Biology

Aplicaciones de la cartografía espacio-temporal y técnicas de análisis de partículas para cuantificar Ca intracelular^{2 +} señalización In Situ

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58989

Bernard T. Drumm¹, Grant W. Hennig², Salah A. Baker¹, Kenton M. Sanders¹

¹Department of Physiology and Cell Biology, University of Nevada Reno School of Medicine, ²Department of Pharmacology, The Robert Larner, M.D. College of Medicine, University of Vermont

Summary

Ca^{2 +} indicadores genético codificados (GECIs) han cambiado radicalmente cómo in situ Ca^{2 +} proyección de imagen se realiza. Para maximizar la recuperación de datos de esas grabaciones, análisis apropiado de señales de Ca^{2 +} se requiere. Los protocolos en este trabajo facilitan la cuantificación de Ca^{2 +} señales grabadas in situ utilizando Cartografía espacio-temporal y el análisis de partículas.

Abstract

CA^{2 +} proyección de imagen de células aisladas o tipos específicos de células dentro de tejidos intactos a menudo revela patrones complejos de Ca^{2 +} señalización. Esta actividad requiere cuidadosos y profundo análisis y cuantificación para capturar toda la información sobre los eventos subyacentes como sea posible. Espacial, temporal y los parámetros de intensidad intrínsecos al Ca^{2 +} señales tales como frecuencia, duración, propagación, velocidad y amplitud pueden proporcionar información biológica necesaria para la señalización intracelular. Alta resolución Ca^{2 +} la proyección de imagen típicamente resultados en la adquisición de grandes archivos de datos que son lentos al proceso en cuanto a la traducción de la información de imagen en datos cuantificables y este proceso puede ser susceptible a sesgo y error humano. Análisis de Ca^{2 +} señales de células in situ por lo general se basa en mediciones de intensidad simple de arbitrariamente las regiones de interés (ROI) dentro de un campo de visión (FOV). Este enfoque ignora gran parte de la información de señalización importante contenida en el FOV. Por lo tanto, para maximizar la recuperación de la información de tales grabaciones de alta resolución obtenidos con tintes de Ca^{2 +}o optogenetic Ca^{2 +}imagen, adecuado análisis espacial y temporal de las señales de Ca^{2 +} se requiere. Los protocolos descritos en este artículo describen cómo se puede obtener un gran volumen de datos de Ca^{2 +} proyección de imagen las grabaciones para facilitar el más completo análisis y cuantificación de Ca^{2 +} señales de las células usando una combinación de mapa espacio-temporal (STM)-basado en el análisis y el análisis de partículas. Los protocolos también describen cómo diferentes patrones de Ca^{2 +} señalización observada en células diferentes poblaciones in situ pueden ser analizadas adecuadamente. Por ejemplo, el método examinará Ca^{2 +} en una población especializada de células en el intestino, células intersticiales de Cajal (ICC), usando GECIs.

Introduction

CA^{2 +} es un mensajero intracelular ubicuo que controla una amplia gama de procesos celulares, tales como músculo contracción¹^,², metabolismo³, celular proliferación³^,⁴^, ⁵, estimulación de liberación de neurotransmisor en el nervio terminales⁶^,⁷y la activación de la transcripción de factores en el núcleo. ⁷ Ca intracelular^{2 +} señales muchas veces tomar la forma de elevaciones transitorias en citosólica Ca^{2 +}, y estos pueden ser espontáneos o surgen de la estimulación agonista dependiendo el tipo de célula⁸. Espacial, temporal y los parámetros de intensidad intrínsecos al Ca^{2 +} señales tales como frecuencia, duración, propagación, velocidad y amplitud pueden proporcionar la información biológica necesaria para la señalización intracelular⁵^, ⁷ ^, ⁹. citoplasmática de Ca^{2 +} señales pueden resultar de la afluencia de Ca^{2 +} desde el espacio extracelular o a través de Ca^{2 +} liberación desde el retículo endoplásmico (ER) a través de canales de Ca^{2 +} lanzamiento como receptores de Ryanodina (RyRs) y receptores de inositol-tri-fosfato (IP₃Rs)¹⁰. RyRs y IP₃Rs pueden contribuir a la generación de señales de Ca^{2 +} y la apertura concertada de estos canales, que combinado con diversos mecanismos de Ca^{2 +} afluencia puede resultar en una miríada de Ca^{2 +} patrones de señalización que son formados por los números y abre la probabilidad de Ca^{2 +} flujo canales, el perfil de la expresión de canales de Ca^{2 +} liberación, la proximidad entre el Ca^{2 +} afluencia y canales de la libertad y expresión y distribución de Ca^{2 +} las proteínas de reabsorción y de la protuberancia. CA^{2 +} señales pueden tomar la forma de uniforme, duradero, las oscilaciones globales de intensidad alta que puede durar varios segundos o incluso minutos, multiplicación intracelulares e intercelulares Ca^{2 +} ondas que pueden cruzar distancias intracelulares más de 100 μm¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶, o más breve, espacialmente localizados eventos como Ca^{2 +}chispas y Ca^{2 +} soplos que se producen en decenas de milisegundo plazos y menos de 5 μm¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰.

Microscopía fluorescente se ha utilizado ampliamente para controlar Ca^{2 +} señalización en células aisladas y cultivadas y en los tejidos intactos. Tradicionalmente, estos experimentos incluyeron el uso de fluorescentes Ca^{2 +} indicadores, proporcionales y no proporcionales tintes como Fura2, Fluo3/4 o Rhod2, entre otros ²¹^,²²^,²³. Estos indicadores fueron diseñados para ser permeable a las membranas celulares y luego queda atrapado en las células por el clivaje de un grupo éster mediante esterasas endógenas. Unión del Ca^{2 +} en los indicadores de alta afinidad provocó cambios en la fluorescencia, cuando las células y los tejidos se iluminan por las correspondientes longitudes de onda de la luz. El uso de celular permeable al Ca^{2 +} indicadores mejorado enormemente nuestra comprensión de Ca^{2 +}señalización en las células vivas y permite la resolución espacial y cuantificación de estas señales que no era posible analizando las señales de Ca^{2 +} a través de otros medios, como la electrofisiología. Sin embargo, tradicional Ca^{2 +} indicadores tienen varias limitaciones, como el fotoblanqueo que ocurre durante períodos de grabación extendida²⁴. Mientras que el indicador de Ca^{2 +}nuevos tintes como Cal520/590 tienen mucho mejor señal a proporción de ruido y la capacidad para detectar locales Ca^{2 +} señales²⁵, problemas con el fotoblanqueo pueden todavía sigue siendo una preocupación para algunos investigadores²⁶²⁷^,de^,²⁸. Fotoblanqueo precipitada también restringe el aumento, tasa de adquisición de la imagen, y resolución que se puede utilizar para las grabaciones, como aumentar la potencia objetivo y tasas de adquisición de imágenes requieren mayor intensidad de luz de excitación que aumenta el fotoblanqueo.

Estas limitaciones de tradicional Ca^{2 +} indicador de tintes se agravan cuando grabación de Ca^{2 +} señales in situ, por ejemplo cuando grabación intracelular Ca^{2 +} señales de tejidos intactos. Debido a los problemas mencionados, visualización de Ca^{2 +} señales in situ usando celular permeable al Ca^{2 +}indicadores ha sido limitada a aumento de la energía baja y redujo las tasas de captura de la imagen, restricción de la capacidad de los investigadores para registrar y cuantificar el Ca^{2 +} señales subcelulares temporal o espacialmente restringidas. Así, ha sido difícil de capturar, analizar y apreciar la complejidad espacial y temporal de Ca^{2 +} señales, que pueden ser importantes en la generación de respuestas biológicas deseadas, como se indicó anteriormente. Análisis de Ca^{2 +} señales de células in situ por lo general se basa en mediciones de intensidad simple de las regiones de interés (ROI) dentro de un campo de visión (FOV). La opción arbitraria del número, tamaño y posición del ROI, dependiente en el capricho del investigador, severamente puede sesgar los resultados obtenidos. Así como el sesgo inherente con análisis del ROI, este enfoque ignora gran parte de la importante información contenida en el campo de visión, como dinámica Ca^{2 +} eventos dentro de un arbitrariamente elegido de señalización ROI son seleccionados para el análisis. Además, análisis de ROI no proporcionan información sobre las características espaciales de las Ca^{2 +} señales observadas. Por ejemplo, no es posible distinguir entre un aumento de Ca^{2 +} resultante de una propagación de onda de Ca^{2 +} y un altamente localizada Ca^{2 +} liberan evento de tabulaciones de Ca^{2 +} señales dentro de un retorno de la inversión.

El advenimiento de genéticamente codificados Ca^{2 +} indicadores (GECIs) ha cambiado radicalmente como Ca^{2 +} la proyección de imagen puede ser realizado en situ²⁹^,³⁰^,³¹^,³²^,³³. Hay varias ventajas al uso de GECIs sobre tintes. El más importante quizás es que la expresión de GECI puede realizarse en una manera específica de la célula, que reduce la contaminación de fondo no deseados de las células no de interés. Otra ventaja de GECIs sobre tradicional Ca^{2 +} indicadores es eso fotoblanqueo se reduce (como fluorescencia y consecuencialmente fotoblanqueo sólo ocurre cuando las células están activas), en comparación con muestras, cargado de tinte, particularmente a alta Ampliación y las altas tasas de imagen capturan³⁴. Así, la proyección de imagen con GECIs, tales como la serie de GCaMP de optogenetic sensores, ofrece a los investigadores la capacidad para registrar breve, localizada celular Ca^{2 +} señales en situ e investigar Ca^{2 +} en células dentro de su ambientes nativos que no han sido posibles anteriormente. Para maximizar la recuperación de la información de tales grabaciones de alta resolución, análisis espacial y temporal adecuado de las señales de Ca^{2 +} se requiere. Cabe señalar que mientras GECIs puede ofrecer que algunas ventajas claras, estudios recientes han revelado que Ca^{2 +} la proyección de imagen puede ser realizada con éxito de grandes poblaciones de diferentes clases neuroquímicas de neuronas simultáneamente con las convencionales CA^{2 +} en los indicadores que no están genéticamente codificados en los animales³⁵. Este enfoque utiliza inmunohistoquímica post-hoc para revelar varias clases diferentes de neuronas disparar en alta frecuencia en explosiones sincronizadas y evita el potencial que las modificaciones genéticas a los animales pueden haber interferido con el fisiológico comportamiento el investigador busca comprender³⁵^,³⁶.

Los protocolos descritos en este documento facilitan más completo análisis y cuantificación de Ca^{2 +} señales grabadas desde células in situ usando una combinación de mapa espacio-temporal (STM)-basado en el análisis y el análisis de partículas. Los protocolos también describen cómo diferentes patrones de Ca^{2 +} señalización observada en células diferentes poblaciones in situ pueden ser analizadas adecuadamente. Por ejemplo, el método examinará Ca^{2 +} en una población especializada de células en el intestino, células intersticiales de Cajal (ICC). ICC son las células especializadas en el tracto gastrointestinal (GI) que presentan dinámica intracelular Ca^{2 +} señalización, como visualizar usando los ratones que expresaban GCaMPs³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^, ⁴¹^,⁴². CA^{2 +} transitorios en ICC están vinculados a la activación de Ca^{2 +}-activa Cl^– (codificados por Ano1) los canales que son importantes en la regulación de la excitabilidad del músculo liso intestinal células (SMCs)⁴³^, ⁴⁴^,⁴⁵. Así, el estudio de Ca^{2 +} en ICC es fundamental para comprender la motilidad intestinal. El intestino murino ofrece un excelente ejemplo de esta demostración, ya que hay dos clases de ICC que están separadas anatómicamente y pueden visualizarse de forma independiente: i) ICC están situados en la zona entre el músculo liso circular y longitudinal capas, que rodean el plexo mientérico (ICC-mi). Estas células sirven como células marcapasos y generan la actividad eléctrica conocida como ondas lentas⁴⁶^,⁴⁷^,⁴⁸^,⁴⁹; II) ICC también se encuentran entre un plexo rico en los terminales de las neuronas motoras (plexo muscular profundo, así ICC-DMP). Estas células sirven como mediadores de las respuestas a la neurotransmisión entéricas de motor³⁷^,³⁹^,⁴⁰^,⁵⁰. ICC-mi y ICC-DMP son morfológicamente distintos, y sus comportamientos señalización Ca^{2 +} se diferencian radicalmente para realizar sus tareas específicas. ICC-mi son radiados en la forma y forman una red de células interconectadas a través de las ensambladuras de gap⁵¹^,⁵². CA^{2 +} señales en ICC-mi manifiesto como breves y localizadas espacialmente Ca^{2 +} lanzamiento eventos que ocurren en los sitios múltiples asincrónicamente a través de la ICC-mi red como visualizado dentro de un campo de visión (imagen con el objetivo X 60)³⁸. Estas señales asíncronas están organizadas temporalmente en 1 segundo racimos que, cuando se tabulan juntos, equivalen a un neto 1 s celular aumento de Ca^{2 +}. Estas señales de propagación célula a célula, dentro de la red de ICC y por lo tanto organizan Ca^{2 +} señalización, generados a partir de sitios web celular, en una tejido amplio Ca^{2 +} onda. Clustering temporal y la sumatoria de Ca^{2 +} señales en ICC-mi se la ha denominado Ca^{2 +} grupos transitorios (CTC)³⁸. CTC se producen rítmicamente (e.g. bastante similares duraciones y periodos similares entre CTC) 30 veces por minuto en el ratón. Por el contrario, ICC-DMP están las células del huso en forma, algunos con procesos secundarios, que distribuyen entre comités y procesos del nervio varices y no independientemente forman una red⁵¹^,⁵². ICC-DMP forman uniones comunicantes con comités, sin embargo y dentro este sincitio mayor, conocido como el SIP sincicio⁵³. Señales de CA^{2 +} se producen en múltiples sitios a lo largo de la longitud de las células, pero estas oscilaciones no ocluidos o temporal agrupados, como se observa en el ICC-mi³⁷. CA^{2 +} señales en ICC-DMP se producen de manera estocástica, con variable intensidad, duración y características espaciales. Los protocolos por debajo, usando el ejemplo de Ca^{2 +} en ICC-mi y ICC-DMP, describen técnicas para analizar el complejo de señalización en tipos específicos de células in situ. Utilizamos el sistema Cre-Lox inducible para expresar GCaMP6f exclusivamente en la ICC, después de inducir la activación de Cre-Recombinase (Cre) conducida por un promotor específico de la ICC (Kit).

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Protocol

Todos los animales utilizados y los protocolos realizados en este estudio estaban de acuerdo con los institutos nacionales de salud guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de cuidado en la Universidad de Nevada, Reno y uso institucional de Animal.

1. generación de ratones KitGCaMP6f

Cruz Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (ratones GCaMP6f) y c-Kit^{+ Cre-ERT2} (Kit-Cre ratones) para generar ICC GCaMP6f expresando animales específicos (Kit-Cre-GCaMP6f ratones).
Nota: GCaMP6f fue utilizado debido a su eficiencia reportado en información localizada, breve intracelular Ca^{2 +} señales de in situ y en vivo⁵⁴.
Inyectar a ratones Kit-Cre-GCaMP6f con tamoxifeno en edades de 6 a 8 semanas para inducir activación del Cre Recombinase y la subsecuente expresión de GCaMP6f en ICC (figura 1).
1. Para crear la solución de tamoxifeno, disolver 80 mg de tamoxifeno (véase Tabla de materiales) en 800 μL de etanol (véase Tabla de materiales) en una cubeta y agitar durante 20 minutos.
2. Añadir 3,2 mL de aceite de cártamo (Genérico) para crear soluciones de 20 mg/mL y luego someter a ultrasonidos durante 30 minutos antes de la inyección.
3. Inyectar a ratones (inyección intraperitoneal; IP) con 0,1 mL de solución de tamoxifeno (tamoxifen 2 mg) por tres días consecutivos. Confirmar GCaMP6f expresión de genotipado y utilizar ratones 10 días después de la primera inyección.
  1. Ratones de genotipo por recorte un trozo de oreja de cada animal. A continuación, utilice el método de HotSHOT⁵⁵ para el aislamiento de ADN genómico incubando clips oreja a 95 ° C por 60 min en 75 mL de NaOH y luego neutralizar 75 mL de tampón Tris. Uso de PCR estándar para determinar el genotipo de cada animal, 2 mL de DNA en una reacción de 20 mL con iniciadores específicos de GCaMP6f⁵⁶. Ejecutar 10 mL del producto de PCR en un gel de agarosa al 2% para determinar el tipo salvaje (297 bp) y mutantes (~ 450 bp) bandas.

2. preparación de tejidos para la proyección de imagen de Ca^{2 +}

Anestesiar ratones por inhalación con isoflurano (4%, ver Tabla de materiales) de una campana ventilada y luego sacrificio por dislocación cervical.
Utilizando unas tijeras afiladas abrir el abdomen de ratones, eliminar el intestino y en solución de Krebs-Ringer bicarbonato (KRB). Abrir el intestino a lo largo de la frontera mesentérica y elimine cualquier contenido intraluminal con KRB. Utilizando disecciones afiladas, quite las capas mucosa y sub mucosa.
Nota: Solución KRB tiene la composición siguiente (en mM): 118.5 de NaCl, KCl 4.7, CaCl₂ 2.5, MgCl₂ 1.2, NaHCO₃ 23,8, KH₂PO₄ 1.2, dextrosa 11.0. Esta solución tiene un pH de 7,4 a 37 ° C cuando se burbujeó a equilibrio con 95% O₂- 5% CO₂.
Con pequeños pernos, perno del tejido del intestino delgado a la base de un volumen de 5 mL, 60 mm de diámetro recubierto Sylgard plato con la capa de músculo liso circular hacia arriba. Inundar la preparación con solución KRB calentado a 37 ° C durante un período de equilibrio de 1 hora antes de la experimentación.
Después de este período de equilibrio, realizar in situ Ca^{2 +} proyección de imagen de pequeño intestinal ICC-mi y ICC-DMP usando microscopia confocal (las imágenes en este protocolo fueron adquiridas con un microscopio confocal con un disco de spinning). Debido a los beneficios de GECIs descritas, utilice imágenes de lapso de tiempo de alta resolución (> 30 fotogramas por segundo, FPS) combinado con objetivos de alta potencia (60 – 100 x) para adquirir películas de Ca^{2 +} señales dinámicas en ICC.
Nota: Para reducir el movimiento del tejido, aplique nicardipine (0.1-1 μM) durante las grabaciones como se describió anteriormente³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹.
Distinguir mi ICC y ICC-DMP en el intestino con su localización anatómica diferente, morfología y básicos patrones de Ca^{2 +} actividad.
1. Localizar mi ICC a nivel del plexo mientérico, entre las capas de músculo liso circular y longitudinal del intestino delgado. Son radiados formado, formando una red (Figura 3A). CTC (descrito anteriormente) se propaga a través de la red de ICC-mi con una ocurrencia regular de 30 ciclos por minuto.
2. Por el contrario, localizar ICC-DMP en un solo plano a nivel del plexo muscular profundo, entre la capa circular de músculo liso y el plexo submucoso. ICC-DMP no forman una red y son células formadas huso (figura 2A) que no exhiben eventos reproducción regulares y en su lugar fuego estocástico, localizadas intracelular Ca^{2 +} transitorios.
Sin importar el software de adquisición utilizado, guardar películas como una pila de imágenes TIFF.

3. Análisis Estocástico Ca^{2 +} señales en ICC-DMP utilizando Cartografía espacio-temporal (STM)

Analizar utilizando Cartografía espacio-temporal con una combinación de software ImageJ (NIH, USA, gratis descargar en http://imagej.nih.jov/ij) y software hecho a la medida (volumetría, versión G8d GWH, operable en Mac OS, contacto grant.hennig@ Grant Hennig ICC-DMP Med.uvm.edu sobre información de volumetría de acceso y uso)
Nota: También se proporciona un método alternativo para analizar plenamente estos mapas espacio-temporales con ImageJ solo en secciones posteriores (empezando en paso 3.9).
Volumetría de Abra y utilice el clic derecho del ratón para abrir carpetas que contienen archivos de películas. Izquierda haga clic en el archivo de película a analizar para abrirlo en volumetría (debe estar en formato TIFF sin comprimir). Una vez abierto, la película será dentro de una borde azul ventana (película) que abarcará un área de la pantalla derecha. El lado izquierdo de la pantalla contiene la ventana Plot (superior 4/5ths) y la ventana de rastros (menor de 1/5^th).
Ajustar las dimensiones de la película manteniendo pulsada la tecla Mayús y simultáneamente de desplazamiento hacia arriba con el botón central del ratón (MMB, reduce el tamaño) o desplazamiento hacia abajo con el MMB (aumento de tamaño). Iniciar o detener la reproducción pulsando 'A'; puede ajustarse la velocidad de reproducción pulsando el arriba y abajo teclas de flecha.
Para crear un STM con volumetría, dibujar un ROI sobre una célula entera manteniendo pulsada la tecla Mayús mientras haga clic y arrastre el botón izquierdo del ratón. Ajustar la orientación de la ROI desplazándose con el MMB en las esquinas del ROI. Cuando el ROI está en lugar sobre la célula para ser analizados (figura 2A), uso la derecha haga clic en la ventana de la película a ' ROI STMs – STMyAvg > xRow' y haga clic para crear un STM de la actividad celular en la ventana Plot (también hay una opción para seleccionar ' STMxAvg > yRo w ', que uno es seleccionado dependerá de si la orientación de la célula está más alineada con la x o eje y, por ejemplo la celda destacó figura 2A es más orientada en el eje y').
Haz click en el STM en la trama de la ventana y pulse 'P' para quitar ruido de fondo promedio y pulse 'H' para aumentar el contraste del STM. Guardar el STM haciendo clic derecho sobre él para acceder a ' STM carga guardar - guardar STM como .tif' y luego click izquierdo para guardar como un TIFF.
El resto del análisis del ICC-DMP se realizará en ImageJ. ImageJ consta de dos componentes principales, una barra de herramientas con una posición fija en la parte superior del monitor y una interfaz de usuario móvil. Con ImageJ, abra el archivo TIFF de STM de ICC-DMP Ca^{2 +} actividad (archivo-abrir en la barra de herramientas imagen J).
Abierta la volumetría creado STM, que tendrá tiempo orientado verticalmente. ImageJ abrirá automáticamente archivos TIFF RGB o imágenes de 16 bits. Para mejorar la calidad de la imagen, haga clic en 'Imagen' en la barra de herramientas de ImageJ. Desplazamiento en la primera opción ' tipo 'para mostrar un menú de diversos formatos de imagen desplegable, desplácese sobre 32 bits' y click izquierdo para cambiar.
Para el STM legible contra el tiempo de izquierda a derecha, izquierda haga clic en la barra de herramientas de ImageJ en la siguiente ruta: 'Imagen transformar rotar 90 grados izquierda'. También es posible crear STM de Ca in situ^{2 +} actividad utilizando linescans con ImageJ sin volumetría y esto se detalla a continuación.
Nota: Una vez creados los STM, se analizan de la misma manera sin importar que software fue utilizado para generarlas. Para omitir este método alternativo para la creación de STM en ImageJ, vaya al paso 3.19.
Para crear el STM con ImageJ, abrir la pila de archivos TIFF que conforman el registro de la ICC-DMP Ca^{2 +} actividad (archivo-abrir en la barra de herramientas de ImageJ). ImageJ abrirá automáticamente archivos TIFF RGB o imágenes de 16 bits. Para mejorar la calidad de la imagen, haga clic en 'Imagen' en la barra de herramientas de ImageJ. Desplazamiento en la primera opción ' tipo 'para mostrar un menú de diversos formatos de imagen desplegable, desplácese sobre 32 bits' y click izquierdo para cambiar.
Ruido de fondo (ocasionados por el ruido de auto fluorescencia o cámara) ahora debe restarse de la película. Izquierda haga clic en la función de 'Selección Rectangular' en la interfaz de ImageJ y dibujar un ROI (click izquierdo y arrastrando a forma y tamaño deseado) sobre la fluorescencia del fondo de la película.
Después de seleccionar el ROI, izquierda haga clic en 'Analizar' en la barra de herramientas de ImageJ y luego presione 'Histograma' en el menú desplegable resultante. Entonces aparecerá un cuadro emergente indagación acerca de los valores de rango de píxeles para calcular; ImageJ tiene los valores de la ROI preseleccionados tan izquierda haga clic en 'OK'.
Después de hacer clic en 'OK', aparecerá un cuadro emergente nueva que contiene un histograma que muestra la distribución de valores para el ruido del píxel de fondo en el ROI. Anote el valor medio del histograma a continuación y luego cierre la ventana emergente.
Haga clic en volver a la película de 32 bits y seleccione el campo de visión entero izquierda haga clic en 'Editar' en la barra de herramientas de ImageJ, desplazamiento a la 'Selección' y a la izquierda o haga clic en 'Seleccionar todo' en el menú desplegable reveló.
A la izquierda, haga clic en 'Proceso' en la barra de herramientas de ImageJ, desplácese a 'Matemáticas' y 'Restar' click izquierdo en el menú desplegable revelada.
Un popup aparecerá donde puede introducirse un valor para ser restada del FOV. Introduzca el valor medio de histograma en el paso anterior 3.12 y haga clic en 'Aceptar'. ImageJ luego le preguntará procesar todos los fotogramas en la pila TIFF (y no sólo el único fotograma la película actualmente). Haga clic en 'Sí'.
Después de hacer clic en 'Sí', la película se da vuelta a negra. Para corregir esto, haga clic en 'Imagen' en la barra de herramientas de ImageJ y moverse sobre 'Ajuste'. Izquierda haga clic en la opción primera revelada para 'Brillo y contraste' (B y C). Esto hará que aparezca un pop-up cuadro de donde se pueden modificar varios aspectos de brillo y contraste. Izquierda haga clic en la opción de 'Auto' una vez para revelar el aumento de la calidad en la película. Deje B & C pop caja abierta para su uso futuro.
Para crear un linescan, primero haga clic en la herramienta de selección de línea en la interfaz de ImageJ para revelar opciones para diferentes líneas; izquierda haga clic en' segmentado' a elegir de la lista. Con la herramienta de 'línea segmentado' seleccionada, solo uso izquierda haga clic para dibujar una línea a lo largo del eje medio de una ICC-DMP individual. Cada clic izquierdo solo fijará la línea en ese punto y la línea puede entonces libremente moverse más lejos en cualquier ángulo deseado. Cuando la línea se completa, doble click izquierdo para fijar la línea en su lugar.
Izquierda haga clic en 'Imagen' en la barra de herramientas de ImageJ y moverse sobre 'Las pilas' y haz click en la opción 'Segmentar'. Aparecerá un cuadro emergente; Haz click en la opción de 'rotar 90 grados', esto orientará el linescan de izquierda a derecha, lo que puede ser calibrado y leer contra el tiempo en el eje x, con el espacio en el eje y. Haga clic en 'OK' para crear el STM.
La intensidad del STM se creará en una escala de grises con Ca^{2 +} señales de intensidad alta que se muestra como diferentes grados de blanco, de gris claro o blanco dependiendo de su intensidad. Normalmente, el contraste de la linescan creado tendrá que ser mejorado. Para ello haga clic en 'Auto' en el pop B & C caja.
La intensidad de la fluorescencia de la linescan se presenta en el STM en valores de píxel arbitraria. Para medir con precisión la amplitud de Ca^{2 +} señales de la STM, los valores de fluorescencia de la STM (F) ahora deben normalizarse. Utilizando la función de 'Selección Rectangular' en la interfaz de ImageJ, dibujar un ROI en un área del STM que muestra la zona más uniforme y menos intensa de fluorescencia (F₀).
Repita los pasos en 3.11-3.12 para obtener un valor medio (F₀) de la intensidad en el ROI de las y seleccione STM todo por la izquierda haciendo clic en 'Editar-selección-Seleccionar todo' de la barra de herramientas de ImageJ.
A la izquierda, haga clic en 'Proceso' en la barra de herramientas de ImageJ y desplácese a 'Matemáticas'; Haga clic en 'Dividir' de las opciones de revelado. En el cuadro emergente posterior, escriba el valor medio (F₀) obtenida en el paso 3.21. A dividiendo el STM todo (F₀) STM se da vuelta a negro; corregir esto haciendo clic en 'Auto' en el B & C pop-up box. El linescan está ahora calibrado para la amplitud, con intensidad de fluorescencia expresada en F/F₀.
El STM actualmente mostrará el número de marcos en la pila TIFF en el eje x y el número de píxeles que representa la longitud de la célula en el eje y. Para cuantificar la información temporal y espacial de las señales de Ca^{2 +} , calibrar el STM para el espacio y el tiempo. A la izquierda, haga clic en 'Imagen' en la barra de herramientas de ImageJ y a la izquierda haga clic en 'Propiedades'. Aparecerá un cuadro emergente. Dentro de esta ventana, introduzca los valores apropiados para calibrar completamente lo STM.
Para 'Pixel Width', introduzca la longitud de tiempo que toma para capturar un solo fotograma en segundos. Por ejemplo, a 5 FPS, introduzca un valor de 0, 2, 50 FPS Introduzca un valor de 0.02, para 33 FPS Introduzca un valor de 0.033 etcetera. Para 'Píxeles de altura', escriba cuantas micras cada representa píxeles (dependerá el objetivo utilizado y la cámara utilizada para la adquisición). 'Profundidad de Voxel' queda en 1 antes de hacer clic en 'Aceptar'. Otros parámetros no deben ajustarse dentro de la ventana.
Nota: Después de hacer clic en 'Aceptar', el STM se calibrarán completamente de amplitud, espacio y tiempo. Amplitud en el STM se expresará como F/F_0,tiempo en el eje x se le expresa en segundos y espacio en el eje y se expresa en μm (figura 2B). CA^{2 +} eventos en el STM están listos para medirse, el calibrado STM también puede ser guardado como una imagen TIFF a analizar en una fecha posterior.
ImageJ tiene un número de construido en tabla de búsqueda codificadas por color (LUT) que puede utilizarse para la código de color del STM. Construido en LUT se aplican por la izquierda haciendo clic en la barra de herramientas de ImageJ en el camino 'Tablas de búsqueda de imagen' y elija una LUT para aplicar. LUTs por encargo también se puede importar al STM haciendo click izquierdo en la barra de herramientas de ImageJ en la ruta 'Archivo-importar-LUT' y seleccionando el LUT para importar. Por ejemplo el STM se muestra en la figura 2 ha tenido el encargo LUT 'QUBPallete' (Queens University Belfast, UK) aplicado, a colores cálidos (rojo, naranja) como áreas de Ca^{2 +} fluorescencia intensa y colores fríos (negro, azul) como áreas de baja Ca^{2 +}fluorescencia.
Para insertar una barra de calibración de amplitud para indicar el rango de amplitudes representado por los distintos colores, izquierda haga clic en 'Analizar' en la barra de herramientas de ImageJ, desplácese a 'Herramientas' y seleccione 'Calibración Bar' en el menú revelado. Se dan opciones de tamaño, zoom, rango y posición en el STM para la barra de calibración; ajustar estas opciones según desee y haga clic en 'Aceptar'. Tenga en cuenta que cuando se inserta la barra de calibración, ImageJ crea un nuevo STM que contiene, dejando a la versión original sin la barra de calibración intacta y separada.
Nota: Si está marcada la casilla 'Overlay' cuando se inserta la barra de calibración, no se generará un nuevo STM.
Para comenzar a analizar los eventos de Ca^{2 +} , haga clic en el selector de 'Línea recta' en la interfaz de ImageJ. Por inicialmente click izquierdo en el STM, dibujar una línea recta horizontal a través del centro de un evento de Ca^{2 +} paralela al eje x (contra tiempo). Completar la línea de la izquierda pulsando una segunda vez (Figura 2D).
Haga clic en 'Analizar' en la barra de herramientas de ImageJ y haz click en 'Trama de perfil'. Aparecerá una nueva caja con el perfil de la parcela del Ca^{2 +} evento (Figura 2E).
Nota: La opción 'Lista' de este cuadro genera una lista de valores XY de la trama generada, que puede ser copiada en un programa de hoja de cálculo para crear trazas si así lo desean.
Para medir la amplitud de la Ca^{2 +} evento en el perfil de trama, haga clic en el selector de 'Línea recta' en la interfaz de ImageJ. A continuación, trace una línea vertical desde la línea de base del perfil del terreno a la cima del evento^{2 +} Ca; la longitud de la línea (se muestra en la interfaz de ImageJ) representa la amplitud del evento expresado como ΔF/F₀ (Figura 2E).
Utilizando el valor de la amplitud adquirida, puede medirse la duración de la Ca^{2 +} evento dibujando una línea recta a lo ancho del evento en el punto de 50% de amplitud máxima (duración total con amplitud máxima de la mitad de FDHM) o la duración completa del evento se puede medir Si se desea (Figura 2E).
Nota: Experimentadores necesitará diseño específico criterio de umbralización válido Ca^{2 +} eventos en estas grabaciones. En nuestros experimentos, eventos de Ca^{2 +} fueron señalados como válida para el análisis si su amplitud es > 15% del evento de máxima amplitud en la sección de control de grabación. Sin embargo, estos umbrales dependerán de los tejidos específicos y las células bajo estudian son sólo pautas arbitrarias que requieren optimización específica para cada tipo de tejidos y células.
Dibujando una línea a lo largo de la carrera ascendente o descendente del Ca^{2 +} evento parcela perfil, la tasa de aumento o disminución se puede calcular en consecuencia. Después se traza la línea, el cursor del ratón se puede mover hasta el punto donde la línea comienza y donde termina. Cuando el cursor está parado sobre estos puntos, coordenadas x, y en esta ubicación se mostrará en la parte inferior izquierda de la interfaz de ImageJ. Así, mediante la adquisición de x, y valores de donde empieza la línea (x₁, y₁) y termina (x₂, y₂), la tasa de aumento o disminución (ΔF/s) puede ser calculada como la pendiente de la línea, y₂- y₁ / x₂- x₁ (figura 2F ).
Para calcular la propagación o extensión espacial de un evento de Ca^{2 +} , a la izquierda haga clic en el selector de 'Línea recta' en la interfaz de ImageJ. Luego, trace una línea recta vertical a lo largo de la longitud de la Ca^{2 +} evento a lo largo del eje y. La longitud de la línea (se muestra en la interfaz de ImageJ) representará la extensión espacial del evento expresado en μm (figura 2).
Determinar la velocidad de un evento de Ca^{2 +} multiplicación dibujando una línea a lo largo de la parte delantera propagación del evento y calcular la pendiente de la línea. Esto puede realizarse manualmente de manera similar se describe en el paso 3.32, mediante la determinación de x, y valores de donde empieza la línea (x₁, y₁) y termina (x₂, y₂); Estos valores se mostrarán en la parte inferior izquierda de la interfaz de ImageJ cuando el cursor está situado sobre el STM.
En la colección de los parámetros deseados para la cuantificación de Ca^{2 +} evento, piscina estos media de valores para generar valores promedios para cada parámetro de forma por la célula; como alternativa, coloque todos los valores crudos en un histograma de distribución para mostrar su gama (figura 2 H).

4. cuantificación de CTC en ICC-mi partícula utilizando análisis basado

Antes de analizar películas en volumetría con PTCLs, la calibración espacial y temporal de la película tendrá que insertarse en el nombre del archivo. Editar todos los archivos a analizar en volumetría a contener en el título el número de segundos que equivale cada marco y también el número de micras que cada píxel equivale a separado por un guión simple, con los valores encerrados en corchetes. Por ejemplo, una película adquirida en 33 FPS con el objetivo 60 x (512 x 512) debe tener [0,22 – 0,033] introduce su nombre de archivo.
Volumetría de Abra y utilice el clic derecho del ratón para abrir carpetas que contienen archivos de películas. Izquierda haga clic en el archivo de película a analizar para abrirlo en volumetría (Figura 3A, debe estar en formato TIFF sin comprimir).
Para calcular con precisión Ca^{2 +} señales desde el campo de visión entero, la película se someterá primero a diferenciación y alisado para eliminar la interferencia de fondo (ruido de cámara, auto fluorescencia etc.) y aumentar la relación señal a ruido. En la ventana de película, botón derecho del ratón para abrir un menú y usando clic derecho acceso ' STK filtro-diferenciar ', haga clic otra vez para introducir un valor para distinguir, presione entrar y haga clic para aplicar (para películas adquirieron en 33 FPS un valor de 2 (∆t = ± 66-70 mseg) funciona bien, el valor se incrementa la tasa de incremento de captura de imagen).
Nota: Diferenciación en este contexto reducirá la intensidad de las áreas de grabación (píxeles) que no mostrar ninguna actividad dinámica sobre el número de fotogramas especificado. Así, si se inserta un valor de '2', cada píxel en cada fotograma de la grabación es analizada y si dentro de ese marco no es el dynamic pixel fluorescencia 1 antes y 1 después de, se restará la intensidad dentro de los píxeles de la grabación. Así, se elimina el ruido de fondo no dinámicos y señal a ruido es mayor.
Suave la película diferenciada mediante la aplicación de un filtro gaussiano. Haga clic derecho en la ventana de la película para que aparezca un menú y usando clic derecho acceso 'STK filtro Gauss KRNL', haga clic otra vez para introducir un valor (use siempre un número impar, para películas en 33 FPS, un valor de 5 funciona bien, 1,5 x 1,5 μm StdDev 1.0) un valor de entrada, presione entrar y haga clic para aplicar (figura 3B).
Empezar a crear PTCLs seleccionando primero un período de la película que incluye un período de reposo (20 – 40 fotogramas) seguido por la ocurrencia de un CTC y también 20 – 40 Marcos después de la CTC. Para ello, desplácese por la película con el MMB para desplazarse de izquierda a derecha en la barra amarilla.
Con la selección realizada, uso la derecha haga clic en la ventana de la película para 'STK Ops – rampa DS PTCLinfo' y a la izquierda haga clic en aplicar. Esta función ejecuta una rutina de análisis PTCL que progresivamente rampas del umbral de intensidad máxima y mínima intensidad. Esto se mostrará gráficamente en la ventana de la trama como una trama de ruido y también en la ventana de rastros como huellas color tres, con el rastro verde que muestra el número de PTCLs, el rastro rojo que muestra el tamaño promedio de PTCL y el rastro azul mostrando la intensidad absoluta umbral.
Nota: El tamaño promedio y número de PTCLs en cada umbral se calcula automáticamente y luego un umbral semi-manual se aplica con la intensidad en que en que el tamaño medio de PTCLs empieza a caer, que se produce en el punto de inflexión de la traza roja en la ventana de seguimiento (figura 3D, es decir, debido a la gran cantidad de ruido espacial limitada PTCLs reduciendo el tamaño medio de PTCLs).
Dentro de la ventana de diagrama, pulse 'H' al equilibrio de histograma la trama de la muestra de ruido PTCL. Ciclo a través de esquemas de color pulsando ' [' hasta que el fondo es color blanco con restos de color en la parte superior.
Pulse 'F' a plantear una herramienta de medición y haz click en la parcela en la intersección donde las parcelas color shift a la derecha. Esto marca una línea vertical en la barra de desplazamiento de la ventana de rastros abajo.
Dentro de la ventana de seguimiento, desplazarse la MMB izquierda a derecha desde el punto de inflexión de la traza roja hasta que la línea vertical blanca marcada creó en el paso 4.10 y asegurándose de que el rastro azul se selecciona haciendo clic derecho sobre él, lee la 'yAVG' que se mostrará en el t él inferior lado izquierdo de la ventana de rastros. Deseleccionar la selección presionando el MMB una vez dentro de la ventana de rastros.
Dentro de la ventana de la película, pulse 'C' para que aparezca una rueda de color y, a continuación, pulse sería ' Ajustar umbral. Ahora se mostrará PTCLs válidos como rojo en la ventana de la película (figura 3) y aquellos que saturan será blanco. Eliminar las zonas blancas desplazándose con el botón izquierdo del ratón.
Desplácese hacia arriba o hacia abajo con el MMB para ajustar el valor numérico amarillo en la rueda de color, ajustar este valor al valor yAVG de paso 4.11. Esto asignará todo en rojo como un activo Ca^{2 +} PTCL transitoria en el punto de umbral determinado. Para guardar esto como un archivo de coordenadas basado en partículas, uso la derecha hace clic a acceso ' STK 3D-Save PTCLS 0' y luego a la izquierda, haga clic en para guardar el archivo.
Dejar de volumetría y abrir. Abra el archivo PTCL (.gpf archivo) creado en el paso 4.13. En este tipo de archivo, todo activo Ca^{2 +} transitorios se guardan como un PTCL azul uniforme (figura 3E). Como cada PTCL es una entidad individual con su propio ID, área y perímetro coordenadas, banderas de estado (véase abajo) y matrices de resultado, se optimiza el análisis de las características espacio-temporales de PTCLs o entre PTCLs.
Para comenzar el análisis de PTCLs, quitar cualquier ruido restante de PTCL (pequeño PTCLs no válidos cuando se genera el archivo .gpf) mediante clic derecho en la ventana de la película para acceder a ' ptcls PTCL STKOPS bandera > Min = 70' y el botón izquierdo para aplicar. Esta acción será bandera PTCLs mayores que 6 μm² (~ diámetro > 2μm) y volumetría asignará a la selección de 'Bandera 1'. Cuando esto termine, PTCLs que están por encima de este umbral (pabellón 1) aparece como un luz color púrpura en la ventana de la película, considerando que cualquier PTCLs umbral serán siendo su base color azul (figura 3F).
Crear representaciones de mapa de calor de la actividad PTCL mediante clic derecho en la ventana de la película para acceder a ' PTCL STKops StatMap bandera ='. Haciendo clic derecho sobre este camino final, se puede introducir una asignación de bandera a analizar. Así, queriendo cuantificar PTCLs asignados a FLAG1, simplemente introduzca '1', presiona ENTER y luego a la izquierda, haga clic en para aplicar. Esto generará un mapa de calor con el PTCLs total para toda la longitud de la grabación, con diferentes colores que representan la ocurrencia (%) a lo largo de la grabación (figura 3, colores cálidos indican mayor ocurrencia en esa ubicación).
Guardar mapas de calor haciendo clic derecho en ellos para acceder a ' STM carga guardar - guardar STM como .tif' y luego click izquierdo para guardar como un TIFF.
Cuantificar la actividad PTCL usando clic derecho en la ventana de la película a ' PTCL medida PTCLStats STK =', haciendo clic derecho sobre este camino final, se puede introducir una asignación de bandera a analizar. Así, queriendo cuantificar PTCLs asignados a FLAG1, simplemente introduzca '1', presiona ENTER y luego a la izquierda, haga clic en para aplicar. Esto generará una serie de huellas en la ventana seguimiento.
Por defecto volumetría superponen los rastros PTCL generados en el paso 4.17 uno encima del otro. Separarlos utilizando la derecha haga clic en la ventana de traza a 'Alinear-sepárese traza' y a la izquierda haga clic en para aplicar. Esto revelará los cuatro rastros diferentes de PTCL que cuantifican el Ca^{2 +} actividad PTCL en la película que muestra zona PTCL (verde), cuenta PTCL (rojo), tamaño PTCL (cian) y desviación de estándar de tamaño PTCL (azul) trazada contra el tiempo (figura 3 H).
Estos rastros pueden guardarse como un archivo de texto que puede importarse en un programa de hoja de cálculo para su posterior análisis. Para guardar rastros, mantenga pulsada la tecla Mayús y utilice la derecha haga clic en la ventana de traza a 'ROI surtidos-descarga como texto' y a la izquierda haga clic en para guardar el archivo. Esta información luego es recopilada e ilustrada en histogramas u otras representaciones gráficas apropiadas (figura 3 H).
Para mirar la ocurrencia inicial de PTCLs (es decir, buscar en sitios de la leña), estos PTCLs iniciales reciben una asignación de otra marca. Aislar mejor sitios de la leña que ocurren dentro de la red, solamente ésos PTCLs que no se superponen con las partículas en el cuadro anterior pero el traslapo con partículas en los próximos 70 ms se consideran sitios de disparo.
Para aplicar este umbral, uso la derecha haga clic en la ventana de la película a ' PTCL comportamiento-F1 InitSites > F = 3' y a la izquierda, haga clic en aplicar. Esto asignará iniciando PTCLs como 'Bandera 3' y PTCLs que cumplen este criterio aparecerá como un color verde lima en la película (Figura 4A).
Volumetría también ofrece la capacidad de cuantificar y trazar el número de lugares de tiro PTCL en un determinado campo visual, así como trazar su probabilidad de disparo durante un CTC. Para analizar estos parámetros, crear un mapa de calor de iniciar PTCLs (bandera 3) como se describe en el paso 4.16 (Figura 4B).
Izquierda haga clic en la ventana del diagrama y luego le prensa 'C' para que aparezca una rueda de color y pulse ' al umbral. El mapa de calor de iniciar PTCLs voluntad entonces vuelta gris y blanco. Eliminar todo el blanco desplazándose hacia arriba con el botón izquierdo del ratón y umbral PTCLs en el mapa de calor que sólo válidos PTCLs están cubiertas en gris (ajuste umbral desplazándose hacia arriba y hacia abajo con el MMB).
Uso derecho hace clic sobre el mapa de calor en la ventana Plot 'STM PTCLs encontrar PTCLs 70' y a la izquierda haga clic en aplicar. Esto asignará todos PTCLs gris en el mapa que son más de 70 pixeles² en tamaño para ser asignadas como una iniciación codificadas por color separado PTCL PTCL disparo sitio (figura 4).
Trama de la actividad de cada uno de estos sitios de disparo contra tiempo haciendo clic derecho sobre el PTCL leña mapa y acceder a 'STM crear PTCLs PTCL rois' y click izquierdo para aplicar. Esto generará una nueva imagen en la ventana de la película con todos lo PTCL color separado sitios aparece con un ROI a su alrededor la leña.
Uso derecho haga clic en la ventana de la película a ' medida de PTCL-PTCLpixROIBM > = 1' y el botón izquierdo para aplicar. Esto permitirá identificar los ROIs en la ventana de película que contienen al menos un PTCL y se trama de toda la actividad dentro de los ROIs en la ventana de rastros. De forma predeterminada, estos rastros se se superponen el uno del otro. Para separarlos, uso la derecha haga clic en la ventana de traza a 'Alinear-sepárese traza' y a la izquierda haga clic en para aplicar. Para guardar rastros, mantenga pulsada la tecla Mayús y utilice la derecha haga clic en la ventana de traza a 'ROI surtidos-descarga como texto' y a la izquierda haga clic en para guardar el archivo.
La actividad de cada sitio de disparo se puede trazar también como un mapa de ocurrencia. Para hacer esto, uso la derecha haga clic en la ventana de la película a ' PTCL medida ROI Pianola = 10' y el botón izquierdo para aplicar. Esto generará una parcela de todos los sitios de disparo contra tiempo en la ventana de la parcela. Cada sitio de la leña se mostrará como una entidad color por separado, cada uno en su propio 'lane' y estas parcelas corresponden a Ca^{2 +} PTCLs iniciando en CTC (figura 4E) guardar estos mapas de ocurrencia haciendo clic derecho sobre ellos para acceder a ' STM Carga de guardar - guardar STM como .tif ' y luego click izquierdo para guardar como un TIFF.
Para cuantificar la probabilidad de disparo en cada sitio de disparo durante un CTC, uso la derecha haga clic en la ventana de la película a ' PTCL comportamiento marca es = 1' y el botón izquierdo para aplicar. Esto permitirá identificar todos los marcos de la película que contienen PTCLs por encima del umbral y estos se marcará en la parte inferior de la ventana de la película como líneas azules verticales.
CTC se manifiesta como agrupamiento rápido de leña asincrónica de múltiples lugares de tiro en el campo visual con boquetes de s ~ 1 entre cada ciclo CTC. Esta regularidad y la larga distancia entre no PTCLs activadas entre CTC se utiliza para definir un CTC para el análisis.
Uso derecho haga clic en la ventana de la película a ' brecha PTCL bloque de comportamiento es < =' y utilizar un clic derecho en el punto final que ingrese un número. Este comando agrupará los marcos PTCL activados identificados en el paso 4.28 en bloques y bloques se basan en el número de fotogramas que separan PTCLs activadas. Para grabaciones de 33 FPS por ejemplo, un valor de 10 funciona bien. Si PTCLS activos son menos de 10 cuadros aparte (330 ms) se agrupan en un solo bloque para el análisis (los bloques entonces aparecen como rectángulos color de rosa sobre las líneas azules verticales en la parte inferior de la ventana de la película, con cada rectángulo rosado ahora indicando un CTC).
Uso derecho haga clic en la ventana de la película a 'Medida-PTCL PTCL evento Prob'. Esto generará un archivo de texto que puede importarse en un programa de hoja de cálculo. Este archivo de texto proporcionará una gran cantidad de datos sobre la naturaleza de los sitios de iniciación que se han definido de 4.16 – 4.23 y su contribución a la CTC.
Nota: El archivo de texto mostrará el número de sitios de iniciación (denominado 'dominios'), el tamaño del sitio en píxeles y μm², probabilidad de cada sitio de iniciación disparar cualquiera una vez o varias veces durante cada CTC (dada como %), la duración media y el tamaño de PTCLs que ocurre en ese sitio de iniciación, el número de ciclos CTC (como paso en 4.23) y el porcentaje de lugares de tiro que disparó durante cada ciclo CTC. Esta información se recoge y se muestra en los histogramas u otras representaciones gráficas apropiadas (figura 4F).

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Representative Results

Utilizando ratones de Kit-Cre-GCaMP6F (figura 1), dinámica Ca^{2 +} señalización comportamientos de ICC en el tracto gastrointestinal pueden ser reflejadas en situ. Con microscopía confocal, imágenes de alta resolución de poblaciones específicas de ICC pueden ser adquiridos sin contaminar las señales de otras poblaciones de CPI dentro del mismo tejido pero en planos anatómico distintos del foco (figura 2A)³⁷ ^, ³⁹ ^, ⁴⁰ ^, ⁴¹. es posible registro breve (< 100 ms), localizado el Ca^{2 +} eventos que no eran posibles con membrana permeable al Ca^{2 +} indicadores. Mapas espacio-temporales con volumetría o ImageJ software pueden usarse para generar STM de todos eventos de Ca^{2 +} en células in situ. Usando este acercamiento, Ca^{2 +} eventos en un campo de visión entero pueden visualizarse y asignan (figura 2BC), en lugar de simplemente registrar la actividad limitada de un único retorno de la inversión. Estos métodos pueden ser extendidos a cada celda dentro de un determinado campo visual, asegurando colección de datos representativos de todas las células y proporcionando información cuantitativa sobre las amplitudes relativas, duración transitoria, índice de la subida y la caída de transitorios, etc. (Figura 2E , F). Análisis de la STM, a diferencia de intensidad basado en el retorno de la inversión de parcelas, también ofrecen la posibilidad para el monitoreo y registro características espaciales de Ca^{2 +} de señalización, tales como la extensión espacial y la velocidad de propagación, como se muestra en la figura 2. Esta información puede ser amasada para proporcionar una visión bastante completa de Ca^{2 +} señalización de comportamientos en las células en sus ambientes nativos (figura 2 H).

Análisis PTCL pueden utilizarse para cuantificar más compleja Ca^{2 +} señalización comportamientos, tales como ésos que ocurren dentro de las redes celulares interconectadas. Un ejemplo de esta aplicación es proporcionado por el análisis realizado en ICC-mi (Figura 3A). Generalmente en estas preparaciones complejas, ruido y señal a ruido pueden ser un problema. Sin embargo, utilizando el software de la volumetría para aplicar filtros de suavizado y diferenciales en películas de actividad Ca^{2 +} y aplicando protocolos de umbral de ruido para filtrar hacia fuera ruido de fondo ruido (figura 3B-D) pueden eliminarse del complejo grabaciones de actividad dinámica. Utilizando PTCL análisis como se muestra en la figura 3E-G, información cuantitativa acerca de Ca^{2 +} señalización puede calcularse midiendo el área PTCL, cuenta PTCL y PTCL tamaño que indican intervalos espaciales de activación de Ca^{2 +} señales en un campo de visión. Estos datos pueden ser compilados como se muestra en la figura 3 H y analizados estadísticamente, según el caso. Figura 4 ilustra cómo análisis PTCL permite cuantificación de profundidad de celular Ca^{2 +} por examinar la situación y probabilidades de Ca^{2 +} sitios la leña la leña. Asignando PTCLs en banderas diferentes por sus características temporales, iniciar PTCLs puede exactamente asignarse como se muestra en la figura 4-E y una gran cantidad de datos adquiridos en el número de sitios de la iniciación (conocido como ' Dominios), el tamaño del sitio en píxeles y μm², la probabilidad de cada iniciación del sitio disparando a cualquiera una vez o varias veces durante cada CTC (dada como %), la duración promedio y tamaño de PTCLs que ocurre en el sitio de iniciación, el número de CTC ciclos (como definido en el paso 4.23) y el % de los lugares de tiro que disparó durante cada ciclo CTC. Estas técnicas permiten un alto nivel de minería de datos y cuantificación de in situ Ca^{2 +} señales que ocurren dentro de una red celular intacta que no son posibles con análisis basados en ROI.

Figura 1: generación de ratones KitGCaMP6f. Diagrama esquemático de cómo Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (ratones GCaMP6f) fueron cruzados con c-Kit^{+ Cre-ERT2} (Kit-Cre ratones) para generar ratones Kit-Cre-GCaMP6f. Estos ratones se les inyecta tamoxifeno en edades de 6 a 8 semanas para inducir el Cre Recombinase y la subsecuente expresión de GCaMP6f exclusivamente en ICC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Análisis de estocástico Ca^{2 +} señales en ICC-DMP utilizando Cartografía espacio-temporal (STM). (A) imagen representativa de varios ICC-DMP del intestino del ratón Kit-Cre-GCaMP6F in situ. Un ROI verde indica el tamaño y la orientación de ROI para dibujar alrededor de un único ICC-DMP en el campo de visión para crear un STM en volumetría. Actividad (B) STM de Ca^{2 +} en ICC-DMP destacada en panel A después de que se ha calibrado correctamente para amplitud, espacio y tiempo. (C) el mismo STM se muestra en el panel B después de que ha sido codificado con una tabla de búsqueda (QUBPallete) color. (D) imagen ampliada del ICC-DMP Ca^{2 +} transitorios aparecen en un color codificado STM, indicando dónde trazar una línea a través de un evento de Ca^{2 +} a través de su eje de tiempo (x) para crear un perfil de la parcela de su actividad en ImageJ. (E) parcela destacó el perfil del evento de Ca^{2 +} en el panel D, que indica donde se muestra las líneas de ser dibujado para medir con precisión la amplitud y la duración del evento. (F) terreno destacó el perfil del evento de Ca^{2 +} en el panel D, que indica donde se muestra las líneas de ser dibujado para medir con precisión la tasa de ascenso y de caída del evento. (G) imagen ampliada del ICC-DMP Ca^{2 +} transitorios aparecen en un color codificado STM, indicando dónde trazar una línea a través de un evento de Ca^{2 +} a través de su eje de espacio (y) para medir con precisión su extensión espacial. (H) histogramas representantes de los datos agrupados de ICC-DMP que ilustra cómo mostrar gráficamente la amplitud, duración y extensión espacial de valores adquiridos de seguir los pasos anteriores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: cuantificación de CTC en el uso de ICC-mi partícula basado en el análisis. (A) imagen representativa de una ICC-mi red de intestino de ratón Kit-Cre-GCaMP6F in situ. (B) imagen tomada de la grabación se muestra en el panel A después de que ha sufrido un filtro diferencial de Δt = ±66 – 70 ms y un filtro gaussiano de 1.5 x 1.5 μm, 1.0 StdDev. (C) imagen tomada del video en B después de umbralización se completó con PTCLs por encima del umbral que se muestra en rojo. (D) rastros de PTCL contar y decir tamaño PTCL en un protocolo de umbral para eliminar los ruidos de la película se muestra en el panel B. PTCLs fueron creados usando un algoritmo de inundaciones rellenar que marcaron la estructura de todos los píxeles contiguos que tuvieron intensidades por encima del umbral, Ca ^{2 +} transitorias PTCLs eran más grandes que ruido PTCLs. El umbral en que grandes cantidades de ruido tamaño pequeño PTCLs emergieran y comenzaron a reducir el tamaño medio de PTCLs puede utilizarse como un umbral común para todas las grabaciones. Imagen representativa (E) del base de coordenadas Ca^{2 +} PTCL archivo creado a partir de la grabación thresholded en imagen representativa C. (F) tomada de la ficha PTCL de E después de criterios de proyección de > 6 μm² (diámetro ~ 2 μm o menor) se aplicó; PTCLs por encima de este límite son marcados (pabellón 1) como partículas de color púrpura claras y mapa de PTCLs. (G) calor válido del PTCLs total (pabellón 1) para toda la grabación del vídeo se muestra en el panel F, con total PTCLs resumidos con colores que representan ocurrencia a lo largo de la grabación (colores cálidos indican mayor ocurrencia en esa ubicación). (H) rastros representativos del área PTCL (azul) y Conde PTCL (rojo) derivada el archivo PTCL creado en el panel A-G. Abajo los rastros se muestran histogramas representativos de los datos agrupados de varios experimentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Análisis de Ca^{2 +} leña sitios utilizando ICC-mi partícula basado en el análisis. (A) imagen representativa tomada de la ficha PTCL figura 3E después de bandera 1 PTCLS están perfeccionados en Pabellón 3, el estado bandera de Ca^{2 +} sitios de disparo. Bandera 3 PTCLs aparecen como verde lima (solamente ésos PTCLs que no se superponen con las partículas en el cuadro anterior pero el traslapo con partículas en los próximos 70 ms eran considerados lugares de tiro). (B) calor mapa mostrando el total PTCLs (bandera 3) de toda la grabación del vídeo se muestra en el panel A, con total PTCLs resumió con colores que representan la ocurrencia a lo largo de la grabación (colores cálidos indican mayor ocurrencia en esa ubicación). (C) mapa representativo de Ca^{2 +} se muestra en el panel que b, con cada disparo diferente sitio asignados un color diferente de la identificación de sitios de la leña. (D) restos representativos de PTCL (azul) y PTCL cuentan (rojo) deriva el archivo PTCL creado en la Figura 3A-G. (E) un mapa de ocurrencia de la actividad de los lugares de tiro individuales. Cada sitio de leña en el campo visual se muestra como un bloque de color en su propia 'lane' contra el tiempo. (F) histogramas representativos de los datos agrupados de varios experimentos se muestran ilustrando valores de acumulación de Ca^{2 +} probabilidad de disparo de sitio de la leña / CTC y el número de Ca^{2 +} leña sitios en un campo de visión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

CA^{2 +} proyección de imagen de tipos específicos de células dentro de tejidos intactos o dentro de las redes de las células a menudo revela patrones complejos de transitorios de Ca^{2 +} . Esta actividad requiere cuidadosos y profundo análisis y cuantificación para capturar toda la información sobre los eventos subyacentes y la cinética de estos eventos como sea posible. STM y PTCL análisis proporcionan una oportunidad para maximizar la cantidad de datos cuantitativos rindió de grabaciones de este tipo.

El estrecho, morfología en forma de huso de ICC-DMP hacen idóneo al STM análisis derivado de los STM se ha señalado anteriormente. Sin embargo, este análisis no es idóneo para ICC-mi que son radiadas en forma y conectados en una red (Figura 3A). Además, el Ca^{2 +} patrones de señalización en ICC-mi son más complejos, que se manifiesta como propagar CTC desde múltiples sitios de origen a través de la red ICC-mi. Por lo tanto, para cuantificar la actividad que ocurre en la ICC-mi red dentro de un campo de visión, análisis de partículas (PTCL) fue implementado mediante software hecho a la medida (volumetría, versión G8d GWH, operable en Mac OS, contacto grant.hennig@med.uvm.edu Grant Hennig en cuanto a consultas de volumetría de acceso y uso).

Análisis STM permite todos los eventos de Ca^{2 +} en las células y dentro de todas las células en un campo de visión para analizar críticamente una variedad de parámetros espaciales y temporales. El protocolo descrito ilustra cómo estas técnicas pueden ser aplicadas a ICC-DMP del intestino delgado del ratón. Por completamente cuantificación de Ca^{2 +} señalización en ICC-DMP, como se muestra en la figura 2B-G, Ca^{2 +} señalización patrones se han caracterizado en detalle³⁷. Estos análisis se han aplicado a las grabaciones donde ICC-DMP se someten a intervenciones para finalmente cuantificar los efectos de bloqueo o estimulación de comunicado de Ca^{2 +} /^{2 +} afluencia Ca / vías de neurotransmisión³⁷^,³⁹ ^, ⁴⁰ ^, ⁴¹. estas técnicas pueden aplicarse fácilmente a otras preparaciones de tejido intacto. Por ejemplo, análisis STM como se describe aquí ha sido utilizado para identificar nuevas vías mecánicas involucradas en la generación de Ca intracelular^{2 +} ondas del músculo liso uretral en situ⁵⁷.

La preparación de STM en volumetría requiere cierta precaución, ya que la función de la volumetría que crea el STM de lo ROI dibujada (figura 2A) es un valor promedio de la intensidad. Por lo tanto, la amplitud de las señales de Ca^{2 +} podría potencialmente diluir si el ROI es dibujado más amplio o más que el Ca^{2 +} evento o célula de interés. Así, los usuarios deben procurar establecer ROIs que ajuste herméticamente como sea posible a las señales de Ca^{2 +} o célula particular que están analizando con el fin de aliviar este problema. Del mismo modo, creando STMS linescans píxel en ImageJ significa que precisa de eventos de Ca^{2 +} está sujeto a la proximidad de la señal de Ca^{2 +} a la línea dibujada. Tales preocupaciones son menores en huso delgado en forma de células tales como ICC-DMP, sin embargo otra célula tipos con una morfología más radiada o redonda pueden hacer que este tipo de análisis inadecuado asignar todas las Ca^{2 +} señales con precisión. Preparación de STM para el análisis, independientemente de si fueron hechos en volumetría o con ImageJ linescans, existen algunas áreas a destacar para efectos de la resolución de problemas. Es importante cambiar la calidad de imagen de 32 bits antes de realizar cualquier calibración en la STMs. no hacerlo, o hacerlo después de calibración para F/F₀ puede conducir a medidas inconsistentes a través de experimentos. Siempre revise la calidad de imagen del STM, que es indicado en la zona superior del borde blanco del STM cuando abrió con ImageJ. Otra área potencial de incompatibilidad es seleccionar el valor de₀ F durante la calibración de amplitud. Es fundamental que para la selección de la región para F₀, lo cubre un área de la célula que es uniforme y en foco. Por esta razón, las zonas de la célula que tienen una fluorescencia basal inestable o que cambiar debido a movimiento u otros artefactos no son ideales y protocolos de estabilización riguroso movimiento deben emplearse en estos casos.

En preparaciones in situ o cultivos que contiene interconectado redes celulares, tales como ICC-mi en el pequeño intestino, análisis PTCL proporciona una técnica simplificada para cuantificar complejos subcelulares Ca^{2 +} eventos que ocurren en la red. Por otra parte, también permite que todos los eventos de Ca^{2 +} en la red dentro de un campo visual dado a analizar, en lugar de usar ROIs arbitrarias, que sólo proporcionan información sobre frecuencia e intensidad en el ROI. Una ventaja del análisis PTCL descrito aquí es que mediante la aplicación de diferencial y gaussiano suavizado filtros a las grabaciones, una gran cantidad de ruido puede sacarse de películas que pueden contener contaminante luz de células no de interés o no dinámicos manchas o inclusiones. Es importante tener en cuenta que la cantidad de diferenciación aplicada a grabaciones dependerá en gran medida la tasa de adquisición utilizada por el experimentador. Diferenciar películas como se describe en el protocolo proporciona un medio de aplicar un filtro a la película para eliminar ruidos de alta frecuencia de las grabaciones. Aplicando un valor de diferenciación de '2' cuando adquirir a 33FPS funciona bien para quitar ruido de fondo manteniendo buena señal a ruido (si el valor es demasiado bajo, se captarán ruidos pero señal a ruido se verá afectada si el valor es demasiado alto). El valor de diferenciación aplicado debe incrementarse con rapidez de adquisición, por ejemplo a 100 FPS, un valor de diferenciación del '7' da aproximadamente la misma señal a ruido como un valor de '2' a una grabación de 33FPS. Experimentadores necesitará optimizar estas configuraciones por consiguiente para su preparación y condiciones de grabación.

El protocolo de umbralización se describe en la figura 3D permite un procedimiento constante umbral para aplicar a diferentes grabaciones realizadas en diferentes sistemas con software de adquisición diferentes. Esta flexibilidad permite que los datos de múltiples investigadores trabajando en diferentes sistemas para compilar sus grabaciones en el mismo conjuntos de datos. Mediante el sistema de la bandera en volumetría, PTCL análisis permite la visualización y cuantificación de cada Ca^{2 +} leña sitios dentro de una red en detalle. Puede obtener información sobre el número de sitios de iniciación, el tamaño del sitio en píxeles y μm²y la duración media de PTCLs que ocurre en ese sitio. Este análisis PTCL permitió la primera caracterización de la actividad CTC en el intestino a un nivel celular, y, usando las diferentes banderas en volumetría software, PTCLs tanto en la red y el disparo individual sitio nivel fueron cuantificados en el tejido intacto preparación del Kit-Cre-GCaMP3 ratones³⁸. De estas observaciones iniciales, este análisis ha sido más utilizado para estudiar la novela Ca^{2 +} afluencia caminos en ICC-mi como tienda-funcionado-Ca^{2 +}GI-entrada⁴² y el papel de mitocondrial Ca^{2 +} señalización en pacemaking GI ⁴¹. mucho como análisis STM descrito, análisis PTCL pueden adaptarse fácilmente a diferentes preparaciones intactas distinto al descrito en el presente Protocolo. Por ejemplo, un estudio reciente utilizó el PTCL análisis para estudiar la novela rítmica Ca^{2 +} eventos que ocurren en las redes celular intactas de la lámina propia de la vejiga urinaria de rata⁵⁸^,⁵⁹ y así se podría aplicar fácilmente a otros sistemas celulares complejas, intactos como sistemas neuronales. Mientras este trabajo se centró en Ca^{2 +} en los tejidos intactos con GECIs, estas técnicas de análisis se pueden ejecutar también en células aisladas y tejidos cargados con tradicionales tintes de Ca^{2 +} indicador. El análisis STM basado se ha utilizado para cuantificar correctamente localizadas señales de Ca^{2 +} y Ca^{2 +} ondas del huso en forma de células intersticiales y las células musculares lisas de una variedad de preparaciones¹¹^,⁶⁰ ^, ⁶¹ ^, ⁶² ^, ⁶³. Además, las rutinas de análisis PTCL aquí descritas también se han aplicado preparaciones in situ red visualizadas con 520 Cal⁵⁸^,⁵⁹. Sin embargo, estos estudios también conservan las desventajas de tal tinte cargando protocolos como célula ambigua identificación y problemas con la señal al ruido.

Los ejemplos ilustrados arriba demuestran que el análisis de STM y PTCL son técnicas altamente maleables que se pueden utilizar para cuantificar complejo Ca^{2 +} en una amplia gama de preparaciones de tejido intacto. Los enfoques ofrecen muchas ventajas sobre la tradicional ROI basado en parcelas de intensidad que se han utilizado rutinariamente previamente y deben proporcionar a los investigadores información cuantitativa más valiosa en Ca^{2 +} de señalización que podría lograrse previamente.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

La financiación fue proporcionada por el NIDDK, a través de DK41315 P01.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageJ software	NIH	1.5a	ImageJ software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit^+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6

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Biology

Aplicaciones de la cartografía espacio-temporal y técnicas de análisis de partículas para cuantificar Ca intracelular^{2 +} señalización In Situ

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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