Biology

Programmer Spatio-temporale kartlegging og partikkel analyseteknikker for å kvantifisere intracellulær Ca^{2 +} signalering i Situ

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58989

Bernard T. Drumm¹, Grant W. Hennig², Salah A. Baker¹, Kenton M. Sanders¹

¹Department of Physiology and Cell Biology, University of Nevada Reno School of Medicine, ²Department of Pharmacology, The Robert Larner, M.D. College of Medicine, University of Vermont

Summary

Genetisk kodet Ca^{2 +} indikatorer (GECIs) har radikalt forandret hvordan i situ Ca^{2 +} imaging utføres. For å maksimere data utvinning fra slike innspillinger, kreves det riktige analyse av Ca^{2 +} signaler. Protokollene i denne utredningen lette kvantifisering av Ca^{2 +} signaler registrert i situ spatiotemporal kartlegging og partikkel-baserte analyser.

Abstract

Ca^{2 +} imaging isolert celleområde eller bestemte typer celler i intakt vev ofte avslører komplekse mønstre av Ca^{2 +} signalering. Denne aktiviteten krever forsiktig og Dyptgående analyser og kvantifisering å fange så mye informasjon om den underliggende hendelser som mulig. Spatial, timelige og intensitet parametere iboende til Ca^{2 +} signaler som frekvens, varighet, overføring, hastighet og amplitude kan gi noen biologiske informasjon kreves for intracellulær signalisere. Høyoppløselig Ca^{2 +} imaging vanligvis resulterer i kjøp av store datafiler som er tidkrevende prosessen i forhold til oversette tenkelig informasjonen i kvantifiserbare data, og denne prosessen kan være utsatt for menneskelig feil og bias. Analyse av Ca^{2 +} signaler fra celler i situ er vanligvis avhengig av enkel intensitet målinger for tilfeldig utvalgte regioner av interesse (ROI) i en synsfelt (FOV). Denne metoden ignorerer mye viktig signalnettverk informasjonen i FOV. Derfor, for å maksimere utvinningen av informasjon fra slike høyoppløselig opptak med Ca^{2 +}fargestoffer eller optogenetic Ca^{2 +}tenkelig, passende romlige og tidsmessige analyse av Ca^{2 +} signaler er nødvendig. Protokollene som beskrevet i denne artikkelen vil beskrive hvordan en stor mengde data kan hentes fra Ca^{2 +} tenkelig opptak til rette mer fullstendig analyse og måling av Ca^{2 +} signaler innspilt fra celler ved hjelp av en kombinasjon av spatiotemporal kart (STM)-basert analyse og partikkel-basert analyse. Protokollene beskriver også hvordan ulike mønstre av Ca^{2 +} signalering observert i ulike celle populasjoner i situ kan analyseres riktig. For illustrasjon, vil metoden undersøke Ca^{2 +} signalering i en spesialisert populasjon av celler i tynntarmen, interstitielle cellene av Cajal (ICC), ved hjelp av GECIs.

Introduction

Ca^{2 +} er en allestedsnærværende intracellulær budbringer som styrer en rekke cellulære prosesser, for eksempel muskel sammentrekning¹^,², stoffskifte³, celle spredning³^,⁴^, ⁵, stimulering av nevrotransmitter utgivelsen på nerve terminaler⁶^,⁷, og aktivering av transkripsjon faktorer i kjernen. ⁷ intracellulær Ca^{2 +} signaler ofte tar form av forbigående høyder i cytosolic Ca^{2 +}, og dette kan være spontan eller oppstå Agonistiske stimulering avhengig av den celle type⁸. Spatial, timelige og intensitet parametere iboende til Ca^{2 +} signaler som frekvens, varighet, overføring, hastighet og amplituden kan gi biologiske informasjon kreves for intracellulær signal⁵^, ⁷ ^, ⁹. cytoplasmatiske Ca^{2 +} signaler kan resultere av Ca^{2 +} fra ekstracellulære plass eller via Ca^{2 +} utgivelse fra det endoplasmatiske retikulum (ER) via Ca^{2 +} utgivelsen kanaler som ryanodine reseptorer (RyRs) og inositol-tri-fosfat reseptorer (IP₃Rs)¹⁰. RyRs og IP₃Rs kan både bidra til generasjon av Ca^{2 +} signaler og felles åpningen av disse kanalene, som kombinert med ulike Ca^{2 +} tilstrømningen mekanismer kan resultere i en myriade av Ca^{2 +} signalisere mønstre som er formet av tallene og åpne sannsynligheten av Ca^{2 +} tilstrømningen kanaler, profilen for expression av Ca^{2 +} utgivelsen kanaler, nærhet mellom Ca^{2 +} tilstrømningen og utgivelsen kanaler, og uttrykket og distribusjon av Ca^{2 +} reopptak og ekstrudering proteiner. Ca^{2 +} signaler kan ta form av uniform, langvarig, høy intensitet globale svingninger som kan vare i flere sekunder eller minutter, spre intracellulær og intercellulære Ca^{2 +} bølger som kan krysse intracellulær avstander over 100 µm¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶eller flere kort, romlig lokalisert hendelser som Ca^{2 +}gnister og Ca^{2 +} puffs som oppstår på titalls millisekund tidsrammer og spre mindre enn 5 µm¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰.

Fluorescerende mikroskopi er blitt anvendt vidt å overvåke Ca^{2 +} signalisere isolert og kultivert celler og intakt vev. Tradisjonelt disse eksperimentene omfattet bruk av fluorescerende Ca^{2 +} indikatorer, ratiometric og ikke-ratiometric fargestoffer som Fura2, Fluo3/4 eller Rhod2, blant annet ²¹^,²²^,²³. Disse indikatorene ble utformet permeable til celle membraner og deretter bli fanget i celler i spalting av en ester gruppe via endogene esterases. Binding av Ca^{2 +} til høy affinitet indikatorer forårsaket endringer i fluorescens når celler og vev ble opplyst av aktuelle bølgelengder av lys. Bruk av cellen permeable Ca^{2 +} indikatorer forbedret kraftig vår forståelse av Ca^{2 +}signalering i levende celler og tillatt romlig oppløsning og måling av disse signalene som ikke var mulig ved assaying Ca^{2 +} signaler på andre måter, for eksempel elektrofysiologi. Tradisjonelle Ca^{2 +} indikatorer har imidlertid flere begrensninger, som photobleaching som skjer over utvidet opptak perioder²⁴. Mens nyere Ca^{2 +}indikator fargestoffer som Cal520/590 har kraftig forbedret signal til støy forhold og muligheten til å oppdage lokale Ca^{2 +} signaler²⁵, kan problemer med photobleaching fortsatt et problem for noen etterforskere²⁶^,²⁷^,²⁸. Stupbratte photobleaching begrenser også forstørrelsen, antall bildeopptak, og oppløsning som kan brukes for opptak, som økt objektive makt og høyere priser på bildeopptak krever økt eksitasjon lysintensiteten som øker photobleaching.

Disse begrensningene av tradisjonelle Ca^{2 +} indikator fargestoffer er forverret ved registrering av Ca^{2 +} signaler på stedet, for eksempel når innspillingen intracellulær Ca^{2 +} signaler fra intakt vev. På grunn av problemene ovenfor, visualisering av Ca^{2 +} signaler i situ med cellen permeable Ca^{2 +}indikatorer har vært begrenset til strømsparingsmodus forstørrelse og reduserte priser for bildebehandling, begrenser evnen til etterforskerne å registrere og kvantifisere timelig eller romlig begrenset subcellular Ca^{2 +} signaler. Derfor har det vært vanskelig å fange, analysere og verdsette romlige og tidsmessige kompleksiteten av Ca^{2 +} signaler, som kan være viktig for generering av biologiske responser er ønsket, som beskrevet ovenfor. Analyse av Ca^{2 +} signaler fra celler i situ er vanligvis avhengig av enkel intensitet målinger fra utvalgte regioner av interesse (ROI) i en synsfelt (FOV). Tilfeldig valg av antall, størrelse og plassering av ROIs, avhengig av innfall av forskeren, kan alvorlig bias resultatene. Og iboende skjevheter med avkastningsanalyse, ignorerer denne tilnærmingen mye av viktig signalnettverk informasjonen i FOV, som dynamisk Ca^{2 +} hendelser i opptil Avkastningen er valgt for analyse. Videre unnlater analyse av ROIs å gi informasjon om romlige karakteristikkene av Ca^{2 +} signalene observert. For eksempel kan det ikke være mulig for å skille mellom en økning i Ca^{2 +} som følge av en overføring av Ca^{2 +} bølge og en sterkt lokalisert Ca^{2 +} release event fra tabeller av Ca^{2 +} signaler i en avkastning.

Ankomsten av genetisk kodet Ca^{2 +} indikatorer (GECIs) har radikalt forandret hvordan Ca^{2 +} bildebehandling kan være utført i situ²⁹^,³⁰^,³¹^,³²^,³³. Det er flere fordeler med å bruke GECIs over fargestoffer. Den viktigste kanskje er at uttrykk for GECI kan utføres på en celle bestemt måte, noe som reduserer uønsket bakgrunn forurensning fra cellene ikke av interesse. En annen fordel med GECIs over tradisjonelle Ca^{2 +} indikatorer er at photobleaching reduseres (som fluorescens og consequentially photobleaching oppstår bare når celler er aktive), sammenlignet med fargestoff lastet prøver, spesielt på høy forstørrelse og høye image fange³⁴. Dermed tenkelig med GECIs, som en GCaMP rekke optogenetic sensorer, gir etterforskerne evnen å fortegnelse korte, lokalisert sub mobilnettet Ca^{2 +} signaler i situ og undersøke Ca^{2 +} signalering i celler i deres innfødte miljøer som ikke er mulig tidligere. For å maksimere utvinningen av informasjon fra slike høyoppløselig opptak, kreves det riktige romlige og tidsmessige analyse av Ca^{2 +} signaler. Det bør bemerkes at mens GECIs kan tilby noen klare fordeler, studier har nylig avdekket at Ca^{2 +} bildebehandling kan utføres vellykket fra store populasjoner av ulike nevrokjemiske klasser av neurons samtidig ved hjelp av konvensjonelle Ca^{2 +} indikatorer som ikke er genetisk kodet inn i dyr³⁵. Denne tilnærmingen brukes post hoc immunohistochemistry for å avsløre flere forskjellige klasser av neurons skyting på høy frekvens i synkroniserte støt, og unngikk potensialet som genetiske modifikasjoner til dyret kan ha forstyrret den fysiologiske virkemåten etterforskeren søker å forstå³⁵^,³⁶.

Protokollene i notatet rette mer fullstendig analyse og kvantifisering av Ca^{2 +} signaler innspilt fra celler i situ med en kombinasjon av spatiotemporal kart (STM)-basert analyse og partikkel-basert analyse. Protokollene beskriver også hvordan ulike mønstre av Ca^{2 +} signalering observert i ulike celle populasjoner i situ kan analyseres riktig. For illustrasjon, vil metoden undersøke Ca^{2 +} signalisere i en spesialisert populasjon av celler i tynntarmen, interstitielle cellene av Cajal (ICC). ICC er spesialiserte celler i fordøyelsessystemet (GI) som viser dynamisk intracellulær Ca^{2 +} signalnettverk, som visualisert ved hjelp av mus uttrykke GCaMPs³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^, ⁴¹^,⁴². Ca^{2 +} transienter i ICC er knyttet til aktivering av Ca^{2 +}-aktivert Cl^- kanaler (kodet av Ano1) som er viktige i å regulere excitability av intestinal glatt muskel celler (SMCs)⁴³^, ⁴⁴^,⁴⁵. Dermed er studiet av Ca^{2 +} signalering i ICC grunnleggende for å forstå intestinal motilitet. Murine tynntarmen tilbyr et utmerket eksempel for denne demonstrasjonen, som det er to klasser av ICC som skilles anatomisk og kan visualiseres uavhengig: jeg) ICC ligger i området mellom den sirkulære og langsgående glatt muskelen lag, rundt myenteric plexus (ICC-min). Disse cellene som Pacemakerceller og generere den elektriske aktiviteten kjent som langsom bølger⁴⁶^,⁴⁷^,⁴⁸^,⁴⁹; II) ICC ligger også blant en plexus rike i terminalene på motor neurons (dyp muskel plexus, dermed ICC-DMP). Disse cellene tjene som meglere svar til enteric motor neurotransmission³⁷^,³⁹^,⁴⁰^,⁵⁰. ICC-min ICC-DMP morphologically distinkte og er Ca^{2 +} signalnettverk virkemåtene som er vesentlig for å utføre sine oppgaver. ICC-min er stellate i form og danner et nettverk av sammenhengende celler via gapet veikryss⁵¹^,⁵². Ca^{2 +} signaler i ICC-min manifest som kort og romlig lokalisert Ca^{2 +} utgivelsen hendelser på flere områder asynkront gjennom ICC-min nettverket som visualisert innenfor en FOV (fotografert med en 60 X-målet)³⁸. Disse asynkrone signalene er timelig organisert i 1 sekund klynger som, når ordnet sammen, utgjør en netto 1 s mobilnettet økning i Ca^{2 +}. Disse signalene overføres celle til celle i ICC nettverket og derfor organisere Ca^{2 +} signalering, generert fra sub mobilnettet steder, i en vev bredt Ca^{2 +} bølge. Timelige klynger og summering av Ca^{2 +} signaler i ICC-min har blitt kalt Ca^{2 +} forbigående klynger (CTCs)³⁸. CTCs oppstå rytmisk (f.eks ganske like varigheter og lignende periodene mellom CTCs) 30 ganger per minutt i musen. Derimot ICC-DMP spindel formet celler, noen med sekundære prosesser, som distribuerer mellom SMCs og varicose nerve prosesser og ikke uavhengig danner et nettverk⁵¹^,⁵². ICC-DMP skjemaet gapet veikryss SMCs, men og funksjon i denne større syncytium, kalles SIP syncytium⁵³. Ca^{2 +} signaler oppstår på flere områder langs lengden på cellene, men disse transienter ikke entrained eller timelig gruppert, som observert i ICC-min³⁷. Ca^{2 +} signaler i ICC-DMP forekommer i en Stokastisk måte, med varierende intensitet, varighet og romlig egenskaper. Protokollene nedenfor, bruker eksemplet med Ca^{2 +} signalering i ICC-min og ICC-DMP, beskriver teknikker for å analysere komplekse signalering i bestemte typer celler i situ. Vi utnyttet induserbart grobunn-Lox p systemet for å uttrykke GCaMP6f i ICC, etter inducing aktivering av grobunn-Recombinase (grobunn) drevet av en ICC bestemt arrangøren (Kit).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr som brukes og protokollene i denne studien var i samsvar med den nasjonale institutter for helse Guide og bruk av forsøksdyr. Alle prosedyrer ble godkjent av institusjonelle dyr bruk og omsorg komiteen på University of Nevada, Reno.

1. generasjon KitGCaMP6f mus

Krysse Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f mus) og c-Kit^{/ grobunn-ERT2} (Kit-grobunn mus) til å generere ICC bestemte GCaMP6f uttrykke dyr (Kit-Cre-GCaMP6f mus).
Merk: GCaMP6f ble brukt på grunn av effektiviteten rapportert i rapportering lokalisert, signaler kort intracellulær Ca^{2 +} i situ og in vivo⁵⁴.
Sprøyte Kit-Cre-GCaMP6f mus med tamoxifen på alderen 6-8 uker å indusere grobunn Recombinase aktivisering og påfølgende GCaMP6f uttrykk i ICC (figur 1).
1. For å opprette tamoxifen løsningen, oppløse 80 mg Tamoxifen (se Tabell for materiale) i 800 μL etanol (se Tabell for materiale) cuvette og vortex i 20 minutter.
2. Legge til 3,2 mL safflower olje (generisk) til å lage løsninger på 20 mg/mL og deretter sonicate i 30 minutter før injeksjon.
3. Injisere mus (intraperitoneal injeksjon; IP) med 0,1 mL tamoxifen (2 mg tamoxifen) i tre påfølgende dager. Bekreft GCaMP6f uttrykk ved genotyperingteknologi og bruke mus 10 dager etter første injeksjon.
  1. Genotype mus ved klipping en liten bit av øre fra hvert dyr. Deretter Bruk HotSHOT metoden⁵⁵ genomisk DNA isolering av rugende øret klipp på 95 ° C for 60 min i 75 mL av NaOH og deretter nøytralisere av 75 mL Tris bufferen. Bruk standard PCR for å bestemme genotype av hvert dyr, 2 mL DNA i en 20 mL reaksjon med GCaMP6f bestemte primere⁵⁶. Kjør 10 mL av PCR produktet på en 2% agarose gel å bestemme wild type (297 bp) og mutant (~ 450 bp) band.

2. forberedelse av vev for Ca^{2 +} Imaging

Anaesthetize mus ved Inhalasjon med isoflurane (4%, se Tabellen for materiale) i en ventilert hette og deretter offer av cervical forvridning.
Bruke skarp saks åpne magen av mus, Fjern tynntarm og plasser i Krebs-ringe bikarbonat løsning (KRB). Åpne tynntarmen langs hvem grensen og vask bort intraluminal innholdet med KRB. Bruker skarpe disseksjoner, fjerne og utbredelse sub mucosa lagene.
Merk: KRB løsningen har følgende sammensetning (i mM): NaCl 118.5 KCl 4.7 CaCl₂ 2.5, MgCl₂ 1.2, NaHCO₃ 23.8, KH₂PO₄ 1.2, druesukker 11.0. Denne løsningen har en pH på 7,4 på 37 ° C når boblet til likevekt med 95% O₂- 5% CO₂.
Bruker små pinner, feste tynntarmen vevet til bunnen av en 5 mL volum, 60 mm diameter Sylgard-belagt parabolen med den sirkulære glatte muskulatur laget grossist. Perfuse utarbeidelse varmet KRB løsning på 37 ° C for en balanse periode 1 time før eksperimentering.
Etter denne balanse perioden, utføre i situ Ca^{2 +} bildebehandling av små intestinal ICC-min og ICC-DMP bruker AC confocal mikroskopi (bildene i denne protokollen ble kjøpt med AC confocal mikroskop utstyrt med et spinning-disk). På grunn av fordelene med GECIs beskrevet ovenfor, kan du bruke time-lapse høy oppløsning (> 30 bilder per sekund, FPS) kombinert med høy effekt mål (60-100 x) å kjøpe filmer av dynamisk Ca^{2 +} signaler i ICC.
Merk: For å redusere vev bevegelse, bruke nicardipine (0,1 til 1 μM) under opptak som beskrevet tidligere³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹.
Skille ICC-min og ICC-DMP i tynntarmen bruke ulike anatomiske plassering, morfologi og basale Ca^{2 +} aktivitet mønstre.
1. Finn ICC-min på nivået av myenteric plexus, mellom rundp og langsgående glatt muskel lagene i tynntarmen. De er stellate formet, danner et tilkoblet nettverk (figur 3A). CTCs (beskrevet ovenfor) overføres via nettverket av ICC-min med en vanlig forekomst av ~ 30 sykluser per min.
2. Omvendt, Finn ICC-DMP i et enkelt fly på nivå med dyp muskel plexus, mellom den sirkulære glatte muskulatur laget og den submucosal plexus. ICC-DMP utgjør ikke et nettverk og er spindel formet celler (figur 2A) som viser noen vanlige overføre hendelser og i stedet brann Stokastisk, lokalisert intracellulær Ca^{2 +} transienter.
Uansett oppkjøpet programvaren benyttes, lagre filmer som en bunke med TIFF-bilder.

3. analyse av Stokastisk Ca^{2 +} signaler i ICC-DMP bruker Spatio-temporale kartlegging (STM)

Analysere ICC-DMP bruker spatio-temporale kartlegging med en kombinasjon av ImageJ programvare (NIH, USA, gratis å laste ned på http://imagej.nih.jov/ij) og tilpasset laget programvare (Volumetry, versjon G8d, GWH, drift på Mac OS, kontakt Grant Hennig grant.hennig@ med.uvm.edu om henvendelser for Volumetry tilgang og bruk)
Merk: En alternativ tilnærming til fullt analysere disse spatio-temporale kart med ImageJ alene finnes også i senere delene (begynner på trinn 3.9).
Åpne Volumetry og bruk høyre museknapp Klikk åpne mapper som inneholder videofiler. Venstreklikk på filmfilen skal analyseres for å åpne den i Volumetry (må være i ukomprimert TIFF-format). Når åpnet, vil filmen finnes i et Aarvik vindu (film vindu), som vil omfatte et stort område av høyre skjermen. Venstre side av skjermen inneholder vinduet Plot (øvre 4/5ths) og vinduet spor (lavere 1/5^th).
Justere størrelsen på filmen ved å holde nede SKIFT og samtidig rulling opp med midtre museknapp (MMB, reduserer størrelsen) eller rulle ned med MMB (øker størrelsen). Starte eller stoppe avspillingen ved å trykke "A"; hastigheten på avspillingen kan justeres ved å trykke opp og ned piltastene.
For å opprette en STM bruker Volumetry, kan du tegne en avkastning over en hel celle ved å holde nede SKIFT mens du klikker og drar venstre museknapp. Juster retningen på Avkastningen ved å rulle med MMB i hjørnene av Avkastningen. Når Avkastningen er på plass over cellen skal analyseres (figur 2A), bruk høyre klikk i vinduet filmen til "avkastning STMs-STMyAvg > xRow' og venstre klikk for å opprette en STM celle aktivitet i vinduet Plot (det er også mulig å velge ' STMxAvg > yRo w ", som er valgt avhengig om retningen til cellen er mer på linje med x eller y-aksen i for eksempel cellen merket figur 2A er mer orientert på y-aksen").
Venstreklikk på STM i vinduet Plot og trykk "P" til trekker gjennomsnittlig bakgrunnsstøy og trykke "H" for å øke kontrasten av STM. Lagre STM av rett klikker på den til "STM Last lagre - lagrer STM som TIF" og deretter venstreklikke for å lagre som TIFF.
Resten av analyse av ICC-DMP utføres i ImageJ. ImageJ består av to hovedkomponenter, en verktøylinje med en fast posisjon på skjermen og en mobil bruker grenseflate. Bruker ImageJ, åpne filen STM TIFF ICC-DMP Ca^{2 +} aktivitet (fil-åpne på verktøylinjen bilde J).
Åpne Volumetry opprettet STM, som har tid vertikalt orientert. ImageJ vil automatisk åpne TIFF-filer som RGB eller 16-biters bilder. For å forbedre bildekvaliteten, venstre klikk 'Image' på verktøylinjen ImageJ. Bla på det første alternativet "Skriv inn"for å vise en rullegardinmeny med ulike bildeformater, bla over "32-biters", og venstre klikk for å endre.
For å gjøre STM lesbar mot tiden fra venstre til høyre, venstre klikk på verktøylinjen ImageJ følgende bane: "Bilde-Transform-rotere 90 grader venstre". Det er også mulig å opprette STMs i situ ca^{2 +} -aktivitet som linescans med ImageJ alene uten Volumetry og dette er beskrevet nedenfor.
Merk: Når STMs er opprettet, analyseres de på samme måte uansett hvilken programvare ble brukt til å generere dem. For å hoppe over denne alternative metoden for oppretting STMs i ImageJ, hopper du til trinn 3,19.
For å opprette STMs med ImageJ, åpne av TIFF-filer som utgjør innspillingen av ICC-DMP Ca^{2 +} aktivitet (fil-åpne på verktøylinjen ImageJ). ImageJ vil automatisk åpne TIFF-filer som RGB eller 16-biters bilder. For å forbedre bildekvaliteten, venstre klikk 'Image' på verktøylinjen ImageJ. Bla på det første alternativet "Skriv inn"for å vise en rullegardinmeny med ulike bildeformater, bla over "32-biters", og venstre klikk for å endre.
Bakgrunnsstøy (skyldes auto fluorescens eller kameraet Støy) skal nå trekkes fra filmen. Venstre klikk funksjonen "Rektangulært utvalg" i ImageJ grensesnittet og tegne en avkastning (ved venstre klikke og dra til ønsket størrelse og form) over bakgrunnen fluorescens av filmen.
Når du har valgt Avkastningen, venstre klikk på "Analysere" på verktøylinjen ImageJ, og deretter venstre klikk "Histogrammet" fra rullegardinlisten som vises. Et forgrunnsvindu vises spørrende om pixel verdier å regne; ImageJ har verdiene av Avkastningen forhåndsvalgt så venstre klikk "OK".
Etter klikker 'OK', vises et nytt popup-vindu som inneholder et histogram viser fordelingen av verdier for pixel støy i bakgrunnen i Avkastningen. Legg merke til middelverdien oppført under histogrammet og Lukk pop-up-boksen.
Klikk tilbake til 32-biters filmen og velg den hele FOV ved venstre klikke "Rediger" på verktøylinjen ImageJ rulling til 'Utvalg' og venstre-klikke på "Velg alle" fra rullegardinmenyen avdekket.
Venstre klikk "Prosess" på verktøylinjen ImageJ, bla til 'Matte' og venstreklikk "Trekk fra" fra rullegardinmenyen avdekket.
Et popup-boksen vises der verdien skal trekkes fra FOV kan settes. Angi middelverdien fra histogrammet i trinn 3.12 ovenfor og klikk "OK". ImageJ vil deretter be om å behandle alle rammer i TIFF-stakken (og ikke bare enkelt rammen filmen er for tiden på). Velg 'Ja'.
Etter klikker 'Ja', vil filmen bli svart. Dette løses venstre klikk 'Image' i ImageJ verktøylinje og bla over 'Justere'. Venstreklikk avdekket første alternativet for "lysstyrke/kontrast' (B & C). Dette vil bringe opp en pop up boks hvor ulike aspekter av lysstyrke og kontrast kan endres. Venstreklikk på "Auto" alternativet når å avsløre den økte kvaliteten i filmen. La dette B & C pop opp boksen åpen for fremtidig bruk.
Du oppretter en linescan ved først å høyreklikke på linjen markeringsverktøyet i ImageJ-grensesnitt for å vise alternativer for forskjellige linjer; venstreklikk på "Segmentert linje" å velge den fra listen. Med verktøyet "Segmentert linje" valgt, klikk Bruk enkelt venstre for å tegne en linje langs midten av aksen av en individuell ICC-DMP. Hver enkelt venstre klikk rette linjen på at spesielt punkt og linjen kan fritt flyttes videre i ønsket vinkel. Når linjen er fullført, doble venstreklikk for å reparere ledningen på plass.
Venstre klikk 'Image' på ImageJ verktøylinjen og rull over "Stabler" og venstre klikk på alternativet "Reslice". Et popup-boksen vises. venstre klikk på alternativet til 'rotere 90 grader', dette vil orientere linescan fra venstre til høyre slik at det kan være kalibrert og lese mot tiden på x-aksen, med plass på y-aksen. Klikk "OK" for å opprette STM.
Intensiteten av STM opprettes på en gråskala med høy intensitet Ca^{2 +} signaler som varierende grad av hvitt, av hvite eller lys grå avhengig av intensitet. Normalt, må kontrasten av den opprettede linescan forbedres. Gjør dette ved å klikke "Auto" på B & C popmusikk opp boksen.
Intensiteten av fluorescens av linescan presenteres på STM i vilkårlig bildepunktverdiene. For å måle amplituden av Ca må^{2 +} signaler fra STM, fluorescens verdiene av STM (F) nå normaliseres. Bruke funksjonen "Rektangulært utvalg" ImageJ grensesnittet, tegne en avkastning på et område på STM som viser mest uniform og minst intens området fluorescens (F₀).
Gjenta trinnene tatt i 3.11-3.12 for å få en middelverdien (F₀) intensitet i valgte Avkastningen, og velg deretter hele STM ved venstre klikke på "Rediger-utvalg-Select All" fra verktøylinjen ImageJ.
Venstre klikk "Prosess" på ImageJ verktøylinjen og bla til 'Matte'; venstre klikk "Dele" fra alternativene avslørt. Angi middelverdien (F₀) fra trinn 3.21 i påfølgende popup-boksen. Ved å dele hele STM (F₀) vil STM bli svart; rette dette ved å velge "Auto" på B & C popmusikk opp boksen. Linescan er nå kalibrert for amplitude, med intensiteten av fluorescens uttrykt som F/F₀.
STM vil vise antall bilder i TIFF-stakken på x-aksen og antall piksler representerer lengden på cellen på y-aksen. For å kvantifisere timelige og romlig informasjon fra Ca^{2 +} signaler, kalibrere STM for rom og tid. Venstre klikk 'Image' på verktøylinjen ImageJ og venstre klikk "Egenskaper". Et popup-boksen vises. I dette vinduet angir du de riktige verdiene for å kalibrere fullt av STM.
For 'Bredde', angi hvor lang tid det tar for å fange et enkeltbilde i sekunder. For eksempler, 5 fps, verdien 0,2, for 50 FPS angi verdien 0,02, for 33 FPS angi verdien 0.033 osv. "Pixel høyde", angi hvor mange mikron hver piksel representerer (avhenger på målet brukes og kameraet brukes for oppkjøp). 'Voxel dybde' står på 1 før du klikker 'OK'. Ingen andre parametere må justeres i vinduet.
Merk: Etter klikker 'OK', vil STM være fullt kalibrert for amplitude, rom og tid. Amplituden på STM måles som F/F_0,tid på x-aksen måles i sekunder og plass på y-aksen måles i μm (figur 2B). Ca^{2 +} hendelser på STM er nå klar til å bli målt, kalibrert STM kan også lagres som et enkelt TIFF-bilde kan analysere senere.
ImageJ har en rekke bygget i fargekodet oppslagstabell (LUTs) som kan brukes til å fargekode STM. Bruke en innebygd LUT ved venstre klikke på verktøylinjen ImageJ på veien 'Bilde-oppslag tabeller' og velg en LUT gjelder. Skreddersydde LUTs kan også importeres til STM ved venstre klikke på verktøylinjen ImageJ på veien "Fil-Import-LUT" og deretter velge LUT importere. For eksempel har STM vist i figur 2C hatt den egendefinerte LUT 'QUBPallete' (Queens University Belfast, UK) brukt til det å kode varme farger (rød, oransje) som intens Ca^{2 +} fluorescens og kalde farger (svart, blå) som områder av lav Ca^{2 +}fluorescens.
Sette en amplituden kalibreringslinjen angir hvilket amplituder representert ved de ulike fargene, venstre klikk 'Analyser' fra verktøylinjen ImageJ, bla til "Verktøy" og velg "Kalibrering Bar" fra rullegardinmenyen avdekket. Alternativene er gitt for størrelse, zoom, utvalg og posisjon på STM for kalibrering bar; justere disse innstillingene etter behov og klikk "OK". Merk at når kalibreringslinjen settes, ImageJ skaper en ny STM som inneholder den, og den opprinnelige versjonen uten kalibreringslinjen intakt og separat.
Merk: Hvis boksen "Overlegg" er krysset ved innsetting av kalibreringslinjen, genereres ikke en ny STM.
Hvis du vil analysere Ca^{2 +} enkelthendelser, venstre klikk på "Rett linje" velgeren på ImageJ grensesnittet. Først igjen klikker på STM, tegn en rett vannrett linje gjennom midten av en Ca^{2 +} hendelse parallelt med x-aksen (mot tid). Fullføre linjen ved venstre klikke en gang (figur 2D).
Klikk 'Analyser' på verktøylinjen ImageJ og venstre klikk på 'Plot profil'. En ny boks vises med tomt profil av Ca^{2 +} hendelsen (figur 2E).
Merk: Alternativet "List" i denne boksen vil generere en liste over XY verdier av genererte plottet, som kan kopieres til et regnearkprogram opprette spor hvis ønskelig.
For å måle amplituden av Ca^{2 +} hendelsen i tomten profilen, venstre klikk på "Rett linje" velgeren på ImageJ grensesnittet. Deretter tegn en vertikal linje fra grunnlinjen til plottet profilen til toppen av Ca^{2 +} arrangementet; lengden på linjen (vist på ImageJ grensesnittet) vil representere amplituden til hendelsen uttrykt som ΔF/F₀ (figur 2E).
Bruker ervervet amplitude verdi, varigheten av Ca^{2 +} hendelsen kan måles ved å tegne en rett linje langs bredden av hendelsen på 50% maksimal amplitude (full varighet på halv maksimal amplitude, FDHM) eller hele varigheten til hendelsen kan måles hvis ønskelig (figur 2E).
Merk: Forskere må utforme bestemt kriterium for terskelverdi gyldig Ca^{2 +} hendelser i disse innspillingene. I vårt forsøk, Ca^{2 +} hendelser ble utpekt som er gyldige for analyse om sin amplituden var > 15% av maksimal amplitude hendelsen i delen kontroll av innspillingen. Men disse grensene vil avhenge av den spesifikke vev og celler under studere og er bare tilfeldig retningslinjer som krever bestemte optimalisering for alle typer vev og celle.
Ved å tegne en linje langs upstroke eller downstroke av Ca^{2 +} event tomt profil, kan frekvensen av stiger eller faller beregnes tilsvarende. Når linjen er tegnet, kan musepekeren flyttes til et punkt der linjen begynner og hvor det slutter. Når markøren er i ro over disse punktene, x, y-koordinater for denne plasseringen vil vises i nedre venstre side av ImageJ grensesnittet. Således, ved å kjøpe x, y-verdiene for der linjen begynner (x₁, y₁) og ender (x₂, y₂), frekvensen av stiger eller faller (ΔF/s) kan beregnes som skråningen av en linje, y₂- y₁ / x₂- x₁ (figur 2F ).
For å beregne overføring eller romlige spredning av en Ca^{2 +} hendelse, venstre klikk på "Rett linje" velgeren på ImageJ grensesnittet. Deretter tegn en rett loddrett linje langs lengden av Ca^{2 +} hendelsen langs y-aksen. Lengden på linjen (vist på ImageJ grensesnittet) vil representere romlige spredning av hendelsen uttrykt som μm (figur 2 g).
Bestemme hastigheten av en spre Ca^{2 +} hendelse ved å tegne en linje langs spre foran hendelsen og beregne stigningstallet for linjen. Dette kan utføres manuelt på en lignende måte som beskrevet i trinn 3.32, ved å bestemme x, y-verdiene for der linjen begynner (x₁, y₁) og ender (x₂, y₂); disse verdiene vises i nedre venstre side av ImageJ grensesnittet når markøren ligger på STM.
Ved innsamling av ønsket parameterne for Ca^{2 +} hendelsen kvantifisering, basseng disse verdiene gjennomsnittet for å generere mener verdier for hver parameter på per celle basis; Alternativt sted alle rå verdiene i en distribusjon histogram å vise sin rekkevidde (figur 2 H).

4. kvantifisering av CTCs i ICC-min bruker partikkel basert analyse

Før analysere filmer i Volumetry med PTCLs, må romlige og tidsmessige kalibrering av filmen settes inn i filnavnet. Rediger alle filer som analyseres i Volumetry inneholder i tittelen antall sekunder som hver ramme er lik og også antall mikron som hver piksel tilsvarer atskilt ved én strek, med verdiene omsluttet av hakeparenteser. For eksempel en film kjøpt på 33 FPS med en 60 x målsetting (512 x 512) skal ha [0.22-0.033] inn filnavnet.
Åpne Volumetry og bruk høyre museknapp Klikk åpne mapper som inneholder videofiler. Venstreklikk på filmfilen skal analyseres for å åpne den i Volumetry (figur 3A, må være i ukomprimert TIFF-format).
For å nøyaktig beregne Ca^{2 +} signaler fra den hele FOV, gjennomgå filmen først differensiering og utjevning for å fjerne bakgrunnen forstyrrelser (kameraet Støy, auto fluorescens etc.) og øke signalet til støyforhold. I vinduet film, høyreklikk å få opp en meny og bruker høyre klikk access "STK Filter-skille", høyreklikk igjen for å angi en verdi for å skille, trykk ENTER og VENSTREKLIKK for å bruke (for filmer kjøpt på 33 FPS verdien 2 (∆t = ± 66-70 MS) fungerer bra, verdien økes som rate av image capture øker).
Merk: Differensiering i denne sammenheng vil redusere intensiteten av opptak (piksler) som viser ingen dynamisk aktivitet over antall rammer som er angitt. Dermed, hvis verdien '2' settes, hvert bildepunkt i hver ramme på innspillingen er analysert og hvis innen rammen det er ingen dynamisk endring i pixel fluorescens 1 ramme før og 1 ramme etter, intensiteten i bildepunktene trekkes fra innspillingen. Dermed ikke-dynamisk bakgrunnsstøy er fjernet og signal til støy er økt.
Glatt differensiert filmen ved å bruke en Gaussian filter. Høyreklikk vinduet film å få opp en meny og bruker høyre klikk access "STK Filter-Gauss KRNL", høyreklikk igjen å sette inn en verdi (Bruk alltid et oddetall, for filmer kjøpt på 33 FPS, en verdi på 5 fungerer godt, 1,5 x 1,5 µm STDAVVIK 1.0) en inndataverdi, trykk ENTER og VENSTREKLIKK for å bruke (figur 3B).
Begynne å lage PTCLs ved først å velge en periode av filmen som inkluderer en quiescent periode (20-40 bilder) etterfulgt av forekomsten av en CTC og også 20-40 bilder etter CTC. Dette kan du bla gjennom filmen ved hjelp av MMB bla venstre til høyre på den gule linjen.
Med valget, klikk Bruk høyre i vinduet film tilgang 'STK Ops-rampen DS PTCLinfo' og VENSTREKLIKK for å bruke. Denne funksjonen kjøres en PTCL analyse rutine som gradvis ramper terskelen fra maksimale intensitet til minimum intensitet. Dette vises grafisk i vinduet tomten som et plott av støy og også i vinduet spor som tre farget spor, med grønne sporingen viser antall PTCLs, rød sporingen viser gjennomsnittlig PTCL størrelse og blå sporingen viser absolutt intensiteten terskelen.
Merk: Antall og gjennomsnittlig størrelsen på PTCLs ved hver beregnes automatisk og deretter en semi-manuell terskel brukes med intensiteten som som den gjennomsnittlige størrelsen på PTCLs begynner å slippe, som oppstår på vendepunkt for rød spor i Vinduet spor (figur 3D, dvs på grunn av stort antall romlig begrenset støy PTCLs redusere den gjennomsnittlige størrelsen på PTCLs).
I vinduet plott trykk "H" histogrammet balansen handlingen vises PTCL støy. Bla gjennom fargevalg ved å trykke ' [' til bakgrunnen er farget hvit med fargede spor på toppen.
Trykk 'F' oppdra måleverktøy og venstreklikk på tomten i krysset der farget tomter skifte til høyre side. Dette vil markere én loddrett linje i rullefeltet i vinduet spor nedenfor.
I Sporing-vinduet bla MMB venstre høyre fra vendepunkt i rød sporet til den merkede hvite vertikale linjen opprettet i trinn 4.10 og sørge for at blå spor velges ved å høyreklikke på den, lese av 'yAVG' som vises i t Han nedre venstre side av vinduet spor. Fjern markeringen ved å trykke på MMB en gang i spor-vinduet.
I film-vinduet trykker du "C" for å få opp et fargehjul, så presse ville ' justere terskel. Gyldig PTCLs vises rødt i vinduet film (Figur 3 c) og de som mette blir hvite. Fjerne de hvite områdene ved å rulle opp med venstre museknapp.
Rulle opp eller ned med MMB å justere gule numeriske verdien i fargehjulet, justere denne verdien yAVG verdien tatt fra steg 4.11. Dette tilordner alt i rødt som en aktiv Ca^{2 +} forbigående PTCL på bestemt terskel punkt. For å lagre dette som en koordinere basert partikkel-fil, bruk høyre klikk Access ' STK 3D-lagre PTCLS 0 og deretter til venstre klikk for å lagre filen.
Avslutt Volumetry og åpne på nytt. Åpne den PTCL filen (.gpf) opprettet i trinn 4.13. I denne filen kan lagres alle aktive Ca^{2 +} transienter som en jevn blå PTCL (figur 3E). Hver PTCL er en enkelt enhet med sin egen ID, område og perimeter koordinater, stat flagg (se nedenfor) og resultatet matriser, strømlinjeformet analyse av spatio-temporale egenskaper av PTCLs, eller mellom PTCLs.
For å begynne PTCLs analyse, fjerne gjenværende PTCL støy (liten ugyldig PTCLs opprettet når filen .gpf genereres) ved hjelp av høyre klikk i vinduet filmen til ' PTCL STKOPS-flagget ptcls > Min = 70' og VENSTREKLIKK for å bruke. Denne handlingen ville flagg PTCLs større enn 6 µm² (~ diameter > 2µm) og Volumetry vil tilordne dem til 'Flagg 1' valg. Når dette er fullført, vises PTCLs som er over denne terskelen (Flagg 1) som en lys lilla farge i vinduet film mens noen PTCLs under terskelen blir deres base blått (figur 3F).
Opprette varme kart representasjoner av PTCL aktivitet med høyre klikk i vinduet filmen til ' PTCL STKops-StatMap flagg ='. Ved å høyreklikke på denne endelige banen, kan et flagg oppdrag å analysere angis. Dermed, hvis ønsker å kvantifisere PTCLs tilordnet flagg 1, bare skriv inn '1', trykk ENTER og deretter venstre klikk for å bruke. Dette vil generere en varmekart viser de totale PTCLs for hele opptak, med forskjellige farger representerer forekomsten (%) hele innspillingen (Figur 3 g, varme farger indikerer økt forekomst på den plasseringen).
Lagre varme kart av rett klikker på tilgang "STM Last lagre - lagrer STM som TIF" og deretter venstreklikke for å lagre som TIFF.
Kvantifisere PTCL aktivitet ved hjelp av høyre klikk i vinduet filmen til ' PTCL mål-PTCLStats STK = ", ved å høyreklikke på denne endelige banen, et flagg oppdrag å analysere kan angis. Dermed, hvis ønsker å kvantifisere PTCLs tilordnet flagg 1, bare skriv inn '1', trykk ENTER og deretter venstre klikk for å bruke. Dette vil generere en rekke spor i vinduet spor.
Volumetry vil som standard sammenligne PTCL spor generert i trinn 4.17 oppå hverandre. Skill dem ved hjelp av høyre klikk i vinduet spor tilgang "Juster-eget Trace" og VENSTREKLIKK for å bruke. Dette vil avdekke fire forskjellige PTCL spor som kvantifisere Ca^{2 +} PTCL aktivitet i filmen viser PTCL området (grønn), PTCL antall (rød), PTCL størrelse (cyan) og PTCL størrelse standardavvik (blå) plottet mot tid (Figur 3 H).
Disse spor kan lagres som en tekstfil som kan importeres til et regnearkprogram for videre analyse. For å lagre spor, hold nede SKIFT og bruker klikker høyre i vinduet spor tilgang 'Assorted-Dump avkastning som tekst' og venstre klikk for å lagre filen. Denne informasjonen er deretter samlet og illustrert i histogrammer eller andre passende grafiske fremstillinger (Figur 3 H).
For å se på den første forekomsten av PTCLs (dvs. å se på skyting steder), får disse første PTCLs et annet flagg oppdrag. Å bedre isolere avfyring områder innenfor nettverket, bare de PTCLs som ikke overlapper med partikler i forrige bilde men overlapping med partikler i neste 70 ms anses avfyring nettsteder.
Hvis du vil bruke denne terskelen, bruk høyre klikk i vinduet filmen til ' PTCL atferd-F1 InitSites > F = 3' og venstre klikk for å bruke. Dette tilordner starter PTCLs som 'Flagg 3', og PTCLs som oppfyller disse kriteriene vises nå som en lime grønn farge i filmen (figur 4A).
Volumetry gir også muligheten til å kvantifisere og plotte antall PTCL avfyring områder i en gitt FOV samt plotting deres sannsynligheten for avfyring under en CTC. Analysere disse parameterne, lage en varmekart over starte PTCLs (flagg 3) som beskrevet i trinn 4,16 (figur 4B).
Venstreklikk i vinduet Plot og så presse 'C' å oppdra en fargehjulet og trykk ville ' terskelen. Varmekart over initiere PTCLs vil deretter slå grå og hvit. Fjern alle hvite ved å rulle opp med venstre museknapp og terskelen PTCLs varme kart slik at bare gyldige PTCLs er dekket med grå (Juster terskelen ved å rulle opp og ned med MMB).
Bruk Klikk høyre over varmekartet i vinduet Plot tilgang "STM PTCLs-Finn PTCLs 70" og VENSTREKLIKK for å bruke. Dette tilordner alle grå PTCLs kart som er større enn 70 piksler² størrelse skal tildeles som en separat fargekodet innvielse PTCL eller PTCL skyte området (figur 4C).
Tegne inn aktiviteten til hver av disse skyte mot tiden av rett klikker på PTCL avfyring kart og tilgang til "STM PTCLs-Opprett PTCL rois" og venstre klikke gjelder. Dette vil generere et nytt bilde i vinduet film alle separat farget PTCL avfyring nettsteder vises med en avkastning rundt dem.
Bruk høyre klikk i vinduet filmen til ' PTCL mål-PTCLpixROIBM > = 1 og venstre klikk for å bruke. Dette vil identifisere alle ROIs i vinduet film som inneholder minst én PTCL og tegner all aktivitet innen disse ROIs i vinduet spor. Som standard er vil disse spor være oppå hverandre. For å skille dem, klikk Bruk høyre i vinduet spor tilgang "Juster-eget Trace" og VENSTREKLIKK for å bruke. For å lagre spor, hold nede SKIFT og bruker klikker høyre i vinduet spor tilgang 'Assorted-Dump avkastning som tekst' og venstre klikk for å lagre filen.
Aktiviteten til hver avfyring området kan også tegnes som en forekomst kart. Dette gjør bruk høyre klikk i vinduet filmen til ' PTCL mål-ROI Pianola = 10 og VENSTREKLIKK for å bruke. Dette vil generere et plott av alle skyting steder mot tiden i vinduet Plot. Hver avfyring området vises som en separat farget enhet, hver i sin egen "lane" og disse flatene tilsvarer Ca^{2 +} PTCLs starte under CTCs (Figur 4 dE) lagre disse forekomst kartene ved å høyreklikke på dem til ' STM Last lagre - lagrer STM som TIF "og deretter venstreklikke for å lagre som TIFF.
For å måle sannsynligheten for skyting på hver avfyring området under en CTC, bruk høyre klikk i vinduet filmen til ' PTCL atferd-merket er = 1 og venstre klikk for å bruke. Dette vil identifisere alle rammene i filmen som inneholder PTCLs over terskelen og vil disse bli markert i bunnen av vinduet film som vertikale blå linjer.
CTCs manifest som rask klynger av asynkrone fra flere skyte områder innen FOV ~ 1 s mellomrom mellom hver CTC syklus. Denne regularitet og lang avstand på ingen aktive PTCLs mellom CTCs brukes til å definere ytterligere en CTC for analyse.
Bruk høyre klikk i vinduet filmen til ' PTCL atferd-blokk er gapet < =', og bruke et høyreklikk på det siste punktet for å angi et tall. Denne kommandoen vil gruppere aktive PTCL rammene identifisert i trinn 4.28 i blokker og blokker er basert på antall rammer som skiller aktive PTCLs. Opptak av 33 FPS for eksempel fungerer en verdi på 10 bra. Hvis aktiv PTCLS er mindre enn 10 bilder fra hverandre (330 ms) er de gruppert i en enkelt blokk for analyse (blokkene vises deretter som rosa rektangler over de loddrette blå linjene på bunnen av vinduet film med hvert rosa rektangel nå indikerer en CTC).
Bruk Klikk høyre i vinduet filmen til 'PTCL mål-PTCL hendelsen Prob'. Dette vil generere en tekstfil som kan importeres til et regnearkprogram. Denne tekstfilen gir en enorm mengde data på natur webområdene innvielse som ble definert fra trinn 4,16-4.23 og deres bidrag til CTCs.
Merk: Tekstfilen viser antall innvielsen områder (referert til som "domener"), størrelsen på området i piksler og μm², sannsynligheten for hvert innvielsen område skyte enten én gang eller flere ganger under hver CTC (gitt som en %), gjennomsnittlig varighet og størrelsen på PTCLs på innvielsen området, antall CTC sykluser (som definert i trinn 4.23) og andelen avfyring nettsteder som sparken under hver CTC syklus. Denne informasjonen samles og illustrert i histogrammer eller andre passende grafiske fremstillinger (figur 4F).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bruke Kit-Cre-GCaMP6F mus (figur 1), dynamiske Ca^{2 +} signalering atferd av ICC i fordøyelsessystemet kan avbildes i situ. Med AC confocal mikroskopi, kan høyoppløselige bilder av spesifikke populasjoner av ICC skaffes uten forurensende signaler fra andre populasjoner av ICC i samme vev men i anatomisk forskjellige nivåer av fokus (figur 2A)³⁷ ^, ³⁹ ^, ⁴⁰ ^, ⁴¹. er det mulig å ta opp kort (< 100 ms), lokalisert Ca^{2 +} hendelser som ikke var mulig med membran permeable Ca^{2 +} indikatorer. Spatio-temporale kartlegging med Volumetry eller ImageJ kan brukes til å generere STMs av Ca^{2 +} arrangementene i celler i situ. Bruker denne tilnærmingen, Ca^{2 +} hendelser i en hel FOV kan visualiseres og tilordnet (figur 2BC), i stedet for bare registrering begrenset aktiviteten til en enkelt avkastning. Disse metodene kan utvides til hver celle i en gitt FOV, sikre representant datainnsamling fra alle celler og kvantitativ informasjon om relativ amplituder, forbigående varighet, hastighet på stige og falle av transienter, etc. (figur 2E , F). STM analyse, i motsetning til ROI-basert intensitet tomter, gir også muligheten til å overvåke og registrere romlige egenskaper av Ca^{2 +} signalnettverk, som romlig spredning og overføring hastighet, som vist i figur 2 g. Denne informasjonen kan være samlet for å gi en heller fullstendig oversikt over Ca^{2 +} signalering atferd i celler i sine opprinnelige omgivelser (figur 2 H).

PTCL analyse kan brukes å kvantifisere mer komplekse Ca^{2 +} signalering atferd, som de oppstår innen sammenkoblede mobilnettverk. Et eksempel på dette programmet tilbys av analyse utført på ICC-min (figur 3A). Vanligvis i slike komplekse preparater, kan bakgrunnsstøy og signal til støy være et problem. Imidlertid kan bruker Volumetry programvare bruke differensial og utjevning filtre på filmer av Ca^{2 +} aktivitet og deretter bruke støy terskelen protokoller for å filtrere ut støy (figur 3BD) bakgrunnsstøy fjernes fra komplekse opptak av dynamisk aktivitet. PTCL analyse som vist i figur 3E-G, kvantitativ informasjon om Ca^{2 +} kan signalering beregnes ved å måle PTCL området, PTCL teller og PTCL størrelse som indikerer romlige celleområder aktivering av Ca^{2 +} signaler i en FOV. Disse dataene kan kompilert som vist i Figur 3 H og analyseres statistisk etter behov. Figur 4 illustrerer hvordan PTCL analyse kan i dybden kvantifisering av sub mobilnettet Ca^{2 +} signalering ved å studere plasseringen og skyte sannsynligheter av Ca^{2 +} avfyring nettsteder. Ved å tildele PTCLs til forskjellige flagg basert på deres timelige egenskaper, initiere PTCLs kan være nøyaktig kartlagt som vist i figur 4C-E og et vell av harde data ervervet på antall innvielsen områder (referert til som " domener), størrelsen på området i piksler og µm², sannsynligheten av hver site skyte enten én gang eller flere ganger under hver CTC (gitt som en %), gjennomsnittlig varighet og størrelsen på PTCLs på webområdet innvielsen, antall CTC sykluser (som definert i trinn 4.23) og % skyting nettsteder som sparken under hver CTC syklus. Disse teknikkene tillater et høyt nivå av datamining og måling i situ Ca^{2 +} signaler innenfor et intakt mobilnettverk som ikke er mulig med ROI-basert analyser.

Figur 1: generasjon KitGCaMP6f mus. Skjematisk diagram av hvordan Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f mus) var korslagt med c-Kit^{/ grobunn-ERT2} (Kit-grobunn mus) til å generere Kit-Cre-GCaMP6f mus. Disse musene er injisert med tamoxifen i alderen 6-8 uker å indusere grobunn Recombinase og senere GCaMP6f uttrykk i ICC. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Analyse av Stokastisk Ca^{2 +} signaler i ICC-DMP bruker spatio-temporale kartlegging (STM). (A) representativt bilde av flere ICC-DMP fra tynntarm Kit-Cre-GCaMP6F museklikk på stedet. En grønn avkastning angir størrelsen og retningen av Avkastningen å trekke rundt en enkelt ICC-DMP innenfor FOV å opprette en STM i Volumetry. (B) STM av Ca^{2 +} aktivitet i ICC-DMP uthevet i A-panelet etter at den er riktig kalibrert for amplitude, rom og tid. (C) den samme STM vises i panelet B etter at den er fargekodet med en oppslagstabell (QUBPallete). (D) utvidet bilde av ICC-DMP Ca^{2 +} transienter vises på en farge kodet STM, som viser hvor å tegne en linje gjennom en Ca^{2 +} hendelse over sin tidsakse (x) å skape en tomt profil av sin virksomhet i ImageJ. (E) Plot profil av Ca^{2 +} hendelsen uthevet i panelet D, indikerer hvor linjene som vist være trukket til nøyaktig måle amplituden og varigheten av hendelsen. (F) Plot profil av Ca^{2 +} hendelsen uthevet i panelet D, indikerer hvor linjene som vist være trukket til nøyaktig måle hastigheten på økning og på høsten hendelsen. (G) utvidet bilde av ICC-DMP Ca^{2 +} transienter vises på en farge kodet STM, som viser hvor å tegne en linje gjennom en Ca^{2 +} hendelse over sin plass (y) akse å måle romlige spredning. (H) representant histogrammer for grupperte data fra ICC-DMP illustrerer hvordan å grafisk vise amplitude, varighet og romlig spredning verdiene fra følge fremgangsmåten ovenfor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: kvantifisering av CTCs i ICC-min bruker partikkel basert analyse. (A) representativt bilde av en ICC-mitt nettverk fra tynntarm Kit-Cre-GCaMP6F museklikk på stedet. (B) bilde tatt fra innspillingen vises i panelet A etter at den har gjennomgått et differensial filter av Δt = ±66-70 ms og filtere Gaussian på 1,5 x 1,5 µm, STDAVVIK 1.0. (C) bilde tatt fra videoen i B etter terskelverdi ble fullført med PTCLs over terskelen vises i rødt. (D) spor av PTCL telle og mener PTCL størrelse i en terskelverdi-protokoll for å eliminere støy i filmen vises i panelet B. PTCLs ble opprettet med en flom fylle algoritme som merket strukturen i alle tilstøtende bildepunkter som hadde intensiteter over terskelen, Ca ^{2 +} forbigående PTCLs var større enn støy PTCLs. Terskelen som stort antall små størrelse støy PTCLs dukket opp og begynte å redusere betyr størrelsen på PTCLs kan brukes som en vanlig terskelverdi for alle opptak. (E) representativt bilde fra koordinaten-baserte Ca^{2 +} PTCL fil opprettet fra thresholded innspillingen i C. (F) representativt bilde tatt fra filen PTCL e etter en screening kriteriene for > 6 µm² (diameter ~ 2 µm eller mindre) ble brukt; PTCLs over denne grensen er flagget (Flagg 1) som lys lilla partikler og vurdert gyldige PTCLs. (G) varmekartet viser de totale PTCLs (Flagg 1) for hele innspillingen av videoen vises i panelet F, med totalt PTCLs summert med farger som representerer forekomsten hele innspillingen (varme farger indikerer økt forekomst på den plasseringen). (H) representant spor av PTCL området (blå) og PTCL teller (rød) fra PTCL-fil som er opprettet i panelet A-G. Representant histogrammer grupperte data fra flere eksperimenter er vist nedenfor spor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: Analyse av Ca^{2 +} skyting steder i ICC-min bruker partikkel basert analyse. (A) representativt bilde tatt fra den PTCL filen figur 3E etter flagg 1 PTCLS er ytterligere forbedret i flagg 3, flaggstatusen for Ca^{2 +} avfyring nettsteder. FLAGG 3 PTCLs vises som lime grønn (bare de PTCLs som ikke overlapper med partikler i forrige bilde men overlapping med partikler i neste 70 ms ble vurdert avfyring områder). (B) varme kart som viser de totale PTCLs (flagg 3) til hele innspillingen av videoen vises i panelet A, med totalt PTCLs summert med farger som representerer forekomsten hele innspillingen (varme farger indikerer økt forekomst på den plasseringen). (C) representant kart over Ca^{2 +} avfyring områdene som vises i panelet B, med hver annen avfyring området tildelt en annen identifiserende farge. (D) representant spor av PTCL området (blå) og PTCL teller (rød) avledet fra filen PTCL opprettet i figur 3A-G. (E) en forekomst kart over aktiviteten til personlige skyting steder. Hver avfyring området FOV vises som en farget blokk i sin egen "lane" mot tiden. (F) representant histogrammer grupperte data fra flere eksperimenter vises illustrerer verdiene akkumuleres i Ca^{2 +} skyte området avfyring sannsynlighet / CTC og antallet av Ca^{2 +} skyting steder i en FOV. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ca^{2 +} avbilding av bestemte typer celler i intakt vev eller innen nettverk av celler ofte avslører komplekse mønstre av Ca^{2 +} transienter. Denne aktiviteten krever forsiktig og Dyptgående analyser og kvantifisering å fange så mye informasjon om underliggende hendelser og kinetics av disse hendelsene som mulig. STM og PTCL analyse gir mulighet for å maksimere mengden av kvantitative data gitt opptak av denne typen.

Smalt, spindel-formet morfologi av ICC-DMP gjør dem velegnet til STM analyse avledet fra STMs som er skissert ovenfor. Denne analysen er imidlertid ikke godt egnet til ICC-min som er stellate formet og koblet i et nettverk (figur 3A). Videre er Ca^{2 +} signalnettverk mønstre i ICC-min mer kompleks, manifestert som overføres CTCs fra flere områder av opprinnelse på ICC-min nettverket. Derfor, for å måle aktivitet forekommer i hele ICC-min nettverket innen en FOV, partikkel (PTCL) analyse ble gjennomført med tilpasset laget programvare (Volumetry, versjon G8d, GWH, drift på Mac OS, kontakt Grant Hennig grant.hennig@med.uvm.edu angående henvendelser for Volumetry tilgang og bruk).

STM analyse kan alle Ca^{2 +} hendelser enkeltceller og alle cellene i et FOV skal analyseres kritisk over en rekke romlige og tidsmessige parametere. Protokollen beskrevet illustrerer hvordan disse teknikkene kan brukes på ICC-DMP i tynntarmen musen. Ved fullt kvantifisere Ca^{2 +} signalering i ICC-DMP, som vist i figur 2B-G, Ca^{2 +} signalering mønstre har vært preget i detalj³⁷. Disse analysene er brukt på opptak hvor ICC-DMP gjennomgå intervensjoner fint kvantifisere effekten av blokkerer eller stimulere Ca^{2 +} utgivelse / Ca^{2 +} tilstrømningen / neurotransmission veier³⁷^,³⁹ ^, ⁴⁰ ^, ⁴¹. disse teknikkene kan lett brukes på andre intakt vev preparater. For eksempel blitt STM analyse som beskrevet her benyttet for å identifisere nye mekanistisk veier involvert i generasjon intracellulær Ca^{2 +} bølger i urinrøret glatt muskel i situ⁵⁷.

Utarbeidelse av STMs i Volumetry krever forsiktighet, som funksjonen i Volumetry som skaper STM fra trukket Avkastningen (figur 2A) er en gjennomsnittsverdi av intensitet. Amplituden av Ca^{2 +} signaler kan dermed potensielt fortynnes hvis Avkastningen er trukket bredere eller lengre enn Ca^{2 +} hendelsen eller cellen rundt. Således burde brukernes være forsiktig å trekke ROIs til tett passer som mulig til Ca^{2 +} signaler eller bestemt celle som de analyserer for å løse dette problemet. Tilsvarende opprette STMS bruke enkelt piksel linescans i ImageJ betyr at korrekt tilordning av Ca^{2 +} hendelser er underlagt nærhet av Ca^{2 +} signalet til tegnet linjen. Slike bekymringer er mindre i tynne spindel formet celler som ICC-DMP, men andre cellen typer har en mer stellate eller runde morfologi kan gjøre denne typen analyse upassende å tilordne alle Ca^{2 +} signaler nøyaktig. Når forbereder STMs analyse, uansett om de var i Volumetry eller med ImageJ linescans, er det noen områder til å bli markert for feilsøkingsformål. Det er viktig å endre bildekvaliteten til 32-biters før utføre noen kalibrering på STMs. unnlatelse av å gjøre det, eller gjøre det etter kalibrering for F/F₀ kan føre til inkonsekvent målinger over eksperimenter. Sjekk alltid STM, som er angitt i øvre område av den hvite kanten av STM selv når åpnes med ImageJ kvalitet. En annen potensielt samarbeidsområde inkonsekvens velger F₀ verdien når kalibrering for amplitude. Det er viktig at for å velge området for F₀, at det dekker et område av cellen som er jevn og i fokus. Derfor områder av cellen som har en ustabil basale fluorescens eller som endres på grunn av bevegelse eller andre gjenstander er ikke ideelle og strenge bevegelse stabilisering protokoller skal brukes i disse tilfellene.

I på stedet eller kulturperler preparater som inneholder sammen mobilnettverk, som ICC-min i små tarmen, PTCL analysen gir en strømlinjeformet teknikk for å kvantifisere komplekse, subcellular Ca^{2 +} hendelser i nettverket. Videre gjør det også Ca^{2 +} arrangementene i nettverket innen en gitt FOV som skal analyseres, snarere enn benytter vilkårlig ROIs, som bare gir informasjon om og i Avkastningen. En fordel med PTCL analysen beskrevet her er at ved å bruke differensial og Gaussian utjevning filtre til innspillinger mye støy kan fjernes fra filmer som kan inneholde skadelige lys fra cellene ikke av interesse eller ikke-dynamisk lyspunkter eller Inneslutninger. Det er viktig å merke seg at mengden av differensiering brukes til opptak avhenger i stor grad på oppkjøp satsen av eksperimentator. Skille filmer som beskrevet i protokollen gir en måte å bruke et filter på filmen fjerne høyfrekvent støy fra opptak. Bruk differensiering verdien '2' da anskaffe 33 fps fungerer godt for å fjerne bakgrunnsstøy samtidig opprettholde god signal til støy (Hvis verdien er for lav, støy oppdages men signal til støy blir kompromittert Hvis verdien er for høy). Differensiering verdien brukt skal økes med raskere oppkjøpet priser, for eksempel ved 100 FPS, differensiering verdien '7' gir omtrent samme signal til støyforhold som verdien '2' 33FPS opplest. Forskere må optimalisere innstillingene tilsvarende for sine forberedelser og opptak forhold.

Terskelverdi protokollen beskrevet i figur 3D gir en konsekvent terskelverdi prosedyre på forskjellige innspillinger gjort på forskjellige systemer med ulike oppkjøpet programvare. Denne fleksibiliteten gjør at data fra flere etterforskere arbeider på forskjellige systemer å samle sine innspillinger i samme datasett. Ved hjelp av flagg system i Volumetry, tillater PTCL analyse visualisering og kvantifisering av personlige Ca^{2 +} skyting steder innenfor et nettverk i detalj. Informasjon kan samles på antall innvielsen nettsteder, størrelsen på området i piksler og µm², og den gjennomsnittlige varigheten for PTCLs på området. PTCL analysen tillatt første karakterisering av CTC aktivitet i tynntarmen på sub cellenivå, og bruke forskjellige flaggene i Volumetry software, PTCLs både nettverket og personlige avfyring nettsted nivå kvantifisert i intakt vev forberedelser fra Kit-Cre-GCaMP3 mus³⁸. Fra disse første observasjoner, denne analysen blitt ytterligere benyttet for å studere romanen Ca^{2 +} tilstrømningen stier i GI ICC-min som butikk-opererte-Ca^{2 +}-oppføringen⁴² og rollen mitokondrie Ca^{2 +} signalisere på GI pacemaking ⁴¹. mye som STM analyse beskrevet ovenfor, PTCL analyse kan lett tilpasses forskjellige intakt preparater enn som beskrevet i denne protokollen. For eksempel en fersk studie brukes PTCL analyse for å studere romanen rytmisk Ca^{2 +} hendelser i intakt cellular nettverk av lamina propria rotten urinblæren⁵⁸^,⁵⁹ , og dermed kan lett brukes på andre komplekse, intakt cellulær systemer som nevrale systemer. Mens dette papiret fokusert på Ca^{2 +} imaging intakt vev med GECIs, kan disse analyseteknikker også kjøres på isolerte celler og vev lastet med tradisjonell Ca^{2 +} indikator fargestoffer. STM basert analyse er brukt til å kunne kvantifisere lokalisert Ca^{2 +} signaler og Ca^{2 +} bølger fra spindelen interstitielle cellene og glatt muskelceller fra en rekke preparater¹¹^,⁶⁰ ^, ⁶¹ ^, ⁶² ^, ⁶³. videre PTCL analyse rutiner beskrevet her er også brukt i situ nettverk preparater visualisert med Cal 520⁵⁸^,⁵⁹. Men beholde disse studiene også ulempene ved slikt fargestoff lasting protokoller som tvetydig celle identifikasjon og problemer med signal til støy.

Eksemplene illustrert ovenfor viser at både STM og PTCL analyse er svært formbare teknikker som kan brukes å kvantifisere komplekse Ca^{2 +} signalering i en rekke intakt vev forberedelser. De tilbyr mange fordeler over tradisjonelle avkastning basert intensitet tomter som har brukt rutinemessig tidligere og bør gi etterforskere mer verdifull kvantitativ informasjon på Ca^{2 +} signalering enn tidligere kan oppnås.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Midler ble gitt av NIDDK, via P01 DK41315.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageJ software	NIH	1.5a	ImageJ software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit^+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Wellman, G. C., Nelson, M. T. Signaling between SR and plasmalemma in smooth muscle: Sparks and the activation of Ca2+-sensitive ion channels. Cell Calcium. 34 (3), 211-229 (2003).
Mironneau, J., Arnaudeau, S., Macrez-Lepretre, N., Boittin, F. X. Ca2+sparks and Ca2+waves activate different Ca2+-dependent ion channels in single myocytes from rat portal vein. Cell Calcium. 20 (2), 153-160 (1996).
Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1793 (6), 933-940 (2009).
Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. Calcium signalling. Current biology. 9 (5), R157-R159 (1999).
Bootman, M. D., et al. Calcium signalling—an overview. Seminars in Cell & Developmental Biology. 12 (1), 3-10 (2001).
Brain, K. L., Bennett, M. R. Calcium in sympathetic varicosities of mouse vas deferens during facilitation, augmentation and autoinhibition. The Journal of Physiology. 502 (3), 521-536 (1997).
Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).
Dupont, G., Goldbeter, A. Problems and paradigms: Oscillations and waves of cytosolic calcium: Insights from theoretical models. BioEssays. 14 (7), 485-493 (1992).
Bootman, M. D., Berridge, M. J. The elemental principles of calcium signaling. Cell. 83 (5), 675-678 (1995).
Berridge, M. J., Dupont, G. Spatial and temporal signalling by calcium. Current Opinion in Cell Biology. 6 (2), 267-274 (1994).
Drumm, B. T., et al. The role of Ca 2+ influx in spontaneous Ca 2+ wave propagation in interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. The Journal of Physiology. 593 (15), 3333-3350 (2015).
Bayguinov, P. O., Hennig, G. W., Smith, T. K. Ca 2+ imaging of activity in ICC-MY during local mucosal reflexes and the colonic migrating motor complex in the murine large intestine. The Journal of Physiology. 588 (22), 4453-4474 (2010).
Drumm, B. T., Sergeant, G. P., Hollywood, M. A., Thornbury, K. D., McHale, N. G., Harvey, B. J. The role of cAMP dependent protein kinase in modulating spontaneous intracellular Ca2+ waves in interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. Cell Calcium. 56 (3), 181-187 (2014).
Nathanson, M. H., Padfield, P. J., O’Sullivan, A. J., Burgstahler, A. D., Jamieson, J. D. Mechanism of Ca2+ wave propagation in pancreatic acinar cells. Journal of Biological Chemistry. 267 (25), 18118-18121 (1992).
Straub, S. V., Giovannucci, D. R., Yule, D. I. Calcium wave propagation in pancreatic acinar cells: functional interaction of inositol 1,4,5-trisphosphate receptors, ryanodine receptors, and mitochondria. The Journal of General Physiology. 116 (4), 547-560 (2000).
Sneyd, J., Tsaneva-Atanasova, K., Bruce, J. I. E., Straub, S. V., Giovannucci, D. R., Yule, D. I. A model of calcium waves in pancreatic and parotid acinar cells. Biophysical Journal. 85 (3), 1392-1405 (2003).
Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. Calcium sparks in smooth muscle. American Journal of Physiology. Cell. 278 (2), C235-C256 (2000).
Nelson, M. T., et al. Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks. Science. 270 (5236), 633-637 (1995).
Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks: Elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 262 (5134), 740-744 (1993).
Parker, I., Choi, J., Yao, Y. Elementary events of InsP3-induced Ca2+ liberation in Xenopus oocytes: Hot spots, puffs and blips. Cell Calcium. 20 (2), 105-121 (1996).
Diliberto, P. a, Wang, X. F., Herman, B. Confocal imaging of Ca2+ in cells. Methods in Cell Biology. 40, 243-262 (1994).
Martínez-Zaguilán, R., Parnami, G., Lynch, R. M. Selection of fluorescent ion indicators for simultaneous measurements of pH and Ca2+. Cell Calcium. 19 (4), 337-349 (1996).
Hayashi, H., Miyata, H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2. The Journal of Pharmacology & Toxicology Methods. 31 (1), 1-10 (1994).
Thomas, D., Tovey, S. C., Collins, T. J., Bootman, M. D., Berridge, M. J., Lipp, P. A comparison of fluorescent Ca2+indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+signals. Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).
Lock, J. T., Parker, I., Smith, I. F. A comparison of fluorescent Ca2+indicators for imaging local Ca2+signals in cultured cells. Cell Calcium. 58 (6), 638-648 (2015).
Flagmeier, P., et al. Ultrasensitive Measurement of Ca 2+ Influx into Lipid Vesicles Induced by Protein Aggregates. Angewandte Chemie International Edition. 56 (27), 7750-7754 (2017).
Tsutsumi, S., et al. Structure-Function Relationships between Aldolase C/Zebrin II Expression and Complex Spike Synchrony in the Cerebellum. Journal of Neuroscience. 35 (2), 843-852 (2015).
Rietdorf, K., Chehab, T., Allman, S., Bootman, M. D. Novel improved Ca indicator dyes on the market - a comparative study of novel Ca indicators with Fluo-4. Calcium Signalling: The Next Generation. , 590 (2014).
Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
Seidemann, E., et al. Calcium imaging with genetically encoded indicators in behaving primates. eLife. 5 (2016JULY), (2016).
Su, S., et al. Genetically encoded calcium indicator illuminates calcium dynamics in primary cilia. Nature Methods. 10 (11), 1105-1109 (2013).
Kaestner, L., et al. Genetically encoded Ca2+ indicators in cardiac myocytes. Circulation Research. 114 (10), 1623-1639 (2014).
Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor design. Current Opinion in Chemical Biology. 27, 90-97 (2015).
Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence. PLoS ONE. 12 (2), 1-24 (2017).
Spencer, N. J., et al. Identification of a rhythmic firing pattern in the enteric nervous system that generates rhythmic electrical activity in smooth muscle. The Journal of Neuroscience. , 3489 (2018).
Hibberd, T. J., et al. Synaptic Activation of Putative Sensory Neurons By Hexamethonium-Sensitive Nerve Pathways in Mouse Colon. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. (861), (2017).
Baker, S. A., Drumm, B. T., Saur, D., Hennig, G. W., Ward, S. M., Sanders, K. M. Spontaneous Ca(2+) transients in interstitial cells of Cajal located within the deep muscular plexus of the murine small intestine. The Journal of Physiology. 594 (12), 3317-3338 (2016).
Drumm, B. T., et al. Clustering of Ca2+ transients in interstitial cells of Cajal defines slow wave duration. The Journal of General Physiology. 149 (7), 703-725 (2017).
Baker, S. A., Drumm, B. T., Cobine, C. A., Keef, K. D., Sanders, K. M. Inhibitory Neural Regulation of the Ca2+ Transients in Intramuscular Interstitial Cells of Cajal in the Small Intestine. Frontiers in Physiology. 9 (April), 1-24 (2018).
Baker, S. A., et al. Excitatory Neuronal Responses of Ca 2+ Transients in Interstitial Cells of Cajal in the Small Intestine. eNeuro. 5 (2), (2018).
Drumm, B. T., Sung, T. S., Zheng, H., Baker, S. A., Koh, S. D., Sanders, K. M. The effects of mitochondrial inhibitors on Ca2+signalling and electrical conductances required for pacemaking in interstitial cells of Cajal in the mouse small intestine. Cell Calcium. 72, 1-17 (2018).
Zheng, H., Drumm, B. T., Earley, S., Sung, T. S., Koh, S. D., Sanders, K. M. SOCE mediated by STIM and Orai is essential for pacemaker activity in the interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. Science Signaling. 11 (June), (2018).
Zhu, M. H., et al. A Ca(2+)-activated Cl(-) conductance in interstitial cells of Cajal linked to slow wave currents and pacemaker activity. The Journal of Physiology. 587 (20), 4905-4918 (2009).
Zhu, M. H., Sung, T. S., O’Driscoll, K., Koh, S. D., Sanders, K. M. Intracellular Ca(2+) release from endoplasmic reticulum regulates slow wave currents and pacemaker activity of interstitial cells of Cajal. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 308 (8), C608-C620 (2015).
Zhu, M. H., et al. Muscarinic activation of Ca2+-activated Cl- current in interstitial cells of Cajal. The Journal of Physiology. 589 (Pt 18), 4565-4582 (2011).
Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine. The Journal of Physiology. 480 (Pt 1), 91-97 (1994).
Huizinga, J. D., Thuneberg, L., Klüppel, M., Malysz, J., Mikkelsen, H. B., Bernstein, A. W/kit gene required for interstitial cells of cajal and for intestinal pacemaker activity. Nature. 373 (6512), 347-349 (1995).
Ordog, T., Ward, S. M., Sanders, K. M. Interstitial cells of Cajal generate electricial slow waves in the murine stomach. The Journal of Physiology. 518 (1), 257-269 (1999).
Sanders, K. M., Ward, S. M., Koh, S. D. Interstitial cells: regulators of smooth muscle function. Physiological Reviews. 94 (3), 859-907 (2014).
Ward, S. M., McLaren, G. J., Sanders, K. M. Interstitial cells of Cajal in the deep muscular plexus mediate enteric motor neurotransmission in the mouse small intestine. The Journal of Physiology. 573 (1), 147-159 (2006).
Komuro, T. Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. The Journal of Physiology. 576 (3), 653-658 (2006).
Komuro, T. Comparative morphology of interstitial cells of Cajal: ultrastructural characterization. Microscopy Research and Technique. 47 (4), 267-285 (1999).
Sanders, K. M., Ward, S. M., Koh, S. D. Interstitial Cells: Regulators of Smooth Muscle Function. Physiological Reviews. 94 (3), 859-907 (2014).
Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+dynamics in the awake mouse brain. PLoS ONE. 12 (7), e0181113 (2017).
Truett, G. E., Heeger, P., Mynatt, R., Truett, A. A., Walker, J. A., Warman, M. L. Preparation of PCR quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT). BioTechniques. 29 (52), 54 (2000).
The Jackson Laboratory. , Available from: https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:5:0::NO:5:P5_MASTER_PROTOCOL_ID,P5_JRS_CODE:27076,028865 (2017).
Drumm, B. T., et al. Ca 2+ signalling in mouse urethral smooth muscle in situ role of Ca 2+ stores and Ca 2+ influx mechanisms. The Journal of Physiology. 596 (8), 1433-1466 (2018).
Heppner, T. J., Hennig, G. W., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Rhythmic Calcium Events in the Lamina Propria Network of the Urinary Bladder of Rat Pups. Frontiers in Systems Neuroscience. 11 (December), 1-16 (2017).
Heppner, T. J., Hennig, G. W., Nelson, M. T., May, V., Vizzard, M. A. PACAP38-Mediated Bladder Afferent Nerve Activity Hyperexcitability and Ca 2 + Activity in Urothelial Cells from Mice. Journal of Molecular Neuroscience. 1, (2018).
Griffin, C. S., et al. Muscarinic Receptor Induced Contractions of the Detrusor are Mediated by Activation of TRPC4 Channels. Journal of Urology. 196 (6), 1796-1808 (2016).
Sergeant, G. P., Craven, M., Hollywood, M. A., Mchale, N. G., Thornbury, K. D. Spontaneous Ca2+waves in rabbit corpus cavernosum: Modulation by nitric oxide and cGMP. Journal of Sexual Medicine. 6 (4), 958-966 (2009).
Bradley, E., et al. Novel Excitatory Effects of Adenosine Triphosphate on Contractile and Pacemaker Activity in Rabbit Urethral Smooth Muscle. Journal of Urology. 183 (2), 801-811 (2010).
Drumm, B. T., et al. The effect of high [K + ] o on spontaneous Ca 2+ waves in freshly isolated interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. Physiological Reports. 2 (1), e00203 (2014).

Biology

Programmer Spatio-temporale kartlegging og partikkel analyseteknikker for å kvantifisere intracellulær Ca^{2 +} signalering i Situ

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.