Biology

Anvendelser af Spatio-temporale kortlægning og partikel analyseteknikker til at kvantificere intracellulære Ca^{2 +} signalering In Situ

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58989

Bernard T. Drumm¹, Grant W. Hennig², Salah A. Baker¹, Kenton M. Sanders¹

¹Department of Physiology and Cell Biology, University of Nevada Reno School of Medicine, ²Department of Pharmacology, The Robert Larner, M.D. College of Medicine, University of Vermont

Summary

Genetisk kodet Ca^{2 +} indikatorer (GECIs) har radikalt ændret hvordan in situ Ca^{2 +} imaging er udført. For at maksimere datagendannelse fra sådanne optagelser, er relevant analyse af Ca^{2 +} signaler påkrævet. Protokoller i dette papir lette kvantificering af Ca^{2 +} -signaler registreres på stedet ved hjælp af spatiotemporelle kortlægning og partikel-baseret analyse.

Abstract

Ca^{2 +} billeddannelse af isolerede celler eller bestemte typer af celler i intakt væv ofte afslører komplekse mønstre af Ca^{2 +} signalering. Denne aktivitet kræver omhyggelig og dybdegående analyser og kvantificering til at fange så mange oplysninger om de underliggende arrangementer som muligt. Spatial, tidsmæssige og intensitet parametre iboende til Ca^{2 +} signaler som hyppighed, varighed, formering, hastighed og amplitude kan give nogle biologiske oplysninger kræves til intracellulær signalering. Høj opløsning Ca^{2 +} imaging typisk resulterer i anskaffelsen af store datafiler, der er tidskrævende proces med hensyn til at oversætte de billeddiagnostiske oplysninger i kvantificerbare data, og denne proces kan være modtagelige for menneskelige fejl og bias. Analyse af Ca^{2 +} signaler fra celler in situ typisk bygger på enkle intensitet målinger fra vilkårligt udvalgte områder af interesse (ROI) i en field of view (FOV). Denne tilgang ignorerer meget vigtig signalfunktion oplysningerne i FOV. Således, for at maksimere inddrivelsen af oplysninger fra sådanne høj opløsning optagelser opnået med Ca^{2 +}farvestoffer eller optogenetic Ca^{2 +}imaging, passende rumlige og tidsmæssige analyse af Ca^{2 +} signaler er påkrævet. De protokoller, der er beskrevet i denne hvidbog vil beskrive, hvordan en stor mængde data kan fås fra Ca^{2 +} imaging optagelser at lette mere fuldstændig analyse og kvantificering af Ca^{2 +} signaler registreret fra celler ved hjælp af en kombination af spatiotemporelle kort (STM)-baseret analyse og partikel-baseret analyse. Protokollerne beskriver også, hvordan forskellige mønstre af Ca^{2 +} signalering observerede i forskellige celle populationer på stedet kan analyseres korrekt. Illustration, vil metoden undersøge Ca^{2 +} signalering i en specialiseret population af celler i tyndtarmen, interstitielle celler af Cajal (ICC), ved hjælp af GECIs.

Introduction

Ca^{2 +} er en allestedsnærværende intracellulære messenger, som styrer en lang række cellulære processer såsom muskel sammentrækning¹^,², stofskifte³, celle spredning³^,⁴^, ⁵, stimulering af neurotransmitter frigivelse på nerve terminaler⁶^,⁷, og aktivering af transskription faktorer i cellekernen. ⁷ intracellulære Ca^{2 +} signaler ofte tage form af forbigående stigninger i cytosole Ca^{2 +}, og disse kan være spontan eller opstå som følge af agonist stimulation afhængigt af celle type⁸. Spatial, tidsmæssige og intensitet parametre iboende til Ca^{2 +} signaler som hyppighed, varighed, formering, hastighed og amplitude kan give de biologiske oplysninger kræves til intracellulær signalering⁵^, ⁷ ^, ⁹. cytoplasmatisk Ca^{2 +} signaler kan skyldes en tilstrømning af Ca^{2 +} fra det ekstracellulære rum eller via Ca^{2 +} frigivelse fra det endoplasmatiske reticulum (ER) via Ca^{2 +} release kanaler såsom ryanodine receptorer (RyRs) og inositol-tri-fosfat receptorer (IP₃Rs)¹⁰. RyRs og IP₃Rs kan både bidrage til generation af Ca^{2 +} signaler og samordnet åbningen af disse kanaler, som kombineret med forskellige Ca^{2 +} tilstrømning mekanismer kan resultere i et utal af Ca^{2 +} signalering mønstre der er formet af numrene og åbne sandsynligheden af Ca^{2 +} tilstrømning kanaler, udtryk-profil af Ca^{2 +} release kanaler, nærhed mellem Ca^{2 +} tilstrømning og slippe kanaler, og udtryk og distribution af Ca^{2 +} reuptake og ekstrudering proteiner. Ca^{2 +} signaler kan tage form af ensartede, lang holdbarhed, høj intensitet globale svingninger, der kan vare i flere sekunder eller endda minutter, formerings intracellulære og intercellulære Ca^{2 +} bølger, der kan passere intracellulære afstande over 100 µm¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶, eller flere kort, rumligt lokaliseret begivenheder såsom Ca^{2 +}sparks og Ca^{2 +} pust, der forekommer på snesevis af millisekund tidsfrister og sprede mindre end 5 µm¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰.

Fluorescerende mikroskopi har været anvendes bredt til at overvåge Ca^{2 +} signalering i isolerede og kulturperler celler og i intakt væv. Traditionelt disse eksperimenter involveret brug af fluorescerende Ca^{2 +} indikatorer, ratiometric og ikke-ratiometric farvestoffer såsom Fura2, Fluo3/4 eller Rhod2, blandt andre ²¹^,²²^,²³. Disse indikatorer var designet til at blive gennemtrængelig for cellemembraner og derefter blive fanget i cellerne ved spaltning af en ester gruppe via endogene esteraser. Binding af Ca^{2 +} høj affinitet indikatorer forårsaget ændringer i fluorescens når celler og væv blev belyst ved relevante bølgelængder af lys. Brug af celle gennemtrængelig Ca^{2 +} indikatorer styrket vores forståelse af Ca^{2 +}signalering i levende celler og tilladt rumlige opløsning og kvantificering af disse signaler, det ikke var muligt af aflæst Ca^{2 +} signaler gennem andre midler, såsom Elektrofysiologi. Traditionelle Ca^{2 +} indikatorer har dog flere begrænsninger, såsom photobleaching, der opstår over udvidede optagelse perioder²⁴. Mens nyere Ca^{2 +}indikator farvestoffer som Cal520/590 har stærkt forbedret signal til støj-forhold og evnen til at opdage lokale Ca^{2 +} signaler²⁵, kan problemer med photobleaching stadig forblive et anliggende for nogle efterforskere²⁶^,²⁷^,²⁸. Stejle photobleaching også begrænser forstørrelsen, sats på billede erhvervelse, og beslutning, som kan bruges for optagelser, da øget objektive magt og højere priser for image erhvervelse kræver øget excitation lysintensiteten, øger photobleaching.

Disse begrænsninger af traditionelle Ca^{2 +} indikator farvestoffer er forværret ved registrering af Ca^{2 +} signaler på stedet, for eksempel når optagelse intracellulære Ca^{2 +} signaler fra intakt væv. På grund af ovennævnte problemer visualisering af Ca^{2 +} signaler i situ ved hjælp af celle gennemtrængelig Ca^{2 +}indikatorer har været begrænset til lavt strømforbrug forstørrelse og nedsatte billedoptagelse, begrænsende evne til efterforskerne til at optage og kvantificere tidsmæssigt eller geografisk begrænset subcellulært Ca^{2 +} signaler. Således har det været vanskeligt at indsamle, analysere og værdsætter den rumlige og tidsmæssige kompleksitet af Ca^{2 +} signaler, som kan være vigtige i generation af ønskede biologiske reaktioner, som skitseret ovenfor. Analyse af Ca^{2 +} signaler fra celler in situ typisk bygger på enkle intensitet målinger fra udvalgte områder af interesse (ROI) i en field of view (FOV). Den vilkårlige valg af antallet, størrelsen og placeringen af ROIs, afhængig af indfald af forskeren kan alvorligt bias de opnåede resultater. Samt iboende bias med ROI analyse, denne tilgang ignorerer meget af den vigtige signalering oplysningerne i FOV, som dynamisk Ca^{2 +} begivenheder inden for et vilkårligt valgte ROI er udvalgt til analyse. Derudover undlader analyse af ROIs at give oplysninger om de rumlige Karakteristik af Ca^{2 +} signaler observeret. For eksempel, kan det ikke være muligt for at skelne mellem en stigning i Ca^{2 +} som følge af en formerings Ca^{2 +} bølge og et stærkt lokaliseret Ca^{2 +} frigive begivenhed fra tabuleringerne af Ca^{2 +} signaler inden for en ROI.

Fremkomsten af genetisk kodet Ca^{2 +} indikatorer (GECIs) har radikalt ændret hvordan Ca^{2 +} imaging kan være udført i situ²⁹^,³⁰^,³¹^,³²^,³³. Der er flere fordele ved at bruge GECIs over farvestoffer. Det vigtigste er måske, udtryk for GECI kan udføres på en bestemt måde, celle, som reducerer uønskede baggrundsforurening fra celler ikke af interesse. En anden fordel ved GECIs over traditionelle Ca^{2 +} indikatorer er at photobleaching reduceres (som fluorescens og som følge heraf photobleaching kun opstår Hvornår celler er aktive), sammenlignet med farvestof-loaded enheder, især ved høje forstørrelse og høje image capture³⁴. Således imaging med GECIs, som GCaMP serien af sensorer, optogenetic, frembyder efterforskere evnen til at optage korte, lokaliserede subcellulære Ca^{2 +} -signaler i situ og undersøge Ca^{2 +} signalering i celler inden for deres Native miljøer, der ikke har været muligt tidligere. For at maksimere inddrivelsen af oplysninger fra sådanne høj opløsning optagelser, er passende rumlige og tidsmæssige analyse af Ca^{2 +} signaler påkrævet. Det skal bemærkes, at mens GECIs kan tilbyde nogle klare fordele, de seneste undersøgelser har vist, at Ca^{2 +} imaging kan udføres med succes fra store bestande af forskellige neurokemiske klasser af neuroner samtidigt ved hjælp af konventionelle Ca^{2 +} indikatorer, der ikke er genetisk kodet ind i den animalske³⁵. Denne fremgangsmåde anvendes post hoc Immunohistokemi til at afsløre flere forskellige klasser af neuroner fyring i høj frekvens i synkroniseret brister, og undgået det potentiale, som genetiske modifikationer til dyret kan have blandet sig med de fysiologiske adfærd investigator søger at forstå³⁵^,³⁶.

De protokoller, der er skitseret i dette papir lette mere fuldstændig analyse og kvantificering af Ca^{2 +} -signaler registreres fra celler på stedet ved hjælp af en kombination af spatiotemporelle kort (STM)-baseret analyse og partikel-baseret analyse. Protokollerne beskriver også, hvordan forskellige mønstre af Ca^{2 +} signalering observerede i forskellige celle populationer på stedet kan analyseres korrekt. Illustration, vil metoden undersøge Ca^{2 +} signalering i en specialiseret population af celler i tyndtarmen, interstitielle celler af Cajal (ICC). ICC er specialiserede celler i den gastrointestinal (GI) tarmkanalen, der udviser dynamisk intracellulære Ca^{2 +} signalering, som visualiseres ved hjælp af mus at udtrykke GCaMPs³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^, ⁴¹^,⁴². Ca^{2 +} transienter i ICC er knyttet til aktivering af Ca^{2 +}-aktiveret Cl^- kanaler (kodet af Ano1), der er vigtige i reguleringen af ophidselse af intestinal glat muskel celler (SMCs)⁴³^, ⁴⁴^,⁴⁵. Undersøgelse af Ca^{2 +} signalering i ICC er således grundlæggende at forstå tarmens motilitet. Murine tyndtarmen tilbyder et fremragende eksempel for denne demonstration, som der er to klasser af ICC, der er anatomisk separeret, kan visualiseres uafhængigt: Jeg) ICC er beliggende i området mellem den cirkulære og langsgående glatte muskulatur lag, omkring myenteric plexus (ICC-min). Disse celler fungerer som pacemaker celler og generere den elektriske aktivitet kendt som langsom bølger⁴⁶^,⁴⁷^,⁴⁸^,⁴⁹; II) ICC ligger også blandt en plexus rig på terminaler motor neuroner (dyb muskuløs plexus, således ICC-DMP). Disse celler fungerer som mediatorer af svar til enteriske motor neurotransmission³⁷^,³⁹^,⁴⁰^,⁵⁰. ICC-MY og ICC-DMP er Morfologisk adskiller sig, og deres Ca^{2 +} signaling adfærd afviger radikalt for at udføre deres specifikke opgaver. ICC-min er Stjernehus i form og danne et netværk af sammenkoblede celler via gap vejkryds⁵¹^,⁵². Ca^{2 +} -signaler i ICC-min manifest som kort og rumligt lokaliseret Ca^{2 +} release hændelser på flere websteder asynkront gennem det ICC-mit netværk som visualiseret i en FOV (afbildet med en 60 X mål)³⁸. Disse asynkrone signaler er inddelt tidsmæssigt i 1 sekund klynger der, når tabuleres sammen, beløber sig til en netto 1 s cellulære stigning i Ca^{2 +}. Signalerne udbreder celle til celle i ICC netværket og derfor organisere Ca^{2 +} signalering, genereret fra subcellulære websteder, i et væv bred Ca^{2 +} bølge. Tidsmæssige klyngedannelse og summation af Ca^{2 +} -signaler i ICC-min er blevet kaldt Ca^{2 +} forbigående klynger (CTCs)³⁸. CTCs forekomme rytmisk (fx ganske lignende varigheder og lignende perioder mellem CTCs) 30 gange pr. minut i musen. Omvendt, ICC-DMP er spindel formet celler, nogle med sekundære processer, der distribuerer mellem SMCs og åreknuder nerve processer og ikke selvstændigt danne et netværk⁵¹^,⁵². ICC-DMP form gap vejkryds med SMCs, men og funktion inden for denne større syncytium, kendt som SIP syncytium⁵³. Ca^{2 +} signaler forekomme på flere steder langs længder af celler, men disse transienter er ikke medrives eller tidsligt klynger, som bemærket ICC-min³⁷. Ca^{2 +} signaler i ICC-DMP forekommer på stokastiske måde, med varierende intensitet, varighed og rumlige egenskaber. Protokollerne nedenfor, ved hjælp af eksemplet med Ca^{2 +} signalering i ICC-MY og ICC-DMP, beskriver teknikker til at analysere komplekse signalering i bestemte typer af celler på stedet. Vi udnyttede det inducerbare Cre-Lox p system for at udtrykke GCaMP6f udelukkende i ICC, efter inducerende aktivering af Cre-Recombinase (Cre) drevet af en ICC specifikke promotor (Kit).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøgsdyr og de protokoller, der er foretaget i denne undersøgelse var i overensstemmelse med de nationale institutter sundhed Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Alle procedurer blev godkendt af institutionelle dyr brug og efterbehandling Udvalget på University of Nevada, Reno.

1. generation af KitGCaMP6f mus

Cross Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f mus) og c-Kit^{+/ Cre-ERT2} (Kit-Cre mus) til at generere ICC specifikke GCaMP6f udtrykker dyr (Kit-Cre-GCaMP6f mus).
Bemærk: GCaMP6f blev brugt på grund af dens rapporterede effektivitet i rapportering lokaliseret, signaler korte intracellulære Ca^{2 +} på stedet og in vivo⁵⁴.
Injicere Kit-Cre-GCaMP6f mus med tamoxifen i en alder af 6 – 8 uger til at fremkalde Cre Recombinase aktivering og efterfølgende GCaMP6f udtryk i ICC (figur 1).
1. Hvis du vil oprette tamoxifen løsningen, opløse 80 mg Tamoxifen (Se Tabel af materialer) i 800 μL af ethanol (Se Tabel af materialer) i en kuvette og vortex i 20 minutter.
2. Tilføje 3,2 mL tidselolie (generisk) til at oprette løsninger på 20 mg/mL og derefter Læg instrumenterne i ultralydsbad i 30 minutter før injektion.
3. Injicere mus (intraperitoneal injektion; IP) med 0,1 mL af tamoxifen (2 mg tamoxifen) i tre på hinanden følgende dage. Bekræft GCaMP6f udtryk af genotypebestemmelse og bruge mus 10 dage efter den første injektion.
  1. Genotype mus ved klipning et lille stykke af øre fra hvert dyr. Brug derefter HotSHOT metode⁵⁵ for genomisk DNA isolation ved at inkubere øre clips på 95 ° C i 60 min i 75 mL NaOH og derefter neutraliserende af 75 mL af Tris buffer. Bruge standard PCR til at bestemme genotype for hvert dyr, 2 mL af DNA i en 20 mL reaktion med GCaMP6f specifikke primere⁵⁶. Køre 10 mL af PCR produkt på en 2%-agarosegel at bestemme vildtype (297 bp) og mutant (~ 450 bp) bands.

2. forberedelse af væv til Ca^{2 +} Imaging

Anaesthetize mus ved inhalation med isofluran (4%, se Tabel af materialer) i en ventileret hood og derefter offer af cervikal dislokation.
Ved hjælp af skarpe saks open maven af mus, fjerne tyndtarmen og placere i Krebs-Ringer bikarbonat løsning (KRB). Åbn tyndtarmen langs grænsen mesenteriallymfeknuderne og vaske væk enhver intraluminal indholdet med KRB. Bruger skarpe dissektioner, fjerne de slimhinde og sub slimhinde lag.
Bemærk: KRB løsning har følgende sammensætning (i mM): NaCl 118.5, KCl 4.7, CaCl₂ 2,5, MgCl₂ 1.2, NaHCO₃ 23,8, KH₂PO₄ 1.2, dextrose 11,0. Denne løsning har en pH-værdi på 7,4 ved 37 ° C når boblede op til ligevægt med 95% O₂- 5% CO₂.
Ved hjælp af små stifter, pin tyndtarmen væv i bunden af en 5 mL volumen, 60 mm diameter Sylgard-belagte fad med cirkelformede glatte muskulatur lag vender opad. Perfuse forberedelse med varmede KRB løsning ved 37 ° C i en ækvilibrering periode på 1 time før eksperimenter.
Efter denne ækvilibrering periode, udføre in situ Ca^{2 +} billeddannelse af små tarm ICC-MY og ICC-DMP bruger Konfokal mikroskopi (billeder i denne protokol er anskaffet med en Konfokal mikroskop udstyret med en spinning-disk). På grund af fordelene ved GECIs beskrevet ovenfor, bruge time-lapse billeder med høj opløsning (> 30 rammens per other, FPS) kombineret med høj effekt mål (60-100 x) at erhverve film af dynamiske Ca^{2 +} signaler i ICC.
Bemærk: For at reducere væv bevægelse, anvende nicardipin (0,1-1 μM) under optagelser som tidligere beskrevet³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹.
Skelne ICC-MY og ICC-DMP i tyndtarmen ved hjælp af deres forskellige anatomiske placering, morfologi og basal Ca^{2 +} aktivitet mønstre.
1. Find ICC-min på niveau af myenteric plexus, mellem de cirkulære og langsgående glat muskel lag af tyndtarmen. De er Stjernehus formet, danner et forbundet netværk (figur 3A). CTCs (beskrevet ovenfor) overføres via netværk af ICC-min med en regelmæssig forekomst af ~ 30 cyklusser pr. min.
2. Omvendt, finde ICC-DMP i en enkelt plan på niveau med den dybe muskuløs plexus, laget cirkelformede glatte muskulatur og submukøse plexus. ICC-DMP danne ikke et netværk og er spindel formet celler (figur 2A), der udviser ingen regelmæssig formeringsmaterialets begivenheder og i stedet fyre stokastiske, lokaliseret intracellulære Ca^{2 +} transienter.
Uanset erhvervelse software udnyttes, skal du gemme film som en stak af TIFF-billeder.

3. analyse af stokastiske Ca^{2 +} signaler i ICC-DMP bruger Spatio-temporale kortlægning (STM)

Analysere ICC-DMP bruger spatio-temporale kortlægning med en kombination af ImageJ software (NIH, USA, gratis til download på http://imagej.nih.jov/ij) og brugerdefinerede lavet software (Volumetry, version G8d, GWH, betjenes på Mac OS, kontakt Grant Hennig grant.hennig@ med.UVM.edu vedrørende henvendelser for Volumetry adgang og brug)
Bemærk: En alternativ tilgang til fuldt analysere disse spatio-temporale kort med ImageJ alene er også fastsat i senere afsnit (begyndelsen på trin 3.9).
Åbn Volumetry og bruge højre museklik til at åbne mapper, der indeholder film-filer. Venstre klik på filmfilen skal analyseres for at åbne det i Volumetry (skal være i ukomprimeret TIFF-format). Når åbnet, indeholdt filmen i en blå-omkranset vindue (film vindue), som vil omfatte et stort område af skærmbilledet højre. Den venstre side af skærmbilledet indeholder vinduet Plot (øverste 4/5ths) og vinduet spor (nedre 1/5^th).
Justere dimensionerne på filmen ved at holde Skift nede og samtidigt rulle op med den midterste museknap (MMB, reducerer størrelse) eller rulle ned med MMB (øger størrelse). Starte eller stoppe afspilning ved at trykke på 'A'; hastighed afspilning kan justeres ved at trykke på op og ned piletasterne.
Hvis du vil oprette en STM, ved hjælp af Volumetry, tegne en ROI over en hele cellen ved at holde Skift nede, mens klikke og trække med venstre museknap. Justere retningen af Investeringsafkastet ved at rulle med MMB i hjørnerne af ROI. Når ROI er i sted over cellen, der skal analyseres (figur 2A), brug højre klik i vinduet film til at få adgang til ' ROI STM'er – STMyAvg > xRow «og venstre klik for at oprette en STM celle aktivitet i vinduet Plot (der er også en mulighed for at vælge ' STMxAvg > yRo w ", hvoraf den ene er valgt vil afhænge om orientering af cellen er mere på linje med x eller y-aksen, for eksempel cellen fremhævet figur 2A er mere orienteret på y-aksen").
Venstre klik på STM i vinduet Plot og tryk på 'P' for at subtrahere gennemsnitlig baggrundsstøj og tryk på 'H' at øge kontrasten i STM. Gem STM ved at højre klikke på det for at få adgang til 'STM belastning Gem - gemmer STM som .tif' og derefter venstreklikke for at gemme som en TIFF-fil.
Den resterende del af analysen af ICC-DMP vil blive gennemført i ImageJ. ImageJ består af to hovedkomponenter, en værktøjslinje med en fast position på toppen af skærmen og en mobil brugergrænseflade. Brug ImageJ, åbne STM TIFF-fil af ICC-DMP Ca^{2 +} aktivitet (File-Open på værktøjslinjen Billede Jørgensen).
Åbn Volumetry lavet STM, som vil have tid vertikalt orienteret. ImageJ vil automatisk åbne TIFF-filer som enten RGB- eller 16-bit-billeder. For at forbedre billedkvaliteten, venstre klik 'Billede' på værktøjslinjen ImageJ. Rul den første indstilling ' skrive «for at afsløre en drop down menu med forskellige billedformater, rulle over ' 32-bit», og venstre klik for at ændre.
For at gøre STM læsbare mod tiden fra venstre mod højre, venstre klik på værktøjslinjen ImageJ på følgende sti: 'Billede-Transform-Roter 90 grader venstre'. Det er også muligt at oprette STM'er af in situ Ca^{2 +} aktivitet ved hjælp af linescans med ImageJ alene uden Volumetry og dette er nærmere beskrevet nedenfor.
Bemærk: Når STM'erne er skabt, analyseres de på samme måde, uanset hvilken software blev brugt til at generere dem. Du kan springe denne alternative metode til at skabe STM'erne i ImageJ, springe til trin 3.19.
Du kan oprette STM'er med ImageJ, åbne stakken af TIFF-filer, der udgør optagelse af ICC-DMP Ca^{2 +} aktivitet (File-Open på værktøjslinjen ImageJ). ImageJ vil automatisk åbne TIFF-filer som enten RGB- eller 16-bit-billeder. For at forbedre billedkvaliteten, venstre klik 'Billede' på værktøjslinjen ImageJ. Rul den første indstilling ' skrive «for at afsløre en drop down menu med forskellige billedformater, rulle over ' 32-bit», og venstre klik for at ændre.
Baggrundsstøj (som følge af auto fluorescens eller kamera støj) skal nu trækkes fra filmen. Venstre klik 'Rektangulær markering' funktion i grænsefladen ImageJ og tegner en ROI (ved venstre at klikke og trække til ønsket størrelse og form) over baggrunden fluorescens af filmen.
Efter valg af ROI, venstre klik på 'Analysere' på værktøjslinjen ImageJ, og derefter venstre klik 'Histogram' fra den resulterende dropdown menu. En pop-up boks vises derefter spørgende om vifte pixelværdierne til at beregne; ImageJ har værdier af ROI forudvalgt så venstre klik 'OK'.
Når du klikker på 'OK', vises en ny pop-up-boks indeholdende et histogram viser fordelingen af værdier for pixel støj i baggrunden inden for ROI. Vær opmærksom på den gennemsnitlige værdi som anført under histogrammet og derefter lukke pop op-boksen.
Klik på tilbage til 32-bit filmen og vælge hele FOV ved venstre at klikke på 'Rediger' på værktøjslinjen ImageJ, rulle til 'Markering' og venstreklikke på 'Vælg alle' fra afslørede dropdown menuen.
Venstre klik 'Proces' på værktøjslinjen ImageJ, Rul ned til 'Math' og venstre klik 'Subtraher' afslørede dropdown-menuen.
Der vises en popup-boks, hvor værdi fratrækkes FOV kan indsættes. Angiv den gennemsnitlige værdi erhvervet fra histogram i trin 3.12 ovenfor og klik på 'OK'. ImageJ bliver derefter bedt om at behandle alle billederne i TIFF-stak (og ikke bare en enkelt ramme filmen er i øjeblikket på). Klik på 'Ja'.
Når du klikker på 'Ja', vil filmen blive sort. For at rette dette, venstre klik 'Billede' i ImageJ værktøjslinjen og rulle over 'Adjust'. Venstreklik på den åbenbarede første mulighed for "lysstyrke/kontrast' (B & C). Dette vil opdrage en pop up boks hvor forskellige aspekter af lysstyrke og kontrast kan ændres. Venstre klik på 'Auto' indstilling engang at afsløre den øget kvalitet i filmen. Åbner denne B & C pop up box til fremtidig brug.
Hvis du vil oprette en linescan, først højre klik på værktøjet streg udvælgelse i ImageJ interface til at afsløre muligheder for forskellige linjer; venstre klik på 'Segmenterede linje' til at vælge det fra listen. Med værktøjet 'Segmenterede Line' valgt klik brug enkelt venstre for at tegne en linje langs midten af aksen af en individuel ICC-DMP. Hver enkelt venstre klik vil lave linjen på dette punkt og linjen kan derefter frit flyttes yderligere fra alle ønskede vinkler. Når linjen er afsluttet, dobbelt venstre klik for at løse linjen på plads.
Venstre klik 'Billede' på ImageJ værktøjslinjen og rulle over 'Stakke' og venstre klik på indstillingen 'Reslice'. Der vises en popup-boks; venstre klik på indstillingen 'Roter 90 grader', dette vil orientere linescan fra venstre mod højre, således at det kan være kalibreret og læse mod tiden på x-aksen, med plads på y-aksen. Klik på 'OK' for at oprette STM.
Intensiteten af STM vil blive oprettet på en gråtoner med høj intensitet Ca^{2 +} signaler vist som varierende grader af hvid, off hvid eller lysegrå afhængigt af deres intensitet. Kontrasten i de oprettede linescan vil normalt, skal forbedres. Gøre dette ved at klikke på 'Auto' på B & C pop up boks.
Intensiteten af fluorescens af linescan præsenteres på STM i vilkårlige pixelværdier. Præcist måle amplitude af Ca skal^{2 +} signaler fra STM, fluorescens værdier af STM (F) nu normaliseres. Brug funktionen 'Rektangulær markering' i grænsefladen ImageJ, tegne en ROI på et område af den STM, der viser den mest ensartede og det mindste intense område af fluorescens (F₀).
Gentag skridt i 3.11-3.12 at opnå en gennemsnitlig værdi (F₀) intensitet inden for den valgte ROI og derefter vælge den hele STM ved venstre at klikke på 'Edit-udvalg-Vælg alle' fra værktøjslinjen ImageJ.
Venstre klik 'Proces' på ImageJ værktøjslinjen og rul ned til 'Math'; venstre klik 'Dele' fra de viste muligheder. Angiv den gennemsnitlige værdi (F₀) fra trin 3.21 i boksen efterfølgende popup. Ved at dividere den hele STM med (F₀) vil STM vende sort; rette dette ved at klikke på 'Auto' på B & C pop up boks. Linescan er nu kalibreret for amplitude, med intensiteten af fluorescens udtrykt som F/F₀.
STM vises i øjeblikket, antallet af billeder i TIFF stakken på x-aksen og antallet af pixels repræsenterer længden på cellen på y-aksen. For at kvantificere tidsmæssige og rumlige oplysninger fra Ca^{2 +} signaler, kalibrere STM for tid og rum. Venstre klik 'Billede' på værktøjslinjen ImageJ og venstre klik 'Egenskaber'. Der vises en popup-boks. Angiv de relevante værdier for at fuldt kalibrere STM i dette vindue.
'Pixel bredde', Indtast længden af tid, det tager for at fange en enkelt ramme i sekunder. For eksempler, på 5 FPS, indtaste en værdi på 0,2, om 50 FPS kan du angive en værdi på 0,02 til 33 FPS angiver værdien 0,033 osv. For 'Pixel højde', Indtast hvor mange mikron hver pixel repræsenterer (afhænger på mål bruges og kameraet anvendes til erhvervelse). 'Voxel dybde' er tilbage på 1 før du klikker på 'OK'. Ingen andre parametre skal tilpasses inden for vinduet.
Bemærk: Når du klikker på 'OK', vil STM kalibreres fuldt for amplitude, tid og rum. Amplitude på STM udtrykkes som F/F_0,tid på x-aksen vil være udtrykt i sekunder og plads på y-aksen vil være udtrykt i μm (figur 2B). Ca^{2 +} begivenheder på STM er nu klar til at blive målt, kalibreret STM kan også gemmes som en enkelt TIFF-billede til at analysere på et senere tidspunkt.
ImageJ er et antal bygget i farvekodede opslagstabel (LUTs), der kan bruges til at farve kode af STM. Anvende en indbygget i LUT ved at venstreklikke på værktøjslinjen ImageJ på stien billede opslagstabeller og vælge en LUT gælde. Specialfremstillede LUTs kan også importeres til STM ved at venstreklikke på værktøjslinjen ImageJ på sti 'Fil-Import-LUT' og derefter vælge LUT at importere. For eksempel har den STM, vist i figur 2 c haft den brugerdefinerede LUT 'QUBPallete' (Queens University Belfast, Storbritannien) anvendes til det, at kode varme farver (rød, orange) som områder med intens Ca^{2 +} fluorescens og kolde farver (sort, blå) som områder med lav Ca^{2 +}fluorescens.
For at indsætte en amplitude kalibrering bar for at angive intervallet af amplituder repræsenteret af de forskellige farver, venstre klik 'Analysere' fra værktøjslinjen ImageJ, Rul ned til 'Funktioner' og vælg 'Kalibrering Bar' fra den viste menu. Indstillinger er givet for størrelse, zoom, rækkevidde og position på STM for kalibrering bar; justere disse indstillinger som ønsket, og klik på 'OK'. Bemærk, at når baren kalibrering er indsat, ImageJ opretter en ny STM indeholdende det, forlader den oprindelige version uden kalibrering bar intakt og separat.
Bemærk: Hvis boksen "Overlay" er afkrydset, når du indsætter linjen kalibrering, genereres en ny STM ikke.
For at begynde at analysere enkelte Ca^{2 +} begivenheder, venstre klik på ' Straight' linjevælgeren på grænsefladen ImageJ. Af oprindeligt venstreklikke på STM, tegne en lige vandret linje gennem centrum af en Ca^{2 +} event parallelt med x-aksen (med tiden). Komplet linjen ved venstre at klikke på et andet tidspunkt (figur 2D).
Klik på 'Analysere' på værktøjslinjen ImageJ og venstre klik på 'Plot profil'. Der vises en ny boks med profilen plot af Ca^{2 +} event (figur 2E).
Bemærk: 'Liste' mulighed indenfor denne boks vil generere en liste af XY-værdier for den genererede plot, som kan kopieres til et regnearksprogram til at skabe spor, hvis det ønskes.
For at måle amplitude af Ca^{2 +} begivenhed repræsenteret i profilen plot, venstre klik på ' Straight' linjevælgeren på grænsefladen ImageJ. Derefter, tegne en lodret streg fra baseline af plot profil til toppen af Ca^{2 +} event; længden af linjen (vist på grænsefladen ImageJ) vil repræsentere amplitude af hændelsen udtrykt ΔF/F₀ (figur 2E).
Bruger værdien erhvervede amplitude, varigheden af Ca^{2 +} event kan måles ved at tegne en lige linje tværs over bredden af hændelsen på 50% maksimale amplitude (fuld varighed på et halvt maksimale amplitude, FDHM) eller den fulde varighed for begivenheden kan måles, hvis det ønskes (figur 2E).
Bemærk: Eksperimentatorer bliver nødt til at designe specifikt kriterium for tærskel gyldig Ca^{2 +} begivenheder i disse optagelser. I vores forsøg, Ca^{2 +} begivenheder blev udpeget som værende gyldigt for analyse, hvis dens amplitude var > 15% af den maksimale amplitude begivenhed i sektionen kontrolelementer for optagelse. Men disse tærskler vil afhænge af de specifikke væv og celler under studere og er kun vilkårlige retningslinjer, der kræver specifikke optimering for hver type af væv og celler.
Ved at tegne en streg langs upstroke eller nedadgående af Ca^{2 +} event plot profil, kan satsen for stigning eller fald beregnes i overensstemmelse hermed. Når linjen er trukket, kan musemarkøren flyttes til punktet, hvor linjen begynder, og hvor det ender. Når markøren er stillestående over disse punkter, x, y koordinater for denne placering vises i nederste venstre side af grænsefladen ImageJ. Således, ved at erhverve x, y værdier for hvor linjen begynder (x₁, y₁) og slutter (x₂, y₂), stige eller falde (ΔF/s) kan beregnes som hældningen af linjen, y₂- y₁ / x₂- x₁ (figur 2F ).
For at beregne formering eller geografisk spredning af Ca^{2 +} hændelsen, venstre klik på ' Straight' linjevælgeren på grænsefladen ImageJ. Derefter, trække en lige lodret linje langs længden af Ca^{2 +} event langs y-aksen. Længden af linjen (vist på grænsefladen ImageJ) vil repræsentere den rumlige udbredelse af hændelsen udtrykt som μm (fig. 2 g).
Bestemme hastigheden af en formeringsmaterialets Ca^{2 +} begivenhed ved at tegne en streg langs formeringsmaterialets forsiden af hændelsen og beregning af hældningen af linjen. Dette kan udføres manuelt på en lignende måde som beskrevet i trin 3,32, ved at bestemme x, y værdier for hvor linjen begynder (x₁, y₁) og slutter (x₂, y₂); disse værdier vises i nederste venstre side af grænsefladen ImageJ, når musemarkøren er beliggende på STM.
Efter indsamling af de ønskede parametre for Ca^{2 +} event kvantificering, samle disse værdier gennemsnit for at generere gennemsnitsværdier for hver parameter på pr. celle basis; Alternativt, placere alle de rå værdier i en distribution histogram til at vise deres rækkevidde (figur 2 H).

4. kvantificering af CTCs i ICC-min bruger partikel baseret analyse

Før analysere film i Volumetry med PTCLs, vil den rumlige og tidsmæssige kalibrering af filmen skal indsættes i filnavnet. Redigere alle filer der skal analyseres i Volumetry at indeholde inden for titlen antallet sekunder, som hvert billede er lig med og også antallet af mikron, der svarer til hver pixel adskilt af en enkelt streg, med de værdier, der er indkapslet i firkantede parenteser. Eksempelvis en film, der er erhvervet på 33 FPS med en 60 x mål (512 x 512) bør have [0,22-0.033] indsat i dets filnavn.
Åbn Volumetry og bruge højre museklik til at åbne mapper, der indeholder film-filer. Venstre klik på filmfilen skal analyseres for at åbne det i Volumetry (figur 3A, skal være i ukomprimeret TIFF-format).
For at præcist beregne Ca^{2 +} signaler fra den hele FOV, vil filmen første gennemgå differentiering og udjævning for at fjerne baggrunden indblanding (kamera støj, auto fluorescens osv.) og øge signal / støjforhold. I vinduet film, lige falde i hak at opdrage en menu og ved hjælp af højre klik adgang ' STK Filter-differentiere ', lige falde i hak igen for at angive en værdi til at differentiere, tryk på ENTER, og venstre klik for at anvende (for film erhvervet på 33 FPS en værdi af 2 (∆t = ± 66-70 msek) fungerer godt, værdien er steget som satsen for image capture stigninger).
Bemærk: Differentiering i denne sammenhæng vil reducere intensiteten af områder af optagelsen (pixels), der viser ingen dynamisk aktivitet over antallet rammer, der er angivet. Således, hvis der indsættes en værdi på '2', hver pixel i hver ramme af optagelsen er analyseret og hvis inden for rammen der er ingen dynamiske ændringer i pixel fluorescens 1 billede før og 1 billede efter, intensitet inden for disse pixels vil blive fratrukket optagelsen. Således, ikke-dynamisk baggrundsstøj er fjernet og signal til støj er steget.
Glat differentieret filmen ved at anvende en Gaussisk filter. Højreklik i vinduet film til at opdrage en menu og bruger højre klik adgang 'STK Filter-Gauss KRNL', Højreklik igen for at indsætte en værdi (Brug altid et ulige antal, nemlig film erhvervet på 33 FPS, en værdi af 5 fungerer godt, 1,5 x 1,5 µm StAfv 1,0) input en værdi, skal du trykke på ENTER og venstre klik for at anvende (figur 3B).
Begynde at skabe PTCLs ved først at vælge en periode af filmen, som omfatter en inaktiv periode (20 – 40 frames) efterfulgt af forekomst af en CTC og også 20 – 40 rammer efter CTC. Det gør du rulle gennem filmen ved hjælp af MMB rulle venstre mod højre på den gule bjælke.
Med valget, klik brug højre i vinduet film til at få adgang til "STK Ops-rampe DS PTCLinfo" og venstre klik for at anvende. Denne funktion kører en PTCL analyse rutine, som gradvis ramper tærskel fra maksimal intensitet til minimum intensitet. Dette vil blive vist grafisk i vinduet Plot som en plot af støj og også i vinduet spor som tre farvede spor, med den grønne spor viser antallet af PTCLs, det røde spor viser gennemsnitlige PTCL størrelse, og det blå spor viser den absolutte intensitet tærskel.
NOTE: Tal og gennemsnitlige størrelse af PTCLs på hver grænse beregnes automatisk og derefter en semi-manuel tærskel er anvendt ved hjælp af intensiteten på som på som den gennemsnitlige størrelse af PTCLs begynder at falde, som indtræder ved vendepunkt af det røde spor i Vinduet Trace (figur 3D, dvs. på grund af stort antal rumligt begrænset støj PTCLs at reducere den gennemsnitlige størrelse af PTCLs).
I vinduet Plot tryk 'H' til histogrammet balance plottet vist af PTCL støj. Cyklus gennem farveskemaer ved at trykke på ' [' indtil baggrunden er farvet hvid med farvede spor på toppen.
Tryk på 'F' til at opdrage en måling værktøj og venstre klik på grund af skæringspunktet hvor de farvede parceller Skift til højre side. Dette vil markere en enkelt lodret linje i rullepanelet i vinduet spor nedenfor.
I vinduet Trace rulle MMB venstre mod højre fra vendepunkt af det røde spor indtil den markerede hvide lodret linje skabt taktfast 4.10 og sørge for, at det blå spor er markeret ved at højreklikke på det, læse ned af 'yAVG', der skal vises i t han sænke venstre side af vinduet spor. Fravælg valget ved at trykke på MMB en gang inde i vinduet spor.
I vinduet film Tryk på 'C' for at opdrage et farvehjul, så tryk på 'd ' til at justere tærskel. Gyldig PTCLs vil nu blive vist som rød i vinduet film (figur 3 c) og dem at mætte bliver hvide. Fjerne de hvide områder ved at rulle op med venstre museknap.
Rul op eller ned med MMB at justere den gule talværdi i farvehjulet, justere denne værdi til værdien yAVG taget fra trin 4.11. Dette vil tildele alt i rød som en aktiv Ca^{2 +} forbigående PTCL på punktet, bestemmes tærsklen. For at gemme det som en koordinere baseret partikel fil, brug højre klikker til adgang ' STK 3D-Gem PTCLS 0' og derefter til venstre klik for at gemme filen.
Lukke Volumetry og genåbne. Åbn filen PTCL (.gpf fil) skabt taktfast 4.13. I denne filtype gemmes alle aktive Ca^{2 +} transienter som en ensartet blå PTCL (figur 3). Da hver PTCL er en enkelt enhed med sin egen ID, område og omkreds koordinater, stat flag (se nedenfor) og resultatet arrays, strømlinet analyse af spatio-temporale karakteristika af PTCLs, eller mellem PTCLs.
Til at begynde PTCLs analyse, fjerne enhver resterende PTCL støj (lille ugyldig PTCLs oprettes, når filen .gpf er genereret) ved hjælp af højre klik i vinduet film til at få adgang til ' PTCL STKOPS-Flag ptcls > Min = 70' og venstre klik for at anvende. Denne handling vil hoved PTCLs større end 6 µm² (~ diameter > 2µm) og Volumetry vil tildele dem til 'FLAG 1' udvalg. Når dette er fuldført, vises PTCLs, der ligger over denne tærskel (FLAG 1) som en lys lilla farve i vinduet film, der henviser til, at enhver PTCLs tærskel vil forblive deres blå bundfarve (figur 3F).
Opret varme kort repræsentationer af PTCL aktivitet ved hjælp af højre klik i vinduet film til at få adgang til ' PTCL STKops-StatMap Flag ='. Ved at højreklikke på denne endelige sti, kan et flag opgave at analysere angives. Således, hvis der ønsker at kvantificere PTCLs tildelt FLAG1, blot indtaste '1', skal du trykke på ENTER og derefter venstre klik for at anvende. Dette vil generere et varmekort viser de samlede PTCLs for hele længden af optagelse, med forskellige farver repræsenterer forekomst (%) i hele optagelsen (figur 3 g, varme farver viser øget forekomst på denne placering).
Gemme varme kort ved at højreklikke på dem for at få adgang til 'STM belastning Gem - gemmer STM som .tif' og derefter venstreklikke for at gemme som en TIFF-fil.
Kvantificere PTCL aktivitet ved hjælp af højre klik i vinduet film til at få adgang til ' PTCL foranstaltning-PTCLStats STK =', ved at højreklikke på denne endelige sti, der kan indtastes et flag opgave at analysere. Således, hvis der ønsker at kvantificere PTCLs tildelt FLAG1, blot indtaste '1', skal du trykke på ENTER og derefter venstre klik for at anvende. Dette vil generere en række spor i vinduet spor.
Volumetry vil som standard oven PTCL spor genereret i trin 4.17 oven på hinanden. Adskille dem ved hjælp af lige klikker i vinduet spor til at få adgang til "Juster-separat spor" og venstre klik for at anvende. Dette vil afsløre de fire forskellige PTCL spor, at kvantificere de Ca^{2 +} PTCL aktivitet i filmen viser PTCL område (grøn), PTCL count (rød), PTCL størrelse (cyan) og PTCL størrelse standardafvigelse (blå) plottes tid (figur 3 H).
Disse spor kan gemmes som en tekstfil, der kan importeres til et regnearksprogram for yderligere analyse. For at gemme spor, holde Skift nede og bruge klikker lige i vinduet spor til at få adgang til 'Assorted-Dump ROI som tekst' og venstre klik for at gemme filen. Disse oplysninger er derefter indsamlet og illustreret i histogrammer eller andre passende grafiske repræsentationer (figur 3 H).
For at se på den første forekomst af PTCLs (dvs., at se på fyring sites), får disse indledende PTCLs et andet flag opgave. Til bedre isolat fyring steder indtræffer inden for netværket, kun de PTCLs, der ikke overlapper med partikler i den forrige ramme men overlapning med partikler i de næste 70 ms anses fyring websteder.
Hvis du vil anvende denne tærskel, brug højre klik i vinduet film til at få adgang til ' PTCL adfærd-F1 InitSites > F = 3' og venstre klik for at anvende. Dette vil tildele indlede PTCLs som 'FLAG 3', og PTCLs, der opfylder dette kriterium vises nu som en lime grøn farve i filmen (figur 4A).
Volumetry giver også mulighed for at kvantificere og afbilde antallet af PTCL fyring websteder i en given FOV samt plotte deres sandsynlighed for fyring under en CTC. For at analysere disse parametre, skal du oprette en zonekort til at indlede PTCLs (FLAG 3) som beskrevet i trin 4.16 (figur 4B).
Venstre klik i vinduet Plot og derefter trykke på 'C' til at opdrage en kolorere hjul, og tryk på 'd ' til tærskel. Zonekort til at indlede PTCLs vil derefter vende grå og hvid. Fjern alle hvide ved at rulle med venstre museknap og tærskel PTCLs i varmekort, således at kun gyldig PTCLs er dækket i grå (justere tærskel ved at rulle op og ned med MMB).
Brug klikker højre over zonekort i vinduet Plot til at få adgang til 'STM PTCLs-Find PTCLs 70' og venstre klik for at anvende. Dette vil tildele alle grå PTCLs i kortet, der er større end 70 pixels² i størrelse fordeles som en separat farvekodede indledning PTCL eller PTCL fyring websted (figur 4 c).
Plot aktivitet af hver af disse fyring websteder mod tid ved at højreklikke på PTCL fyring kort og adgang til 'STM PTCLs-Opret PTCL rois' og venstreklikke gælde. Dette vil generere et nyt billede i vinduet film med alle de separate farvede PTCL fyring websteder, der vises med en ROI omkring dem.
Brug lige klikker i vinduet film til at få adgang til ' PTCL foranstaltning-PTCLpixROIBM > = 1' og venstre klik for at anvende. Dette vil identificere alle ROIs i vinduet film, der indeholder mindst én PTCL og vil afbilde al aktivitet inden for disse ROIs i vinduet spor. Som standard vil disse spor oven på hinanden. For at adskille dem, klik brug højre i vinduet spor til at få adgang til "Juster-separat spor" og venstre klik for at anvende. For at gemme spor, holde Skift nede og bruge klikker lige i vinduet spor til at få adgang til 'Assorted-Dump ROI som tekst' og venstre klik for at gemme filen.
Aktiviteten af hver fyring site kan også afbildes som en forekomst kort. For at gøre dette, brug højre klik i vinduet film til at få adgang til ' PTCL foranstaltning-ROI Pianola = 10' og venstre klik for at anvende. Dette vil generere et plot af alle fyring websteder mod tiden i vinduet Plot. Hver fyring websted vises som et separat farvet enhed, hver i sin egen vognbane og disse grunde svarer til Ca^{2 +} PTCLs indledning under CTCs (figur 4DE) Gem disse forekomst kort ved at højreklikke på dem for at få adgang til ' STM Belastning Gem - gemmer STM som .tif ' og derefter venstreklikke for at gemme som en TIFF-fil.
For at sætte tal på sandsynligheden for fyring på hver fyring websted under en CTC, brug højre klik i vinduet film til at få adgang til ' PTCL adfærd-Mark er = 1' og venstre klik for at anvende. Dette vil identificere alle rammer i filmen, der indeholder PTCLs tærskel og disse vil være markeret i bunden af vinduet film som lodrette blå streger.
CTCs åbenbart som hurtige klynger af asynkrone fyring fra flere fyring websteder inden for FOV med ~ 1 s huller i mellem hver CTC cyklus. Denne regelmæssighed og lang kløft af ingen aktive PTCLs mellem CTCs bruges til at definere yderligere en CTC for analyse.
Brug lige klikker i vinduet film til at få adgang til ' PTCL adfærd-blok er kløften < =', og brug et Højreklik på det sidste punkt for at indtaste et tal. Denne kommando vil gruppere de aktive PTCL rammer identificerede i trin 4.28 i blokke og blokke er baseret på antallet rammer, der adskiller aktive PTCLs. Til optagelser af 33 FPS for eksempel, fungerer en værdi af 10 godt. Hvis aktive PTCLS er mindre end 10 billeder fra hinanden (330 ms) er de grupperet i en enkelt blok til analyse (blokke vises derefter som pink rektangler over de lodrette blå streger nederst i vinduet film med hver pink rektangel der nu angiver en CTC).
Brug klikker lige i vinduet film til at få adgang til 'PTCL foranstaltning-PTCL begivenhed Prob'. Dette vil generere en tekstfil, der kan importeres til et regnearksprogram. Denne tekstfil vil give et stort antal data på arten af de indledning websteder, der blev defineret fra trin 4.16 – 4.23 og deres bidrag til CTCs.
Bemærk: Tekstfil vil vise antallet af indledningen websteder (benævnt 'domains'), størrelsen af webstedet i pixel og μm², sandsynligheden for hver indledning site fyring enten én gang eller flere gange i løbet af hver CTC (givet som en %), den gennemsnitlige varighed og størrelse PTCLs opstår på anlægget i indledningen, cyklus antallet af CTC cyklusser (som defineret i trin 4.23) og procentdelen af fyring websteder, der affyret under hver CTC. Disse oplysninger er indsamlet og illustreret i histogrammer eller andre passende grafiske repræsentationer (figur 4F).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af Kit-Cre-GCaMP6F mus (figur 1), dynamisk Ca^{2 +} signalering opførsel af ICC i mave-tarmkanalen kan være afbildet på stedet. Med Konfokal mikroskopi, kan høj opløsning billeder af bestemte populationer af ICC erhverves uden forurener signaler fra andre populationer af ICC i det samme væv, men i anatomisk adskilte fly af fokus (figur 2A)³⁷ ^, ³⁹ ^, ⁴⁰ ^, ⁴¹. er det muligt at optage korte (< 100 ms), lokaliseret Ca^{2 +} begivenheder, der ikke var muligt med membran gennemtrængelig Ca^{2 +} indikatorer. Spatio-temporale kortlægning med Volumetry eller ImageJ software kan bruges til at generere STM'er af alle Ca^{2 +} begivenheder i celler på stedet. Brug denne fremgangsmåde, Ca^{2 +} begivenheder i en hele FOV kan visualiseres og kortlagt (figur 2BC), snarere end blot optagelse en enkelt ROI begrænsede aktivitet. Disse metoder kan udvides til hver celle i en given FOV, at sikre indsamling af repræsentative data fra alle celler og giver kvantitative oplysninger om relative amplituder, forbigående varigheder, satsen for stigning og fald af transienter, etc. (figur 2E , F). STM analyse, i modsætning til ROI-baseret intensitet parceller, giver også mulighed for at overvåge og registrere rumlige Karakteristik af Ca^{2 +} signalering, såsom rumlige udbredelse og formering hastighed, som vist i figur 2 g. Denne information kan være samlet for at give en temmelig komplet visning af Ca^{2 +} signalering adfærd i celler i deres native miljøer (figur 2 H).

PTCL analyse kan bruges til at kvantificere mere komplekse Ca^{2 +} signalering adfærd, såsom dem, der forekommer inden for sammenkoblede mobilnetværk. Et eksempel på denne ansøgning er fastsat af analysen udføres på ICC-min (figur 3A). Normalt i sådanne komplekse forberedelsen, kan baggrundsstøj og signal til støj være et problem. Dog kan bruger Volumetry software til at anvende differentieret og udglatning filtre på film af Ca^{2 +} aktivitet og derefter anvende støj tærskel protokoller til at filtrere baggrundsstøjen støj (figur 3B-D) fjernes fra komplekse optagelser af dynamisk aktivitet. Ved hjælp af PTCL analyse som vist i figur 3E-G, kvantitative oplysninger om Ca^{2 +} kan signalering beregnes ved at måle PTCL område, PTCL count og PTCL størrelse som angiver rumlige intervaller af aktivering af Ca^{2 +} signaler i en FOV. Disse data kan samles som vist i figur 3 H og analyseres statistisk, som passende. Figur 4 illustrerer, hvordan PTCL analyse giver mulighed for i dybden kvantificering af subcellulære Ca^{2 +} signalering ved at undersøge placeringen og fyring sandsynligheder af Ca^{2 +} fyring websteder. Ved at tildele PTCLs til forskellige flag baseret på deres tidsmæssige karakteristika, indleder PTCLs kan være kortlægges nøjagtigt som vist i figur 4 c-E og en rigdom af hårde data erhvervet på antallet af indledningen websteder (omtalt som ' domæner), størrelsen af webstedet i pixel og µm², sandsynligheden for hver indledning site fyring enten én gang eller flere gange i løbet af hver CTC (givet som en %), den gennemsnitlige varighed og størrelse af PTCLs sker på webstedet indledning antallet af CTC cykler (som defineret i trin 4.23) og % af fyring websteder, der affyret under hver CTC cyklus. Disse teknikker giver mulighed for et højt niveau af datamining og kvantificering af in situ Ca^{2 +} signaler forekommer i en intakt cellular netværk, ikke der er muligt med ROI-baserede analyser.

Figur 1: Generation af KitGCaMP6f mus. Skematisk diagram over hvordan Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f mus) blev krydset med c-Kit^{+/ Cre-ERT2} (Kit-Cre mus) til at generere Kit-Cre-GCaMP6f mus. Disse mus er injiceret med tamoxifen i en alder af 6-8 uger til at fremkalde Cre Recombinase og efterfølgende GCaMP6f udtryk udelukkende i ICC. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Analyse af stokastiske Ca^{2 +} signaler i ICC-DMP bruger spatio-temporale kortlægning (STM). (A) repræsentativt billede af flere ICC-DMP fra tyndtarmen Kit-Cre-GCaMP6F musen på stedet. En grøn ROI angiver størrelsen og retningen af ROI henlede omkring en enkelt ICC-DMP inden for FOV at skabe en STM i Volumetry. (B) STM af Ca^{2 +} aktivitet i ICC-DMP fremhævet i panelet A efter det har været korrekt kalibreret for amplitude, tid og rum. (C) den samme STM vist i panelet B efter det er blevet farvekodet med en opslagstabel (QUBPallete). (D) udvidet billedet af ICC-DMP Ca^{2 +} transienter vises på en farve kodet STM, der angiver, hvor man kan trække en linje gennem et Ca^{2 +} event over sin tid (x) akse til at oprette et plot profil af sin aktivitet i ImageJ. (E) Plot profil af Ca^{2 +} event fremhævet i panelet D, der angiver, hvor linjerne vist blive draget til præcist foranstaltning amplitude og varighed af hændelsen. (F) Plot profil af Ca^{2 +} event fremhævet i panelet D, der angiver, hvor linjerne vist blive draget til præcist foranstaltning anledning og sats af fall af hændelsen. (G) udvidet billedet af ICC-DMP Ca^{2 +} transienter vises på en farve kodet STM, der angiver, hvor man kan trække en linje gennem et Ca^{2 +} event over sin plads (y) akse til at præcist at måle dens rumlige udbredelse. (H) repræsentative histogrammer poolede data fra ICC-DMP illustrerer hvordan til grafisk at vise amplitude, varighed og geografisk spredning værdier erhvervet fra at følge trinene ovenfor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: kvantificering af CTCs i ICC-min bruger partikel baseret analyse. (A) repræsentativt billede af en ICC-mit netværk fra tyndtarmen Kit-Cre-GCaMP6F musen på stedet. (B) billede taget fra optagelse vist i panelet A efter det har undergået en differentieret filter af Δt = ±66 – 70 ms og en Gaussisk filter 1,5 x 1,5 µm, StAfv 1.0. (C) billede taget fra video i B efter tærskel blev afsluttet med PTCLs over tærsklen, vist med rødt. (D) spor af PTCL tælle og betyde PTCL størrelse i en tærskel protokol til at fjerne støj i filmen vist i panelet B. PTCLs blev skabt ved hjælp af en oversvømmelse-fill algoritme, der markerede strukturen af alle tilstødende pixel, der havde intensiteter over tærsklen, Ca ^{2 +} forbigående PTCLs var større end støj PTCLs. Den tærskel, hvor stort antal små mellemstore støj PTCLs dukkede op og begyndte at reducere den gennemsnitlige størrelse af PTCLs kan bruges som en fælles grænse for alle optagelser. (E) repræsentative billede fra Koordinatbaserede Ca^{2 +} PTCL fil oprettet fra thresholded optagelse i C. (F) repræsentative billede taget fra filen PTCL e efter en screeningskriterierne af > 6 µm² (diameter ~ 2 µm eller mindre) blev anvendt; PTCLs ovenfor denne grænse er markeret (FLAG 1) som lys lilla partikler og betragtes som gyldige PTCLs. (G) varmekort viser de samlede PTCLs (FLAG 1) for hele optagelsen af video vist i panelet F, med total PTCLs summated med farver repræsenterer forekomst i hele optagelsen (varme farver viser øget forekomst på denne placering). (H) repræsentative spor af PTCL område (blå) og PTCL count (rød) afledt af PTCL fil oprettet i panelet A-G. Repræsentative histogrammer poolede data fra flere forsøg er vist under sporene. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Analyse af Ca^{2 +} fyring websteder i ICC-min bruger partikel baseret analyse. (A) repræsentative billede taget fra filen PTCL af figur 3E efter FLAG 1 PTCLS er yderligere raffineres til FLAG 3, Flagstatus for Ca^{2 +} fyring websteder. FLAG 3 PTCLs vises som limegrøn (kun de PTCLs, der ikke overlapper med partikler i den forrige ramme men overlapning med partikler i de næste 70 ms ansås fyring websteder). (B) varme kort der viser de samlede PTCLs (FLAG 3) for hele optagelsen af video vist i panelet A, med total PTCLs lægges sammen med farver repræsenterer forekomst i hele optagelsen (varme farver viser øget forekomst på denne placering). (C) repræsentative kort af Ca^{2 +} fyring websteder vises i panelet B, med hver anden fyring site tildelt en anden identificerende farve. (D) repræsentative spor af PTCL område (blå) og PTCL tælle (rød) afledt af PTCL fil oprettet i figur 3A-G. (E) en forekomst kort over aktiviteten af enkelte fyring websteder. Hver fyring websted inden for FOV vises som en farvet blok i sin egen vognbane mod tiden. (F) repræsentative histogrammer poolede data fra flere forsøg er vist illustrerer værdier akkumulere for Ca^{2 +} fyring site fyring sandsynlighed / CTC og antallet af Ca^{2 +} fyring websteder i en FOV. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ca^{2 +} billeddannelse af bestemte typer celleområde intakt væv eller inden for netværk af celler ofte afslører komplekse mønstre af Ca^{2 +} transienter. Denne aktivitet kræver omhyggelig og dybdegående analyser og kvantificering til at fange så mange oplysninger om de underliggende begivenheder og kinetik af disse begivenheder som muligt. STM og PTCL analyse giver en mulighed for at maksimere mængden kvantitative data givet fra optagelser af denne type.

Smalt, spindel formet morfologi af ICC-DMP gør dem velegnet til STM analyse afledt af STM'erne skitseret ovenfor. Denne analyse er imidlertid ikke velegnet til ICC-min der er Stjernehus, formet og forbundet i et netværk (figur 3A). Derudover er Ca^{2 +} signaling mønstre i ICC-min mere komplekse, manifesterer sig som formeringsmateriale CTCs fra flere steder af oprindelse i hele ICC-netværket. Således, for at kvantificere den aktivitet, der opstår i den hele ICC-mit netværk inden for en FOV, partikel (PTCL) analyse blev implementeret ved hjælp af custom made software (Volumetry, version G8d, GWH, betjenes på Mac OS, kontakt Grant Hennig grant.hennig@med.uvm.edu angående henvendelser for Volumetry adgang og brug).

STM analyse giver alle Ca^{2 +} begivenheder inden for enkelte celler og alle celler i en FOV skal analyseres kritisk på tværs af en række rumlige og tidsmæssige parametre. Protokollen beskrev illustrerer, hvordan disse teknikker kan anvendes til ICC-DMP i tyndtarmen, mus. Af fuldt kvantificere Ca^{2 +} signalering i ICC-DMP, som vist i figur 2B-G, Ca^{2 +} signalering mønstre er blevet karakteriseret i detaljer³⁷. Disse analyser har været anvendt til indspilninger hvor ICC-DMP gennemgå interventioner til fint kvantificere virkningerne af blokering eller stimulere Ca^{2 +} release / Ca^{2 +} tilstrømning / neurotransmission veje³⁷^,³⁹ ^, ⁴⁰ ^, ⁴¹. disse teknikker kan let anvendes på andre intakt væv præparater. For eksempel, er STM analyse som beskrevet her blevet udnyttet til at identificere nye mekanistiske veje involveret i generation af intracellulære Ca^{2 +} bølger indspillet i urethral glatte muskulatur i situ⁵⁷.

Forberedelse af STM'erne i Volumetry kræver nogle forsigtighed, da funktionen i Volumetry, der skaber STM fra den trukket ROI (figur 2A) er en gennemsnitlig værdi af intensitet. Amplituden af Ca^{2 +} signaler kunne således potentielt blive udvandet, hvis ROI er trukket bredere eller længere end Ca^{2 +} event eller celle af interesse. Brugere bør således forsigtig med at tegne ROIs, der er så stramt montering som muligt til Ca^{2 +} signaler eller bestemt celle, som de analyserer for at afhjælpe dette problem. Ligeledes, skabe STMS bruger enkelt pixel linescans i ImageJ betyder at nøjagtigt kortlægning af Ca^{2 +} begivenheder er underlagt nærhed af Ca^{2 +} signal til den tegnede linje. Sådanne bekymringer er mindre i tynde spindel formet celler såsom ICC-DMP, men andre celler typer med en mere Stjernehus eller runde morfologi kan gøre denne type analyse af upassende tilknytte alle Ca^{2 +} signaler præcist. Når du forbereder STM'erne for analyse, uanset om de var lavet i Volumetry eller med ImageJ linescans, er der et par områder at blive fremhævet til fejlfindingsformål. Det er vigtigt at ændre billedkvaliteten til 32-bit før udfører alle kalibrering på den STM'er. undladelse af at gøre det, eller gøre det efter kalibrering for F/F₀ kan føre til usammenhængende målinger på tværs af eksperimenter. Altid kontrollere billedkvaliteten af STM, som er anført i det øverste område af den hvide kant af STM, selv når de åbnes med ImageJ. En anden potentiel område af uoverensstemmelse valg af F₀ værdi når kalibrering for amplitude. Det er afgørende, for at markere området for F₀, at det dækker et område af den celle, der er ensartet og i fokus. Af denne grund, områder af cellen, der har en ustabil basal fluorescens eller at ændre på grund af bevægelse eller andre artefakter er ikke ideel og stringent bevægelse stabilisering protokoller bør være ansat i disse tilfælde.

Inden for in situ eller kulturperler præparater indeholdende sammenkoblet mobilnetværk, såsom ICC-min i den lille tarmen, PTCL analyse giver en strømlinet teknik til at kvantificere komplekse, subcellulært Ca^{2 +} begivenheder forekommer i netværket. Desuden, det giver også alle Ca^{2 +} begivenheder i netværk inden for en given FOV skal analyseres, snarere end ved hjælp af vilkårlige ROIs, som kun give oplysninger om hyppighed og intensitet i ROI. En fordel af PTCL analyse beskrevet her er at ved at anvende differentieret og Gaussisk gulvafslibning filtre til optagelser, en stor mængde af støj kan fjernes fra film, der kan indeholde kontaminerende lys fra celler ikke af interesse eller på grund af ikke-dynamisk lyse pletter eller optagelser. Det er vigtigt at bemærke, at mængden af differentiering anvendes til optagelser i høj grad vil afhænge af erhvervelse sats anvendes af eksperimentatoren. Differentiere film som beskrevet i protokollen giver et middel til at anvende et filter til filmen til at fjerne højfrekvente støj fra optagelser. Anvende en differentiering værdi på '2', når erhverve ved 33FPS fungerer godt til at fjerne baggrundsstøj samtidig opretholde god signal til støj (hvis værdien er for lav, støj vil blive afhentet men signal til støj vil blive kompromitteret, hvis værdien er for høj). Den differentiering værdi anvendes bør forhøjes med hurtigere erhvervelse priser, for eksempel på 100 FPS, en differentiering værdien af '7' giver ca det samme signal-støj-forhold som en værdi på '2' til en 33FPS optagelse. Eksperimentatorer bliver nødt til at optimere disse indstillinger i overensstemmelse hermed for deres forberedelser og optagelse betingelser.

Tærskel protokollen beskrevet i figur 3D giver en ensartet tærskel procedure skal anvendes på forskellige optagelser foretaget på forskellige systemer med forskellige erhvervelse software. Denne fleksibilitet giver mulighed for data fra flere investigatorer på forskellige systemer til at udarbejde deres optagelser til det samme datasæt. Ved hjælp af FLAG system i Volumetry, tillader PTCL analyse Visualisering og kvantificering af individuelle Ca^{2 +} fyring sites inden for et netværk i detaljer. Oplysninger kan indsamles på antallet af indledningen websteder, størrelsen af webstedet i pixel og µm², og den gennemsnitlige varighed af PTCLs sker på dette websted. Denne PTCL analyse tilladt den første karakterisering af CTC aktivitet i tyndtarmen på en sub cellulært niveau, og ved hjælp af de forskellige flag i Volumetry software, PTCLs på begge netværk og enkelte fyring site niveau var kvantificeret i intakt væv præparater fra Kit-Cre-GCaMP3 mus³⁸. Fra disse indledende bemærkninger, denne analyse har været yderligere udnyttet til at studere roman Ca^{2 +} tilstrømning veje i GI ICC-min som butik-drevet-Ca^{2 +}-post⁴² og rollen mitokondriel Ca^{2 +} signalering på GI pacemaking ⁴¹. meget gerne STM analyse ovenfor beskrevne, PTCL analyse kan være let tilpasses til forskellige intakt præparater end den i denne protokol beskrevne. For eksempel en nylig undersøgelse bruges PTCL analyse til at undersøge nye rytmiske Ca^{2 +} hændelser, som forekommer i de intakte cellular netværk af lamina propria af rotte urinblæren⁵⁸^,⁵⁹ og således kunne være nemt anvendes til andre komplekse, intakt cellulære systemer såsom neuronal systemer. Mens dette papir fokuseret på Ca^{2 +} imaging i intakt væv med GECIs, kan disse analyseteknikker også køres på isolerede celler og væv fyldt med traditionelle Ca^{2 +} indikator farvestoffer. STM baseret analyse har været anvendt til med held kvantificere lokaliseret Ca^{2 +} signaler og Ca^{2 +} bølger fra spindel formet interstitielle celler og glatte muskelceller fra en lang række præparater¹¹^,⁶⁰ ^, ⁶¹ ^, ⁶² ^, ⁶³. Desuden PTCL analyse rutiner beskrevet her er også blevet anvendt til in situ netværk forberedelserne visualiseret med Cal 520⁵⁸^,⁵⁹. Disse undersøgelser fastholder imidlertid også ulemperne ved sådanne farvestof lastning protokoller såsom tvetydige celle identifikation og problemer med signal til støj.

Eksemplerne illustreret ovenfor viser, at både STM og PTCL analyse er meget formbart teknikker, der kan bruges til at kvantificere komplekse Ca^{2 +} signalering i en bred vifte af intakt væv præparater. Tilgange tilbyder mange fordele i forhold til traditionelle ROI baseret intensitet parceller, der har været rutinemæssigt anvendt tidligere og bør give mere værdifuld kvantitative oplysninger på Ca^{2 +} signaling end kunne opnås tidligere efterforskere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Finansieringen blev leveret af NIDDK via P01 DK41315.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageJ software	NIH	1.5a	ImageJ software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit^+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Wellman, G. C., Nelson, M. T. Signaling between SR and plasmalemma in smooth muscle: Sparks and the activation of Ca2+-sensitive ion channels. Cell Calcium. 34 (3), 211-229 (2003).
Mironneau, J., Arnaudeau, S., Macrez-Lepretre, N., Boittin, F. X. Ca2+sparks and Ca2+waves activate different Ca2+-dependent ion channels in single myocytes from rat portal vein. Cell Calcium. 20 (2), 153-160 (1996).
Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1793 (6), 933-940 (2009).
Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. Calcium signalling. Current biology. 9 (5), R157-R159 (1999).
Bootman, M. D., et al. Calcium signalling—an overview. Seminars in Cell & Developmental Biology. 12 (1), 3-10 (2001).
Brain, K. L., Bennett, M. R. Calcium in sympathetic varicosities of mouse vas deferens during facilitation, augmentation and autoinhibition. The Journal of Physiology. 502 (3), 521-536 (1997).
Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).
Dupont, G., Goldbeter, A. Problems and paradigms: Oscillations and waves of cytosolic calcium: Insights from theoretical models. BioEssays. 14 (7), 485-493 (1992).
Bootman, M. D., Berridge, M. J. The elemental principles of calcium signaling. Cell. 83 (5), 675-678 (1995).
Berridge, M. J., Dupont, G. Spatial and temporal signalling by calcium. Current Opinion in Cell Biology. 6 (2), 267-274 (1994).
Drumm, B. T., et al. The role of Ca 2+ influx in spontaneous Ca 2+ wave propagation in interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. The Journal of Physiology. 593 (15), 3333-3350 (2015).
Bayguinov, P. O., Hennig, G. W., Smith, T. K. Ca 2+ imaging of activity in ICC-MY during local mucosal reflexes and the colonic migrating motor complex in the murine large intestine. The Journal of Physiology. 588 (22), 4453-4474 (2010).
Drumm, B. T., Sergeant, G. P., Hollywood, M. A., Thornbury, K. D., McHale, N. G., Harvey, B. J. The role of cAMP dependent protein kinase in modulating spontaneous intracellular Ca2+ waves in interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. Cell Calcium. 56 (3), 181-187 (2014).
Nathanson, M. H., Padfield, P. J., O’Sullivan, A. J., Burgstahler, A. D., Jamieson, J. D. Mechanism of Ca2+ wave propagation in pancreatic acinar cells. Journal of Biological Chemistry. 267 (25), 18118-18121 (1992).
Straub, S. V., Giovannucci, D. R., Yule, D. I. Calcium wave propagation in pancreatic acinar cells: functional interaction of inositol 1,4,5-trisphosphate receptors, ryanodine receptors, and mitochondria. The Journal of General Physiology. 116 (4), 547-560 (2000).
Sneyd, J., Tsaneva-Atanasova, K., Bruce, J. I. E., Straub, S. V., Giovannucci, D. R., Yule, D. I. A model of calcium waves in pancreatic and parotid acinar cells. Biophysical Journal. 85 (3), 1392-1405 (2003).
Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. Calcium sparks in smooth muscle. American Journal of Physiology. Cell. 278 (2), C235-C256 (2000).
Nelson, M. T., et al. Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks. Science. 270 (5236), 633-637 (1995).
Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks: Elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 262 (5134), 740-744 (1993).
Parker, I., Choi, J., Yao, Y. Elementary events of InsP3-induced Ca2+ liberation in Xenopus oocytes: Hot spots, puffs and blips. Cell Calcium. 20 (2), 105-121 (1996).
Diliberto, P. a, Wang, X. F., Herman, B. Confocal imaging of Ca2+ in cells. Methods in Cell Biology. 40, 243-262 (1994).
Martínez-Zaguilán, R., Parnami, G., Lynch, R. M. Selection of fluorescent ion indicators for simultaneous measurements of pH and Ca2+. Cell Calcium. 19 (4), 337-349 (1996).
Hayashi, H., Miyata, H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2. The Journal of Pharmacology & Toxicology Methods. 31 (1), 1-10 (1994).
Thomas, D., Tovey, S. C., Collins, T. J., Bootman, M. D., Berridge, M. J., Lipp, P. A comparison of fluorescent Ca2+indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+signals. Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).
Lock, J. T., Parker, I., Smith, I. F. A comparison of fluorescent Ca2+indicators for imaging local Ca2+signals in cultured cells. Cell Calcium. 58 (6), 638-648 (2015).
Flagmeier, P., et al. Ultrasensitive Measurement of Ca 2+ Influx into Lipid Vesicles Induced by Protein Aggregates. Angewandte Chemie International Edition. 56 (27), 7750-7754 (2017).
Tsutsumi, S., et al. Structure-Function Relationships between Aldolase C/Zebrin II Expression and Complex Spike Synchrony in the Cerebellum. Journal of Neuroscience. 35 (2), 843-852 (2015).
Rietdorf, K., Chehab, T., Allman, S., Bootman, M. D. Novel improved Ca indicator dyes on the market - a comparative study of novel Ca indicators with Fluo-4. Calcium Signalling: The Next Generation. , 590 (2014).
Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
Seidemann, E., et al. Calcium imaging with genetically encoded indicators in behaving primates. eLife. 5 (2016JULY), (2016).
Su, S., et al. Genetically encoded calcium indicator illuminates calcium dynamics in primary cilia. Nature Methods. 10 (11), 1105-1109 (2013).
Kaestner, L., et al. Genetically encoded Ca2+ indicators in cardiac myocytes. Circulation Research. 114 (10), 1623-1639 (2014).
Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor design. Current Opinion in Chemical Biology. 27, 90-97 (2015).
Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence. PLoS ONE. 12 (2), 1-24 (2017).
Spencer, N. J., et al. Identification of a rhythmic firing pattern in the enteric nervous system that generates rhythmic electrical activity in smooth muscle. The Journal of Neuroscience. , 3489 (2018).
Hibberd, T. J., et al. Synaptic Activation of Putative Sensory Neurons By Hexamethonium-Sensitive Nerve Pathways in Mouse Colon. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. (861), (2017).
Baker, S. A., Drumm, B. T., Saur, D., Hennig, G. W., Ward, S. M., Sanders, K. M. Spontaneous Ca(2+) transients in interstitial cells of Cajal located within the deep muscular plexus of the murine small intestine. The Journal of Physiology. 594 (12), 3317-3338 (2016).
Drumm, B. T., et al. Clustering of Ca2+ transients in interstitial cells of Cajal defines slow wave duration. The Journal of General Physiology. 149 (7), 703-725 (2017).
Baker, S. A., Drumm, B. T., Cobine, C. A., Keef, K. D., Sanders, K. M. Inhibitory Neural Regulation of the Ca2+ Transients in Intramuscular Interstitial Cells of Cajal in the Small Intestine. Frontiers in Physiology. 9 (April), 1-24 (2018).
Baker, S. A., et al. Excitatory Neuronal Responses of Ca 2+ Transients in Interstitial Cells of Cajal in the Small Intestine. eNeuro. 5 (2), (2018).
Drumm, B. T., Sung, T. S., Zheng, H., Baker, S. A., Koh, S. D., Sanders, K. M. The effects of mitochondrial inhibitors on Ca2+signalling and electrical conductances required for pacemaking in interstitial cells of Cajal in the mouse small intestine. Cell Calcium. 72, 1-17 (2018).
Zheng, H., Drumm, B. T., Earley, S., Sung, T. S., Koh, S. D., Sanders, K. M. SOCE mediated by STIM and Orai is essential for pacemaker activity in the interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. Science Signaling. 11 (June), (2018).
Zhu, M. H., et al. A Ca(2+)-activated Cl(-) conductance in interstitial cells of Cajal linked to slow wave currents and pacemaker activity. The Journal of Physiology. 587 (20), 4905-4918 (2009).
Zhu, M. H., Sung, T. S., O’Driscoll, K., Koh, S. D., Sanders, K. M. Intracellular Ca(2+) release from endoplasmic reticulum regulates slow wave currents and pacemaker activity of interstitial cells of Cajal. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 308 (8), C608-C620 (2015).
Zhu, M. H., et al. Muscarinic activation of Ca2+-activated Cl- current in interstitial cells of Cajal. The Journal of Physiology. 589 (Pt 18), 4565-4582 (2011).
Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine. The Journal of Physiology. 480 (Pt 1), 91-97 (1994).
Huizinga, J. D., Thuneberg, L., Klüppel, M., Malysz, J., Mikkelsen, H. B., Bernstein, A. W/kit gene required for interstitial cells of cajal and for intestinal pacemaker activity. Nature. 373 (6512), 347-349 (1995).
Ordog, T., Ward, S. M., Sanders, K. M. Interstitial cells of Cajal generate electricial slow waves in the murine stomach. The Journal of Physiology. 518 (1), 257-269 (1999).
Sanders, K. M., Ward, S. M., Koh, S. D. Interstitial cells: regulators of smooth muscle function. Physiological Reviews. 94 (3), 859-907 (2014).
Ward, S. M., McLaren, G. J., Sanders, K. M. Interstitial cells of Cajal in the deep muscular plexus mediate enteric motor neurotransmission in the mouse small intestine. The Journal of Physiology. 573 (1), 147-159 (2006).
Komuro, T. Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. The Journal of Physiology. 576 (3), 653-658 (2006).
Komuro, T. Comparative morphology of interstitial cells of Cajal: ultrastructural characterization. Microscopy Research and Technique. 47 (4), 267-285 (1999).
Sanders, K. M., Ward, S. M., Koh, S. D. Interstitial Cells: Regulators of Smooth Muscle Function. Physiological Reviews. 94 (3), 859-907 (2014).
Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+dynamics in the awake mouse brain. PLoS ONE. 12 (7), e0181113 (2017).
Truett, G. E., Heeger, P., Mynatt, R., Truett, A. A., Walker, J. A., Warman, M. L. Preparation of PCR quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT). BioTechniques. 29 (52), 54 (2000).
The Jackson Laboratory. , Available from: https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:5:0::NO:5:P5_MASTER_PROTOCOL_ID,P5_JRS_CODE:27076,028865 (2017).
Drumm, B. T., et al. Ca 2+ signalling in mouse urethral smooth muscle in situ role of Ca 2+ stores and Ca 2+ influx mechanisms. The Journal of Physiology. 596 (8), 1433-1466 (2018).
Heppner, T. J., Hennig, G. W., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Rhythmic Calcium Events in the Lamina Propria Network of the Urinary Bladder of Rat Pups. Frontiers in Systems Neuroscience. 11 (December), 1-16 (2017).
Heppner, T. J., Hennig, G. W., Nelson, M. T., May, V., Vizzard, M. A. PACAP38-Mediated Bladder Afferent Nerve Activity Hyperexcitability and Ca 2 + Activity in Urothelial Cells from Mice. Journal of Molecular Neuroscience. 1, (2018).
Griffin, C. S., et al. Muscarinic Receptor Induced Contractions of the Detrusor are Mediated by Activation of TRPC4 Channels. Journal of Urology. 196 (6), 1796-1808 (2016).
Sergeant, G. P., Craven, M., Hollywood, M. A., Mchale, N. G., Thornbury, K. D. Spontaneous Ca2+waves in rabbit corpus cavernosum: Modulation by nitric oxide and cGMP. Journal of Sexual Medicine. 6 (4), 958-966 (2009).
Bradley, E., et al. Novel Excitatory Effects of Adenosine Triphosphate on Contractile and Pacemaker Activity in Rabbit Urethral Smooth Muscle. Journal of Urology. 183 (2), 801-811 (2010).
Drumm, B. T., et al. The effect of high [K + ] o on spontaneous Ca 2+ waves in freshly isolated interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. Physiological Reports. 2 (1), e00203 (2014).

Biology

Anvendelser af Spatio-temporale kortlægning og partikel analyseteknikker til at kvantificere intracellulære Ca^{2 +} signalering In Situ

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.