно с использованием обычных CA^{2 +} индикаторы, которые генетически не кодируются в животных³⁵. Этот подход используется post hoc иммуногистохимия выявить несколько различных классов нейронов стрельбы на высоких частотах в синхронизированных выстрелов и избегать потенциал, что генетические модификации для животного может помешали физиологических поведение следователь стремится понять³⁵^,³⁶.

Протоколы, изложенных в настоящем документе облегчить более полный анализ и количественная оценка Ca^{2 +} сигналов, записанные с клетки на месте, используя комбинацию пространственно-временных карты (СТМ)-на основе анализа и анализа на основе частиц. Протоколы также описывают как различные модели Ca^{2 +} сигнализации наблюдаемых в различных клеток, которые население на местах могут быть проанализированы надлежащим образом. Для иллюстрации, метод будет проверять Ca^{2 +} сигнализации в специализированных популяции клеток в тонком кишечнике, интерстициальных клеток Кахаля (ICC). ICC – специализированные клетки желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), которые экспонат динамическое внутриклеточных Ca^{2 +} сигнализации, как визуализируются с помощью мыши, выражая GCaMPs³⁷^,^,³⁸³⁹^,⁴⁰^,^, ⁴¹-⁴². CA^{2 +} переходные процессы в МУС связаны с активации Ca^{2 +}-активированный Cl^– (в формате Ano1) каналы, которые играют важную роль в регуляции возбудимости кишечных гладкомышечные клетки (SMCs)⁴³^,⁴⁵ ⁴⁴^,. Таким образом изучение Ca^{2 +} сигнализации в МУС имеет основополагающее значение для понимания кишечной моторики. Мышиных тонкой кишки служит прекрасным примером для этой демонстрации, поскольку существует два класса МУС, которые анатомически разделены и могут быть визуализированы самостоятельно: я) ICC расположены в районе между круговой и продольных гладких мышц слои, окружающие myenteric сплетение (ICC-MY). Эти клетки служат кардиостимулятор клетки и генерации электрической активности, известный как медленные волны⁴⁶^,⁴⁷^,^,⁴⁸⁴⁹; II) ICC также расположены среди сплетения, богатые в терминалах двигательных нейронов (глубокие мышечные сплетения, таким образом ICC-DMP). Эти клетки служат посредниками ответов на кишечные мотор синапсах³⁷^,^,³⁹⁴⁰^,⁵⁰. ICC-MY и ICC-DMP морфологически отличаются, и их Ca^{2 +} сигнализации поведения радикально отличаются для решения их конкретных задач. ICC-MY севрюги в форме и образуют сеть взаимосвязанных клеток через разрыв соединения⁵¹^,⁵². CA^{2 +} сигналов в ICC-мой манифест как краткие и пространственно-локализованных Ca^{2 +} релиз событий, происходящих на нескольких сайтах асинхронно через ICC-моя сеть как визуализация в ПЗ (образы с 60 X цель)³⁸. Эти асинхронные сигналы височно организованы в 1 секунду кластеров, что, когда Табулированы вместе, сумма нетто 1 s сотовой увеличение Ca^{2 +}. Эти сигналы распространения ячеек в пределах сети МУС и поэтому организовать Ca^{2 +} сигнализации, сгенерированные из субклеточном сайты ткани широкие Ca^{2 +} волна. Височной группирования и суммирования Ca^{2 +} сигналов в ICC-мой был назван Ca^{2 +} переходных кластеры (CTCs)³⁸. ЦОК происходит ритмично (например очень похожи длительностей и аналогичные периоды между CTCs) 30 раз в минуту в мыши. И наоборот ICC-DMP шпинделя формы клетки, некоторые с вторичных процессов, которые распределить между SMCs и варикозной нервных процессов, а не самостоятельно формируют сети⁵¹^,⁵². ICC-DMP формы разрыв соединения с SMCs, однако и функции в рамках этой более синцития, известный как SIP синцития⁵³. CA^{2 +} сигналы происходят в нескольких местах вдоль длины клеток, но эти переходные процессы не увлекаемого или височно кластеризованный, как отмечено в ICC-мой³⁷. CA^{2 +} сигналов в ICC-DMP происходят на основе стохастической, с переменной интенсивности, длительности и пространственных характеристик. Протоколы ниже, на примере Ca^{2 +} сигнализации в ICC-мой и ICC-DMP, описывают методы для анализа сложных сигналов в конкретных типах клеток на месте. Мы использовали индуцибельной Cre-Lox p системы выразить GCaMP6f исключительно в МУС, после вызывающих активацию Cre-рекомбиназа (Cre) обусловлен конкретной промоутера ICC (комплект).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все животные и протоколы, в этом исследовании были в соответствии с национальных институтов здравоохранения руководство для ухода и использования лабораторных животных. Все процедуры были утверждены Комитетом правомерного использования животных и уход на Университет Невады в Рено.

1. поколение KitGCaMP6f мышей

Крест Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f мышей) и c комплект^{+/ Cre-ERT2} (комплект-Cre мышей) для создания МУС конкретных GCaMP6f выражая животных (мышей Kit-Cre-GCaMP6f).
Примечание: GCaMP6f был использован из-за его сообщил эффективности отчетности локализованные, краткие внутриклеточных Ca^{2 +} сигналы на месте, так и in vivo⁵⁴.
Придать мышей Kit-Cre-GCaMP6f с тамоксифен в возрасте 6 – 8 недель, чтобы побудить Cre рекомбиназа активации и последующие выражения GCaMP6f в МУС (рис. 1).
1. Чтобы создать решение тамоксифен, распустить 80 мг тамоксифен (см. Таблицу материалы) в 800 мкл этанола (см. Таблицу материалы) в кювет и вихревые за 20 минут.
2. Добавьте 3,2 мл сафлоровое масло (общий) для создания решения по 20 мг/мл и затем sonicate за 30 минут до инъекции.
3. Придать мышей (внутрибрюшной инъекции; IP) с 0,1 мл раствора (2 мг тамоксифен) тамоксифен для трех дней подряд. Подтвердите GCaMP6f выражение, Генотипирование и использовать мышь через 10 дней после первого введения.
  1. Генотип мышей путем отсечения небольшой кусок уха из каждого животного. Затем используйте метод отчаянный⁵⁵ для геномной ДНК изоляции инкубировать уха клипы на 95 ° C 60 мин в 75 мл NaOH и затем нейтрализации 75 мл трис-буфер. Используйте стандартное PCR для определения генотипа каждого животного, 2 мл в 20 мл реакции с GCaMP6f конкретных грунтовки⁵⁶ДНК. Запуск 10 мл ПЦР продукта на 2% агарозном геле для определения дикого типа (297 bp) и мутанта (~ 450 bp) полос.

2. Подготовка тканей для Ca^{2 +} изображений

Обезболивают мышей при вдыхании с изофлюрановая (4%, см. Таблицу материалы) в вентилированные капюшон и затем жертву от шейки матки дислокации.
С помощью острых ножниц открыть брюшке мышей, удалите тонкой кишки и место в растворе Кребса-звонарь бикарбонат (KRB). Открыть в тонком кишечнике на границе верхней брыжеечной и смыть содержимое любого внутрипросветная с KRB. Используя острые Анатомирование, удалите слои слизистой оболочки и суб слизистой.
Примечание: KRB решение имеет следующий состав (в мм): NaCl 118,5, хлористого калия 4,7, CaCl₂ 2.5, MgCl₂ 1.2, NaHCO₃ 23,8, KH₂PO₄ 1.2, декстроза 11.0. Это решение имеет рН 7,4 при 37 ° C, когда кипела равновесия с 95% O₂- 5% CO₂.
С помощью небольшой булавки, контакта ткани тонкой кишки на базе тома 5 мл, Sylgard покрытием блюдо диаметром 60 мм с круговой гладкой мускулатуры, вверх. Perfuse подготовка с утепленным KRB решения при 37 ° C для уравновешивания продолжительностью 1 час перед экспериментов.
После этого периода уравновешивания, выполняют на месте Ca^{2 +} томография малого кишечника ICC-мой и ICC-DMP с помощью конфокальной микроскопии (изображения в этот протокол были приобретены с Конфокальный микроскоп оснащен спиннинг диск). Из-за преимущества GECIs, описанных выше, использовать промежуток времени изображения с высоким разрешением (> 30 кадров в секунду, FPS) в сочетании с высокой мощности целей (60-100 x) приобрести фильмы динамических Ca^{2 +} сигналов в МУС.
Примечание: Чтобы уменьшить движение ткани, применить nicardipine (0,1-1 мкм) во время записи, как описано ранее³⁷^,^,³⁸³⁹^,⁴⁰^,⁴¹.
Отличить ICC-MY и ICC-DMP в тонкой кишке, используя их различных анатомических месте, морфология и базальной Ca^{2 +} деятельности шаблоны.
1. Найдите ICC-мой на уровне myenteric сплетения, между слоями круговой и продольных гладких мышц кишечника. Они являются звездчатой формы, образуя подключенной сети (рис. 3A). ЦОК (описанные выше) распространить через сеть ICC-мой с обычным явлением ~ 30 циклов в минуту.
2. И наоборот найти ICC-DMP в одной плоскости на уровне глубокой мышечной сплетения, между круговой гладкой мускулатуры и подслизистую сплетения. ICC-DMP не образуют сеть и шпинделя форме клетки (рисунок 2A), которые демонстрируют события не регулярное распространение и вместо этого огонь стохастические, локализованные внутриклеточного Ca^{2 +} транзиентов.
Независимо от приобретения программного обеспечения использовать сохраните фильмы как стек изображений TIFF.

3. анализ стохастических Ca^{2 +} сигналов в ICC-DMP с помощью пространственно временные сопоставления (STM)

Анализ в ICC-DMP с использованием пространственно временных сопоставление с сочетанием ImageJ (НИЗ, США, бесплатно скачать на http://imagej.nih.jov/ij) и пользовательские сделал программного обеспечения (Volumetry, версия G8d, GWH, открывающиеся на Mac OS, обратитесь к grant.hennig@ Хеннига Грант MED.uvm.edu относительно запросы для доступа к Volumetry и использования)
Примечание: Альтернативный подход к полностью проанализировать эти пространственно временной карты с ImageJ только также приводится в последующих разделах (начало в шаге 3.9).
Открыть Volumetry и использование правой кнопкой мыши щелчков для открытия папок, содержащих файлы фильмов. Щелкните левой кнопкой мыши на файл фильма, чтобы быть проанализированы, чтобы открыть его в Volumetry (должен быть в несжатый формат TIFF). После открытия, фильм будет содержаться внутри граничит с голубой окна (фильм) который будет охватывать большую площадь экрана справа. В левой части экрана будет содержать участок окно (верхняя 4/5ths) и окно следы (Нижняя 1/5^th).
Отрегулируйте размеры фильма, удерживая нажатой клавишу SHIFT и одновременно прокрутка вверх с помощью средней кнопки мыши (MMB, уменьшает размер) или прокрутки вниз с MMB (увеличивает размер). Начать или остановить воспроизведение, нажав «A»; скорость воспроизведения можно отрегулировать, нажав вверх и вниз клавиши со стрелками.
Для создания STM с помощью Volumetry, нарисуйте ROI за всю ячейку, удерживая нажатой клавишу SHIFT при нажатии и перетаскивании левой кнопкой мыши. Отрегулируйте ориентацию ROI, прокрутка с MMB на углах ROI. Когда ROI находится в месте над ячейкой для анализа (рисунок 2A), использование щелкает правой кнопкой в окне фильм для доступа к ' ROI STM-STMyAvg > xRow' и щелкните левой кнопкой мыши для создания STM клеточной активности в окне печати (есть также возможность выбрать ' STMxAvg > Одеского w «, который выбран будет зависеть ли ориентации клетки более выравнивается с x или ось y, например, ячейки выделены рисунок 2A больше ориентирован на оси y»).
Левый клик на STM в окне печати и нажмите «P» вычесть среднее фоновый шум и нажмите клавишу «H» для увеличения контрастности STM. Сохраните STM, щелкнув правой кнопкой мыши на нем для доступа к «STM нагрузки Save - сохранить STM как .tif» и затем левой кнопкой мыши, сохранить как TIFF.
Остальная часть анализа ICC-ПРСБ будет осуществляться в ImageJ. ImageJ состоит из двух основных компонентов, инструментов с фиксированной позицией на верхней части монитора и мобильных пользовательский интерфейс. С помощью ImageJ, откройте файл STM TIFF ICC-DMP Ca^{2 +} активности (файл-> открыть на панели инструментов для изображений J).
Открытые Volumetry создал STM, который будет иметь время вертикально ориентированные. ImageJ будет автоматически открывать файлы TIFF как RGB или 16-битные изображения. Для улучшения качества изображения, щелкните левой кнопкой мыши «Изображение» на панели инструментов ImageJ. Выделите первый вариант ' тип «выявить раскрывающегося меню различных форматов изображений, прокрутите ' 32-битный» и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы изменить.
Чтобы сделать STM читаемым против времени слева направо, щелкните левой кнопкой мыши на панели ImageJ по следующему пути: «Имидж-Transform-повернуть 90 градусов влево». Это также возможно для создания STMs на месте Ca^{2 +} активности с использованием linescans с ImageJ, только без Volumetry и это подробно излагается ниже.
Примечание: После того, как создаются STMs, они анализируются таким же образом, независимо от программного обеспечения был использован для их создания. Чтобы пропустить этот альтернативный метод для создания STM в ImageJ, перейдите к шагу 3.19.
Чтобы создать STM с ImageJ, откройте стек TIFF-файлы, которые составляют записи ICC-DMP Ca^{2 +} активности (файл-> открыть на панели инструментов ImageJ). ImageJ будет автоматически открывать файлы TIFF как RGB или 16-битные изображения. Для улучшения качества изображения, щелкните левой кнопкой мыши «Изображение» на панели инструментов ImageJ. Выделите первый вариант ' тип «выявить раскрывающегося меню различных форматов изображений, прокрутите ' 32-битный» и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы изменить.
Фоновый шум (в результате auto флуоресценции или камеры шум) теперь должны быть вычтены из фильма. Щелкните левой кнопкой мыши функцию «Прямоугольное выделение» в интерфейсе ImageJ и рисовать ROI (левой кнопкой мыши и перетаскивания нужного размера и формы) на фоне флуоресцирования фильма.
После выбора ROI, щелкните левой кнопкой мыши на «Analyze» в панели инструментов ImageJ, и затем щелкните левой кнопкой мыши «Гистограмма» из раскрывающегося меню. Всплывающее окно появится вопросительно о диапазона значений пикселов для вычисления; ImageJ имеет значения ROI предварительно так левой нажмите «OK».
После нажатия кнопки «OK», новый всплывающее окно, содержащее гистограммы появится показаны распределение значений для пикселей шум фон в ROI. Принять к сведению среднее значение перечисленных ниже гистограммы, а затем закройте всплывающее окно.
Нажмите кнопку назад для 32-разрядных фильм и выберите весь ПЗ кликнув левой кнопкой мыши «Edit» на панели ImageJ, прокрутка «Выбор» и левой кнопкой мыши на «Выбрать все» показал в раскрывающемся меню.
Левый клик «Процесс» на панели инструментов ImageJ, перейдите к «Математика» и нажмите левую кнопку «Вычесть» показал в раскрывающемся меню.
Всплывающее окно появится, когда значение быть вычитанным из ПЗ может быть вставлен. Введите среднее значение приобрел от гистограмму в шаге выше 3.12 и нажмите «OK». ImageJ затем будет просить, чтобы обработать все фреймы в стеке TIFF (и не только один кадр фильма в настоящее время). Нажмите кнопку «Да».
После нажатия кнопки «Да», фильм будет черным. Чтобы исправить это, левой кнопкой «Изображение» в панели инструментов ImageJ и прокрутки над «Настройки». Щелкните левой кнопкой мыши на показал первый вариант для «Яркость/контрастность» (B и C). Это принесет вверх всплывающее окно, где могут быть изменены различные аспекты яркости и контраста. Щелкните левой кнопкой мыши на параметр «Auto», один раз раскрыть повышение качества в фильме. Оставьте этот B & C поп окно открытым для использования в будущем.
Для создания linescan, сначала щелкните правой кнопкой мыши на выделение линии в интерфейсе ImageJ выявить варианты для различных линий; Щелкните левой кнопкой мыши на «Сегментирована линии», чтобы выбрать его из списка. С выбранным инструментом «Сегментированный линия» использование единого оставил щелкает нарисовать линию по середине оси отдельных ICC-DMP. Каждый один левый клик будет исправить строки в этот конкретный момент и линии можно затем свободно переместить дальше под любым углом. По завершении линии двойной левый клик исправить линии в месте.
Щелкните левой кнопкой мыши «Изображение» на панели инструментов ImageJ и прокрутки над «Стеки» и щелкните левой кнопкой мыши на параметр «Изменить». Появится всплывающее окно; Щелкните левой кнопкой мыши на параметр «повернуть на 90 градусов», это будет ориентировать linescan слева направо, так что он может быть откалиброван и читать против времени на оси x, с пространством на оси y. Нажмите кнопку «OK» для создания STM.
Интенсивность STM будет создаваться на серого с высокой интенсивностью Ca^{2 +} сигналов как различной степени белого цвета, с белым или светло серый в зависимости от их интенсивности. Как правило контраст созданный linescan будет необходимо усовершенствовать. Сделать это, нажав «Auto» на B & C поп окно.
Интенсивность флуоресценции linescan представлен на STM значений произвольных точек. Для точного измерения амплитуды Ca^{2 +} сигналы от STM, значения флуоресценции STM (F) теперь должны быть нормализованы. Используя функцию «Прямоугольное выделение» в интерфейсе ImageJ, нарисуйте ROI на площади STM, который отображает области наиболее равномерное и наименее интенсивных флуоресценции (F₀).
Повторите шаги, предпринятые в 3.11-3.12 получить среднее значение (F₀) интенсивности в пределах выбранного ROI, а затем выберите всю STM кликнув левой кнопкой мыши на «Edit-выбор-выбрать все» от ImageJ инструментов.
Щелкните левой кнопкой мыши «Процесс» на панели инструментов ImageJ и перейдите к «Математика»; левый клик «Разбить» из выявленных вариантов. В последующих всплывающее окно введите среднее значение (F₀), полученные из шага 3.21. После деления всего STM (₀F) почернеют STM; Исправьте это, нажав «Auto» на B & C всплывающее окно. Linescan теперь откалиброван для амплитуды, с интенсивностью флуоресценции, выраженные как F/F₀.
В настоящее время STM будет отображать количество кадров в стеке TIFF на оси x и количество пикселей, представляющее длину клетки на оси y. В целях количественной оценки временнóй и пространственной информации от Ca^{2 +} сигналов, калибровки STM для пространства и времени. Левый клик «Изображение» в панели инструментов ImageJ и нажмите левую кнопку «Свойства». Появится всплывающее окно. В этом окне введите соответствующие значения для полностью калибровки STM.
Для «Ширина» укажите продолжительность времени требуется, чтобы захватить один кадр в секундах. Для примеров, частотой 5 FPS введите значение 0,2, для 50 FPS, введите значение 0,02, для 33 FPS введите значение 0,033 и т.д. Для «Пикселей высота» введите сколько мкм каждый пиксель представляет (будет зависеть от цели используется и используется для приобретения камеры). «Voxel глубины» остается в 1 перед нажатием кнопки «OK». Никакие другие параметры должны быть скорректированы в пределах окна.
Примечание: После нажатия кнопки «OK», СТМ будет полностью калиброванные для амплитуды, пространства и времени. Амплитуда на СТМ будет выражаться как F/F_0,время на оси x будет выражаться в секундах и пространства на оси y будет выражаться в мкм (Рисунок 2Б). CA^{2 +} события на STM теперь готовы быть измерена, калиброванный STM также могут быть сохранены как единое изображение TIFF для анализа на более позднем этапе.
ImageJ имеет ряд построен в таблице подстановки цветом (ТМП), который может быть использован для цветовой код STM. Применить встроенный в LUT кликнув левой кнопкой мыши на панели инструментов ImageJ на пути «Image-поиска таблиц» и выбрать LUT для применения. Пользовательские сделал ТМП можно также импортировать STM, левой кнопкой мыши на панели инструментов ImageJ на пути «Файл-импорт-LUT» и затем выбрав LUT для импорта. К примеру STM, показано на рисунке 2 c имеет пользовательские LUT «QUBPallete» (Квинс университета Белфаст, Великобритания) применяется к нему, чтобы код теплые цвета (красный, оранжевый) как районы интенсивной Ca^{2 +} флуоресценции и холодные цвета (черный, синий) в области низких Ca^{2 +}флуоресценции.
Чтобы вставить амплитуды калибровочных бар чтобы указать диапазон амплитуд, представлены различные цвета, левый клик «Analyze» из панели инструментов ImageJ, выделите «Инструменты» и выявленных меню выберите «Калибровка Bar». Параметры приведены для размер, масштаб, диапазона и позиции на STM для калибровки бара; настроить эти параметры и нажмите кнопку «OK». Обратите внимание, что при вставке калибровочных бар, ImageJ создает новый STM, содержащие его, оставив исходную версию без калибровочных бар нетронутыми и отдельный.
Примечание: Если поле «Наложение» отмечена при вставке калибровочных бар, не создается новый STM.
Чтобы начать анализ отдельных Ca^{2 +} события, щелкните левой кнопкой мыши на селекторе «Прямой линии» в интерфейсе ImageJ. Первоначально левой кнопкой мыши на STM, нарисуйте прямую горизонтальную линию через центр Ca^{2 +} события параллельно оси x (в отношении времени). Полная линия кликнув левой кнопкой мыши во второй раз (Рисунок 2D).
Нажмите кнопку «Анализировать» на панели инструментов ImageJ и щелкните левой кнопкой мыши на «Участок профиля». Новое поле появится с профилем участка Ca^{2 +} события (Рисунок 2E).
Примечание: Параметр «Список» в этом поле будет генерировать список значений XY сгенерированный сюжет, который можно скопировать в программу электронных таблиц для создания трассировок, если того пожелают.
Для измерения амплитуды Ca^{2 +} события, представленные в участок профиля, щелкните левой кнопкой мыши на селекторе «Прямой линии» в интерфейсе ImageJ. Затем нарисуйте вертикальную линию от базовой участок профиля на пик Ca^{2 +} события; Длина линии (показано на интерфейсе ImageJ) будет представлять амплитуда события, выраженный в виде ΔF/Ф₀ (Рисунок 2E).
С помощью приобретенных амплитудное значение, продолжительность Ca^{2 +} мероприятия может быть измерен Рисование прямой линии по всей ширине события точке 50% максимальной амплитудой (полный срок на половину максимальной амплитуды, FDHM) или полной продолжительности события может быть измерена при желании (Рисунок 2E).
Примечание: Экспериментаторы будет необходимо разработать конкретный критерий для Бинаризация действительный Ca^{2 +} события в этих записей. В наших экспериментах, Ca^{2 +} события были обозначены как будучи действительны для анализа, если его амплитуда > 15% максимальной амплитуды события в Секции управления записи. Однако эти пороговые значения будет зависеть от конкретных тканей и клеток под изучить и только произвольным руководящие принципы, которые требуют конкретных оптимизации для каждого типа ткани и клетки.
По прямой линии вдоль (рубильный) станок или надувки Ca^{2 +} событий участок профиля, темпы роста или падения может быть рассчитано соответственно. После того, как рисуется линия, курсор мыши может перемещаться до точки, где строка начинается и где заканчивается. Когда курсор находится в неподвижном состоянии через эти точки, x, y координаты для этот местоположение будет отображаться в нижней левой части интерфейса ImageJ. Таким образом, приобретая x, значений y, для которых начинается линии (x₁, y₁) и заканчивается (x₂, y₂), темпы роста или падения (ΔF/s) может быть рассчитана как наклон линии,₂y - y₁ / x₂- x₁ (Рисунок 2F ).
Для того чтобы вычислить распространением или пространственного распространения Ca^{2 +} события, щелкните левой кнопкой мыши на селекторе «Прямой линии» в интерфейсе ImageJ. Затем нарисуйте прямо вертикальную линию по длине Ca^{2 +} события вдоль оси y. Длина линии (показано на интерфейсе ImageJ) будет представлять пространственного распространения событий, выраженный в виде мкм (рис. 2 g).
Определение скорости распространения событий Ca^{2 +} Рисование линии вдоль распространение фронта события и расчета наклон линии. Это может осуществляться вручную аналогичным образом описано в шаге 3.32, путем определения x, значений y, для которых начинается линии (x₁, y₁) и заканчивается (x₂, y₂); Эти значения будут отображаться в нижней левой части интерфейса ImageJ когда курсор мыши находится на STM.
По коллекции нужные параметры для Ca^{2 +} событий количественной оценки бассейн среднего эти значения для создания средних значений для каждого параметра на основе за клеток; Кроме того место все необработанные значения в гистограмму распределения, чтобы показать их диапазон (Рисунок 2 H).

4. Количественная оценка ЦОК в ICC-мой с помощью частиц на основе анализа

Прежде чем анализировать фильмов в Volumetry с PTCLs, пространственных и временных калибровки фильма нужно будет вставляться в имя файла. Редактировать все файлы, которые будут проанализированы в Volumetry содержат в названии количество секунд, которые каждый кадр равен, а также количество микрон, которые каждый пиксель равен отделены одной тире, с ценностями, заключенная в квадратные скобки. Например, фильм, приобретенных на 33 FPS с целью 60 x (512 x 512) должны иметь [0.22-0.033] вставляется имя его файла.
Открыть Volumetry и использование правой кнопкой мыши щелчков для открытия папок, содержащих файлы фильмов. Щелкните левой кнопкой мыши на файл фильма, чтобы быть проанализированы, чтобы открыть его в Volumetry (рис. 3A, должен быть в несжатый формат TIFF).
Для того, чтобы точно рассчитать Ca^{2 +} сигналы от всего ПЗ, фильм будет сначала проходят дифференциации и сглаживания для удаления фона помех (шум камеры, auto флуоресценции и т.д.) и увеличить соотношение сигнал-шум. В окне фильма, щелкните правой кнопкой мыши, чтобы вывести меню и с помощью правой кликов доступа ' СТК фильтр-дифференцировать ', щелкните правой кнопкой мыши снова, чтобы входное значение для дифференциации, нажмите клавишу ENTER и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы применить (за фильмы приобретенных на 33 FPS значение 2 (∆t = ± 66-70 мс) работает хорошо, значение увеличивается как коэффициент увеличения изображения захвата).
Примечание: Дифференциация в этом контексте будет уменьшить интенсивность областей записи (пикселей), которые показывают не динамической активности за количество кадров указанного. Таким образом Если вставляется значение '2', каждый пиксель в каждом кадре запись анализируется, и если в течение этого периода не динамические изменения в кадр флуоресценции 1 пиксель до и 1 кадр после, интенсивность этих точек будет вычитаться из записи. Таким образом удаляется нединамическое фоновый шум и сигнал/шум увеличивается.
Гладкие дифференцированной кино, применив фильтр Гаусса. Щелкните правой кнопкой мыши в окне фильма, чтобы принести вверх меню и с помощью правой кликов доступа «СТК фильтр-Гаусс KRNL», щелкните правой кнопкой мыши снова вставить значение (всегда использовать нечетное число, для фильмов, приобретенных на 33 FPS, значение 5 работает хорошо, 1,5 x 1,5 мкм StdDev 1.0) входное значение, нажмите клавишу ENTER и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы применить (рис. 3B).
Начните создавать PTCLs, сначала выбрав период фильм, который включает в себя период покоя (20 – 40 кадров), следуют появление КТК и также 20 – 40 кадров после КТК. Для этого, прокрутите фильм с помощью MMB для прокрутки слева направо на желтой панели.
С выбор использование щелкает правой кнопкой в окне фильм для доступа к «STK Ops – рамп DS PTCLinfo» и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы применить. Эта функция выполняет процедуру анализа PTCL, который постепенно рампы порог от максимальной интенсивности до минимальной интенсивности. Это будет отображаться графически в окне сюжет как участок шума, а также в окне трассировки, как три цветные следы, зеленый след, отображающие количество PTCLs, красный след, показываю средний размер PTCL, и синий след, показаны абсолютной интенсивности порог.
Примечание: Число и средний размер PTCLs в каждый порог вычисляется автоматически и затем полу ручной порог применяется с помощью интенсивность с которой в котором средний размер PTCLs начинает падать, который происходит в точке перегиба красный след в Окно трассировки (рис. 3D, т.е. Ввиду большого числа пространственно ограниченных шума PTCLs, уменьшение среднего размера PTCLs).
В окне печати нажмите клавишу «H» гистограммы баланс сюжет показано PTCL шума. Переключение цветовых схем, нажав ' [' до тех пор, пока фон является цветной белый с цветные следы на вершине.
Нажмите «F» воспитывать измерительного инструмента и щелкните левой кнопкой мыши на участке, на пересечении которых цветные участки переход с правой стороны. Это будет означать одну вертикальную линию в полосе прокрутки окна следы ниже.
В окне трассировки прокрутите MMB слева направо от точки перегиба красный след заметное Белая вертикальная линия создана в шаге 4.10 и убедившись, что щелкнув правой кнопкой мыши на нем, выбран синий след читал от «yAVG», который будет отображаться в t он ниже левой стороны окна трассировки. Отмените выделение, нажав один раз MMB внутри окна трассировки.
В окне фильма, нажмите «C», чтобы воспитывать колесо цвета, затем нажмите 'D ' настроить порог. Допустимое PTCLs будут отображаться как красный в окне фильма (рис. 3 c) и те, которые насыщают будет белым. Снимите белые области прокрутки вверх с левой кнопкой мыши.
Прокрутка вверх или вниз с MMB регулировать желтый числовое значение в цветовом круге, настроить это значение к значению yAVG, взяты из шага 4.11. Это будет назначать все в красном как активного Ca^{2 +} переходных PTCL в точке установленного порогового показателя. Сохранить как файл координат на основе частиц, использовать право щелкает доступ ' STK 3D-сохранить PTCLS 0' и затем слева нажмите, чтобы сохранить файл.
Закройте Volumetry и вновь открыть. Откройте файл PTCL (.gpf-файл), созданный в шаге 4.13. В этом типе файла все активные Ca^{2 +} переходные процессы сохраняются как равномерное синий PTCL (Рисунок 3E). Поскольку каждый PTCL отдельные сущности с собственным ID, площадь и периметр координаты, государственных флагов (см. ниже) и результат массивы, рационализированы анализ пространственно временных характеристик PTCLs, или между PTCLs.
Чтобы начать анализ PTCLs, удалите любые оставшиеся PTCL шума (малые недействительным PTCLs создается файл .gpf создается), используя право кликов в окне фильм для доступа к ' PTCL STKOPS-флаг ptcls > Min = 70' и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы применить. Это действие будет флаг PTCLs более 6 мкм² (~ диаметр > 2 мкм) и Volumetry будет назначать их «флаг 1' выбор. После завершения этой, PTCLs, которые находятся выше данного порога (флаг 1) будет отображаться как светло фиолетовый цвет в окне фильма, в то время как любой PTCLs ниже порога будет оставаться их базовый синий цвет (Рисунок 3F).
Создание представлений тепла карта PTCL активности с помощью правой кликов в окне фильм для доступа к ' PTCL STKops-StatMap флаг ='. Щелкнув правой кнопкой мыши на этот последний путь, назначение флаг для анализа могут быть введены. Таким образом Если желающих количественно PTCLs, присвоенный Флаг1, просто введите '1', нажмите ENTER и затем щелкните левой кнопкой мыши чтобы применить. Это будет генерировать тепло карта, показывающая общий PTCLs для всей длины записи, с различными цветами, представляющие вхождения (%) во время записи (Рисунок 3 g, теплые цвета показывают увеличение вхождения в этом месте).
Сохраните тепло карты, щелкнув правой кнопкой мыши на них для доступа к «STM нагрузки Save - сохранить STM как .tif» и затем левой кнопкой мыши, сохранить как TIFF.
Количественно PTCL активности с помощью правой кликов в окне фильм для доступа к ' PTCL STK мера-PTCLStats =', щелкнув правой кнопкой мыши на этом заключительном пути, могут быть введены назначение флаг для анализа. Таким образом Если желающих количественно PTCLs, присвоенный Флаг1, просто введите '1', нажмите ENTER и затем щелкните левой кнопкой мыши чтобы применить. Это будет генерировать серию трассировок в окне трассировки.
Volumetry по умолчанию будет накладывать PTCL трассировки, созданные в шаге 4.17 поверх друг друга. Разделите их с помощью щелкает правой кнопкой в окне трассировки для доступа к «Выравнивание-отдельные трассировки» и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы применить. Это позволит выявить четыре различных PTCL следы, которые количественно Ca^{2 +} PTCL деятельность в фильме показаны PTCL области (зеленый), PTCL count (красный), PTCL размер (голубой) и PTCL размер стандартного отклонения (синий) заговор против времени (рис. 3 H).
Эти следы могут быть сохранены в текстовом файле, который может быть импортирован в программу электронных таблиц для дальнейшего анализа. Чтобы сохранить следы, удерживая нажатой клавишу SHIFT и используйте щелкает правой кнопкой в окне трассировки для доступа к «Ассорти-дамп ROI как текст» и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы сохранить файл. Эта информация затем собирается и иллюстрации в гистограммы или другие соответствующие графические материалы (рис. 3 H).
Для того, чтобы взглянуть на возникновения PTCLs (т.е., чтобы взглянуть на обжиг сайтов), эти первоначальные PTCLs получают назначение другой флаг. Лучше изолировать, выпустив сайты происходящих в сети, только те PTCLs, не пересекающиеся с любой частицы в предыдущий кадр но и перекрытия с частицами в следующем 70 мс считаются стрельбы сайтов.
Чтобы применить этот порог, использование щелкает правой кнопкой в окне фильм для доступа к ' PTCL поведение-F1 InitSites > F = 3' и слева нажмите, чтобы применить. Это будет назначать инициирования PTCLs как «флаг 3', и PTCLs, которые отвечают этим критериям теперь будет отображаться как известь зеленый цвет в фильме (рис. 4A).
Volumetry также предоставляет возможность количественной оценки и участок PTCL стрельбы сайтов в данной ПЗ, а также построения вероятность их стрельбы во время КТК. Чтобы проанализировать эти параметры, создайте тепловую карту возбуждения PTCLs (флаг 3), как описано в шаге 4.16 (рис. 4B).
Щелкните левой кнопкой мыши в окне Печать и затем нажмите «C» воспитывать колесо цвета и нажмите 'D ' порога. Карта жары начала PTCLs будет затем повернуть серый и белый. Удалить все белые путем прокрутки вверх с левой кнопкой мыши и порог PTCLs в тепловой карте, так что только действительный PTCLs покрыты серым (настроить порог, прокрутка вверх и вниз с MMB).
Использовать право щелкает на тепловой карте в окне печати для доступа к «STM PTCLs-найти PTCLs 70' и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы применить. Это будет назначать все серые PTCLs на карте, которые больше, чем 70 пикселей² размер выделяемого как отдельным цветом Инициация PTCL или PTCL стрельбы сайта (рис. 4 c).
Участок деятельности каждого из этих сайтов огонь против времени, щелкнув правой кнопкой на PTCL стрельбы карта и доступ к «PTCL PTCLs-создание STM rois» и левой кнопкой мыши для применения. Это будет создавать новое изображение в окне фильм с все отдельные цветные PTCL, выпустив сайты отображаются с Руа вокруг них.
Использование щелкает правой кнопкой в окне фильм для доступа к ' PTCL мера-PTCLpixROIBM > = 1' и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы применить. Это будет определять все ROIs в окне фильма, которые содержат по крайней мере один PTCL и будет участок всю деятельность в рамках этих ROIs в окне трассировки. По умолчанию эти следы будут наложены друг на друга. Чтобы разделить их, используйте щелкает правой кнопкой в окне трассировки для доступа к «Выравнивание-отдельные трассировки» и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы применить. Чтобы сохранить следы, удерживая нажатой клавишу SHIFT и используйте щелкает правой кнопкой в окне трассировки для доступа к «Ассорти-дамп ROI как текст» и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы сохранить файл.
Деятельность каждого обжига сайта также могут быть отображены как возникновение карта. Чтобы сделать это, используйте щелкает правой кнопкой в окне фильм для доступа к ' PTCL мера ROI Pianola = 10' и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы применить. Это будет генерировать участок всех сайтов огонь против времени в окне печати. Каждый сайт стрельбы будет отображаться как отдельно цветные сущности, каждый в свой «Майна» и эти участки соответствуют Ca^{2 +} PTCLs начала в ЦОК (Рисунок 4 dE) сохранить эти вхождения карты, щелкнув правой кнопкой мыши на них для доступа к ' STM Нагрузки Save - сохранить STM как .tif ' и затем левой кнопкой мыши, сохранить как TIFF.
Для количественной оценки вероятности стрельбы на каждом сайте стрельбы во время КТК, использование щелкает правой кнопкой в окне фильм для доступа к ' PTCL поведение-Марк является = 1' и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы применить. Это определит все кадры в фильме, которые содержат PTCLs выше порога, и они будут помечены как Вертикальные синие линии в нижней части окна.
ЦОК проявляются как быстрой кластеризации асинхронных стрельбы из нескольких сайтов стрельбы в ПЗ с ~ 1 s пробелов между каждого цикла КТК. Эта регулярность и долго разрыв не активных PTCLs между CTCs используется для дальнейшего определения КТК для анализа.
Использование щелкает правой кнопкой в окне фильм для доступа к ' PTCL поведение-блок является разрыв < =' и использовать правый клик на конечной точки ввести число. Эта команда будет Группировать активные кадры PTCL, идентифицированную на шаге 4.28 в блоки и блоки основаны на количество кадров, которые отделяют активных PTCLs. Например, для записи 33 FPS значение 10 работает хорошо. Если активные PTCLS менее чем 10 кадров врозь (330 мс) они сгруппированы в один блок для анализа (блоки затем отображаются в виде розовых прямоугольников над Вертикальные синие линии в нижней части окна фильма с каждым розовый прямоугольник, теперь указанием КТК).
Использование щелкает правой кнопкой в окне фильм для доступа к «PTCL мера-PTCL событий Prob». Это создаст текстовый файл, который может быть импортирован в программу электронных таблиц. Этот текстовый файл будет оказывать огромное количество данных о характере инициации сайтов, которые были определены шаги 4.16-4.23 и их вклада в ЦОК.
Примечание: Текстовый файл будет показывать количество сайтов посвящения (упоминаемые как «домены»), размер сайта в пикселах и мкм², вероятность каждого сайта инициации, выпустив либо один раз или несколько раз во время каждого КТК (задается как %), средняя продолжительность и размер PTCLs, происходящих в начало сайта, количество циклов КТК (как определено в шаг 4.23) и процент стрельбы сайтов, которые выпустили во время каждого цикла КТК. Эта информация собирается и иллюстрации в гистограммы или другие соответствующие графические материалы (Рисунок 4F).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

С помощью мыши Kit-Cre-GCaMP6F (рис. 1), динамические Ca^{2 +} сигнализации что поведение ICC в желудочно-кишечном тракте может отражаться на месте. С помощью конфокальной микроскопии изображения с высоким разрешением конкретных популяций МУС могут быть приобретены без загрязнения сигналы от других популяций МТП в рамках же ткани, но в анатомически различных плоскостях фокус (рисунок 2A)³⁷ ^, ³⁹ ^, ⁴⁰ ^, ⁴¹. это можно записать краткие (< 100 мс), локализованные Ca^{2 +} события, которые не были возможны с мембраной проницаемых Ca^{2 +} показателями. Пространственно временные сопоставления с Volumetry или ImageJ программное обеспечение может использоваться для создания STMs всех Ca^{2 +} событий внутри клетки на месте. Используя этот подход, Ca^{2 +} события всей ПЗ могут быть визуализированы и сопоставлены (Рисунок 2БC), а не просто запись ограниченной деятельности единого ROI. Эти методы могут быть расширены для каждой ячейки в пределах данного ПЗ, обеспечение сбора репрезентативных данных от всех клеток и обеспечивая количественную информацию об относительной амплитуды, временной длительности, скорость подъема и падения транзиентов, и т.д. (Рисунок 2E , F). STM анализ, в отличие от участков на основе ROI интенсивности, также обеспечивают возможности для наблюдения и записи пространственных характеристик Ca^{2 +} сигнализации, такие как пространственного распространения и скорости распространения, как показано на рисунке 2 g. Эта информация может быть накопил обеспечить достаточно полное представление о Ca^{2 +} сигнализации поведения в клетках в их родной среде (Рисунок 2 H).

PTCL анализ может использоваться для количественного определения более сложных Ca^{2 +} сигнализации поведения, такие как те, происходящих в взаимосвязанные сотовых сетей. Пример этого приложения осуществляется анализ ICC-мой (рис. 3A). Обычно в таких комплексных препаратов, фоновый шум и сигнал-шум может быть проблемой. Однако с использованием программного обеспечения Volumetry применять дифференцированный и сглаживания фильтры на фильмы Ca^{2 +} деятельности и последующего применения протоколов порог шума для фильтрации фонового шума шума (рисунок 3B-D) могут быть удалены от комплекса записи динамического действия. С помощью анализа PTCL например, показанным на рисунке 3E-G, количественная информация о Ca^{2 +} сигнализация может быть рассчитана путем измерения PTCL области, PTCL количество и размер PTCL, обозначающие пространственные диапазонов активации Ca^{2 +} сигналы в ПЗ. Эти данные можно скомпилировать как показано на рисунке 3 H и проанализированы статистически, при необходимости. Рисунок 4 иллюстрирует, как PTCL анализ позволяет в количественной оценки глубины субклеточном Ca^{2 +} сигнализации, изучая расположение и стрельбы вероятностей Ca^{2 +} обжиг сайтов. Путем выделения PTCLs в различные флаги, основанный на их временных характеристик, инициирование PTCLs можно точно сопоставить как показано на рисунке 4 c-E и обилие жестких данных, полученных на количество сайтов посвящения (упоминаемый как ' домены), размер сайта в пикселах и мкм², вероятность каждого посвящения сайта, выпустив либо один раз или несколько раз во время каждого КТК (задается как %), средняя продолжительность и размер PTCLs, происходящих на сайте посвящения, количество КТК циклов (как определенные в шаге 4.23) и % участков стрельбы, которые выпустили во время каждого цикла КТК. Эти методы позволяют высокий уровень интеллектуального анализа данных и количественной оценки на месте Ca^{2 +} сигналов в пределах нетронутыми сотовой сети которые не возможны с ROI на основе анализа.

Рисунок 1: поколение мышей KitGCaMP6f. Схема как Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f мышей) были скрещены с c комплект^{+/ Cre-ERT2} (комплект-Cre мышей) для создания мышей Kit-Cre-GCaMP6f. Эти мыши вводят тамоксифен в возрасте 6-8 недель, чтобы побудить Cre рекомбиназа и последующие выражения GCaMP6f исключительно в МУС. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: Анализ стохастических Ca^{2 +} сигналов в ICC-DMP с помощью пространственно временные сопоставления (СТМ). (A) представитель изображение нескольких ICC-DMP из тонкой кишки Kit-Cre-GCaMP6F мыши на месте. Зеленый ROI указывает размер и ориентацию ROI нарисовать вокруг одного ICC-DMP в ПЗ для создания STM в Volumetry. (B) STM Ca^{2 +} деятельность ICC-DMP выделены группы A после того, как его правильно откалиброван для амплитуды, пространства и времени. (C) же STM, отображаемые в панели B после него был цветом с таблицей подстановки (QUBPallete). (D) Расширенное изображение ICC-DMP Ca^{2 +} транзиентов отображается на цвет кодированная STM, указывающее, где нарисовать линию через Ca^{2 +} событий через его время (x) оси для создания участка профиля своей деятельности в ImageJ. (E) участок профиля Ca^{2 +} события выделены в панель D, указывающее, где линии показано быть обращено точно измерить амплитуда и продолжительность мероприятия. (F) участок профиля Ca^{2 +} события выделены в панель D, указывающее, где линии показано быть обращено точно измерить скорость подъема и скорость падения события. (G) Расширенное изображение ICC-DMP Ca^{2 +} транзиентов отображается на цвет кодированная STM, указывающее, где нарисовать линию через Ca^{2 +} событий через ее пространства (y) оси, чтобы точно измерить его пространственного распространения. (H) представитель гистограммы объединения данных из ICC-DMP иллюстрирующие как графически отображать амплитуды, продолжительность и пространственного распространения ценностей, полученных от описанных выше. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: количественная оценка ЦОК в ICC-MY с помощью элементарных частиц на основе анализа. (A) представитель изображение ICC-моя сеть из тонкой кишки Kit-Cre-GCaMP6F мыши на месте. (B) изображение взято из записи, отображаемые в панели A после того, как она претерпела дифференциальный фильтр Δt = ±66 – 70 мс и фильтр Гаусса 1,5 x 1,5 мкм, StdDev 1.0. (C) изображение взято из видео в B, после того, как порог был завершен с PTCLs выше порога, показаны красным цветом. (D) следы PTCL рассчитывать и означает размер PTCL Бинаризация протокола для устранения шума в фильме показан в панели PTCLs б. были созданы с помощью заливки алгоритма, который отмечен в структуре всех смежных пикселов, которые интенсивности выше порога, Ca ^{2 +} переходных PTCLs были больше чем шум PTCLs. Порог на котором большое количество малых размеров шум PTCLs появились и начали сократить средний размер PTCLs может использоваться как общий порог для всех записей. (E) представитель изображение из на основе координат Ca^{2 +} PTCL файла создано от показатели записи в C. (F) представитель изображение взято из файла PTCL E после критериям отбора > 6 мкм² (диаметр ~ 2 мкм или меньше) был применен; PTCLs выше этого предела, помечаются как светло фиолетовый частицы (флаг 1) и считается действительным PTCLs. (G) тепла карта, показывающая общий PTCLs (флаг 1) для всей записи видео показано в группе F, с общей PTCLs, выбытие с цветами представляющих появление во время записи (теплые цвета показывают увеличение вхождения в этом месте). (H) представитель следы PTCL области (синий) и PTCL count (красный), полученных от PTCL файла, созданного в группы A-G. Представитель гистограммы объединения данных из нескольких экспериментов показано ниже следы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Анализ Ca^{2 +} обжиг сайтов в ICC-MY с помощью элементарных частиц на основе анализа. (A) представитель изображение взято из PTCL файла Рисунок 3E , после того, как флаг 1 PTCLS далее уточняются в 3 флаг, флаг статуса для Ca^{2 +} обжиг сайтов. Флаг 3 PTCLs отображаются как зеленый лайм (только те PTCLs, не пересекающиеся с любой частицы в предыдущий кадр но и перекрытия с частицами в следующем 70 мс были рассмотрены сайтов обжиг). (B) тепла карта, показывающая общий PTCLs (флаг 3) для всей записи видео, отображаемые в панели A, с общей PTCLs, суммируется с цветами, представляющие вхождения во время записи (теплые цвета показывают увеличение вхождения в этом месте). (C) представитель карта Ca^{2 +} обжиг сайты, отображаемые в панели, B, с каждым сайтом различных стрельбы выделены различные определения цвета. (D) представитель следы PTCL области (синий) и PTCL граф (красный), полученных от PTCL файла, созданного в рисунке 3A-G. (E) возникновение Карта деятельности отдельных стрельбы сайтов. Каждый сайт стрельбы в FOV отображается как цветной блок в свой «Майна» против времени. (F) представитель гистограммы объединения данных из нескольких экспериментов приводятся иллюстрирующие значения накопления для Ca^{2 +} обжиг сайт стрельбы вероятность / КТК и количество Ca^{2 +} стрельбы сайтов в ПЗ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CA^{2 +} изображений конкретных типов клеток в пределах нетронутыми тканей или сети клеток часто показывает сложные узоры Ca^{2 +} транзиентов. Эта деятельность требует тщательного и углубленного анализа и количественной оценки, чтобы захватить столько информации об основных событиях и кинетики этих событий как можно. STM и PTCL анализа дают возможность увеличить количество количественных данных, принесли из записей данного типа.

Узкие, шпиндель форме морфология ICC-DMP сделать их хорошо подходит для анализа STM, производный от STM, изложенных выше. Однако этот анализ не хорошо подходит к ICC-мой, звездчатой формы и подключены в сеть (рис. 3A). Кроме того Ca^{2 +} сигнализации шаблоны в ICC-мой являются более сложными, проявляется как распространение CTCs от множественных мест происхождения на протяжении ICC-моя сеть. Таким образом для того чтобы измерить активность, происходящих во всей сети ICC-мой в ПЗ, анализ частиц (PTCL) был реализован с помощью программного обеспечения на заказ сделал (Volumetry, версия G8d, GWH, открывающиеся на Mac OS, обратитесь к grant.hennig@med.uvm.edu Хеннига Грант что касается запросов для Volumetry доступа и использования).

STM анализ позволяет все Ca^{2 +} события в пределах одной клетки и все клетки в ПЗ критически анализировать в различных пространственных и временных параметров. Протокол, в описанный иллюстрирует, как эти методы могут применяться к ICC-DMP мыши тонкой кишки. От полностью количественной Ca^{2 +} сигнализации в ICC-DMP, как показано на рисунке 2B-G, Ca^{2 +} сигнализации что модели характеризовались в деталях³⁷. Эти анализы были применены к записи, где ICC-DMP проходят вмешательства мелко количественно оценить последствия блокирования или стимулирования Ca^{2 +} релиз / Ca^{2 +} приток / синапсах пути³⁷^,³⁹ ^, ⁴⁰ ^, ⁴¹. Эти методы могут применяться легко с другими препаратами неповрежденной ткани. Например для выявления новых путей механистический участвующих в поколение внутриклеточных Ca^{2 +} волн, записанная в уретры гладких мышц в situ⁵⁷использовались STM анализ как описано здесь.

Подготовка STM в Volumetry требует определенную осторожность, поскольку функции в Volumetry, который создает STM из Рисованные ROI (рисунок 2A) является среднее значение интенсивности. Таким образом амплитуда Ca^{2 +} сигналов потенциально быть разбавлен если ROI рисуется более широкие или более чем Ca^{2 +} события или клетки интереса. Таким образом пользователи должны быть осторожны рисовать трансформирования, которые являются как плотно установку как можно ближе к Ca^{2 +} сигналов или конкретной ячейки, что они анализируются в целях устранения этой проблемы. Аналогичным образом создавая STMS, используя один пиксель linescans в ImageJ означает, что точное картирование Ca^{2 +} событий при условии близости Ca^{2 +} сигнал нарисованные линии. Такие опасения являются незначительными в тонкой форме клетки, такие как ICC-DMP шпинделя, однако другие клетки типы с более севрюга или круглые морфология может сделать этот тип анализа нецелесообразно точно сопоставить все Ca^{2 +} сигналы. При подготовке STM для анализа, независимо от того, ли они были сделаны в Volumetry или с ImageJ linescans, существует несколько областей следует выделить для устранения неполадок. Важно изменить качество изображения до 32-разрядной до выполнения калибровки на STMs. Неспособность сделать это, или делать это после калибровки для F/F₀ может привести к несовместимым измерений через экспериментов. Всегда проверяйте качество изображения STM, который указывается в верхней области белые границы сама когда открыт с ImageJ STM. Другой потенциальной области несоответствия является выбор значения₀ F при калибровке для амплитуды. Важно, что для выбора региона для F₀, что она занимает площадь ячейки, единообразных и в фокусе. По этой причине области ячейки имеют нестабильные базальной флуоресценции или изменить из-за движения или других предметов не идеальны и строгий движение стабилизации протоколы должны применяться в таких случаях.

В рамках подготовки на местах или искусственного содержащих взаимосвязанные сотовых сетей, такие как ICC-мой в малые кишечника, PTCL анализ обеспечивает обтекаемый технику для количественного определения сложных, субцеллюлярные Ca^{2 +} события, происходящие в сети. Кроме того она также позволяет всем Ca^{2 +} события в сети в пределах данного ПЗ для анализа, а не с помощью произвольных трансформирования, который только представить информацию о частотности и интенсивности в пределах ROI. Преимуществом PTCL анализа, описанный здесь является, что, применяя дифференцированный и Гаусса сглаживания фильтры записи, большое количество шума могут быть удалены из фильмов, которые могут содержать загрязняясь свет от клеток не интерес или из-за не динамическая яркие пятна или включений. Важно отметить, что количество дифференциации применительно к записи будет во многом зависеть Частота измерения, используемые экспериментатора. Дифференцируя фильмы, как описано в протоколе предоставляет средства применения фильтра к фильму для удаления шума высокой частоты из записей. При приобретении в 33FPS хорошо работает, чтобы удалить фоновый шум при сохранении хорошего сигнала к шуму (если значение слишком низкое, шум будет подобран, но сигнала к шуму будут подорваны, если значение является слишком высоким), применение дифференциация значение '2'. Дифференциация значение, применяемое должна быть увеличена с скорость приобретения, например на 100 FPS, дифференциация значение '7' дает примерно тот же сигнал шум как значение '2' 33FPS запись. Экспериментаторы будет необходимо оптимизировать эти параметры соответственно для их подготовки и записи условий.

Протокол бинаризация, описанный в рисунке 3D позволяет последовательно Бинаризация процедура применяться к другой записи, сделанные на разных системах с разными приобретение программного обеспечения. Эта гибкость позволяет получать данные из нескольких следователей, работающих на различных систем для компиляции их записи в том же наборы данных. С помощью системы флаг в Volumetry, PTCL анализ позволяет визуализации и количественная оценка отдельных Ca^{2 +} обжиг сайтов в сети в деталях. Информация может быть собрана на количество сайтов посвящения, размер сайта в пикселах и²мкм и средняя продолжительность PTCLs, происходящих на этом сайте. Этот анализ PTCL позволили первая характеристика деятельности КТК в тонком кишечнике на субклеточном уровне, и, используя различные флаги в Volumetry, PTCLs на обоих сети и отдельных стрельбы сайта уровне были количественно оценены в неповрежденной ткани препараты из мышей Kit-Cre-GCaMP3³⁸. Из этих первоначальных замечаний, этот анализ дальнейших использовались для изучения Роман Ca^{2 +} приток пути в GI ICC-мой например магазина эксплуатация Ca^{2 +}-вход⁴² и роль митохондриальной Ca^{2 +} сигнализации на задающий GI ⁴¹. гораздо как STM анализ описанных выше, PTCL анализ может быть легко адаптирована для различных нетронутыми препаратов, которые не описаны в настоящем Протоколе. Например недавние исследования используются PTCL анализ для изучения Роман художественной Ca^{2 +} события, происходящие в нетронутыми сотовых сетях lamina propria крыса мочевого пузыря⁵⁸^,⁵⁹ и таким образом могут легко применяться к другие сложные, нетронутыми клеточных систем таких нейронных систем. Хотя этот документ посвящен Ca^{2 +} изображений в неповрежденной ткани с GECIs, эти методы анализа также может выполняться на изолированных клеток и тканей, загружен с традиционными Ca^{2 +} индикатор красители. STM на основе анализа был использован для успешно определить локализованные Ca^{2 +} сигналов и Ca^{2 +} волн от шпинделя форме интерстициальных клеток и гладкомышечные клетки из различных препаратов¹¹^,⁶⁰ ^, ⁶¹ ^, ⁶² ^, ⁶³. Кроме того, описанные здесь процедуры анализа PTCL применялись также к подготовке на местах сети визуализированы с Cal 520⁵⁸^,⁵⁹. Однако эти исследования также сохранять недостатки такого окрашивания загрузки протоколы, такие как идентификации неоднозначной клетки и проблемы с сигнала к шуму.

В приведенный выше примерах STM и PTCL анализа являются весьма податливый методы, которые могут использоваться для количественного определения комплекс Ca^{2 +} сигнализации в широкий спектр препаратов неповрежденной ткани. Подходы предлагают много преимуществ над традиционными ROI на основе интенсивности участки, которые ранее обычно использовались и должен предоставлять следователей с более ценным количественную информацию о Ca^{2 +} сигнализация не может быть достигнута ранее.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Финансирование было предоставлено NIDDK, через P01 DK41315.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageJ software	NIH	1.5a	ImageJ software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit^+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Wellman, G. C., Nelson, M. T. Signaling between SR and plasmalemma in smooth muscle: Sparks and the activation of Ca2+-sensitive ion channels. Cell Calcium. 34 (3), 211-229 (2003).
Mironneau, J., Arnaudeau, S., Macrez-Lepretre, N., Boittin, F. X. Ca2+sparks and Ca2+waves activate different Ca2+-dependent ion channels in single myocytes from rat portal vein. Cell Calcium. 20 (2), 153-160 (1996).
Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1793 (6), 933-940 (2009).
Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. Calcium signalling. Current biology. 9 (5), R157-R159 (1999).
Bootman, M. D., et al. Calcium signalling—an overview. Seminars in Cell & Developmental Biology. 12 (1), 3-10 (2001).
Brain, K. L., Bennett, M. R. Calcium in sympathetic varicosities of mouse vas deferens during facilitation, augmentation and autoinhibition. The Journal of Physiology. 502 (3), 521-536 (1997).
Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).
Dupont, G., Goldbeter, A. Problems and paradigms: Oscillations and waves of cytosolic calcium: Insights from theoretical models. BioEssays. 14 (7), 485-493 (1992).
Bootman, M. D., Berridge, M. J. The elemental principles of calcium signaling. Cell. 83 (5), 675-678 (1995).
Berridge, M. J., Dupont, G. Spatial and temporal signalling by calcium. Current Opinion in Cell Biology. 6 (2), 267-274 (1994).
Drumm, B. T., et al. The role of Ca 2+ influx in spontaneous Ca 2+ wave propagation in interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. The Journal of Physiology. 593 (15), 3333-3350 (2015).
Bayguinov, P. O., Hennig, G. W., Smith, T. K. Ca 2+ imaging of activity in ICC-MY during local mucosal reflexes and the colonic migrating motor complex in the murine large intestine. The Journal of Physiology. 588 (22), 4453-4474 (2010).
Drumm, B. T., Sergeant, G. P., Hollywood, M. A., Thornbury, K. D., McHale, N. G., Harvey, B. J. The role of cAMP dependent protein kinase in modulating spontaneous intracellular Ca2+ waves in interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. Cell Calcium. 56 (3), 181-187 (2014).
Nathanson, M. H., Padfield, P. J., O’Sullivan, A. J., Burgstahler, A. D., Jamieson, J. D. Mechanism of Ca2+ wave propagation in pancreatic acinar cells. Journal of Biological Chemistry. 267 (25), 18118-18121 (1992).
Straub, S. V., Giovannucci, D. R., Yule, D. I. Calcium wave propagation in pancreatic acinar cells: functional interaction of inositol 1,4,5-trisphosphate receptors, ryanodine receptors, and mitochondria. The Journal of General Physiology. 116 (4), 547-560 (2000).
Sneyd, J., Tsaneva-Atanasova, K., Bruce, J. I. E., Straub, S. V., Giovannucci, D. R., Yule, D. I. A model of calcium waves in pancreatic and parotid acinar cells. Biophysical Journal. 85 (3), 1392-1405 (2003).
Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. Calcium sparks in smooth muscle. American Journal of Physiology. Cell. 278 (2), C235-C256 (2000).
Nelson, M. T., et al. Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks. Science. 270 (5236), 633-637 (1995).
Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks: Elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 262 (5134), 740-744 (1993).
Parker, I., Choi, J., Yao, Y. Elementary events of InsP3-induced Ca2+ liberation in Xenopus oocytes: Hot spots, puffs and blips. Cell Calcium. 20 (2), 105-121 (1996).
Diliberto, P. a, Wang, X. F., Herman, B. Confocal imaging of Ca2+ in cells. Methods in Cell Biology. 40, 243-262 (1994).
Martínez-Zaguilán, R., Parnami, G., Lynch, R. M. Selection of fluorescent ion indicators for simultaneous measurements of pH and Ca2+. Cell Calcium. 19 (4), 337-349 (1996).
Hayashi, H., Miyata, H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2. The Journal of Pharmacology & Toxicology Methods. 31 (1), 1-10 (1994).
Thomas, D., Tovey, S. C., Collins, T. J., Bootman, M. D., Berridge, M. J., Lipp, P. A comparison of fluorescent Ca2+indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+signals. Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).
Lock, J. T., Parker, I., Smith, I. F. A comparison of fluorescent Ca2+indicators for imaging local Ca2+signals in cultured cells. Cell Calcium. 58 (6), 638-648 (2015).
Flagmeier, P., et al. Ultrasensitive Measurement of Ca 2+ Influx into Lipid Vesicles Induced by Protein Aggregates. Angewandte Chemie International Edition. 56 (27), 7750-7754 (2017).
Tsutsumi, S., et al. Structure-Function Relationships between Aldolase C/Zebrin II Expression and Complex Spike Synchrony in the Cerebellum. Journal of Neuroscience. 35 (2), 843-852 (2015).
Rietdorf, K., Chehab, T., Allman, S., Bootman, M. D. Novel improved Ca indicator dyes on the market - a comparative study of novel Ca indicators with Fluo-4. Calcium Signalling: The Next Generation. , 590 (2014).
Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
Seidemann, E., et al. Calcium imaging with genetically encoded indicators in behaving primates. eLife. 5 (2016JULY), (2016).
Su, S., et al. Genetically encoded calcium indicator illuminates calcium dynamics in primary cilia. Nature Methods. 10 (11), 1105-1109 (2013).
Kaestner, L., et al. Genetically encoded Ca2+ indicators in cardiac myocytes. Circulation Research. 114 (10), 1623-1639 (2014).
Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor design. Current Opinion in Chemical Biology. 27, 90-97 (2015).
Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence. PLoS ONE. 12 (2), 1-24 (2017).
Spencer, N. J., et al. Identification of a rhythmic firing pattern in the enteric nervous system that generates rhythmic electrical activity in smooth muscle. The Journal of Neuroscience. , 3489 (2018).
Hibberd, T. J., et al. Synaptic Activation of Putative Sensory Neurons By Hexamethonium-Sensitive Nerve Pathways in Mouse Colon. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. (861), (2017).
Baker, S. A., Drumm, B. T., Saur, D., Hennig, G. W., Ward, S. M., Sanders, K. M. Spontaneous Ca(2+) transients in interstitial cells of Cajal located within the deep muscular plexus of the murine small intestine. The Journal of Physiology. 594 (12), 3317-3338 (2016).
Drumm, B. T., et al. Clustering of Ca2+ transients in interstitial cells of Cajal defines slow wave duration. The Journal of General Physiology. 149 (7), 703-725 (2017).
Baker, S. A., Drumm, B. T., Cobine, C. A., Keef, K. D., Sanders, K. M. Inhibitory Neural Regulation of the Ca2+ Transients in Intramuscular Interstitial Cells of Cajal in the Small Intestine. Frontiers in Physiology. 9 (April), 1-24 (2018).
Baker, S. A., et al. Excitatory Neuronal Responses of Ca 2+ Transients in Interstitial Cells of Cajal in the Small Intestine. eNeuro. 5 (2), (2018).
Drumm, B. T., Sung, T. S., Zheng, H., Baker, S. A., Koh, S. D., Sanders, K. M. The effects of mitochondrial inhibitors on Ca2+signalling and electrical conductances required for pacemaking in interstitial cells of Cajal in the mouse small intestine. Cell Calcium. 72, 1-17 (2018).
Zheng, H., Drumm, B. T., Earley, S., Sung, T. S., Koh, S. D., Sanders, K. M. SOCE mediated by STIM and Orai is essential for pacemaker activity in the interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. Science Signaling. 11 (June), (2018).
Zhu, M. H., et al. A Ca(2+)-activated Cl(-) conductance in interstitial cells of Cajal linked to slow wave currents and pacemaker activity. The Journal of Physiology. 587 (20), 4905-4918 (2009).
Zhu, M. H., Sung, T. S., O’Driscoll, K., Koh, S. D., Sanders, K. M. Intracellular Ca(2+) release from endoplasmic reticulum regulates slow wave currents and pacemaker activity of interstitial cells of Cajal. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 308 (8), C608-C620 (2015).
Zhu, M. H., et al. Muscarinic activation of Ca2+-activated Cl- current in interstitial cells of Cajal. The Journal of Physiology. 589 (Pt 18), 4565-4582 (2011).
Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine. The Journal of Physiology. 480 (Pt 1), 91-97 (1994).
Huizinga, J. D., Thuneberg, L., Klüppel, M., Malysz, J., Mikkelsen, H. B., Bernstein, A. W/kit gene required for interstitial cells of cajal and for intestinal pacemaker activity. Nature. 373 (6512), 347-349 (1995).
Ordog, T., Ward, S. M., Sanders, K. M. Interstitial cells of Cajal generate electricial slow waves in the murine stomach. The Journal of Physiology. 518 (1), 257-269 (1999).
Sanders, K. M., Ward, S. M., Koh, S. D. Interstitial cells: regulators of smooth muscle function. Physiological Reviews. 94 (3), 859-907 (2014).
Ward, S. M., McLaren, G. J., Sanders, K. M. Interstitial cells of Cajal in the deep muscular plexus mediate enteric motor neurotransmission in the mouse small intestine. The Journal of Physiology. 573 (1), 147-159 (2006).
Komuro, T. Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. The Journal of Physiology. 576 (3), 653-658 (2006).
Komuro, T. Comparative morphology of interstitial cells of Cajal: ultrastructural characterization. Microscopy Research and Technique. 47 (4), 267-285 (1999).
Sanders, K. M., Ward, S. M., Koh, S. D. Interstitial Cells: Regulators of Smooth Muscle Function. Physiological Reviews. 94 (3), 859-907 (2014).
Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+dynamics in the awake mouse brain. PLoS ONE. 12 (7), e0181113 (2017).
Truett, G. E., Heeger, P., Mynatt, R., Truett, A. A., Walker, J. A., Warman, M. L. Preparation of PCR quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT). BioTechniques. 29 (52), 54 (2000).
The Jackson Laboratory. , Available from: https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:5:0::NO:5:P5_MASTER_PROTOCOL_ID,P5_JRS_CODE:27076,028865 (2017).
Drumm, B. T., et al. Ca 2+ signalling in mouse urethral smooth muscle in situ role of Ca 2+ stores and Ca 2+ influx mechanisms. The Journal of Physiology. 596 (8), 1433-1466 (2018).
Heppner, T. J., Hennig, G. W., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Rhythmic Calcium Events in the Lamina Propria Network of the Urinary Bladder of Rat Pups. Frontiers in Systems Neuroscience. 11 (December), 1-16 (2017).
Heppner, T. J., Hennig, G. W., Nelson, M. T., May, V., Vizzard, M. A. PACAP38-Mediated Bladder Afferent Nerve Activity Hyperexcitability and Ca 2 + Activity in Urothelial Cells from Mice. Journal of Molecular Neuroscience. 1, (2018).
Griffin, C. S., et al. Muscarinic Receptor Induced Contractions of the Detrusor are Mediated by Activation of TRPC4 Channels. Journal of Urology. 196 (6), 1796-1808 (2016).
Sergeant, G. P., Craven, M., Hollywood, M. A., Mchale, N. G., Thornbury, K. D. Spontaneous Ca2+waves in rabbit corpus cavernosum: Modulation by nitric oxide and cGMP. Journal of Sexual Medicine. 6 (4), 958-966 (2009).
Bradley, E., et al. Novel Excitatory Effects of Adenosine Triphosphate on Contractile and Pacemaker Activity in Rabbit Urethral Smooth Muscle. Journal of Urology. 183 (2), 801-811 (2010).
Drumm, B. T., et al. The effect of high [K + ] o on spontaneous Ca 2+ waves in freshly isolated interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. Physiological Reports. 2 (1), e00203 (2014).

Biology

Приложения пространственно временных карт и методы анализа частиц для количественного определения внутриклеточных Ca^{2 +} сигнализации в Situ

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.