Biology

Aplicações de mapeamento de espaço-temporal e técnicas de análise de partículas para quantificar intracelular Ca^{2 +} sinalização em Situ

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58989

Bernard T. Drumm¹, Grant W. Hennig², Salah A. Baker¹, Kenton M. Sanders¹

¹Department of Physiology and Cell Biology, University of Nevada Reno School of Medicine, ²Department of Pharmacology, The Robert Larner, M.D. College of Medicine, University of Vermont

Summary

Ca^{2 +} indicadores geneticamente codificados (GECIs) mudaram radicalmente como in situ Ca^{2 +} imagem é executada. Para maximizar a recuperação de dados de tais gravações, a análise adequada dos sinais de Ca^{2 +} é necessária. Os protocolos neste papel facilitam a quantificação de Ca^{2 +} sinais gravados em situ usando spatiotemporal mapeamento e análise baseada em partículas.

Abstract

CA^{2 +} imagens de células isoladas ou tipos específicos de células dentro de tecidos intactos, muitas vezes revela padrões complexos de Ca^{2 +} sinalização. Esta atividade requer cuidadosa e detalhada análise e quantificação de capturar o máximo de informação possível sobre os eventos subjacentes. Espacial, temporal e intensidade parâmetros intrínsecos ao Ca^{2 +} sinais, tais como frequência, duração, propagação, velocidade e amplitude podem fornecer algumas informações biológicas necessárias para sinalização intracelular. De alta resolução Ca^{2 +} imagem normalmente resultados na aquisição de grandes arquivos de dados que são demorados para processo em termos de traduzir as informações de imagem em dados quantificáveis e este processo pode ser suscetível a preconceitos e erro humano. Análise de Ca^{2 +} sinais de células no local normalmente se baseia em medições de intensidade simples de arbitrariamente selecionadas regiões de interesse (ROI) dentro de um campo de visão (FOV). Esta abordagem ignora grande parte das informações de sinalização importantes contidas no FOV. Assim, a fim de maximizar a recuperação de informações de tais gravações de alta resolução obtidas com Ca^{2 +}corantes ou optogenetic Ca^{2 +}análise espacial e temporal de imagens, o caso dos sinais de Ca^{2 +} é necessária. Os protocolos descritos neste artigo vou descrever como um alto volume de dados pode ser obtido de Ca^{2 +} imagem gravações para facilitar a mais completa análise e quantificação de Ca^{2 +} sinais gravado a partir de células usando uma combinação de mapa spatiotemporal (STM)-com base em análise e análise baseada em partículas. Os protocolos também descrevem como diferentes padrões de Ca^{2 +} sinalização observados em células diferentes populações in situ podem ser analisadas de forma adequada. Para ilustração, o método examinará Ca^{2 +} sinalização numa população de células no intestino, células intersticiais de Cajal (ICC), usando o GECIs especializada.

Introduction

CA^{2 +} é um mensageiro intracelular onipresente que controla uma grande variedade de processos celulares, tais como músculo contração¹^,², metabolismo³, célula proliferação³^,⁴^, factores de ⁵, estimulação da liberação de neurotransmissores no nervo terminais⁶^,⁷e a ativação da transcrição no núcleo. ⁷ intracelular Ca^{2 +} sinais muitas vezes tomam a forma de elevações transientes em citosólico Ca^{2 +}, e estas podem ser espontâneos ou decorrentes de estimulação agonista, dependendo do tipo de célula⁸. Espacial, temporal e intensidade parâmetros intrínsecos ao Ca^{2 +} sinais, tais como frequência, duração, propagação, velocidade e amplitude podem fornecer as informações biológicas necessárias para sinalização intracelular⁵^, ⁷ ^, ⁹. citoplasmática Ca^{2 +} sinais podem resultar do influxo de Ca^{2 +} do espaço extracelular ou via Ca^{2 +} lançamento do retículo endoplasmático (ER) através de canais de Ca^{2 +} lançamento como receptores de ryanodine (RyRs) e receptores de inositol-tri-fosfato (IP₃Rs)¹⁰. RyRs e IP₃Rs podem contribuir para a geração de sinais de Ca^{2 +} e a abertura concertada destes canais, o que combinado com vários Ca^{2 +} influxo mecanismos pode resultar em uma miríade de Ca^{2 +} padrões de sinalização que são formados pelos números e abrir a probabilidade de Ca^{2 +} influxo canais, o perfil de expressão de^{Ca 2 +} lançamento canais, a proximidade entre o influxo de Ca^{2 +} e canais de liberação e expressão e distribuição de Ca^{2 +} proteínas recaptação e extrusão. CA^{2 +} sinais podem assumir a forma de uniforme, duradouro, oscilações de alta intensidade global que pode durar vários segundos ou até minutos, propagação intracelulares e intercelulares Ca^{2 +} ondas que podem atravessar distâncias intracelulares mais de 100 µm¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶, ou mais breves, espacialmente localizados eventos tais como Ca^{2 +}sparks e Ca^{2 +} sopros que ocorrem em dezenas de milissegundos prazos e espalhar a menos de 5 µm¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰.

Microscopia fluorescente tem sido usada amplamente para monitorar Ca^{2 +} sinalização em células isoladas e cultivadas e em tecidos intactos. Tradicionalmente, estas experiências envolveram o uso de Ca^{2 +} indicadores fluorescentes, ratiometric e não-ratiometric corantes como Fura2, Fluo3/4 ou Rhod2, entre outros ²¹^,²²^,²³. Estes indicadores foram projetados para ser permeável para as membranas celulares e depois ficam presos em células pela clivagem de um grupo éster via endógenas esterases. Vinculação de Ca^{2 +} para os indicadores de alta afinidade causou mudanças na fluorescência quando as células e tecidos foram iluminados pelo apropriado comprimentos de onda da luz. O uso de célula permeável Ca^{2 +} indicadores bastante reforçada a nossa compreensão de Ca^{2 +}permitido resolução espacial e quantificação destes sinais que não era possível pela análise do Ca^{2 +} sinais e sinalização em células vivas através de outros meios, tais como a eletrofisiologia. No entanto, o tradicional Ca^{2 +} indicadores têm várias limitações, tais como fotobranqueamento que ocorre ao longo de períodos de gravação estendida²⁴. Enquanto o indicador de Ca^{2 +}novo corantes tais como Cal520/590 têm sinal melhorou muito a índices de ruído e a capacidade de detectar o local Ca^{2 +} sinais²⁵, problemas com o fotobranqueamento permanecem uma preocupação para alguns investigadores²⁶de²⁷^,^,²⁸. Fotobranqueamento precipitado também restringe a ampliação, a taxa de aquisição de imagem, e a resolução que pode ser usada para gravações, como o aumento de potência objectivo e taxas mais elevadas de aquisição de imagem exigem aumento de intensidade de luz de excitação que aumenta o fotobranqueamento.

Estas limitações do tradicional Ca^{2 +} indicador corantes são exacerbados durante a gravação de Ca^{2 +} sinais no local, por exemplo quando gravação intracelular Ca^{2 +} sinais de tecidos intactos. Devido aos problemas acima, visualização de Ca^{2 +} sinais em situ usando célula permeável Ca^{2 +}indicadores tem sido limitada a ampliação de baixa potência e reduzidas taxas de captura de imagem, restringindo a capacidade de investigadores para gravar e quantificar o temporal ou espacialmente restrita subcellular Ca^{2 +} sinais. Assim, tem sido difícil de capturar, analisar e apreciar a complexidade espacial e temporal de Ca^{2 +} sinais, que pode ser importante na geração de respostas biológicas desejadas, conforme descrito acima. Análise de Ca^{2 +} sinais de células no local normalmente se baseia em medições de intensidade simples de regiões selecionadas de interesse (ROI) dentro de um campo de visão (FOV). A escolha arbitrária do número, tamanho e posição de ROIs, dependentes do capricho do pesquisador, severamente pode influenciar os resultados obtidos. Assim como a tendência inerente com análise ROI, esta abordagem ignora grande parte da importante sinalização informação contida o FOV, como dinâmico Ca^{2 +} eventos dentro de um arbitrariamente escolhida ROI são selecionados para análise. Além disso, a análise de ROIs falha fornecer informações sobre as características espaciais dos Ca^{2 +} sinais observados. Por exemplo, pode não ser possível distinguir entre um aumento de Ca^{2 +} resultante da propagação de uma onda de Ca^{2 +} e um altamente localizadas Ca^{2 +} liberam o evento de tabulações de Ca^{2 +} sinais dentro de um ROI.

O advento da geneticamente codificado Ca^{2 +} indicadores (GECIs) mudou radicalmente como Ca^{2 +} imagem latente pode ser realizada em situ²⁹^,³⁰^,³¹^,³²^,³³. Existem várias vantagens em usar GECIs sobre corantes. O mais importante talvez seja que a expressão de Lino pode ser executada de maneira específica de célula, que reduz a contaminação de fundo indesejados de células não turísticos. Outra vantagem do GECIs sobre indicadores de Ca^{2 +} tradicionais é aquele fotobranqueamento é reduzido (como fluorescência e, consequentemente, fotobranqueamento só ocorre quando as células são ativas), em comparação com espécimes de corante-carregado, particularmente em alta ampliação e altas taxas de imagem capturam³⁴. Assim, imagem latente com GECIs, tais como a série GCaMP de sensores optogenetic, proporciona a investigadores a capacidade de gravar breve, localizadas sub celular Ca^{2 +} sinais em situ e investigar Ca^{2 +} sinalização em células dentro deles ambientes nativos que não tem sido possíveis anteriormente. Para maximizar a recuperação de informações de tais gravações de alta resolução, análise espacial e temporal adequada dos sinais de Ca^{2 +} é necessária. Deve-se notar que, enquanto o GECIs podem oferecer que algumas claras vantagens, estudos recentes têm revelado que Ca^{2 +} imagem latente pode ser realizada com sucesso de grandes populações de diferentes classes neuroquímicas dos neurônios simultaneamente usando convencional CA^{2 +} indicadores que não são geneticamente codificados para o animal,³⁵. Esta abordagem usado post hoc imuno-histoquímica para revelar várias classes diferentes de neurônios disparando em alta frequência em rajadas sincronizadas e evitou o potencial que as modificações genéticas para o animal podem ter interferido com o fisiológico comportamento, o investigador procura entender³⁵^,³⁶.

Os protocolos descritos neste trabalho facilitam a análise mais completa e quantificação de Ca^{2 +} sinais gravado a partir de células no local usando uma combinação de mapa spatiotemporal (STM)-com base em análise e análise baseada em partículas. Os protocolos também descrevem como diferentes padrões de Ca^{2 +} sinalização observados em células diferentes populações in situ podem ser analisadas de forma adequada. Para ilustração, o método examinará Ca^{2 +} sinalização em uma população especializada de células no intestino, células intersticiais de Cajal (ICC). ICC são células especializadas no trato gastrointestinal (GI) que apresentam dinâmica intracelular Ca^{2 +} sinalização, como visualizado utilizando camundongos expressando GCaMPs³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^, ⁴¹^,,⁴². Transientes de CA^{2 +} no ICC estão ligados à ativação de Ca^{2 +}-ativado Cl^– canais (codificados por Ano1) que são importantes na regulação da excitabilidade do músculo de liso intestinal células (SMCs)⁴³^, ⁴⁴^,,⁴⁵. Assim, o estudo de Ca^{2 +} sinalização em ICC é fundamental para a compreensão da motilidade intestinal. O intestino delgado murino oferece um excelente exemplo para esta demonstração, como existem duas classes de ICC que estão anatomicamente separadas e podem ser visualizadas de forma independente: eu) ICC estão localizados na área entre o músculo liso circular e longitudinal camadas, em torno do Plexo mioentérico (ICC-MY). Estas células servem como as células do marcapasso e geram a atividade elétrica conhecida como ondas lentas⁴⁶^,,⁴⁷^,,⁴⁸^,⁴⁹; II) ICC também estão localizados entre um plexo rico nos terminais dos neurônios motores (plexo muscular profunda, assim, ICC-DMP). Estas células servem como mediadores das respostas a neurotransmissão motor entérica³⁷^,³⁹^,⁴⁰^,⁵⁰. ICC-MY ICC-DMP são morfologicamente distintos e seus Ca^{2 +} sinalização comportamentos radicalmente diferem para realizar suas tarefas específicas. ICC-MY são estreladas em forma e formar uma rede de células interconectadas através de lacuna entroncamentos⁵¹^,⁵². CA^{2 +} sinais em ICC-MY manifesto como breves e espacialmente localizados Ca^{2 +} lançamento eventos que ocorrem em vários locais de forma assíncrona, através da rede de ICC-MY como visualizado dentro um FOV (fotografada com um objetivo X 60)³⁸. Estes sinais assíncronos são organizados temporalmente em 1 segundo de clusters que, quando juntos, tabulados, elevar-se a um líquido 1 s celular aumento de Ca^{2 +}. Estes sinais propagam de célula para célula dentro da rede da ICC e, portanto, organizam Ca^{2 +} sinalização, gerados a partir de sites sub celulares, em uma tecido grande Ca^{2 +} onda. Temporal de clustering e soma de Ca^{2 +} sinais em ICC-MY foi denominado Ca^{2 +} aglomerados transitória (CTC)³⁸. CTC ritmicamente ocorre (por exemplo, é bastante semelhantes durações e períodos semelhantes entre CTC) 30 vezes por minuto no mouse. Por outro lado, ICC-DMP são células fusiformes em forma, alguns com processos secundários, que distribuem entre SMCs e processos nervosos varizes e não independentemente formam uma rede⁵¹^,⁵². ICC-DMP forma junções com SMCs, no entanto e função dentro deste sincício maior, conhecido como o SIP sincício⁵³. CA^{2 +} sinais ocorrem em vários locais ao longo dos comprimentos de células, mas estes transientes não são arrastados ou temporalmente em cluster, como observado no ICC-MY³⁷. CA^{2 +} sinais no ICC-DMP ocorrem de forma estocástica, com intensidade variável, durações e características espaciais. Os protocolos abaixo, usando o exemplo do Ca^{2 +} sinalização no ICC-MY e ICC-DMP, descrever técnicas para analisar a complexa sinalização em tipos específicos de células no local. Utilizamos o sistema de p Cre-Lox inducible para expressar GCaMP6f exclusivamente no ICC, após provocar a ativação da Cre Recombinase (Cre) conduzido por um promotor específico de ICC (Kit).

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Protocol

Todos os animais utilizados e os protocolos realizados neste estudo estão de acordo com os institutos nacionais de guia da saúde para o cuidado e o uso de animais de laboratório. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de cuidados na Universidade de Nevada, Reno e uso institucional do Animal.

1. geração de ratos KitGCaMP6f

Cruz Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f ratos) e c-Kit^{+ / Cre-ERT2} (Kit-Cre ratos) para gerar o ICC específicos GCaMP6f expressando animais (ratos Kit-Cre-GCaMP6f).
Nota: GCaMP6f foi usado devido a sua eficiência relatada em reportagem localizadas, breve intracelular Ca^{2 +} sinais in situ e in vivo de⁵⁴.
Injete Kit-Cre-GCaMP6f ratos com tamoxifeno em idades de 6 a 8 semanas para induzir a ativação da Cre Recombinase e subsequente expressão GCaMP6f no ICC (Figura 1).
1. Para criar a solução de tamoxifeno, dissolver 80 mg de tamoxifeno (ver Tabela de materiais) em 800 μL de etanol (ver Tabela de materiais) em uma cubeta e vórtex por 20 minutos.
2. Adicione 3,2 mL de óleo de cártamo (genérico) para criar soluções de 20 mg/mL e em seguida proceda à sonicação durante 30 minutos antes da injeção.
3. Injetar camundongos (injeção intraperitoneal; IP) com 0,1 mL de solução de tamoxifeno (2 mg de tamoxifeno) por três dias consecutivos. Confirmar a expressão de GCaMP6f por genotipagem e usar ratos 10 dias após a primeira injeção.
  1. Ratos de genótipo por recorte um pequeno pedaço da orelha de cada animal. Em seguida, use o método de HotSHOT⁵⁵ para isolamento de DNA genômico pela incubação clipes de orelha a 95 ° C por 60 min em 75 mL de NaOH e neutralizar em seguida por 75 mL de tampão Tris. Use padrão PCR para determinar o genótipo de cada animal, 2 mL de DNA em uma reação de 20 mL com GCaMP6f iniciadores específicos⁵⁶. Executar 10 mL do produto do PCR em um gel de agarose 2% para determinar o tipo selvagem (297 bp) e mutante (~ 450 bp) bandas.

2. preparação dos tecidos para Ca^{2 +} imagens

Anaesthetize ratos por inalação com isoflurano (4%, consulte Tabela de materiais) em uma campânula ventilada e em seguida sacrifício por deslocamento cervical.
Usando tesouras afiadas abrir no abdômen dos ratos, retire o intestino delgado e coloque em solução de Krebs-Ringer bicarbonato (KRB). Abra o intestino delgado na borda mesentérica e lavar qualquer conteúdo intraluminal com KRB. Com dissecações afiadas, retire as camadas mucosa e mucosa sub.
Nota: KRB solução tem a seguinte composição (em mM): 118,5 NaCl, KCl 4.7, CaCl₂ 2.5, MgCl₂ 1.2, NaHCO₃ 23,8, KH₂PO₄ 1.2, 11,0 de dextrose. Esta solução tem um pH de 7,4 a 37 ° C quando borbulhar de equilíbrio com 95% O₂- 5% de CO₂.
Usando pequenos pinos, pino o tecido do intestino delgado para a base de um volume de 5 mL, prato Sylgard revestido, diâmetro 60mm com a camada circular de músculo liso virado para cima. Perfundir a preparação com solução KRB aquecida a 37 ° C por um período de equilíbrio de 1 hr antes de experimentação.
Após este período de equilíbrio, realizar in situ Ca^{2 +} imagens de pequenas intestinal ICC-MY e ICC-DMP usando microscopia confocal (as imagens neste protocolo foram adquiridas com um microscópio confocal, equipado com um disco giratório). Devido aos benefícios do GECIs descritos acima, usar imagens de alta resolução de lapso de tempo (> 30 quadros por segundo, FPS) combinado com objectivos de alta potência (60 – 100 x) para adquirir filmes de Ca^{2 +} sinais dinâmicos no ICC.
Nota: Para reduzir o movimento do tecido, aplique nicardipina (0.1-1 μM) durante as gravações, conforme descrito anteriormente,³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹.
Distinguir ICC-MY e ICC-DMP no intestino usando suas diferente localização anatômica, morfologia e basal Ca^{2 +} padrões de atividade.
1. Localize ICC-MY a nível do Plexo mioentérico, entre as camadas longitudinal e circular de músculo liso do intestino delgado. Eles são estrelados, formando uma rede conectada (Figura 3A). CTC (descrito acima) propaga através da rede de ICC-MY com uma ocorrência regular de ~ 30 ciclos por min.
2. Por outro lado, localize ICC-DMP em um único avião a nível do plexo muscular profundo, entre a camada circular de músculo liso e o plexo submucosa. ICC-DMP não formam uma rede e são células em forma de fuso (Figura 2A) que exibem sem eventos de propagação regulares e em vez disso, fogo estocásticas, localizadas intracelular Ca^{2 +} transientes.
Independentemente do software de aquisição utilizado, salve filmes como uma pilha de imagens TIFF.

3. análise de estocástico Ca^{2 +} sinais no ICC-DMP usando mapeamento de espaço-Temporal (STM)

Analisar o ICC-DMP usando mapeamento de espaço-temporal com uma combinação de software ImageJ (NIH, EUA, livre para download em http://imagej.nih.jov/ij) e software feito sob encomenda (volumetria, versão G8d, GWH, operável no Mac OS, entre em contato com o Grant Hennig grant.hennig@ Med.UVM.edu sobre inquire de volumetria acesso e utilização)
Nota: Uma abordagem alternativa para analisar totalmente estes mapas espácio-temporal com ImageJ sozinho também é fornecida em seções posteriores (início no passo 3.9).
Abra a volumetria e usar o direito do mouse cliques para abrir pastas que contêm arquivos de filme. Clique esquerdo sobre o arquivo de filme para ser analisado para abri-lo em volumetria (deve estar no formato TIFF descompactado). Uma vez aberto, o filme será contido dentro de uma janela azul-fronteira (janela de filme) que irá abranger uma grande área da tela à direita. Do lado esquerdo da tela irá conter a janela Plot (4/5ths superior) e a janela de traços (baixa de 1/5^th).
Ajuste as dimensões do filme mantendo pressionada a tecla SHIFT e, simultaneamente, rolagem acima com o botão do meio do mouse (MMB, reduz o tamanho) ou a rolagem para baixo com o MMB (aumenta o tamanho). Iniciar ou parar a reprodução pressionando 'A'; a velocidade de reprodução pode ser ajustada premindo a cima e para baixo teclas de seta.
Para criar um STM usando volumetria, desenhe um ROI sobre uma célula inteira mantendo pressionada a tecla SHIFT enquanto clicando e arrastando o botão esquerdo do mouse. Ajuste a orientação do ROI de rolagem com o MMB nos cantos do ROI. Quando o ROI é lugar sobre a célula para ser analisado (Figura 2A), uso direito clica na janela do filme para acessar ' ROI STMs – STMyAvg > xRow' e clique com o botão esquerdo para criar um STM da atividade celular na janela Plot (há também uma opção para selecionar ' STMxAvg > yRo w ', qual deles está selecionado dependerá se a orientação da célula é mais alinhada com o x ou eixo y, por exemplo, a célula destacada Figura 2A é mais orientado para o eixo y').
Clique com o botão esquerdo sobre o STM na janela Plot e clique em 'P' para subtrair o ruído de fundo e pressione 'H' para aumentar o contraste da STM. Salve o STM clique direito para acessar 'STM Load Save - salvar STM como. tif' e deixou clicando para salvar como TIFF.
O restante da análise da ICC-DMP realizarão no ImageJ. ImageJ consiste em dois componentes principais, uma barra de ferramentas com uma posição fixa no topo do monitor e uma interface de usuário móvel. Usando o ImageJ, abra o arquivo TIFF STM de ICC-DMP Ca^{2 +} atividade (File-Open na barra de ferramentas imagem J).
Aberta a volumetria criado STM, que terá tempo orientado verticalmente. ImageJ abrirá automaticamente arquivos TIFF como RGB ou imagens de 16 bits. Para melhorar a qualidade da imagem, clique esquerdo 'Imagem' na barra de ferramentas da ImageJ. Rolar na primeira opção ' tipo 'para revelar um menu drop-down de vários formatos de imagem, dirija-se 32-bit' e clique com o botão esquerdo para mudar.
Para tornar o STM legível contra o tempo da esquerda para a direita, clique esquerdo na barra de ferramentas ImageJ no seguinte caminho: 'Imagem-Transform-gire 90 graus à esquerda'. Também é possível criar STMs de in-situ Ca^{2 +} atividade usando linescans com ImageJ sozinho sem volumetria e isso é detalhada abaixo.
Nota: Uma vez que o STM é criado, eles são analisados da mesma forma, independentemente de qual software foi usado para gerá-los. Para ignorar este método alternativo para a criação de STMs no ImageJ, pule para a etapa 3.19.
Para criar o STM com ImageJ, abra a pilha de arquivos TIFF que compõem a gravação do ICC-DMP Ca^{2 +} atividade (File-Open na barra de ferramentas ImageJ). ImageJ abrirá automaticamente arquivos TIFF como RGB ou imagens de 16 bits. Para melhorar a qualidade da imagem, clique esquerdo 'Imagem' na barra de ferramentas da ImageJ. Rolar na primeira opção ' tipo 'para revelar um menu drop-down de vários formatos de imagem, dirija-se 32-bit' e clique com o botão esquerdo para mudar.
Ruído de fundo (resultantes de ruído de fluorescência ou câmera auto) agora deve ser subtraído do filme. Clique esquerdo a função de 'Seleção retangular' na interface do ImageJ e desenhar um ROI (pela esquerda clicando e arrastando para a forma e o tamanho desejado) sobre a fluorescência de plano de fundo do filme.
Depois de selecionar o ROI, esquerda, clique em 'Analisar' na barra de ferramentas da ImageJ, e então clique esquerdo 'Histograma' no menu suspenso resultante. Uma caixa pop-up aparecerá perguntando sobre valores de intervalo de pixel para calcular; ImageJ tem os valores de clique esquerdo então pré-selecionadas de ROI 'Okey'.
Depois de clicar em 'Okey', será exibida uma caixa de pop-up nova contendo um histograma mostrando a distribuição de valores para o ruído de pixel do fundo dentro do ROI. Tome nota da média abaixo do histograma e feche a caixa de pop-up.
Clique em voltar para o filme de 32-bit e selecione o FOV inteira, deixou clicando em 'Editar' na barra de ferramentas do ImageJ, rolagem a 'Seleção' e saiu clicando em 'Selecionar tudo' no menu suspenso revelada.
Clique esquerdo 'Processo' na barra de ferramentas da ImageJ, vá para 'Matemática' e clique esquerdo 'Subtrair' no menu suspenso revelada.
Será exibida uma caixa de pop-up, onde pode ser inserido um valor a ser subtraído o FOV. Digite o valor médio, adquirido a partir do histograma na etapa 3.12 acima e clique em 'Okey'. ImageJ então pedirá para processar todos os quadros na pilha de TIFF (e não apenas o único quadro do filme é atualmente na). Clique em 'Sim'.
Depois de clicar em 'Sim', o filme vai ficar preto. Para corrigir isto, clique esquerdo 'Imagem' na barra de ferramentas do ImageJ e rolar sobre 'Ajustar'. Esquerda clique sobre a primeira opção revelada para 'Brightness/Contrast"(B & C). Isso irá abrir uma caixa pop-up onde vários aspectos de brilho e o contraste podem ser modificados. Esquerda clique sobre a opção 'Auto', uma vez que revelam o aumento da qualidade do filme. Deixe este B & C pop caixa aberta para uso futuro.
Para criar uma linha, primeiro clique direito sobre a ferramenta de seleção de linha na interface do ImageJ para revelar as opções para diferentes linhas; esquerda, clique em 'Linha segmentada' para escolhê-lo na lista. Com a ferramenta 'Linha segmentada' selecionada, uso único deixou cliques para desenhar uma linha ao longo do eixo meado de uma ICC-DMP individual. Cada único clique esquerdo irá corrigir a linha em que ponto específico e a linha pode então ser livremente movida mais em qualquer ângulo desejado. Quando a linha estiver concluída, duplo clique esquerdo para corrigir a linha no lugar.
Clique esquerdo de 'Imagem' na barra de ferramentas do ImageJ e rolar sobre 'Pilhas' e clique com o botão esquerdo na opção 'Refatiar'. Aparecerá uma caixa pop-up; Clique com o botão esquerdo na opção 'Girar 90 graus', isso irá orientar a linha da esquerda para a direita para que ele pode ser calibrado e li contra o tempo no eixo x, com espaço no eixo y. Clique em 'Okey' para criar o STM.
A intensidade do STM será criada em uma escala de cinzentos com alta intensidade Ca^{2 +} sinais mostrados como graus variados de branco, fora cinza branco ou claro, dependendo de sua intensidade. Normalmente, o contraste da linha criado precisa ser melhorada. Fazer isso clicando em 'Auto' no pop B & C caixa.
A intensidade da fluorescência da linha é apresentada sobre o STM em valores de pixel arbitrário. Para medir com precisão a amplitude de Ca^{2 +} sinais de STM, os valores de fluorescência do STM (F) agora precisam ser normalizada. Usando a função 'Seleção retangular' na interface do ImageJ, desenhe um ROI em uma área de STM que exibe a área menos intensa e mais uniforme da fluorescência (F₀).
Repetir os passos dados em 3.11 – 3.12 para obter um valor médio (F₀) da intensidade dentro o ROI selecionado e selecione o STM inteira deixou clicando em 'Editar-seleção-selecionar tudo' na barra de ferramentas do ImageJ.
Clique esquerdo 'Processo' na barra de ferramentas do ImageJ e rolar a 'Matemática'; clique esquerdo 'Dividir' das opções reveladas. No pop-up subsequente, digite o valor médio (F₀) obtido da etapa 3.21. Após dividir o STM inteira por (F₀) o STM girará o preto; corrigi isso clicando em 'Auto' na B & C pop-up caixa. A linha agora é calibrada para amplitude, com intensidade de fluorescência, expressada como F/F₀.
Atualmente, a STM exibirá o número de quadros na pilha de TIFF no eixo x e o número de pixels que representa o comprimento da célula no eixo y. De forma a quantificar informação espacial e temporal de Ca^{2 +} sinais, calibre o STM para espaço e tempo. Clique esquerdo 'Imagem' na barra de ferramentas da ImageJ e deixou clique em 'Propriedades'. Aparecerá uma caixa pop-up. Dentro desta janela, digite os valores apropriados para calibrar totalmente o STM.
Para 'Largura', insira o comprimento de tempo que leva para capturar um único quadro em segundos. Para exemplos, a 5 FPS, insira um valor de 0.2, para 50 FPS digite um valor de 0,02, para 33 FPS Insira um valor de 0,033 etc. Para 'Altura Pixel', digite quantos mícrons cada representa pixel (dependerá do objectivo usado e Câmara utilizada para aquisição). 'Profundidade de Voxel' é deixada em 1 antes de clicar em 'Okey'. Sem outros parâmetros devem ser ajustados dentro da janela.
Nota: Depois de clicar em 'Okey', o STM vai ser totalmente calibrado para amplitude, espaço e tempo. Amplitude na STM será expressa como o tempo de_0,F/F no eixo x será expressa em segundos e espaço no eixo y será expressa em μm (Figura 2B). CA^{2 +} eventos sobre o STM agora estão prontos para ser medido, a STM calibrado também pode ser salvos como uma única imagem TIFF para analisar em uma data posterior.
ImageJ tem um número de construído na tabela de pesquisa de código de cores (LUTs) que pode ser usada para código de cor do STM. Aplicar um construído em LUT deixou clicando na barra de ferramentas ImageJ no caminho da 'Imagem-Lookup Tables' e escolha uma LUT para aplicar. LUTs de feitas sob encomenda também pode ser importada para o STM deixou clicando na barra de ferramentas ImageJ no caminho 'Arquivo-importar-LUT' e em seguida, selecionando a LUT a importar. Por exemplo mostrado na Figura 2 o STM teve a LUT personalizado 'QUBPallete' (Queens University Belfast, UK) aplicada a ele, para o código de cores quentes (vermelho, laranja, etc.) como áreas de Ca^{2 +} fluorescência intensa e cores frias (preto, azul) como áreas de baixo Ca^{2 +}fluorescência.
Para inserir uma barra de calibração de amplitude para indicar o intervalo de amplitudes representadas pelas várias cores, deixou clique em 'Analisar' na barra de ferramentas do ImageJ, role até 'Ferramentas' e selecione 'Barra de calibração' do menu revelado. As opções são dadas para o tamanho, zoom, escala e posição sobre o STM para barra de calibração; ajustar essas configurações conforme desejado e clique em 'Okey'. Observe que, quando a barra de calibração é inserida, ImageJ cria um novo STM contendo, deixando a versão original sem a barra de calibração intacta e separado.
Nota: Se a caixa 'Sobreposição' está seleccionada quando inserir a barra de calibração, não será gerado um novo STM.
Para começar a analisar eventos de Ca^{2 +} individuais, clique esquerdo sobre o seletor de 'Reta' na interface do ImageJ. Clicando inicialmente deixou o STM, desenhe uma linha reta horizontal através do centro de um evento de Ca^{2 +} paralelo ao eixo x (contra o tempo). Complete a linha esquerda clicando uma segunda vez (Figura 2D).
Clique em 'Analisar' na barra de ferramentas ImageJ e clique com o botão esquerdo na 'Traçar perfil'. Uma nova caixa aparecerá com o perfil de trama de Ca^{2 +} de evento (Figura 2E).
Nota: A opção 'Lista' dentro desta caixa irá gerar uma lista dos valores XY do lote gerado, que pode ser copiado para um programa de planilha para criar traços, se assim o desejar.
Para medir a amplitude de Ca^{2 +} de evento representado no perfil do enredo, clique esquerdo sobre o seletor de 'Reta' na interface do ImageJ. Em seguida, desenhe uma linha vertical da linha de base do perfil do enredo para o pico de Ca^{2 +} de evento; o comprimento da linha (mostrado na interface ImageJ) representará a amplitude do evento expressado em ΔF/F₀ (Figura 2E).
Usando o valor de amplitude adquirida, a duração do Ca^{2 +} evento pode ser medida desenhando uma linha reta em toda a largura do evento no ponto de amplitude máxima de 50% (duração total em meia amplitude máxima, FDHM) ou a duração total do evento pode-se medir se desejado (Figura 2E).
Nota: Experimentadores precisará projetar o critério específico para limiarização válido Ca^{2 +} eventos nestas gravações. Em nossos experimentos, eventos de Ca^{2 +} foram designados como sendo válida para análise se foi sua amplitude > 15% do evento amplitude máxima na seção de controle de gravação. No entanto, estes limiares dependerá dos tecidos específicos e células sob estudo e são apenas orientações arbitrárias que exigem otimização específica para cada tipo de tecidos e células.
Desenhando uma linha ao longo do movimento ascendente ou descendente do Ca^{2 +} evento enredo perfil, pode ser calculada a taxa de subida ou descida em conformidade. Depois que a linha é desenhada, o cursor do mouse pode ser movido para o ponto onde a linha começa e onde termina. Quando o cursor está estacionário sobre estes pontos, x, y coordenadas para esse local será exibido no lado esquerdo inferior da interface do ImageJ. Assim, através da aquisição de x, y valores para onde começa a linha (x₁, y₁) e termina (x₂, y₂), a taxa de subida ou descida (ΔF/s) pode ser calculada como o declive da linha, y₂- y₁ / x₂- x₁ (Figura 2F ).
Para calcular a propagação ou disseminação espacial de um evento de Ca^{2 +} , clique esquerdo sobre o seletor de 'Reta' na interface do ImageJ. Em seguida, desenhe uma linha reta vertical ao longo do comprimento de Ca^{2 +} de evento ao longo do eixo y. O comprimento da linha (mostrado na interface ImageJ) representará a propagação espacial do evento expressado em μm (Figura 2).
Determine a velocidade de uma propagação Ca^{2 +} evento desenhando uma linha ao longo da frente de propagação do evento e calculando o declive da linha. Isto pode ser executado manualmente, de forma semelhante, descrita na etapa 3,32, determinando valores de y para onde começa a linha x, (x₁, y₁) e termina (x₂, y₂); esses valores serão exibidos no lado esquerdo inferior da interface do ImageJ quando o cursor do mouse está situado sobre o STM.
Sobre a coleção dos parâmetros desejados para Ca^{2 +} evento quantificação, piscina estes média de valores para gerar valores médios para cada parâmetro em uma base por célula; Como alternativa, coloque todos os valores brutos em um histograma de distribuição para mostrar sua gama (Figura 2 H).

4. quantificação da CTC no ICC-meu usando partículas com base em análise

Antes de analisar filmes em volumetria com PTCLs, a calibração espacial e temporal do filme precisará ser inserido o nome do arquivo. Edite todos os arquivos a serem analisados em volumetria para conter dentro o título, o número de segundos que cada quadro é igual e também o número de mícrons que cada pixel é igual a separados por um traço único, com os valores envolvidos em colchetes. Por exemplo, um filme que adquiriu em FPS 33 com um objectivo de 60 x (512 x 512) deveria ter [0,22 – 0.033] inserido seu nome de arquivo.
Abra a volumetria e usar o direito do mouse cliques para abrir pastas que contêm arquivos de filme. Clique esquerdo sobre o arquivo de filme para ser analisado para abri-lo em volumetria (Figura 3A, deve estar no formato TIFF descompactado).
Para calcular com precisão o Ca^{2 +} sinais do FOV inteiro, o filme passará primeiro por diferenciação e suavização para remover a interferência (ruído da câmera, fluorescência auto etc.) e aumentar a relação sinal / ruído. Na janela do filme, clique direito para abrir um menu e usando acesso direito cliques ' STK filtro-diferenciar ', botão direito do mouse novamente para introduzir um valor para diferenciar, pressione ENTER e clique esquerdo para aplicar (para filmes adquiriram em 33 FPS um valor de 2 (∆ t = ± 66-70 mseg) funciona bem, o valor é maior que a taxa de aumento de captura de imagem).
Nota: Diferenciação neste contexto irá reduzir a intensidade das áreas de gravação (pixéis) que não mostram nenhuma atividade dinâmica sobre o número de quadros especificado. Assim, se for inserido um valor de '2', cada pixel em cada frame da gravação é analisado e se dentro desse quadro, não há alteração dinâmica no quadro de fluorescência 1 pixel antes e 1 quadro depois, a intensidade dentro os pixels será subtraída a gravação. Assim, ruído de fundo não-dinâmico é removido e sinal de ruído é maior.
Alise o filme diferenciado aplicando um filtro Gaussian. Clique com o botão direito na janela do filme para abrir um menu e usando acesso direito cliques 'STK filtro-Gauss KRNL', clique novamente para inserir um valor (sempre usar um número ímpar, para filmes adquiridos em FPS 33, um valor de 5 funciona bem, 1,5 x 1,5 µm StdDev 1.0) um valor de entrada, pressione ENTER e clique esquerdo para aplicar (Figura 3B).
Começamos a criar PTCLs selecionando um período do filme que inclui um período quiescente (20 – 40 frames), seguido pela ocorrência de um CTC e também de 20 – 40 quadros depois do CTC. Para fazer isso, percorrer o filme usando o MMB para rolar a esquerda para a direita na barra amarela.
Com a seleção feita, uso direito clica na janela do filme para acessar 'STK Ops – rampa DS PTCLinfo' e clique com o botão esquerdo para aplicar. Esta função executa uma rotina de análise PTCL rampas progressivamente o limiar de intensidade máxima de intensidade mínima. Isto será exibido graficamente na janela do enredo como um enredo de ruído e também na janela de traços como três traços coloridos, com o traço verde, mostrando o número de PTCLs, o traço vermelho mostrando tamanho médio PTCL e o traço azul mostrando a intensidade absoluta limite.
Nota: O tamanho médio e número de PTCLs cada limiar é calculado automaticamente e em seguida um limiar semi manual é aplicado usando a intensidade em que em que o tamanho médio de PTCLs começa a cair, que ocorre no ponto de inflexão do traço vermelho em a janela de rastreamento (Figura 3D, ou seja, devido ao grande número de ruído espacialmente limitado PTCLs, reduzindo o tamanho médio de PTCLs).
Dentro da janela de plotagem, pressione 'H' para equilíbrio de histograma a trama mostrada de ruído PTCL. Ciclo através de esquemas de cores pressionando ' [' até que o fundo é de cor branca com traços coloridos na parte superior.
Pressione 'F' para trazer um instrumento de medição e clique com o botão esquerdo sobre a trama no cruzamento onde as tramas coloridas se deslocar para o lado de mão direita. Isso marcará uma única linha vertical na barra de rolagem da janela de traços abaixo.
Dentro da janela de rastreamento, role MMB esquerda para a direita do ponto de inflexão do traço vermelho até linha vertical branca marcada criado na etapa 4.10 e certificando-se que o traço azul é selecionado clicando com o botão direito sobre ele, leia o 'yAVG' que será exibido em t ele abaixar o lado esquerdo da janela de vestígios. Desmarque a seleção pressionando o MMB uma vez dentro da janela de vestígios.
Dentro da janela do filme, pressione 'C' para abrir uma roda de cor e, em seguida, pressione ' para ajustar o limiar. PTCLs válidos agora serão mostrados como vermelho na janela de filme (Figura 3) e aqueles que saturar será branco. Remova as áreas brancas deslocando-se com o botão esquerdo do mouse.
Rolar para cima ou para baixo com o MMB para ajustar o valor numérico amarelo na roda de cor, ajuste esse valor para o valor de yAVG retirado passo 4.11. Isto irá atribuir tudo em vermelho como um ativo Ca^{2 +} PTCL transitória no ponto determinado limiar. Para salvar como um arquivo de partículas baseado em coordenadas, uso direito clica para acesso ' STK 3D-Save PTCLS 0' e depois à esquerda clique para salvar o arquivo.
Pare de volumetria e reabrir. Abra o PTCL arquivo (.gpf) criado na etapa 4.13. Neste tipo de arquivo, todos os ativos Ca^{2 +} transientes são salvos como um uniforme azul PTCL (Figura 3E). Como cada PTCL é uma entidade individual com seu próprio ID, área e perímetro coordenadas, sinalizadores de estado (veja abaixo) e matrizes de resultado, a análise das características espácio-temporais, de PTCLs, ou entre PTCLs é simplificada.
Para começar a análise PTCLs, remover qualquer ruído PTCL restante (pequenas PTCLs inválidos criados quando é gerado o arquivo de .gpf) usando certo cliques no filme janela para acessar ' PTCL STKOPS-bandeira ptcls > Min = 70' e clique com o botão esquerdo para aplicar. Esta ação sinalizará o PTCLs superiores a 6 µm² (~ diâmetro > 2µm) e volumetria irá atribuir-lhes a seleção de 'Bandeira 1'. Quando isso for concluído, PTCLs que estão acima desse limite (bandeira 1) aparecerá como uma cor roxa clara na janela do filme, Considerando que qualquer PTCLs abaixo limiar permanecerá sua base cor azul (Figura 3F).
Criar representações de mapa de calor da atividade PTCL usando certo cliques no filme janela para acessar ' PTCL STKops-StatMap bandeira ='. Clicando neste caminho final, pode ser inserida uma atribuição de bandeira para analisar. Assim, se desejar quantificar os PTCLs atribuídos a FLAG1, basta digitar '1', pressione ENTER e em seguida, clique esquerdo para aplicar. Isso irá gerar um mapa de calor, mostrando os totais PTCLs para todo o período de gravação, com cores diferentes, representando a ocorrência (%) em toda a gravação (Figura 3, cores quentes indicam maior ocorrência naquele local).
Salve os mapas de calor clique com o botão direito nelas para acessar 'STM Load Save - salvar STM como. tif' e deixou clicando para salvar como TIFF.
Quantificar a atividade PTCL usando certo cliques no filme janela para acessar ' PTCL medida-PTCLStats STK =', clicando neste caminho final, pode ser inserida uma atribuição de bandeira para analisar. Assim, se desejar quantificar os PTCLs atribuídos a FLAG1, basta digitar '1', pressione ENTER e em seguida, clique esquerdo para aplicar. Isso vai gerar uma série de traços na janela de rastreamento.
Volumetria será por padrão sobrepor os traços PTCL gerados na etapa 4.17 em cima do outro. Separá-los usando o direito do mouse clicar na janela de rastreamento para acessar 'Align-separe Trace' e clique com o botão esquerdo para aplicar. Isto irá revelar os traços PTCL quatro diferentes que quantificam o Ca^{2 +} atividade PTCL no filme mostrando área PTCL (verde), PTCL contagem (vermelho), tamanho PTCL (ciano) e desvio-padrão tamanho PTCL (azul) plotada contra o tempo (Figura 3 H).
Esses traços podem ser salvos como um arquivo de texto que pode ser importado para um programa de planilha para análise adicional. Para salvar os traços, mantenha pressionada a tecla SHIFT e use direito clica na janela para acessar 'Assorted-Dump ROI como texto' e clique com o botão esquerdo para salvar o arquivo de rastreamento. Esta informação é então coletada e ilustrada em histogramas ou outras representações gráficas apropriadas (Figura 3 H).
A fim de examinar a ocorrência inicial de PTCLs (ou seja, olhar para disparar sites), essas PTCLs iniciais recebem uma atribuição de bandeira diferente. Para melhor isolar disparando sites ocorrendo dentro da rede, apenas aqueles PTCLs que não se sobrepõem com as partículas no quadro anterior, mas se sobrepõem com partículas no próximo 70 ms são considerados sites a disparar.
Para aplicar esse limite, uso direito clica na janela do filme para acessar ' PTCL comportamento-F1 InitSites > F = 3' e esquerda clique para aplicar. Isto irá atribuir iniciando PTCLs como 'Bandeira 3', e PTCLs que atendem a esse critério aparecerá como uma cor verde-limão no filme (Figura 4A).
Volumetria também proporciona a capacidade de quantificar e plotar o número de locais de tiro PTCL em um determinado FOV, bem como traçando sua probabilidade de disparo durante uma CTC. Para analisar esses parâmetros, crie um mapa de calor de iniciar PTCLs (pavilhão 3), conforme descrito na etapa 4.16 (Figura 4B).
Clique com o botão esquerdo na janela Plot e então pressione 'C' para abrir uma roda de cor e a imprensa que ' ao limiar. O mapa de calor de iniciar PTCLs vontade então virar cinza e branco. Remover todo branco por rolagem com o botão esquerdo do mouse e o limiar da PTCLs no mapa de calor para que apenas válidos PTCLs são cobertos em cinza (ajustar o limite de rolagem para cima e para baixo com o MMB).
Uso direito do mouse clicar sobre o mapa de calor na janela Plot para acessar 'STM PTCLs-Find PTCLs 70' e clique com o botão esquerdo para aplicar. Isto irá atribuir todas as PTCLs cinzas no mapa de maiores que 70 pixels² no tamanho a ser alocado como uma iniciação codificados por cores separadas PTCL ou PTCL disparando local (Figura 4).
Traça a atividade de cada um desses sites de disparar contra o tempo clicando com o botão direito sobre o PTCL disparando mapa e acessar 'STM PTCLs-criar PTCL rois' e botão esquerdo para aplicar. Isso irá gerar uma nova imagem na janela do filme com todos o separado PTCL colorida disparando sites exibidos com um ROI em torno deles.
Uso direito clica na janela do filme para acessar ' PTCL medida-PTCLpixROIBM > = 1' e clique com o botão esquerdo para aplicar. Isto irá identificar todos os ROIs na janela do filme que contêm pelo menos um PTCL e traçará toda a atividade dentro destes ROIs na janela de vestígios. Por padrão, esses traços vão ser sobrepostos a uma outra. Para separá-los, uso direito clica na janela de rastreamento para acessar 'Align-separe Trace' e clique com o botão esquerdo para aplicar. Para salvar os traços, mantenha pressionada a tecla SHIFT e use direito clica na janela para acessar 'Assorted-Dump ROI como texto' e clique com o botão esquerdo para salvar o arquivo de rastreamento.
A atividade de cada local de disparo também pode ser plotada como um mapa de ocorrência. Para fazer isso, uso direito clica na janela do filme para acessar ' PTCL Pianola de medida-ROI = 10' e clique com o botão esquerdo para aplicar. Isso irá gerar uma trama de todos os sites de disparar contra o tempo na janela Plot. Cada site de disparo será exibido como uma entidade colorida separadamente, cada um em seu próprio 'faixa' e essas parcelas correspondem à Ca^{2 +} PTCLs iniciando durante CTC (Figura 4E) salvar estes mapas de ocorrência clicando com o botão direito nelas para acessar ' STM Load Save - salvar STM como. tif ' e em seguida, botão esquerdo para salvar como TIFF.
Para quantificar a probabilidade de disparo em cada local de fuzilamento durante um CTC, uso direito clica na janela do filme para acessar ' PTCL comportamento-Mark é = 1' e clique com o botão esquerdo para aplicar. Isto irá identificar todos os quadros do filme que contêm PTCLs acima do limiar, e estes serão marcados na parte inferior da janela do filme como linhas verticais azuis.
CTC manifesta como cluster rápida de disparo assíncrono de múltiplos locais de tiro dentro o FOV com lacunas de s ~ 1 entre cada ciclo CTC. Esta regularidade e longa gap de nenhum PTCLs ativos entre CTC é usado para definir um CTC para análise.
Uso direito clica na janela do filme para acessar ' Gap PTCL comportamento-bloco é < =' e usar um clique direito sobre o ponto final para introduzir um número. Este comando agrupará os quadros PTCL ativo identificados na etapa 4.28 em blocos e blocos são baseados no número de quadros que separam PTCLs ativos. Para as gravações de 33 FPS por exemplo, um valor de 10 funciona bem. Se PTCLS ativos são menos de 10 quadros separados (330 ms) eles são agrupados em um único bloco para análise (os blocos são então mostrados como retângulos rosa sobre as linhas verticais azuis na parte inferior da janela do filme, com cada retângulo rosa agora indicando um CTC).
Uso direito clica na janela para acessar 'PTCL medida-PTCL evento Prob' do filme. Isso irá gerar um arquivo de texto que pode ser importado para um programa de planilha. Este arquivo de texto irá fornecer uma vasta quantidade de dados sobre a natureza dos sites iniciação que foram definidos a partir de etapas 4.16 – 4,23 e sua contribuição para o CTC.
Nota: O arquivo de texto mostrará o número de sites de iniciação (referido como 'domínios'), o tamanho do site em pixels e μm², probabilidade de cada site de iniciação disparar ou uma vez ou várias vezes durante cada CTC (dado como um %), a duração média e tamanho de PTCLs ocorridos nesse site de iniciação, o número de ciclos CTC (como definido na etapa 4.23) e a percentagem de locais de tiro que disparou durante cada ciclo CTC. Esta informação é coletada e ilustrada em histogramas ou outras representações gráficas apropriadas (Figura 4F).

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Representative Results

Usando ratos Kit-Cre-GCaMP6F (Figura 1), dinâmica Ca^{2 +} sinalização de comportamentos de ICC no trato gastrointestinal podem ser fotografados no local. Com microscopia confocal, imagens de alta resolução de populações específicas de ICC podem ser adquiridas sem contaminar os sinais de outras populações de ICC dentro do mesmo tecido mas em planos anatomicamente distintos do foco (Figura 2A)³⁷ ^, ³⁹ ^, ⁴⁰ ^, ⁴¹. é possível registro breve (< 100 ms), localizadas a Ca^{2 +} eventos que não eram possíveis com membrana permeável Ca^{2 +} indicadores. Mapeamento de espaço-temporal com volumetria ou ImageJ software pode ser usado para gerar STMs de todos Ca^{2 +} eventos dentro das células no local. Usando essa abordagem, Ca^{2 +} eventos em um FOV inteira podem ser visualizados e mapeado (Figura 2BC), ao invés de só gravar a actividade limitada de um único ROI. Esses métodos podem ser estendidos para cada célula dentro de um determinado FOV, garantindo coleção de dados representativos de todas as células e fornecendo informações quantitativas sobre relativos amplitudes, durações transitórias, taxa de ascensão e queda de transientes, etc (Figura 2E , F). Análise do STM, em oposição a intensidade baseada em ROI parcelas, também fornecem a capacidade para monitorar e gravar características espaciais de Ca^{2 +} sinalização, tais como disseminação espacial e a velocidade de propagação, como mostrado na Figura 2. Esta informação pode ser acumulada para proporcionar uma visão bastante completa de Ca^{2 +} sinalização comportamentos nas células em seus ambientes nativos (Figura 2 H).

PTCL análise pode ser usada para quantificar mais complexo Ca^{2 +} sinalização de comportamentos, tais como os que ocorrem dentro de redes interconectadas de celulares. Um exemplo desta aplicação é fornecido pela análise realizada na ICC-MY (Figura 3A). Normalmente em tais preparações complexas, ruído de fundo e sinal de ruído podem ser um problema. No entanto, usando software de volumetria para aplicar filtros de suavização e diferenciais em filmes de atividade de Ca^{2 +} e em seguida, aplicando protocolos de limite de ruído para filtrar o ruído de fundo do ruído (Figura 3B-D) podem ser removidos do complexo gravações de atividade dinâmica. Usando a análise PTCL, tais como as mostradas na Figura 3E-G, informações quantitativas sobre Ca^{2 +} sinalização pode ser calculada medindo-se a área de PTCL, contagem PTCL e tamanho PTCL que indicam escalas espaciais de ativação de Ca^{2 +} sinais em um FOV. Estes dados podem ser compilados como mostrado na Figura 3 H e analisados estatisticamente, conforme apropriado. A Figura 4 ilustra como PTCL análise permite na quantificação de profundidade de sub celular Ca^{2 +} sinalização examinando o local e disparar as probabilidades de Ca^{2 +} sites a disparar. Alocando PTCLs em bandeiras diferentes com base em suas características temporais, iniciar PTCLs pode ser com precisão mapeado como mostrado na Figura 4-E e uma riqueza de dados adquiridos no número de sites de iniciação (conhecido como ' domínios), o tamanho do site em pixels e µm², a probabilidade de cada iniciação do site disparar ou uma vez ou várias vezes durante cada CTC (dado como um %), a duração média e o tamanho de PTCLs que ocorrem no local de iniciação, o número de CTC ciclos (como definido na etapa 4.23) e a % de locais de tiro que disparou durante cada ciclo CTC. Essas técnicas permitem um alto nível de mineração de dados e quantificação in-situ Ca^{2 +} sinais ocorrendo dentro de uma rede celular intacta que não são possíveis com análises baseadas em ROI.

Figura 1: geração de ratos KitGCaMP6f. Diagrama esquemático de como Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f ratos) foram cruzados com c-Kit^{+ / Cre-ERT2} (Kit-Cre ratos) para gerar ratos Kit-Cre-GCaMP6f. Estes ratos são injetados com tamoxifeno em idades de 6 a 8 semanas para induzir Cre Recombinase e subsequente expressão GCaMP6f exclusivamente no ICC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Análise de estocástico Ca^{2 +} sinais de ICC-DMP usando mapeamento de espaço-temporal (STM). (A) imagem representativa de vários ICC-DMP do intestino de um rato de Kit-Cre-GCaMP6F in situ. Um ROI verde indica o tamanho e a orientação de ROI para desenhar em torno de um único ICC-DMP dentro o FOV para criar um STM em volumetria. (B) STM de Ca^{2 +} atividade em destaque no painel A depois o ICC-DMP foi devidamente calibrada para a amplitude, espaço e tempo. (C) o STM mesmo mostrado no painel B após ele tem sido cor codificada com uma tabela de pesquisa (QUBPallete). (D) imagem expandida de ICC-DMP Ca^{2 +} transientes exibido em uma cor codificada STM, indicando onde desenhar uma linha através de um evento de Ca^{2 +} através de seu eixo de tempo (x) para criar um perfil de parcela de sua atividade no ImageJ. (E) trama do perfil do evento Ca^{2 +} destaque no painel D, indicando onde linhas mostradas ser desenhados para medir com precisão a amplitude e a duração do evento. (F) trama do perfil do evento Ca^{2 +} destaque no painel D, indicando onde linhas mostradas ser desenhados para medir com precisão a taxa de ascensão e queda do evento. (G) imagem expandida de ICC-DMP Ca^{2 +} transientes exibido em uma cor codificada STM, indicando onde desenhar uma linha através de um evento de Ca^{2 +} através de seu eixo (y) de espaço para medir com precisão a sua propagação espacial. (H) representante histogramas de dados em pool de ICC-DMP ilustrando como exibir graficamente a amplitude, duração e valores de propagação espacial adquiridas de seguir os passos acima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: quantificação da CTC no ICC-MY usando partículas com base em análise. (A) imagem representativa de uma ICC-minha rede do intestino de um rato de Kit-Cre-GCaMP6F in situ. (B) imagem tirada da gravação mostrada no painel A depois que passou por um filtro de diferencial de Δt = ±66 – 70 ms e um filtro gaussiano de 1,5 x 1,5 µm, StdDev 1.0. (C) imagem tirada do vídeo no B após limiarização foi concluída com PTCLs acima do limiar, mostrado em vermelho. (D) vestígios de PTCL contar e dizer tamanho PTCL em um protocolo de limiarização para eliminar o ruído no filme mostrado no painel B. PTCLs foram criados usando um algoritmo de inundação-preenchimento que marcou a estrutura de todos os pixels adjacentes que tinha intensidades acima do limiar, Ca ^{2 +} transientes PTCLs eram maiores que o ruído PTCLs. O limite no qual um grande número de PTCLs de ruído pequeno porte surgiu e começou a reduzir o tamanho médio de PTCLs pode ser usado como um limite comum para todas as gravações. (E) a imagem representativa do baseados em coordenadas Ca^{2 +} PTCL arquivo criado da gravação em imagem representativa de C. (F) retirada o arquivo PTCL de E depois de um critério de seleção de thresholded > 6 µm² (diâmetro ~ 2 µm ou menor) foi aplicado; PTCLs acima deste limite são sinalizados (bandeira 1) como partículas de luz roxas e considerado válido mapa de calor PTCLs. (G), mostrando os totais PTCLs (bandeira 1) para a gravação do vídeo mostrado no painel F, com totais PTCLs somadas com cores representando ocorrência em toda a gravação (cores quentes indicam maior ocorrência naquele local). (H) traços representativos da área PTCL (azul) e PTCL contagem (vermelho), derivado do arquivo PTCL criado no painel de A-G. Histogramas representativas de dados em pool de vários experimentos são mostradas abaixo os traços. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise de Ca^{2 +} sites em ICC-MY usando a disparar partículas com base em análise. (A) representante imagem tirada do arquivo de Figura 3E PTCL, depois bandeira 1 PTCLS são ainda mais refinados no pavilhão 3, o status de bandeira para Ca^{2 +} sites a disparar. BANDEIRA 3 PTCLs são exibidos como verde-limão (apenas aquelas PTCLs que não se sobrepõem com as partículas no quadro anterior, mas se sobrepõem com partículas no próximo 70 ms foram considerados locais de tiro). (B) calor mapa mostrando os totais PTCLs (pavilhão 3) para a gravação do vídeo mostrado no painel A, com totais PTCLs resumidas com cores representando a ocorrência em toda a gravação (cores quentes indicam maior ocorrência naquele local). (C) mapa representativo de Ca^{2 +} disparando sites mostrados no painel que b, com cada local de disparo diferentes atribuídos uma cor diferente de identificação. (D) traços representativos de área PTCL (azul) e PTCL contam (vermelhos), derivado do arquivo PTCL criado na Figura 3A-G. E um mapa de ocorrência da atividade de locais de tiro individual. Cada local de fuzilamento dentro o FOV é exibido como um bloco colorido em seu próprio 'lane' contra o tempo. (F) representante histogramas de dados em pool de vários experimentos são mostradas ilustrando valores acumulando para Ca^{2 +} disparando a probabilidade de disparo local / CTC e o número de Ca^{2 +} sites em um FOV de cozedura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

CA^{2 +} imagem de tipos específicos de células em tecidos intactos ou dentro de redes de células, muitas vezes revela padrões complexos de transientes de Ca^{2 +} . Esta atividade requer cuidadosa e detalhada análise e quantificação de capturar o máximo de informação possível sobre os eventos subjacentes e cinética destes eventos. STM e análise PTCL fornecem uma oportunidade para maximizar a quantidade de dados quantitativos, resultantes das gravações deste tipo.

O estreito, morfologia do eixo em forma de ICC-DMP tornam adequada para análise STM derivado da STMs descritas acima. No entanto, esta análise não é adequada para ICC-MY que são estreladas em forma e conectados em uma rede (Figura 3A). Além disso, os Ca^{2 +} sinalização padrões no ICC-MY são mais complexos, manifestando-se como propagação CTC de diversos sites de origem em toda a rede MY-ICC. Assim, de forma a quantificar a atividade ocorrendo em toda a rede ICC-MY dentro um FOV, análise de partículas (PTCL) foi implementado usando o software feito sob encomenda (volumetria, versão G8d, GWH, operável no Mac OS, entre em contato com o Grant Hennig grant.hennig@med.uvm.edu Quanto inquire de volumetria acesso e utilização).

Análise STM permite que todos os eventos de Ca^{2 +} células únicas e dentro de todas as células em um FOV para ser analisado criticamente em toda uma gama de parâmetros espaciais e temporais. O protocolo descrito ilustra como essas técnicas podem ser aplicadas a ICC-DMP do intestino delgado do rato. Quantificando totalmente Ca^{2 +} sinalização no ICC-DMP, conforme mostrado na Figura 2B-G, Ca^{2 +} sinalização padrões foram caracterizados em detalhe³⁷. Essas análises têm sido aplicadas para gravações onde ICC-DMP sofrer intervenções finamente quantificar os efeitos do bloqueio ou estimular a liberação de Ca^{2 +} / influxo de Ca^{2 +} / vias de neurotransmissão³⁷^,³⁹ ^, ⁴⁰ ^, ⁴¹. estas técnicas podem ser facilmente aplicadas a outras preparações de tecido intacto. Por exemplo, análise STM conforme descrito aqui tem sido utilizada para identificar novos caminhos mecanicistas envolvidos na geração de Ca^{2 +} ondas intracelulares, gravado em uretral músculo liso em situ⁵⁷.

A preparação do STM em volumetria exige alguma cautela, como a função em volumetria que cria o STM do ROI desenhado (Figura 2A) é um valor médio de intensidade. Assim, a amplitude de Ca^{2 +} sinais potencialmente pode ser diluída se o ROI é desenhado mais larga ou mais do que o Ca^{2 +} evento ou célula de interesse. Assim, os usuários devem ser cuidadosos desenhar ROIs que são como encaixe firmemente quanto possível para o Ca^{2 +} sinais ou célula específica que eles estão analisando a fim de aliviar esse problema. Da mesma forma, criar STMS usando pixel único linescans no ImageJ significa que precisas de mapeamento de eventos de Ca^{2 +} é sujeita a proximidade do sinal de Ca^{2 +} para linha desenhada. Tais preocupações são menores no eixo fino em forma de células como ICC-DMP, no entanto outra célula tipos com uma morfologia mais estrelada ou redonda podem fazer este tipo de análise inadequada para mapear todos os sinais de Ca^{2 +} com precisão. Ao preparar STMs para análise, independentemente se eles foram feitos em volumetria ou com ImageJ linescans, existem algumas áreas a serem destacadas para fins de solução de problemas. É importante alterar a qualidade da imagem para 32-bit antes de executar qualquer calibração no STMs. falha ao fazer isso, ou fazê-lo depois de calibrar para F/F₀ pode levar a medidas inconsistentes através de experiências. Verifique sempre a qualidade de imagem do STM, que é declarado na área superior da borda branca de STM em si quando abriu com ImageJ. Outra área potencial de inconsistência é selecionar o valor de₀ F quando calibrando para amplitude. É vital que para selecionar a região para F₀, que cobre uma área da célula que é uniforme e em foco. Por esta razão, áreas da célula que têm uma fluorescência basal instável ou que mudar devido ao movimento ou outros artefatos não são ideais e protocolos de estabilização de movimento rigorosa devem ser empregados nesses casos.

Dentro in situ ou cultivadas preparações contendo interligados redes celulares, tais como ICC-MY na análise PTCL pequena intestino, fornece uma técnica simplificada para quantificar o complexos, subcellular Ca^{2 +} eventos que ocorrem na rede. Além disso, ele também permite que todos os eventos de Ca^{2 +} na rede dentro de um determinado FOV para ser analisado, em vez de usando ROIs arbitrários, que só fornecem informações sobre a frequência e intensidade dentro o ROI. Uma vantagem da análise PTCL descrita aqui é que através da aplicação de diferencial e Gaussian suavização de filtros para gravações, uma grande quantidade de ruído pode ser removida de filmes que podem conter contaminante luz de células não de interesse ou devido ao não-dinâmico pontos brilhantes ou inclusões. É importante notar que a quantidade de diferenciação aplicada a gravações dependerá em grande medida a taxa de aquisição usada pelo experimentador. Diferenciar os filmes conforme descrito no protocolo fornece um meio de aplicação de um filtro para o filme para remover o ruído de alta frequência de gravações. Aplicando um valor de diferenciação de '2', quando adquirir em FPS 33 funciona bem para remover o ruído de fundo, mantendo o bom sinal para ruído (se o valor for muito baixo, ruído vai ser escolhido mas sinal para ruído pode ser comprometido se o valor for muito alto). O valor de diferenciação aplicado deve ser aumentado com taxas mais rápidas de aquisição, por exemplo em 100 FPS, um valor de diferenciação do '7' dá aproximadamente o mesmo sinal à relação de ruído como um valor de "2" para uma gravação de 33FPS. Experimentadores precisará otimizar essas configurações em conformidade para seus produtos e condições de gravação.

O protocolo de limiarização descrito na Figura 3D permite que um procedimento de limiarização consistente ser aplicado a diferentes gravações feitas em diferentes sistemas com software de aquisição diferente. Essa flexibilidade permite que dados de vários pesquisadores trabalhando em diferentes sistemas para compilar suas gravações para os mesmos conjuntos de dados. Usando o sistema de bandeira em volumetria, PTCL análise permite a visualização e a quantificação de individual Ca^{2 +} sites dentro de uma rede em detalhe a disparar. Informações podem ser obtidas no número de sites de iniciação, do tamanho do site em pixels e µm²e a duração média das PTCLs ocorrem nesse local. Esta análise PTCL permitiu a primeira caracterização da atividade CTC no intestino delgado em um nível celular secundário, e, usando as diferentes bandeiras em volumetria software, PTCLs em ambos a rede e fuzilamento individual site nível foram quantificados no tecido intacto preparações de Kit-Cre-GCaMP3 ratos³⁸. Partir dessas observações iniciais, esta análise tem sido mais utilizada para estudar a novela Ca^{2 +} influxo vias no GI ICC-MY como loja-operado-Ca^{2 +}-entrada⁴² e o papel da mitocondrial Ca^{2 +} sinalização em GI pacemaking ⁴¹. muito como análise STM descrito acima, PTCL análise pode ser facilmente adaptado a diferentes preparações intactas diferente daquele descrito neste protocolo. Por exemplo, um estudo recente usado análise PTCL para estudar o romance rítmica Ca^{2 +} eventos que ocorrem nas redes de celular intactas da propria do lamina do rato bexiga urinária⁵⁸^,⁵⁹ e, portanto, poderia ser facilmente aplicado a outros sistemas celulares complexos, intactos como sistemas neuronais. Enquanto este trabalho focado em Ca^{2 +} imagem em tecidos intactos com GECIs, estas técnicas de análise também podem ser executadas em células isoladas e carregados com tradicional Ca^{2 +} indicador corantes de tecidos. A análise STM com base tem sido utilizada para quantificar com sucesso Ca^{2 +} sinais localizados e Ca^{2 +} ondas do eixo em forma de células intersticiais e células de músculo liso de uma variedade de preparações¹¹^,⁶⁰ ^, ⁶¹ ^, ⁶² ^, ⁶³. Além disso, as rotinas de análise PTCL descritas aqui também foram aplicadas às preparações in situ rede visualizadas com Cal 520⁵⁸^,⁵⁹. No entanto, estes estudos também conservam as desvantagens de tal corante carregamento protocolos tais como identificação de célula ambíguo e problemas com sinal para ruído.

Os exemplos ilustrados acima demonstram que a análise tanto STM e PTCL são técnicas altamente maleáveis que podem ser usadas para quantificar complexo Ca^{2 +} sinalização em uma variada gama de preparações de tecido intacto. As abordagens oferecem muitas vantagens sobre ROI tradicional com base em parcelas de intensidade que têm sido rotineiramente utilizadas anteriormente e devem fornecer os investigadores mais valiosas informações quantitativas sobre Ca^{2 +} sinalização do que poderia ser alcançado anteriormente.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Financiamento foi fornecido pelo NIDDK, através de DK41315 P01.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageJ software	NIH	1.5a	ImageJ software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit^+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6

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Biology

Aplicações de mapeamento de espaço-temporal e técnicas de análise de partículas para quantificar intracelular Ca^{2 +} sinalização em Situ

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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