Biology

Toepassingen van de Spatio-temporele Mapping en analysetechnieken deeltje te kwantificeren intracellulaire Ca^{2 +} signalering In Situ

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58989

Bernard T. Drumm¹, Grant W. Hennig², Salah A. Baker¹, Kenton M. Sanders¹

¹Department of Physiology and Cell Biology, University of Nevada Reno School of Medicine, ²Department of Pharmacology, The Robert Larner, M.D. College of Medicine, University of Vermont

Summary

Genetisch gecodeerde Ca^{2 +} indicatoren (GECIs) hebben radicaal veranderd hoe in situ Ca^{2 +} imaging wordt uitgevoerd. Maximaliseren van de terugwinning van de gegevens uit deze opnamen, is juiste analyse van Ca^{2 +} signalen vereist. De protocollen in deze paper vergemakkelijken de kwantificering van Ca^{2 +} signalen opgenomen in situ met behulp van Spatio mapping en deeltje gebaseerde analyse.

Abstract

CA^{2 +} beeldvorming van geïsoleerde cellen of specifieke soorten cellen binnen intact weefsels vaak onthult complexe patronen van Ca^{2 +} signalering. Deze activiteit vereist zorgvuldige en grondige analyses en kwantificering te vangen zo veel mogelijk informatie over de onderliggende gebeurtenissen. Ruimtelijke, temporele en intensiteitswaarden intrinsieke tot Ca^{2 +} signalen zoals frequentie, de duur, de voortplanting, de snelheid en de amplitude kunnen bieden sommige biologische informatie die nodig is voor de intracellulaire signalering. Hoge resolutie Ca^{2 +} imaging meestal resultaten in de overname van grote gegevensbestanden die zijn tijdrovend proces in termen van het vertalen van de beeldvorming informatie in meetbare gegevens, en dit proces kan worden vatbaar voor menselijke fouten en bias. Analyse van Ca^{2 +} signalen uit cellen in situ is meestal afhankelijk van eenvoudige intensiteit metingen van willekeurig geselecteerde regio's van belang (ROI) binnen een beeldveld (FOV). Deze aanpak wordt veel van de belangrijke signalering informatie in de FOV genegeerd. Dus, om te maximaliseren van de terugwinning van gegevens van dergelijke hoge resolutie opnamen verkregen met Ca^{2 +}kleurstoffen of optogenetic Ca^{2 +}imaging, passende ruimtelijke en temporele analyse van de Ca^{2 +} signalen is vereist. De protocollen die worden beschreven in dit artikel zal beschrijven hoe een hoog volume van gegevens kan worden verkregen uit Ca^{2 +} imaging opnamen om meer volledige analyse en kwantificering van Ca^{2 +} signalen opgenomen van cellen met behulp van een combinatie van Spatio kaart (STM)-op basis van de analyse en deeltje gebaseerde analyse. De protocollen ook beschrijven hoe verschillende patronen van Ca^{2 +} signalering waargenomen in andere cel populaties in situ op de juiste wijze kunnen worden geanalyseerd. Ter illustratie wordt zal de methode onderzoeken Ca^{2 +} signalering in een gespecialiseerde bevolking van cellen in de dunne darm, interstitiële cellen van Cajal (ICC), met behulp van GECIs.

Introduction

CA^{2 +} is een alomtegenwoordige intracellulaire boodschapper die een breed scala van cellulaire processen, zoals spier contractie¹^,², metabolisme³, cel proliferatie³^,⁴^, onder controle ⁵, stimulatie van de neurotransmitter release op⁶^,⁷van de terminals van de zenuw en activering van transcriptie factoren in de kern. ⁷ intracellulaire Ca^{2 +} signalen vaak de vorm aannemen van voorbijgaande waterstand in cytosolische Ca^{2 +}, en deze kunnen worden spontane of voortvloeien uit agonist stimulatie afhankelijk van de cel type⁸. Ruimtelijke, temporele en intensiteitswaarden intrinsieke tot Ca^{2 +} signalen zoals frequentie, duur, vermeerdering, snelheid en amplitude kunnen de biologische informatie die nodig is voor de intracellulaire signalen⁵^, ⁷ ^, ⁹. cytoplasmatische Ca^{2 +} signalen kunnen ontstaan door de toestroom van Ca^{2 +} vanuit de extracellulaire ruimte of via Ca^{2 +} vrijlating uit het endoplasmatisch reticulum (ER) via Ca^{2 +} release kanalen zoals ryanodine receptoren (RyRs) en inositol-tri-fosfaat receptoren (IP-₃Rs)¹⁰. RyRs en IP-₃Rs kunnen zowel bijdragen tot de generatie van Ca^{2 +} signalen en de gezamenlijke opening van deze kanalen, die gecombineerd met verschillende Ca^{2 +} toestroom mechanismen kan leiden tot een myriade van Ca^{2 +} signalering van patronen die worden gevormd door de nummers en open kans van Ca^{2 +} toestroom kanalen, het profiel van de expressie van Ca^{2 +} release kanalen, de afstand tussen de Ca^{2 +} toestroom en release kanalen, en expressie en distributie van Ca^{2 +} reuptake en extrusie eiwitten. CA^{2 +} signalen kunnen de vorm aannemen van uniforme, langdurige, hoge intensiteit global oscillaties dat voor verscheidene seconden of zelfs minuten duren kan, teeltmateriaal van intracellulaire en intercellulaire Ca^{2 +} golven die intracellulaire afstanden mogen overschrijden meer dan 100 µm¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶of meer korte, ruimtelijk gelokaliseerde evenementen zoals Ca^{2 +}sparks en Ca^{2 +} soesjes die optreden op tientallen milliseconden tijdschalen en minder dan 5 µm¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰te verspreiden.

Fluorescent microscopie is wijd gebruikt om te controleren Ca^{2 +} signalering in geïsoleerde en gekweekte cellen en weefsels intact. Traditioneel, deze experimenten betrokken het gebruik van fluorescerend Ca^{2 +} indicatoren, ratiometric en niet-ratiometric kleurstoffen zoals Fura2, Fluo3/4 of Rhod2, o.a. ²¹^,²²^,²³. Deze indicatoren werden ontworpen om te worden luchtdoorlatend celmembranen en vervolgens worden gevangen in cellen door het splijten van een ester-groep via endogene esterasen. Binding van Ca^{2 +} de hoge affiniteit indicatoren veroorzaakt veranderingen in fluorescentie wanneer de cellen en weefsels werden verlicht door passende golflengten van licht. Het gebruik van cel permeabele Ca^{2 +} indicatoren verbeterd sterk ons begrip van Ca^{2 +}signalering in levende cellen en toegestaan ruimtelijke resolutie en kwantificering van deze signalen, dat door het analyseren van Ca^{2 +} signalen niet mogelijk was via andere middelen, zoals electrofysiologie. Traditionele Ca^{2 +} indicatoren hebben echter verschillende beperkingen, zoals photobleaching dat over uitgebreide opname perioden^{24 optreedt}. Terwijl de nieuwere Ca^{2 +}indicator kleurstoffen zoals Cal520/590 hebben sterk verbeterde signaal ruisverhoudingen en de mogelijkheid om het detecteren van lokale Ca^{2 +} signalen²⁵, kunnen problemen met photobleaching blijven een zorg voor sommige onderzoekers²⁶²⁸²⁷^,^,. Steile photobleaching wordt ook beperkt, de vergroting, aantal Beeldacquisitie, en resolutie die kan worden gebruikt voor opnamen, zoals meer objectieve macht en hogere tarieven van Beeldacquisitie vereisen verhoogd excitatie lichtintensiteit die verhoogt photobleaching.

Deze beperkingen van traditionele Ca^{2 +} indicator kleurstoffen worden verergerd bij het opnemen van Ca^{2 +} signalen ter plaatse, bijvoorbeeld wanneer opname intracellulaire Ca^{2 +} signalen van intact weefsels. Als gevolg van de bovengenoemde problemen, visualisatie van Ca^{2 +} signalen in situ cel permeabele Ca^{2 +}indicatoren is beperkt tot laag vermogen vergroting en verlaagde tarieven van Fotolader, beperken het vermogen van onderzoekers te registreren en stoffelijk of ruimtelijk beperkte subcellular Ca^{2 +} signalen te kwantificeren. Dus, het is al moeilijk te vangen, te analyseren en begrijpen van de complexiteit van het ruimtelijke en temporele van Ca^{2 +} signalen, die van belang zijn in de generatie van gewenste biologische reacties, kunnen zoals hierboven beschreven. Analyse van Ca^{2 +} signalen uit cellen in situ is meestal afhankelijk van eenvoudige intensiteit metingen uit geselecteerde gebieden van belang (ROI) binnen een beeldveld (FOV). De willekeurige keuze van het aantal, de grootte en de positie van ROIs, afhankelijk van de willekeur van de onderzoeker, kan ernstig vertekening van de verkregen resultaten. Evenals de inherente vooringenomenheid met ROI analyse, negeert deze aanpak veel van de belangrijke informatie zoals vervat in de FOV, als dynamische Ca^{2 +} gebeurtenissen binnen een willekeurig gekozen signalering ROI zijn geselecteerd voor analyse. Bovendien, analyse van ROIs mislukt informatie te verstrekken over de ruimtelijke kenmerken van de Ca^{2 +} signalen waargenomen. Bijvoorbeeld, het niet mogelijk onderscheid maken tussen een stijging van Ca^{2 +} die voortvloeien uit een teeltmateriaal Ca^{2 +} Golf en een uiterst gelokaliseerde Ca^{2 +} release evenement van bijhouding van Ca^{2 +} signalen binnen een ROI.

De komst van genetisch gecodeerde Ca^{2 +} indicatoren (GECIs) is radicaal veranderd hoe Ca^{2 +} beeldvorming kan worden uitgevoerd in situ²⁹^,³⁰^,³¹^,³²^,³³. Er zijn verschillende voordelen aan het gebruik van GECIs over kleurstoffen. Het belangrijkste is misschien dat de expressie van GECI kan worden uitgevoerd op een specifieke wijze van cel, waardoor ongewenste achtergrondverontreiniging uit cellen niet van belang. Een ander voordeel van GECIs ten opzichte van traditionele Ca^{2 +} indicatoren is dat photobleaching wordt verminderd (zoals fluorescentie en éénduidige photobleaching treedt alleen op wanneer cellen actief zijn), in vergelijking met kleurstof-geladen monsters, met name bij hoge vergroting en hoge beeld vastleggen³⁴. Dus, imaging met GECIs, zoals de GCaMP-serie van optogenetic sensoren, biedt onderzoekers de mogelijkheid om opnemen kort, gelokaliseerde sub cellulaire Ca^{2 +} signalen in situ en onderzoeken Ca^{2 +} signalering in cellen binnen hun native omgevingen die eerder niet mogelijk zijn geweest. Herstel van gegevens uit dergelijke hoge resolutie opnamen te maximaliseren, is de juiste ruimtelijke en temporele analyse van de Ca^{2 +} signalen vereist. Opgemerkt moet worden dat terwijl GECIs duidelijke voordelen bieden kan, recente studies is gebleken dat Ca^{2 +} imaging met succes kan worden uitgevoerd vanaf de grote populaties van verschillende soorten neurochemical neuronen gelijktijdig gebruik van conventionele CA^{2 +} indicatoren die niet genetisch zijn gecodeerd in de dierlijke³⁵. Deze aanpak gebruikt post hoc immunohistochemistry te onthullen meerdere verschillende klassen van neuronen afvuren op hoge frequentie in gesynchroniseerde uitbarstingen, en het potentieel dat genetische modificaties aan het dier kunnen hebben bemoeid met de fysiologische vermeden gedrag de onderzoeker wil begrijpen³⁵^,,³⁶.

De protocollen die worden beschreven in dit document vergemakkelijken meer volledige analyse en kwantificering van Ca^{2 +} signalen opgenomen uit cellen in situ met behulp van een combinatie van Spatio kaart (STM)-op basis van de analyse en deeltje gebaseerde analyse. De protocollen ook beschrijven hoe verschillende patronen van Ca^{2 +} signalering waargenomen in andere cel populaties in situ op de juiste wijze kunnen worden geanalyseerd. Ter illustratie wordt zal de methode onderzoeken Ca^{2 +} signalering in een gespecialiseerde bevolking van cellen in de dunne darm, interstitiële cellen van Cajal (ICC). ICC zijn gespecialiseerde cellen in het maagdarmkanaal (GI) die vertonen dynamische intracellulaire Ca^{2 +} signalering, als gevisualiseerd met behulp van muizen GCaMPs³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^{, uiten} ⁴¹^,⁴². CA^{2 +} transiënten in ICC zijn gekoppeld aan de activering van Ca^{2 +}-geactiveerd Cl^- (gecodeerd door Ano1) kanalen die belangrijk zijn bij het reguleren van de prikkelbaarheid van de intestinale vlotte spier cellen (SMCs)⁴³^, ⁴⁴,^,⁴⁵. De studie van Ca^{2 +} signalering in ICC is dus fundamenteel voor het begrip van de intestinale motiliteit. De lymfkliertest dunne darm biedt een uitstekend voorbeeld voor deze demonstratie vormt en er zijn twee klassen van Internationaal Strafhof dat zijn anatomisch gescheiden en onafhankelijk van elkaar kunnen worden gevisualiseerd: ik) ICC bevinden zich in het gebied tussen de verdienstelijke en cirkelvormige longitudinale gladde spieren lagen, rond de myenteric plexus (ICC-MY). Deze cellen dienen als pacemaker cellen en het genereren van de elektrische activiteit bekend als langzame golven⁴⁶^,⁴⁷^,⁴⁸^,⁴⁹; II) ICC liggen ook onder een rijke in de terminals van motorische neuronen (diep gespierde plexus, aldus ICC-DMP) plexus. Deze cellen dienen als bemiddelaars van reacties op zuurbestendige motor transmissie³⁷^,³⁹^,⁴⁰^,⁵⁰. ICC-MY ICC-DMP zijn morfologisch verschillend en hun Ca^{2 +} signalering gedrag radicaal verschillen om hun specifieke taken. ICC-MY Notti in vorm en vormen een netwerk van onderling verbonden cellen via gap kruispunten⁵¹^,⁵². CA^{2 +} signalen in ICC-MY manifest als korte en ruimtelijk gelokaliseerde Ca^{2 +} release gebeurtenissen die zich voordoen op meerdere locaties asynchroon via het ICC-mijn netwerk als gevisualiseerde binnen een FOV (beeld met een 60 X doelstelling)³⁸. Deze asynchrone signalen worden geordend stoffelijk 1 seconde clusters die, wanneer samen tabelvorm, oplopen tot een netto 1 s cellulaire stijging van Ca^{2 +}. Deze signalen doorgeven aan-cel binnen het ICC-netwerk en daarom organiseren Ca^{2 +} signalering, gegenereerd op basis van sub cellulaire sites, in een weefsel breed Ca^{2 +} Golf. Temporele clustering en sommatie van Ca^{2 +} signalen in ICC-MY genoemd Ca^{2 +} voorbijgaande clusters (CTCs)³⁸. CTCs optreden ritmisch (bijvoorbeeld vrij gelijkaardig duur en soortgelijke periodes tussen CTCs) 30 perioden per minuut in de muis. Omgekeerd, ICC-DMP zijn spindel vormige cellen, sommige met secundaire processen, die verdelen tussen SMCs en spataderen zenuw processen en niet zelfstandig vormen een netwerk⁵¹^,⁵². ICC-DMP formulier kloof aansluitingen met SMCs, echter, en de functie binnen dit grotere syncytium, bekend als de SIP syncytium⁵³. CA^{2 +} signalen die zich voordoen op meerdere locaties langs de lengte van de cellen, maar deze transiënten niet entrained of stoffelijk geclusterd, zoals waargenomen in ICC-MY³⁷. CA^{2 +} signalen in ICC-DMP optreden op stochastische wijze, met variabele intensiteit, duur en ruimtelijke kenmerken. De protocollen hieronder, met behulp van het voorbeeld van Ca^{2 +} signalering in ICC-MY en ICC-DMP, technieken voor het analyseren van complexe signalering in specifieke soorten cellen in situ te beschrijven. We gebruikt het afleidbare Cre-Lox p systeem express GCaMP6f uitsluitend in ICC, na inducerende activering van Cre-Recombinase (Cre) gedreven door een specifieke promotor van ICC (Kit).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dieren die worden gebruikt en de protocollen die in deze studie uitgevoerd in overeenstemming waren met de nationale instituten van gezondheid gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Alle procedures werden goedgekeurd door het institutionele dier gebruik en Care Comité bij de University of Nevada in Reno.

1. generatie van KitGCaMP6f muizen

Cross Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f muizen) en c-Kit^{+/ Cre-ERT2} (Kit-Cre muizen) voor het genereren van ICC specifieke GCaMP6f waarin dieren (Kit-Cre-GCaMP6f muizen).
Opmerking: GCaMP6f werd gebruikt als gevolg van de gerapporteerde efficiëntie in de rapportage gelokaliseerd, signalen korte intracellulaire Ca^{2 +} ter plaatse en in vivo⁵⁴.
Injecteren Kit-Cre-GCaMP6f muizen met tamoxifen op leeftijd van 6-8 weken voor het opwekken van de activering van de Cre-Recombinase en daaropvolgende GCaMP6f expressie in ICC (Figuur 1).
1. Als u wilt maken de tamoxifen oplossing, los 80 mg van Tamoxifen (Zie Tabel van materialen) in 800 μL van ethanol (Zie Tabel van materialen) in een cuvet en vortex gedurende 20 minuten.
2. Voeg 3.2 mL saffloerolie die voor het maken van oplossingen van 20 mg/mL en bewerk vervolgens ultrasone trillingen ten gedurende 30 minuten vóór injectie (generiek).
3. Injecteren van muizen (intraperitoneale injectie; IP) met 0,1 mL van tamoxifen oplossing (2 mg tamoxifen) gedurende drie opeenvolgende dagen. GCaMP6f expressie door genotypering bevestigen en gebruik van muizen 10 dagen na de eerste injectie.
  1. Genotype muizen door een klein stukje van oor elk dier. Gebruik vervolgens de HotSHOT methode⁵⁵ voor genomic DNA isolatie door oor clips bij 95 ° C gedurende 60 min in 75 mL van de NaOH aan het broeden en vervolgens te neutraliseren door 75 mL van Tris buffer. Gebruik Standaardpcr om genotype van elk dier, 2 mL van DNA in een reactie van de 20 mL met GCaMP6f specifieke primers⁵⁶. 10 mL van het PCR-product worden uitgevoerd op een 2% agarose gel om wild type te bepalen (297 bp) en mutant (~ 450 bp) bands.

2. voorbereiding van weefsels van Ca^{2 +} Imaging

Anaesthetize muizen bij inademing met Isofluraan (4%, Zie Tabel van materialen) in een geventileerde kap en vervolgens offer door cervicale dislocatie.
Met behulp van scherpe schaar open de buik van muizen, verwijder de dunne darm en plaats in Krebs-Ringer bicarbonaat oplossing (KRB). Open de dunne darm langs de mesenterische grens en de inhoud van de intraluminale met KRB wegwassen. Met behulp van scherpe dissecties, het verwijderen van de mucosa en sub mucosa lagen.
Opmerking: KRB oplossing heeft de volgende samenstelling (in mM): 118.5 van NaCl, KCl 4.7, CaCl₂ 2.5, MgCl₂ 1.2, NaHCO₃ 23,8, KH₂PO₄ 1.2, dextrose 11.0. Deze oplossing heeft een pH van 7,4 bij 37 ° C wanneer borrelen aan evenwicht met 95% O₂- 5% CO₂.
Met behulp van kleine pinnen, pin het weefsel van de dunne darm aan de basis van een 5 mL, 60 mm diameter Sylgard beklede schotel met de circulaire vlotte spier laag naar boven. Perfuse van het preparaat met verwarmde KRB oplossing bij 37 ° C gedurende een periode van evenwichtsinstelling van 1 uur voor experimenten.
Na deze periode van evenwichtsinstelling, voeren in situ Ca^{2 +} beeldvorming van kleine intestinale ICC-MY en ICC-DMP met behulp van de confocal microscopie (de beelden in dit protocol werden verkregen met een confocal microscoop voorzien van een draaiende-disc). Vanwege de voordelen van GECIs zoals hierboven beschreven, gebruik time-lapse resolutieafbeeldingen (> 30 frames per seconde, FPS) gecombineerd met hoog vermogen te verwerven van films van dynamische Ca^{2 +} signalen in ICC doelstellingen (60-100 x).
Opmerking: Verklein weefsel verkeer en toepassing nicardipine (0.1-1 μM) tijdens opnames zoals eerder beschreven³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹.
Onderscheiden ICC-MY en ICC-DMP in de dunne darm met behulp van hun verschillende anatomische locatie, de morfologie en de basale Ca^{2 +} activiteit patronen.
1. Zoek ICC-MY op het niveau van de myenteric plexus, tussen de lagen van de verdienstelijke en cirkelvormige longitudinale gladde spieren van de dunne darm. Ze zijn Notti gevormd, vorming van een aangesloten netwerk (figuur 3A). CTCs (zie hierboven) worden doorgegeven via het netwerk van ICC-MY met een gewone gebeurtenis van ~ 30 cycli per min.
2. Zoek omgekeerd, ICC-DMP in een enkel vliegtuig op het niveau van de diepe spieren plexus, tussen de circulaire vlotte spier laag en de submucosal plexus. ICC-DMP doen geen uitmaken van een netwerk en spindel vormige cellen (figuur 2A) die geen regelmatige teeltmateriaal gebeurtenissen vertonen en in plaats daarvan vuur stochastische, gelokaliseerde intracellulaire Ca^{2 +} transiënten.
Ongeacht de acquisitie software gebruikt, sla op films als een stapel van TIFF-afbeeldingen.

3. analyse van stochastische Ca^{2 +} signalen in ICC-DMP gebruik Spatio-temporele toewijzing (STM)

Analyseren van ICC-DMP spatio-temporele toewijzing met een combinatie van ImageJ software (NIH, USA, gratis te downloaden op http://imagej.nih.jov/ij) en software op maat gemaakt (volumetrie, versie G8d, GWH, bedienbaar op Mac OS, neem dan contact op met Grant Hennig grant.hennig@ med.uvm.edu met betrekking tot vraagt voor volumetrie toegang en gebruik)
Opmerking: Een alternatieve aanpak volledig analyseren deze spatio-temporele kaarten met ImageJ alleen vindt u ook in latere secties (beginnend bij stap 3.9).
Open volumetrie en rechter muisknop te klikken kunt u mappen met filmbestanden openen. Klik met de linkermuisknop op het filmbestand te worden geanalyseerd om deze te openen in volumetrie (moet in ongecomprimeerde TIFF-indeling). Eenmaal geopend, zal de film worden opgenomen binnen een grenst aan de blauwe venster (film venster) die een groot gebied van het rechter scherm zal omvatten. De linkerkant van het scherm bevat het Plot venster (bovenste 4/5) en het venster sporen (lagere 1/5^th).
De afmetingen van de film aanpassen door SHIFT ingedrukt te houden en tegelijkertijd omhoog scrollen met de middelste muisknop (MMB, verkleint) of scrollen naar beneden met de MMB (groter). Starten of stoppen door te drukken op "A"; de snelheid van afspelen kan worden aangepast door de op en neer pijltoetsen.
Als u wilt maken een STM met behulp van volumetrie, teken een ROI over een hele cel door SHIFT ingedrukt te houden tijdens het klikken en slepen de linker mouse button. Pas de richting van de ROI door te scrollen met de MMB in de hoeken van de ROI. Wanneer de ROI is op zijn plaats over de cel die moet worden geanalyseerd (figuur 2A), gebruik rechts klikken in het venster film tot ' ROI stm-STMyAvg > xRow' en klik met de linkermuisknop om te maken een STM van de activiteit van de cel in het venster Plot (er is ook een optie om te selecteren "STMxAvg > yRo w ", waarvan één is geselecteerd zal afhangen of de afdrukstand van de cel wordt meer uitgelijnd met de x of y-as, bijvoorbeeld de cel gemarkeerd figuur 2A is meer gericht op de y-as").
Klik met de linkermuisknop op de STM in het Plot venster en druk op 'P' aftrekken gemiddelde achtergrondgeluiden en druk op "H" te verhogen van het contrast van de STM. Sla de STM door rechts te klikken op het tot "STM Load opslaan - Sla STM als .tif" en dan links te klikken als u wilt opslaan als een TIFF-bestand.
De rest van de analyse van de ICC-DMP zal worden uitgevoerd in ImageJ. ImageJ bestaat uit twee hoofdonderdelen, een werkbalk met een vaste positie op de bovenkant van de monitor en een mobiel gebruikersinterface. Met behulp van ImageJ, open het STM TIFF bestand van ICC-DMP Ca^{2 +} activiteit (bestand-openen op de werkbalk Afbeelding J).
Open de volumetrie gemaakt STM, die zal wegens tijdgebrek verticaal georiënteerd. ImageJ zal automatisch openen van TIFF-bestanden als RGB- of 16-bits afbeeldingen. Om beeldkwaliteit te verbeteren, klik met de linkermuisknop 'Beeld' in de knoppenbalk ImageJ. Scroll op de eerste optie ' Typ 'te onthullen een drop-down menu van verschillende beeldformaten, scroll over ' 32-bits' en klik met de linkermuisknop als u wilt wijzigen.
De STM om leesbaar te maken tegen de tijd van links naar rechts, klik met de linkermuisknop op de werkbalk ImageJ op het volgende pad: 'Image-transformatie-90 graden linksom'. Het is ook mogelijk te maken van de STM's voor in situ Ca^{2 +} activiteit linescans met ImageJ alleen zonder volumetrie en dit is hieronder.
Opmerking: Zodra de STM's zijn gemaakt, worden ze geanalyseerd op dezelfde wijze ongeacht welke software werd gebruikt voor het genereren van hen. Als wilt overslaan deze alternatieve methode voor het maken van de STM's in ImageJ, wip voor trede 3.19.
Als wilt maken STM's met ImageJ, opent u de stapel van TIFF-bestanden die deel van de opname van ICC-DMP Ca^{2 +} activiteit (bestand-openen op de werkbalk ImageJ uitmaken). ImageJ zal automatisch openen van TIFF-bestanden als RGB- of 16-bits afbeeldingen. Om beeldkwaliteit te verbeteren, klik met de linkermuisknop 'Beeld' in de knoppenbalk ImageJ. Scroll op de eerste optie ' Typ 'te onthullen een drop-down menu van verschillende beeldformaten, scroll over ' 32-bits' en klik met de linkermuisknop als u wilt wijzigen.
Achtergrondgeluiden (als gevolg van auto-fluorescentie- of camera ruis) moet nu worden afgetrokken van de film. Klik met de linkermuisknop de 'Rechthoekige selectie' functie in de interface ImageJ en trekken een ROI (door links te klikken en te slepen naar de gewenste grootte en vorm) over de fluorescentie van de achtergrond van de film.
Na het selecteren van de ROI, klik links op 'Analyseren' in de knoppenbalk ImageJ en klik links op 'Histogram' van het resulterende dropdownmenu. Vervolgens verschijnt een pop-upvenster onderzoekende over bereik van pixelwaarden te berekenen; ImageJ heeft de waarden van de ROI voorgeselecteerde dus linker klik op 'OK'.
Na het klikken op 'OK', verschijnt een nieuwe pop-upvenster met een histogram waarin de verdeling van de waarden voor het lawaai van de pixel van de achtergrond binnen de ROI. Neem nota van de gemiddelde waarde in de lijst onder het histogram en sluit vervolgens het pop-up bericht.
Klik op terug naar de 32-bits-film en selecteer de gehele FOV door links te klikken op 'Bewerken' op de werkbalk ImageJ schuiven naar 'Selectie' en links te klikken op 'Alles selecteren' van het geopenbaarde dropdownmenu.
Klik met de linkermuisknop 'Proces' op de werkbalk ImageJ, ga naar 'Wiskunde' en klik met de linkermuisknop 'Aftrekken' van het geopenbaarde dropdownmenu.
Een pop-upvenster weergegeven waarin een waarde moet worden afgetrokken van de FOV kan worden ingevoegd. Voer de gemiddelde waarde die verkregen van het histogram in stap 3.12 hierboven en klik op 'OK'. ImageJ zal dan vragen voor het verwerken van alle frames in de TIFF-stack (en niet alleen de één frame de film is momenteel op). Klik op 'Ja'.
Na het klikken op 'Ja', zal de film zwart. Om dit te corrigeren, klik met de linkermuisknop 'Beeld' in de ImageJ werkbalk en ga over 'Aanpassen'. Klik met de linkermuisknop op de geopenbaarde eerste optie voor 'Helderheid/Contrast' (B & C). Dit zal een pop omhooggaande doos waar verschillende aspecten van helderheid en contrast kunnen worden gewijzigd. Klik met de linkermuisknop op de optie 'Automatisch' eens te onthullen van de verhoogde kwaliteit in de film. Deze B & C pop omhoog verlaten vak open voor toekomstig gebruik.
Als u wilt een linescan maken, eerst Klik met de rechtermuisknop op het lijngereedschap in de ImageJ interface te onthullen van opties voor verschillende lijnen; Klik met de linkermuisknop op "gesegmenteerde lijn' te kiezen uit de lijst. Met de 'Gesegmenteerde lijn' gereedschap is geselecteerd, muisklikken gebruik één links om een lijn langs de mid as van een individuele ICC-DMP te tekenen. Elke linker muisklik zal vaststellen dat bepaalde punt de lijn en de lijn vervolgens vrij verrijdbaar verder onder elke gewenste hoek. Als de lijn is voltooid, dubbel klik met de linkermuisknop om te herstellen van de lijn in plaats.
Klik met de linkermuisknop 'Beeld' op de ImageJ werkbalk en scroll over 'Stacks' en klik met de linkermuisknop op de optie 'Reslice'. Een pop-upvenster wordt weergegeven; Klik met de linkermuisknop op de optie '90 graden draaien', dit zal de linescan van links naar rechts oriënteren, zodat het kan worden gekalibreerd en tegen de klok op de x-as, met de ruimte op de y-as lezen. Klik op 'OK' om het maken van de STM.
De intensiteit van de STM zal worden gemaakt op een grijswaarden met hoge intensiteit Ca^{2 +} signalen weergegeven als wisselend van wit, uit wit of licht grijs afhankelijk van hun intensiteit. Normaal gesproken zal het contrast van de gemaakte linescan moeten worden verbeterd. Doe dit door te klikken op 'Auto' op de B & C knal opwaarts vogelhuisje.
De intensiteit van de fluorescentie van de linescan wordt gepresenteerd op de STM in willekeurig pixelwaarden. Om nauwkeurige meting van de amplitude van Ca moeten^{2 +} signalen van de STM, de waarden van de fluorescentie van de STM (F) nu worden genormaliseerd. Met de 'Rechthoekige selectie' functie in de interface ImageJ, tekenen een ROI op een oppervlakte van de STM waarin het meest uniform en minste intense gebied van fluorescentie (F₀).
Herhaal de stappen genomen in 3.11-3.12 om een gemiddelde waarde (F₀) te verkrijgen van de intensiteit binnen de geselecteerde ROI en selecteer vervolgens de gehele STM door links te klikken op 'Edit-selectie-Select All' vanaf de werkbalk ImageJ.
Klik met de linkermuisknop 'Proces' op de ImageJ werkbalk en ga naar 'Wiskunde'; Klik met de linkermuisknop 'Verdelen' van de geopenbaarde opties. In de daaropvolgende popup doos, voert u de gemiddelde waarde (F₀) stap 3,21 verkregen. Op de gehele STM delen door (F,₀) zal de STM zwart; Corrigeer dit door te klikken op 'Auto' op de B & C pop omhooggaand vak. De linescan is nu gekalibreerd voor amplitude, met de intensiteit van de fluorescentie uitgedrukt als F/F₀.
De STM verschijnt op dit moment het aantal frames in de TIFF-stack op de x-as en het aantal pixels dat de lengte van de cel op de y-as vertegenwoordigt. Kalibreer de STM voor ruimte en tijd om te kwantificeren temporele en ruimtelijke informatie van Ca^{2 +} signalen. Klik met de linkermuisknop 'Beeld' in de knoppenbalk ImageJ en klik met de linkermuisknop 'Eigenschappen'. Een pop-upvenster wordt weergegeven. Binnen dit venster typt u de gewenste waarden als u wilt volledig het kalibreren van de STM.
Voor 'pixelbreedte', geef de lengte van de tijd die nodig is om vast te leggen van één frame in seconden. Voor voorbeelden, op 5 FPS, een waarde opgeven van 0,2, voor 50 FPS voert u een waarde van 0.02, voor 33 FPS een waarde invoert van 0.033 enz. Voor 'Pixel hoogte', voert u hoeveel micron elke pixel vertegenwoordigt (zal afhangen van het doel gebruikt en de camera gebruikt voor acquisitie). 'Voxel diepte' wordt overgelaten aan 1 voordat u klikt op 'OK'. Geen andere parameters moeten worden aangepast in het venster.
Opmerking: Na het klikken op 'OK', zal de STM volledig worden gekalibreerd voor amplitude, ruimte en tijd. Amplitude van de STM zal worden uitgedrukt als F/F_0,tijd op de x-as zal worden uitgedrukt in seconden en ruimte op de y-as zal worden uitgedrukt in micrometer (figuur 2B). CA^{2 +} evenementen op de STM zijn nu klaar om te worden gemeten, de geijkte STM kan ook worden opgeslagen als een enkele TIFF-afbeelding te analyseren op een later tijdstip.
ImageJ heeft een aantal gebouwd in kleur gecodeerde opzoektabel (LUTs) die kan worden gebruikt voor de kleur code van de STM. Een ingebouwde LUT toepassen door links te klikken op de werkbalk ImageJ op het pad 'Image-opzoektabellen' en kies een LUT toe te passen. Op maat gemaakte LUTs kan ook worden geïmporteerd in de STM door links te klikken op de werkbalk ImageJ op het pad 'Bestand-Import-LUT' en selecteert u de LUT te importeren. Bijvoorbeeld heeft de STM weergegeven in figuur 2C de aangepaste LUT 'QUBPallete' (Queens University Belfast, UK) toegepast op, op code warme kleuren (rood, oranje) gehad als gebieden van intense Ca^{2 +} fluorescentie en koude kleuren (zwart, blauw) als gebieden voor lage Ca^{2 +}fluorescentie.
Als u wilt invoegen een amplitude kalibratiebalk om aan te geven van het aantal amplitudes vertegenwoordigd door de verschillende kleuren, klik met de linkermuisknop 'Analyseren' van de werkbalk ImageJ Ga naar 'Tools' en selecteer 'Kalibratie Bar' in de geopenbaarde menu. Opties worden gegeven voor de grootte, zoom, bereik en positie op de STM voor de kalibratie bar; deze instellingen naar wens aanpassen en klik op 'OK'. Merk op dat wanneer de kalibratiebalk wordt ingevoegd, ImageJ een nieuwe STM bevatten creëert, zodat de oorspronkelijke versie zonder de kalibratiebalk intact en aparte.
Opmerking: Als de 'Overlay' is aangevinkt bij het invoegen van de kalibratie-bar, zal een nieuwe STM niet worden gegenereerd.
Om te beginnen analyseren van individuele Ca^{2 +} evenementen, klik met de linkermuisknop op de selector 'Rechte lijn' op de ImageJ interface. Trekken door aanvankelijk links te klikken op de STM, een rechte horizontale lijn door het midden van een Ca^{2 +} evenement evenwijdig aan de x-as (tegen de klok). Voltooi de lijn door links te klikken voor een tweede keer (figuur 2D).
Klik op 'Analyseren' op de ImageJ-werkbalk en klik met de linkermuisknop op 'Plot profiel'. Een nieuwe box zal verschijnen met het profiel van de plot van de Ca^{2 +} gebeurtenis (figuur 2E).
Opmerking: De optie 'Lijst' binnen dit vak zal het genereren van een lijst van XY waarden van de gegenereerde plot, die kan worden gekopieerd naar een spreadsheetprogramma sporen maken indien gewenst.
Voor het meten van de amplitude van de Ca^{2 +} evenement vertegenwoordigd in het perceel profiel, klik met de linkermuisknop op de selector 'Rechte lijn' op de ImageJ interface. Vervolgens, vestigen op een verticale lijn vanaf de basislijn van het perceel profiel het hoogtepunt van de Ca^{2 +} gebeurtenis; de lengte van de lijn (afgebeeld op de ImageJ interface) vertegenwoordigen de amplitude van de gebeurtenis uitgedrukt als ΔF/F₀ (figuur 2E).
Met behulp van de waarde van de verworven amplitude, de duur van de Ca^{2 +} gebeurtenis kan worden gemeten door een rechte streep over de volledige breedte van het evenement op het punt van 50% maximale amplitude (volledige duur bij halve maximale amplitude, FDHM) of de volledige duur van het evenement kan worden gemeten indien gewenst (2E figuur).
Opmerking: Onderzoekers zullen moeten ontwerpen specifiek criterium voor drempelmethode geldige Ca^{2 +} gebeurtenissen in deze opnames. In onze experimenten, Ca^{2 +} evenementen werden aangewezen als geldig voor analyse als zijn amplitude was > 15% van de maximale amplitude event in de sectie van de controle van de opname. Echter, deze drempels zal afhangen van de specifieke weefsels en cellen onder studie en zijn alleen willekeurige richtlijnen waarvoor specifieke optimalisatie voor elk type van weefsels en cellen.
Door het tekenen van een lijn langs de ophaal- of neerhaal van de Ca^{2 +} gebeurtenis perceel profiel, kan het tempo van de prijsstijging of -daling dienovereenkomstig worden berekend. Nadat de lijn is getekend, kan de muiscursor worden verplaatst naar het punt waar de lijn begint en waar eindigt. Wanneer de cursor zich stationaire over deze punten, x, y-coördinaten voor deze locatie wordt getoond in de lagere linkerzijde van de ImageJ interface. Dus, door het verwerven van x, y-waarden voor waar de lijn begint (x₁, y₁) en eindigt (x₂, y₂), het tempo van de prijsstijging of -daling (ΔF/s) kan worden berekend als de helling van de lijn, y₂- y₁ / x₂- x₁ (figuur 2F ).
Om de propagatie of de ruimtelijke verspreiding van een Ca^{2 +} evenement berekenen, klik met de linkermuisknop op de selector 'Rechte lijn' op de ImageJ interface. Vervolgens, tekent u een rechte verticale lijn dwars op de lengterichting van de Ca^{2 +} evenement langs de y-as. De lengte van de lijn (afgebeeld op de ImageJ interface) vertegenwoordigen de ruimtelijke verspreiding van de gebeurtenis uitgedrukt als μm (Figuur 2 g).
De snelheid van een teeltmateriaal Ca^{2 +} evenement bepalen door een streep langs de teeltmateriaal voorkant van het evenement en de berekening van de helling van de lijn. Dit kan handmatig worden uitgevoerd op een vergelijkbare manier beschreven in stap 3.32, door bepaling van x, y-waarden voor waar de lijn begint (x₁, y₁) en eindigt (x₂, y₂); deze waarden wordt getoond in de lagere linkerzijde van de ImageJ interface als de muiscursor op de STM ligt.
Bij de inzameling van de gewenste parameters voor Ca^{2 +} gebeurtenis kwantificering, bundelen deze gemiddelde waarden voor het genereren van de gemiddelde waarden voor elke parameter op basis van het per cel; u kunt ook plaats alle ruwe waarden in een histogram van de distributie om te laten zien van hun verspreidingsgebied (Figuur 2 H).

4. kwantificering van CTCs in ICC-mijn met behulp van deeltje gebaseerde analyse

Voordat het analyseren van films in volumetrie met PTCLs, moet de ruimtelijke en temporele kalibratie van de film in naam van het bestand moet worden ingevoegd. Bewerken alle bestanden om te worden geanalyseerd in volumetrie bevatten in de titel het aantal seconden dat elk frame is gelijk aan en ook het aantal micron die overeenkomt met elke pixel gescheiden door een enkel streepje, met de waarden die zijn ingekapseld in vierkante haken. Bijvoorbeeld, een film die verworven bij 33 FPS met een 60 x doelstelling (512 x 512) [0.22-0.033] moet hebben ingevoegd in de bestandsnaam.
Open volumetrie en rechter muisknop te klikken kunt u mappen met filmbestanden openen. Klik met de linkermuisknop op het filmbestand te worden geanalyseerd om deze te openen in volumetrie (figuur 3A, moet in ongecomprimeerde TIFF-indeling).
Om Ca^{2 +} signalen van de gehele FOV precies kunnen worden berekend, zal de film eerst ondergaan differentiatie en vloeiend maken om te verwijderen van de achtergrond interferentie (camera lawaai, auto fluorescentie etc.) en verhogen de signaal / ruisverhouding. In het venster van de film, klik met de rechtermuisknop aan omhoog een menu brengen en met behulp van rechts klikken toegang "STK Filter-differentiëren", klik met de rechtermuisknop om een invoerwaarde te differentiëren, druk op ENTER en klik met de linkermuisknop om toe te passen (voor films bij 33 FPS een waarde van 2 verworven (∆t = ± 66-70 msec) werkt goed, de waarde wordt verhoogd als de koers van de verhogingen van de opname van de afbeelding).
Opmerking: Differentiatie in dit verband zal het verminderen van de intensiteit van de gebieden van opname (pixels) die geen dynamische activiteit Toon over het aantal frames opgegeven. Dus, als een waarde van '2' is ingevoegd, elke pixel in elk frame van de opname wordt geanalyseerd en als in dat kader is er geen dynamische verandering in pixel fluorescentie 1 frame vóór en 1 frame na, de intensiteit van de pixels zullen worden afgetrokken van de opname. Dus, niet-dynamische achtergrondgeluiden wordt verwijderd en signaal aan lawaai wordt verhoogd.
Vlotte de gedifferentieerde film door een Gaussiaans filter toe te passen. Klik met de rechtermuisknop in het venster film naar omhoog een menu brengen en rechts klikken access 'STK Filter-Gauss KRNL' gebruikt, klik met de rechtermuisknop opnieuw als u wilt invoegen een waarde (altijd gebruik maken van een oneven nummer, voor films verworven bij 33 FPS, een waarde van 5 werkt goed, 1.5 x 1,5 µm StdDev 1.0) een invoerwaarde, drukt u op ENTER en klik met de linkermuisknop om toe te passen (figuur 3B).
Beginnen met het maken van PTCLs door eerst te selecteren van een periode van de film waarin een rustige periode (20-40 frames), gevolgd door het optreden van een CTC en ook 20 – 40 frames na de CTC. Om dit te doen, blader door de film met behulp van de MMB schuiven van links naar rechts op de gele balk.
Met de selectie gemaakt, klikken gebruik rechts in het venster film voor toegang tot 'STK Ops-oprit DS PTCLinfo' en klik met de linkermuisknop om toe te passen. Deze functie loopt een PTCL analyse routine die geleidelijk de drempel van maximale intensiteit aan minimale intensiteit hellingen. Dit zal worden grafisch weergegeven in het venster van de Plot als een complot van lawaai en ook in het venster van de sporen als drie gekleurde sporen, met het groene spoor met het nummer van de PTCLs, de rode trace gemiddelde PTCL grootte tonen, en de blauwe trace tonen de absolute intensiteit drempel.
Opmerking: Het aantal en gemiddelde grootte van PTCLs bij elke drempel wordt automatisch berekend en vervolgens een semi-hand drempelwaarde wordt toegepast met behulp van de intensiteit waarmee op die de gemiddelde grootte van PTCLs begint te dalen, die optreedt bij het omslagpunt van het rode spoor in het venster Trace (figuur 3D, d.w.z. toe te schrijven aan de grote aantallen van ruimtelijk beperkte lawaai PTCLs vermindering van de gemiddelde grootte van PTCLs).
Binnen het venster van de Plot, druk op "H" histogram evenwicht de plot getoond van PTCL lawaai. Cyclus door kleurenschema's door op te drukken ' [' totdat de achtergrond wit gekleurd met gekleurde sporen op de top is.
Druk op 'F' opvoeden een meetinstrument en klik met de linkermuisknop op het perceel aan de kruising waar de gekleurde percelen verschuiven naar de rechterkant. Dit zal een enkele verticale lijn in de schuifbalk van het venster sporen daaronder markeren.
In het venster Trace MMB links naar rechts schuiven om uit het omslagpunt van het rode spoor totdat de gemarkeerde witte verticale lijn in stap 4.10 gemaakt en ervoor te zorgen dat de blauwe trace is geselecteerd door rechts te klikken op het, de 'yAVG' die zal worden weergegeven in t afgelezen Hij verlaagt de linker kant van het venster van de sporen. Hef de selectie van de selectie door de MMB te drukken in het venster van de sporen.
Binnen het venster van de film, druk op 'C' om een kleurenwiel, dan pers zou ' drempel aanpassen. Geldig PTCLs wordt nu getoond als rood weergegeven in het venster film (Figuur 3 c) en die verzadigd zal wit worden. Verwijder de witte gebieden door omhoog te scrollen met de linker muisknop.
Omhoog of omlaag schuiven met de MMB aanpassen van de gele numerieke waarde in het kleurenwiel, deze waarde naar de waarde van de yAVG genomen vanaf stap 4.11 aanpassen. Dit zal alles in het rood als een actieve Ca^{2 +} toewijzen voorbijgaande PTCL op het punt van de vastgestelde drempel. Om dit als een coördinaat gebaseerde deeltje-bestand opslaat, gebruik rechts klikken op toegang ' STK 3D-Save PTCLS 0' en vervolgens links klikt u op als het bestand wilt opslaan.
Volumetrie sluit en opnieuw opent. Open de PTCL bestand (.gpf) gemaakt in stap 4.13. In dit bestandstype, worden alle actieve Ca^{2 +} transiënten opgeslagen als een uniforme blauwe PTCL (figuur 3E). Zoals elke PTCL een afzonderlijke entiteit met een eigen ID, gebied en omtrek coördinaten, staat vlaggen (zie hieronder) en resultaat arrays is, wordt de analyse van de spatio-temporele karakteristieken van PTCLs, of tussen PTCLs gestroomlijnd.
Om te beginnen PTCLs analyse, geen resterende PTCL geluid (kleine ongeldige PTCLs gemaakt wanneer het bestand .gpf wordt gegenereerd) te verwijderen met behulp van rechts klikken in het venster film tot ' PTCL STKOPS-vlag ptcls > Min = 70' en klik met de linkermuisknop om toe te passen. Deze actie zal PTCLs groter dan 6 µm² vlag (~ diameter > 2µm) en volumetrie aan 'Vlag 1' selectie zal toewijzen. Wanneer dit voltooid is, verschijnt PTCLs die boven deze drempel (vlag 1) als een licht paarse kleur in het venster film, overwegende dat elke PTCLs drempel hun blauwe basiskleur (figuur 3F blijft).
Warmte kaart representaties van PTCL activiteit maken met behulp van rechts klikken in het venster film tot ' PTCL STKops-StatMap vlag ='. Door rechts te klikken op deze laatste weg, kan de toewijzing van een vlag te analyseren worden ingevoerd. Dus als die wensen te kwantificeren van de PTCLs toegewezen aan Markering1, voer '1', druk op ENTER en klik vervolgens op links om toe te passen. Hierdoor genereert u een warmte-kaart toont de totale PTCLs voor de gehele lengte van de opname, met verschillende kleuren vertegenwoordigen kost (%) in het hele van de opname (Figuur 3 g, warme kleuren geven aan verhoogde aanwezigheid op die locatie).
Warmte plattegronden opslaan door rechts te klikken op hen toegang tot "STM Load opslaan - Sla STM als .tif" en dan links te klikken als u wilt opslaan als een TIFF-bestand.
PTCL activiteit met behulp van rechts klikken in het venster film tot kwantificeren ' PTCL maatregel-PTCLStats STK =', door rechts te klikken op deze laatste weg, de toewijzing van een vlag te analyseren kan worden ingevoerd. Dus als die wensen te kwantificeren van de PTCLs toegewezen aan Markering1, voer '1', druk op ENTER en klik vervolgens op links om toe te passen. Hierdoor genereert u een reeks van sporen in het spoor-venster.
Volumetrie zal standaard de sporen van de PTCL gegenereerd in stap 4.17 bovenop elkaar gelegd. Scheiden met behulp van rechts klikken in het venster van de Trace om toegang te 'Uitlijnen-aparte Trace' en klik met de linkermuisknop om toe te passen. Dit zal onthullen de vier verschillende PTCL sporen die kwantificeren van de Ca^{2 +} PTCL activiteit in de film tonen PTCL gebied (groen), PTCL graaf (rood), PTCL grootte (cyaan) en PTCL grootte standaarddeviatie (blauw) tegen de tijd (Figuur 3 H uitgezet).
Deze sporen kunnen worden opgeslagen als een tekstbestand dat kan worden geïmporteerd in een spreadsheet-programma voor verdere analyse. Als u wilt opslaan van sporen, houdt u SHIFT ingedrukt en gebruik klikken rechts in het venster van de Trace om toegang te 'Assorted-Dump ROI als tekst' en klik met de linkermuisknop om het bestand te slaan. Deze informatie wordt vervolgens verzameld en geïllustreerd in histogrammen of andere geschikte grafische voorstellingen (Figuur 3 H).
Om te kijken naar het eerste exemplaar van PTCLs (dat wil zeggen, om te kijken naar sites vuren), krijgen deze eerste PTCLs de toewijzing van een andere vlag kiest. Aan betere isolaat afvuren van sites die zich voordoen binnen het netwerk, alleen deze PTCLs die niet met eventuele deeltjes in de vorige frame maar overlapping met deeltjes in de volgende 70 ms overlappen deed worden beschouwd als afvuren van sites.
Voor de toepassing van deze drempel, gebruik rechts klikken in het venster van de film tot ' PTCL gedrag-F1 InitSites > F = 3' en links klik om toe te passen. Dit zal toewijzen met het initiëren van PTCLs als 'Vlag 3', en PTCLs die aan deze criteria voldoen worden nu weergegeven als een lime groene kleur in de film (figuur 4A).
Volumetrie biedt ook de mogelijkheid om te kwantificeren en het aantal PTCL explosieruimte in een bepaalde FOV, alsmede het plotten van hun kans op afvuren tijdens een CTC uitzetten. Om deze parameters te analyseren, maakt u een warmte-kaart voor het inleiden van PTCLs (vlag 3), zoals beschreven in stap 4.16 (figuur 4B).
Klik met de linkermuisknop in het venster uitzetten en vervolgens druk op 'C' om een kleurenwiel en druk op zou ' drempel. De warmte-kaart voor het inleiden van de PTCLs zal dan beurt grijs en wit. Verwijder alle witte door te bladeren omhoog met de linker muisknop en de drempel voor de PTCLs in de warmte-kaart zodat alleen geldige PTCLs zijn bekleed met grijs (drempel aanpassen door op en neer te scrollen met de MMB).
Gebruik klikken rechts over de warmte kaart in het Plot venster voor toegang tot 'STM PTCLs-Find PTCLs 70' en klik met de linkermuisknop om toe te passen. Dit zal toewijzen alle grijze PTCLs in de kaart die groter zijn dan 70 pixels² in grootte toe te wijzen als een aparte kleurcode-initiatie PTCL of PTCL afvuren site (figuur 4C).
De activiteit van elk van deze explosieruimte tegen de tijd uitzetten door rechts te klikken op de PTCL vuren kaart en toegang tot "STM PTCLs-Maak PTCL rois" en links te klikken om toe te passen. Hierdoor genereert u een nieuwe afbeelding in het venster film met alle de afzonderlijke gekleurde PTCL afvuren van sites die worden weergegeven met een ROI om hen heen.
Gebruik rechts klikken in het venster film tot ' PTCL maatregel-PTCLpixROIBM > = 1' en klik met de linkermuisknop om toe te passen. Dit zal het identificeren van alle ROIs in het venster film die bevatten ten minste één PTCL en alle activiteit binnen deze ROIs in het venster sporen zal uitzetten. Standaard zullen deze sporen worden bovenop elkaar. Als u wilt scheiden, klikken gebruik rechts in het venster van de Trace om toegang te 'Uitlijnen-aparte Trace' en klik met de linkermuisknop om toe te passen. Als u wilt opslaan van sporen, houdt u SHIFT ingedrukt en gebruik klikken rechts in het venster van de Trace om toegang te 'Assorted-Dump ROI als tekst' en klik met de linkermuisknop om het bestand te slaan.
De activiteit van elke site afvuren kan ook worden uitgezet als een voorval kaart. Om dit te doen, gebruik rechts klikken in het venster film tot ' PTCL maatregel-ROI Pianola = 10' en klik met de linkermuisknop om toe te passen. Hierdoor genereert u een perceel van alle sites van de bakken tegen de klok in het venster van de Plot. Elke vuren-site wordt weergegeven als een apart gekleurde entiteit, elk in zijn eigen 'baan' en deze percelen komen overeen met Ca^{2 +} PTCLs initiëren tijdens CTCs (Figuur 4 dE) opslaan deze gebeurtenis kaarten door rechts te klikken op hen om toegang te ' STM Load opslaan - Sla STM als .tif "en dan links te klikken als u wilt opslaan als een TIFF-bestand.
Om te kwantificeren van de waarschijnlijkheid van vuren op elke site afvuren tijdens een CTC, gebruik rechts klikken in het venster film tot ' PTCL gedrag-Mark IS = 1' en klik met de linkermuisknop om toe te passen. Dit zal alle frames in de film waarin PTCLs boven de drempel te identificeren en deze zal worden gemarkeerd in de bodem van het venster film als verticale blauwe lijnen.
CTCs manifesteren als snelle clustering van asynchrone afvuren van meerdere explosieruimte binnen de FOV met ~ 1 s hiaten tussen elke cyclus van de CTC. Deze regelmaat en lange kloof van geen actieve PTCLs tussen CTCs wordt gebruikt om een CTC p.a. nader te definiëren.
Gebruik rechts klikken in het venster film tot ' Gap PTCL gedrag-Block IS < =', en gebruik een klik met de rechtermuisknop op het laatste punt een nummer in te voeren. Deze opdracht zal het groeperen van de actieve PTCL frames die geïdentificeerd in stap 4.28 in blokken en blokken zijn gebaseerd op het aantal frames dat scheiden van actieve PTCLs. Voor opnames van 33 FPS bijvoorbeeld werkt een waarde van 10 het goed. Als actieve PTCLS minder dan 10 frames uit elkaar zijn (330 ms) zijn ze gegroepeerd in één blok p.a. (de blokken worden dan weergegeven als roze rechthoeken over de verticale blauwe lijnen aan de onderkant van het venster van de film, met elke roze rechthoek die nu aangeeft een CTC).
Gebruik klikken rechts in het venster film tot 'PTCL maatregel-PTCL gebeurtenis Prob'. Dit genereert een tekstbestand dat kan worden geïmporteerd in een spreadsheetprogramma. Dit tekstbestand geeft een enorme hoeveelheid gegevens over de aard van de initiatie-sites die van trappen 4.16 – 4.23 en hun bijdrage aan CTCs zijn gedefinieerd.
Opmerking: Het tekstbestand dat verschijnt het aantal initiatie sites (hierna aangeduid als 'domeinen'), de grootte van de site in pixels en μm², waarschijnlijkheid van elke Inleiding site afvuren van ofwel één keer of meerdere keren tijdens elke CTC (gegeven als een %), de gemiddelde duur en de grootte van PTCLs die zich op die site inleiding, het aantal CTC cycli (als omschreven in stap 4.23) en het percentage van explosieruimte dat afgevuurd tijdens elke cyclus van de CTC. Deze informatie wordt verzameld en geïllustreerd in histogrammen of andere geschikte grafische voorstellingen (figuur 4F).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Met behulp van Kit-Cre-GCaMP6F muizen (Figuur 1), dynamische Ca^{2 +} signalering gedrag van ICC in het maag-darmkanaal kunnen ter plaatse worden beeld. Met confocale microscopie, kunnen resolutieafbeeldingen van specifieke populaties van ICC worden verworven zonder besmetten signalen van andere populaties van ICC binnen de dezelfde weefsel maar in anatomisch verschillende vliegtuigen van focus (figuur 2A)³⁷ ^, ³⁹ ^, ⁴⁰ ^, ⁴¹. het is mogelijk om zowel korte (< 100 ms), Ca^{2 +} evenementen die niet mogelijk is met de membraan doorlaatbaar Ca^{2 +} indicatoren waren gelokaliseerd. Spatio-temporele mapping met volumetrie of ImageJ software kan worden gebruikt voor het genereren van de STM's van Ca^{2 +} Afin binnen cellen in situ. Met behulp van deze aanpak, Ca^{2 +} gebeurtenissen in een hele FOV kunnen worden gevisualiseerd en toegewezen (figuur 2BC), in plaats van alleen het opnemen van de beperkte activiteit van een enkele ROI. Deze methoden kunnen worden uitgebreid tot elke cel binnen een bepaalde FOV, zorgen voor representatieve gegevens verzamelen uit alle cellen en verstrekken van kwantitatieve informatie over relatieve amplitudes, voorbijgaande duur, het groeitempo van de opkomst en val van transiënten, etc. (figuur 2E , F). STM analyse, in tegenstelling tot ROI gebaseerde intensiteit percelen, bieden ook de mogelijkheid aan monitor en record ruimtelijke kenmerken van Ca^{2 +} signalering, zoals ruimtelijke verspreiding en propagatie snelheid, zoals weergegeven in Figuur 2 g. Deze informatie kan worden vergaard om een vrij compleet overzicht van Ca^{2 +} signalering gedrag in cellen in hun oorspronkelijke omgeving (Figuur 2 H).

PTCL analyse kan worden gebruikt te kwantificeren complexere Ca^{2 +} signalering van gedrag, zoals die welke voorkomen in onderling verbonden netwerken voor mobiele telefonie. Een voorbeeld van deze toepassing wordt verstrekt door de analyse uitgevoerd op ICC-MY (figuur 3A). Meestal in zulke complexe voorbereidingen, achtergrondgeluiden en signaal aan lawaai kunnen een probleem. Echter kunnen volumetrie softwarematig toepassen van gedifferentieerde en vloeiend filters op films van Ca^{2 +} activiteit en vervolgens toe te passen lawaai drempel protocollen voor het filteren van ruis (figuur 3B-D) achtergrondgeluiden worden verwijderd van complex opnames van dynamische activiteit. Met behulp van PTCL analyse zoals aangegeven in figuur 3E-G, kwantitatieve informatie over Ca^{2 +} kan signalering worden berekend door het meten van de PTCL gebied, PTCL graaf en PTCL grootte die duiden op een ruimtelijke bereiken van activering van Ca^{2 +} signalen in een FOV. Deze gegevens kan worden samengesteld als afgebeeld in Figuur 3 H en statistisch gezien als passende geanalyseerd. Figuur 4 illustreert hoe PTCL analyse toestaat in diepte kwantificering van sub cellulaire Ca^{2 +} signalering door onderzoek van de locatie en het afvuren van de waarschijnlijkheid van Ca^{2 +} afvuren van sites. Door de toewijzing van PTCLs in verschillende vlaggen op basis van hun temporele karakteristieken, initiëren van PTCLs kan worden nauwkeurig toegewezen zoals weergegeven in figuur 4C-E en een schat aan verkregen op het aantal sites van de inleiding van harde gegevens (hierna aangeduid als ' domeinen), de grootte van de site in pixels en µm², waarschijnlijkheid van elke Inleiding site afvuren van ofwel één keer of meerdere keren tijdens elke CTC (gegeven als een %), de gemiddelde duur en de grootte van de PTCLs die zich op de site van de inleiding, het aantal CTC cycli (als gedefinieerd in stap 4.23) en de % van explosieruimte dat afgevuurd tijdens elke cyclus van de CTC. Deze technieken laten een hoog niveau van datamining en kwantificering van in situ Ca^{2 +} signalen die zich voordoen binnen een intact cellulair netwerk die niet mogelijk met ROI gebaseerde analyses zijn.

Figuur 1: generatie van KitGCaMP6f muizen. Schematisch diagram van hoe Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f muizen) werden gekruist met c-Kit^{+/ Cre-ERT2} (Kit-Cre muizen) voor het genereren van Kit-Cre-GCaMP6f muizen. Deze muizen zijn ingespoten met tamoxifen op leeftijd van 6-8 weken voor het opwekken van Cre-Recombinase en daaropvolgende GCaMP6f expressie uitsluitend in ICC. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: Analyse van stochastische Ca^{2 +} signalen in ICC-DMP gebruik spatio-temporele toewijzing (STM). (A) representatieve afbeelding van verschillende ICC-DMP uit de dunne darm van een Kit-Cre-GCaMP6F muis ter plaatse. Een groene ROI geeft aan het paginaformaat en de afdrukstand van ROI om rond een gemeenschappelijke ICC-DMP binnen de FOV maken een STM in volumetrie te tekenen. (B) STM van Ca^{2 +} activiteit in het ICC-DMP gemarkeerd in deelvenster A na het heeft correct is gekalibreerd voor amplitude, ruimte en tijd. (C) de dezelfde STM getoond in deelvenster B na het heeft zijn kleur gecodeerd met een opzoektabel (QUBPallete). (D) Expanded beeld van ICC-DMP Ca^{2 +} transiënten weergegeven op een kleur gecodeerd STM, die aangeeft waar een lijn door een Ca^{2 +} evenement aanzuigen en zijn tijd (x)-as maken van een perceel-Profiel van haar activiteiten in ImageJ. (E) Plot Profiel van de Ca^{2 +} gebeurtenis gemarkeerd in het deelvenster D, die aangeeft waar lijnen getoond worden aangetrokken tot nauwkeurig maatregel de amplitude en de duur van het evenement. (F) Plot Profiel van de Ca^{2 +} gebeurtenis gemarkeerd in het deelvenster D, die aangeeft waar lijnen getoond worden aangetrokken tot nauwkeurig maatregel de rente van opkomst en val van het evenement. (G) Expanded beeld van ICC-DMP Ca^{2 +} transiënten weergegeven op een kleur gecodeerd STM, die aangeeft waar een lijn door een Ca^{2 +} evenement aanzuigen en de ruimte (y)-as voor het nauwkeurig meten van de ruimtelijke verspreiding ervan. (H) vertegenwoordiger histogrammen van samengevoegde gegevens van ICC-DMP illustreren hoe grafisch weergeven de amplitude, duur en ruimtelijke verspreiding waarden verworven van de bovenstaande stappen te volgen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: kwantificering van CTCs in het gebruik van de ICC-MY deeltje gebaseerde analyse. (A) representatieve afbeelding van een ICC-mijn netwerk uit de dunne darm van een Kit-Cre-GCaMP6F muis ter plaatse. (B)-foto genomen van de opname weergegeven in het deelvenster A nadat het heeft ondergaan een differentiële filter van Δt = ±66 – 70 ms en een Gaussiaans filter 1,5 x 1,5 µm, StdDev 1.0. (C) foto genomen van de video in B na drempelmethode werd aangevuld met PTCLs boven de drempel in het rood weergegeven. (D) sporen van PTCL tellen en betekenen PTCL grootte in een drempelmethode-protocol om storingen in de film getoond in deelvenster B. PTCLs te elimineren zijn gemaakt met behulp van een algoritme van de flood-fill dat gemarkeerd de structuur van alle aangrenzende pixels die had intensiteiten boven de drempel, Ca ^{2 +} voorbijgaande PTCLs waren groter dan lawaai PTCLs. De drempel waarbij grote aantallen kleine formaat lawaai PTCLs ontstaan en begon om de gemiddelde grootte van PTCLs kan worden gebruikt als een gemeenschappelijke drempel voor alle opnamen. (E) representatief beeld van het coördinaat gebaseerde Ca^{2 +} PTCL bestand gemaakt van de thresholded recording in C. (F) representatieve foto genomen vanuit het bestand PTCL E na de screening criteria van > 6 µm² (diameter ~ 2 µm of kleiner) werd toegepast; PTCLs boven deze limiet zijn gemarkeerd (vlag 1) als licht paarse deeltjes en beschouwd als geldige PTCLs. (G) warmte kaart toont de totale PTCLs (vlag 1) voor de volledige opname van de video weergegeven in Configuratiescherm F, met totale PTCLs summated met kleuren vertegenwoordigen kost in het hele van de opname (warme kleuren geven aan verhoogde aanwezigheid op die locatie). (H) vertegenwoordiger sporen van PTCL gebied (blauw) en PTCL tellen (rood) afgeleid van het PTCL-bestand dat is gemaakt in deelvenster A-G. Representatieve histogrammen van samengevoegde gegevens van verschillende experimenten staan hieronder de sporen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: Analyse van Ca^{2 +} afvuren sites in het gebruik van de ICC-MY deeltje gebaseerde analyse. (A) representatieve foto genomen vanuit het bestand PTCL figuur 3E nadat vlag 1 PTCLS zijn verder verfijnd in vlag 3, de status van de vlag voor Ca^{2 +} afvuren van sites. VLAG 3 PTCLs worden weergegeven als lime green (alleen die PTCLs die niet met eventuele deeltjes in de vorige frame maar overlapping met deeltjes in de volgende 70 ms overlappen deed werden beschouwd als explosieruimte). (B) hitte kaart met de totale PTCLs (vlag 3) voor de volledige opname van de video weergegeven in Configuratiescherm A, met totale PTCLs vatte met kleuren die kost in het hele van de opname (warme kleuren geven aan verhoogde aanwezigheid op die locatie). (C) vertegenwoordiger kaart van Ca^{2 +} afvuren sites weergegeven in het deelvenster die b, met elk verschillende bakken-site een andere identificerende kleur toegewezen. (D) vertegenwoordiger sporen van PTCL gebied (blauw) en PTCL tellen (rood) afgeleid van het PTCL-bestand dat is gemaakt in figuur 3A-G. (E) de kaart van een exemplaar van de activiteit van individuele explosieruimte. Elke site afvuren binnen de FOV wordt weergegeven als een gekleurde blokken in zijn eigen 'baan' tegen de tijd. (F) vertegenwoordiger histogrammen van samengevoegde gegevens van verschillende experimenten staan ter illustratie van de waarden zich ophopen voor Ca^{2 +} afvuren site afvuren waarschijnlijkheid / CTC en het aantal Ca^{2 +} afvuren van sites in een FOV. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CA^{2 +} beeldvorming van specifieke soorten cellen binnen intact weefsels of netwerken van cellen vaak onthult complexe patronen van Ca^{2 +} transiënten. Deze activiteit vereist zorgvuldige en grondige analyses en kwantificering te vangen zo veel mogelijk informatie over de onderliggende gebeurtenissen en kinetiek van deze gebeurtenissen. STM en PTCL analyse worden aangegrepen om de hoeveelheid kwantitatieve gegevens opgeleverd van opnames van dit type te maximaliseren.

De smalle, spindel vormige morfologie van ICC-DMP maken hen geschikt voor analyse van de STM afgeleid van de STM's hierboven beschreven. Deze analyse is echter niet geschikt tot ICC-MY Notti gevormd en zijn aangesloten in een netwerk (figuur 3A). Bovendien zijn de Ca^{2 +} signalering patronen in ICC-MY complexer, manifesteren als teeltmateriaal CTCs vanaf meerdere sites van oorsprong in het ICC-mijn netwerk. Dus, om het kwantificeren van de activiteit die zich voordoen in de gehele ICC-mijn netwerk binnen een FOV, deeltje (PTCL) analyse werd uitgevoerd met behulp van software op maat gemaakt (volumetrie, versie G8d, GWH, bedienbaar op Mac OS, neem dan contact op met Grant Hennig grant.hennig@med.uvm.edu met betrekking tot vraagt voor volumetrie toegang en gebruik).

STM analyse laat alle Ca^{2 +} evenementen binnen afzonderlijke cellen en alle cellen in een FOV te kritisch worden geanalyseerd in een heel scala van ruimtelijke en temporele parameters. Het protocol beschreven illustreert hoe deze technieken kunnen worden toegepast op ICC-DMP van de muis dunne darm. Door het volledig kwantificeren van Ca^{2 +} signalering in ICC-DMP, zoals weergegeven in figuur 2B-G, Ca^{2 +} signalering patronen hebben gekenmerkt in detail³⁷. Deze analyses zijn vereffend met opnames waar ICC-DMP ondergaan interventies te fijn het kwantificeren van de effecten van blokkeren of stimuleren van Ca^{2 +} release / Ca^{2 +} toestroom / transmissie trajecten³⁷^,³⁹ ^, ⁴⁰ ^, ⁴¹. deze technieken kunnen eenvoudig worden toegepast op andere preparaten intact weefsel. Bijvoorbeeld, is STM analyse zoals hier beschreven gebruikt ter identificatie van nieuwe mechanistische trajecten die betrokken zijn bij de generatie van intracellulaire Ca^{2 +} golven opgenomen in urethrale glad spierweefsel in situ⁵⁷.

De voorbereiding van de STM's in volumetrie vereist enige voorzichtigheid, zoals de functie in volumetrie waarmee de STM van de getekende ROI (figuur 2A) een gemiddelde waarde van intensiteit is. De amplitude van Ca^{2 +} signalen kan dus mogelijk worden verdund, als de ROI wordt getekend als een breder of langer dan de Ca^{2 +} gebeurtenis of cel van belang. Dus moeten gebruikers voorzichtig te trekken ROIs die als strak passend mogelijk bij de Ca^{2 +} signalen of bepaalde cel die zij analyseren om te verlichten van dit probleem. Ook het creëren van STM's met behulp van één pixel linescans in ImageJ betekent dat nauwkeurig in kaart brengen van Ca^{2 +} evenementen onderworpen aan de nabijheid van de Ca^{2 +} signaal van de getekende lijn is. Dergelijke zorgen zijn kleine in dunne spindel vormige cellen zoals ICC-DMP, maar andere cel typt met een meer Notti of ronde morfologie kan dit type analyse zou onjuist zijn om alle Ca^{2 +} signalen nauwkeurig in kaart. Bij de voorbereiding van de STM's voor analyse, ongeacht of ze werden gemaakt in volumetrie of met ImageJ linescans, zijn er een paar gebieden worden gemarkeerd voor probleemoplossing. Het is belangrijk om de beeldkwaliteit wijzigen in 32-bits voordat iedere kalibratie wilt uitvoeren op de STM. niet te doen, of doen nadat kalibreren voor F/F₀ kan leiden tot inconsistente metingen over experimenten. Controleer altijd de kwaliteit van het beeld van de STM, die staat vermeld in het bovenste gedeelte van de witte rand van de STM zelf met ImageJ geopend. Een ander potentieel gebied van inconsistentie is het selecteren van de F-waarde₀ wanneer kalibreren voor amplitude. Het is belangrijk dat voor het selecteren van de regio voor F₀, dat het heeft een oppervlakte van de cel die zich uniform en focus. Om deze reden, gebieden van de cel die hebben een unstable basale fluorescentie of die veranderen als gevolg van beweging of andere artefacten zijn niet ideaal en rigoureuze beweging stabilisatie protocollen moeten worden gebruikt in deze gevallen.

Binnen in situ of gekweekte preparaten die met elkaar verbonden netwerken voor mobiele telefonie, zoals ICC-mijn in de kleine darm, PTCL analyse biedt een gestroomlijnde techniek om te kwantificeren van complexe, subcellular Ca^{2 +} gebeurtenissen in het netwerk. Bovendien, daardoor ook alle Ca^{2 +} gebeurtenissen in het netwerk binnen een bepaalde FOV te analyseren, in plaats van met behulp van willekeurige ROIs, die alleen informatie verschaffen over frequentie en intensiteit binnen de ROI. Een voordeel van de analyse van de PTCL hier beschreven is dat door het toepassen van differentiële en Gaussian filters aan opnamen, smoothing een grote hoeveelheid ruis kan worden verwijderd van films die besmettende licht uit cellen niet van belang of ten gevolge van niet-dynamische kunnen bevatten heldere vlekken of insluitsels. Het is belangrijk op te merken dat de hoeveelheid differentiatie toegepast op opnames grotendeels van de wisselkoers van de overname door de experimentator afhangen zal. Differentiatie van films zoals beschreven in het protocol biedt een manier voor een filter toepassen op de film om hoge frequentie geluid van opnamen. Toepassing van de waarde van een differentiatie van de '2' bij verwerven bij 33FPS werkt goed aan achtergrondgeluiden verwijderen met behoud van goed signaal aan lawaai (als de waarde te laag is, lawaai zal worden opgepikt maar signaal aan lawaai zal worden aangetast als de waarde te hoog is). De waarde van de differentiatie toegepast moet worden verhoogd met snellere overname tarieven, bijvoorbeeld bij 100 FPS, de waarde van een differentiatie van '7' geeft ongeveer hetzelfde signaal / ruisverhouding als een waarde van '2' aan een opname 33FPS. Onderzoekers zal moeten deze instellingen optimaliseren dienovereenkomstig voor hun preparaten en de opname voorwaarden.

Het drempelmethode protocol beschreven in figuur 3D kan een consistente drempelmethode procedure moet worden toegepast op verschillende opnames gemaakt op verschillende systemen met verschillende acquisitie software. Deze flexibiliteit kan gegevens uit meerdere onderzoekers werken op verschillende systemen om het compileren van hun opnames in de dezelfde datasets. Met behulp van het systeem van de vlag in volumetrie, maakt PTCL analyse de visualisatie en de kwantificering van individuele Ca^{2 +} afvuren van sites binnen een netwerk in detail. Informatie kan worden verzameld over het aantal sites van de inleiding, de grootte van de site in pixels en µm², en de gemiddelde duur van PTCLs die zich op die site. Deze PTCL-analyse toegestaan de eerste karakterisering van CTC activiteit in de dunne darm op een sub cellulair niveau en, met behulp van de verschillende vlaggen in volumetrie software, PTCLs op zowel het netwerk en de afzonderlijke vuren site niveau werden gekwantificeerd in onbeschadigde weefsel preparaten van Kit-Cre-GCaMP3 muizen³⁸. Uit deze eerste waarnemingen, deze analyse is verder gebruikt om te studeren roman Ca^{2 +} toestroom trajecten in GI ICC-MY zoals winkel-geëxploiteerd-Ca^{2 +}-vermelding⁴² en de rol van mitochondriale Ca^{2 +} signalisatie op de GI-pacemaking ⁴¹. veel zoals de bovenstaande analyse STM, PTCL analyse kan gemakkelijk aangepast worden aan verschillende intact preparaten dan die in dit protocol beschreven. Bijvoorbeeld, een recente studie gebruikt PTCL analyse bij het bestuderen van nieuwe ritmische Ca^{2 +} gebeurtenissen in de intact cellulaire netwerken van de lamina propria van de rat urineblaas⁵⁸^,⁵⁹ en aldus kan eenvoudig worden toegepast op andere complexe, intact cellulaire systemen zoals neuronale systemen. Terwijl deze paper op Ca^{2 gericht +} beeldvorming in intact weefsels met GECIs, kunnen het zijn dat deze analysetechnieken ook worden uitgevoerd op geïsoleerde cellen en weefsels geladen met traditionele Ca^{2 +} indicator kleurstoffen. De analyse van de STM gebaseerd heeft geweest tweedehands voor met succes het kwantificeren van gelokaliseerde Ca^{2 +} signalen en Ca^{2 +} golven van spindel gevormde interstitiële cellen en zachte spiercellen uit allerlei voorbereidingen¹¹^,⁶⁰ ^, ⁶¹ ^, ⁶² ^, ⁶³. voorts de PTCL analyse routines die hier worden beschreven zijn ook toegepast ter plaatse netwerk preparaten gevisualiseerd met Cal 520⁵⁸^,⁵⁹. Deze studies behouden echter ook de nadelen van dergelijke kleurstof laden van protocollen zoals dubbelzinnig cel identificatie en problemen met signaal aan lawaai.

De hierboven geïllustreerde voorbeelden tonen aan dat zowel STM en PTCL analyse zeer kneedbaar technieken die kunnen worden gebruikt om te kwantificeren complexe Ca^{2 +} signalering in een breed scala van intact weefsel preparaten. De benaderingen bieden vele voordelen over traditionele ROI intensiteit percelen die eerder routinematig zijn gebruikt en moeten onderzoekers waardevoller kwantitatieve informatie verstrekken over Ca^{2 +} signalering dan eerder kon worden bereikt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Financiering werd verstrekt door de NIDDK, via P01 DK41315.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageJ software	NIH	1.5a	ImageJ software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit^+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Wellman, G. C., Nelson, M. T. Signaling between SR and plasmalemma in smooth muscle: Sparks and the activation of Ca2+-sensitive ion channels. Cell Calcium. 34 (3), 211-229 (2003).
Mironneau, J., Arnaudeau, S., Macrez-Lepretre, N., Boittin, F. X. Ca2+sparks and Ca2+waves activate different Ca2+-dependent ion channels in single myocytes from rat portal vein. Cell Calcium. 20 (2), 153-160 (1996).
Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1793 (6), 933-940 (2009).
Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. Calcium signalling. Current biology. 9 (5), R157-R159 (1999).
Bootman, M. D., et al. Calcium signalling—an overview. Seminars in Cell & Developmental Biology. 12 (1), 3-10 (2001).
Brain, K. L., Bennett, M. R. Calcium in sympathetic varicosities of mouse vas deferens during facilitation, augmentation and autoinhibition. The Journal of Physiology. 502 (3), 521-536 (1997).
Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).
Dupont, G., Goldbeter, A. Problems and paradigms: Oscillations and waves of cytosolic calcium: Insights from theoretical models. BioEssays. 14 (7), 485-493 (1992).
Bootman, M. D., Berridge, M. J. The elemental principles of calcium signaling. Cell. 83 (5), 675-678 (1995).
Berridge, M. J., Dupont, G. Spatial and temporal signalling by calcium. Current Opinion in Cell Biology. 6 (2), 267-274 (1994).
Drumm, B. T., et al. The role of Ca 2+ influx in spontaneous Ca 2+ wave propagation in interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. The Journal of Physiology. 593 (15), 3333-3350 (2015).
Bayguinov, P. O., Hennig, G. W., Smith, T. K. Ca 2+ imaging of activity in ICC-MY during local mucosal reflexes and the colonic migrating motor complex in the murine large intestine. The Journal of Physiology. 588 (22), 4453-4474 (2010).
Drumm, B. T., Sergeant, G. P., Hollywood, M. A., Thornbury, K. D., McHale, N. G., Harvey, B. J. The role of cAMP dependent protein kinase in modulating spontaneous intracellular Ca2+ waves in interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. Cell Calcium. 56 (3), 181-187 (2014).
Nathanson, M. H., Padfield, P. J., O’Sullivan, A. J., Burgstahler, A. D., Jamieson, J. D. Mechanism of Ca2+ wave propagation in pancreatic acinar cells. Journal of Biological Chemistry. 267 (25), 18118-18121 (1992).
Straub, S. V., Giovannucci, D. R., Yule, D. I. Calcium wave propagation in pancreatic acinar cells: functional interaction of inositol 1,4,5-trisphosphate receptors, ryanodine receptors, and mitochondria. The Journal of General Physiology. 116 (4), 547-560 (2000).
Sneyd, J., Tsaneva-Atanasova, K., Bruce, J. I. E., Straub, S. V., Giovannucci, D. R., Yule, D. I. A model of calcium waves in pancreatic and parotid acinar cells. Biophysical Journal. 85 (3), 1392-1405 (2003).
Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. Calcium sparks in smooth muscle. American Journal of Physiology. Cell. 278 (2), C235-C256 (2000).
Nelson, M. T., et al. Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks. Science. 270 (5236), 633-637 (1995).
Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks: Elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 262 (5134), 740-744 (1993).
Parker, I., Choi, J., Yao, Y. Elementary events of InsP3-induced Ca2+ liberation in Xenopus oocytes: Hot spots, puffs and blips. Cell Calcium. 20 (2), 105-121 (1996).
Diliberto, P. a, Wang, X. F., Herman, B. Confocal imaging of Ca2+ in cells. Methods in Cell Biology. 40, 243-262 (1994).
Martínez-Zaguilán, R., Parnami, G., Lynch, R. M. Selection of fluorescent ion indicators for simultaneous measurements of pH and Ca2+. Cell Calcium. 19 (4), 337-349 (1996).
Hayashi, H., Miyata, H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2. The Journal of Pharmacology & Toxicology Methods. 31 (1), 1-10 (1994).
Thomas, D., Tovey, S. C., Collins, T. J., Bootman, M. D., Berridge, M. J., Lipp, P. A comparison of fluorescent Ca2+indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+signals. Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).
Lock, J. T., Parker, I., Smith, I. F. A comparison of fluorescent Ca2+indicators for imaging local Ca2+signals in cultured cells. Cell Calcium. 58 (6), 638-648 (2015).
Flagmeier, P., et al. Ultrasensitive Measurement of Ca 2+ Influx into Lipid Vesicles Induced by Protein Aggregates. Angewandte Chemie International Edition. 56 (27), 7750-7754 (2017).
Tsutsumi, S., et al. Structure-Function Relationships between Aldolase C/Zebrin II Expression and Complex Spike Synchrony in the Cerebellum. Journal of Neuroscience. 35 (2), 843-852 (2015).
Rietdorf, K., Chehab, T., Allman, S., Bootman, M. D. Novel improved Ca indicator dyes on the market - a comparative study of novel Ca indicators with Fluo-4. Calcium Signalling: The Next Generation. , 590 (2014).
Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
Seidemann, E., et al. Calcium imaging with genetically encoded indicators in behaving primates. eLife. 5 (2016JULY), (2016).
Su, S., et al. Genetically encoded calcium indicator illuminates calcium dynamics in primary cilia. Nature Methods. 10 (11), 1105-1109 (2013).
Kaestner, L., et al. Genetically encoded Ca2+ indicators in cardiac myocytes. Circulation Research. 114 (10), 1623-1639 (2014).
Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor design. Current Opinion in Chemical Biology. 27, 90-97 (2015).
Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence. PLoS ONE. 12 (2), 1-24 (2017).
Spencer, N. J., et al. Identification of a rhythmic firing pattern in the enteric nervous system that generates rhythmic electrical activity in smooth muscle. The Journal of Neuroscience. , 3489 (2018).
Hibberd, T. J., et al. Synaptic Activation of Putative Sensory Neurons By Hexamethonium-Sensitive Nerve Pathways in Mouse Colon. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. (861), (2017).
Baker, S. A., Drumm, B. T., Saur, D., Hennig, G. W., Ward, S. M., Sanders, K. M. Spontaneous Ca(2+) transients in interstitial cells of Cajal located within the deep muscular plexus of the murine small intestine. The Journal of Physiology. 594 (12), 3317-3338 (2016).
Drumm, B. T., et al. Clustering of Ca2+ transients in interstitial cells of Cajal defines slow wave duration. The Journal of General Physiology. 149 (7), 703-725 (2017).
Baker, S. A., Drumm, B. T., Cobine, C. A., Keef, K. D., Sanders, K. M. Inhibitory Neural Regulation of the Ca2+ Transients in Intramuscular Interstitial Cells of Cajal in the Small Intestine. Frontiers in Physiology. 9 (April), 1-24 (2018).
Baker, S. A., et al. Excitatory Neuronal Responses of Ca 2+ Transients in Interstitial Cells of Cajal in the Small Intestine. eNeuro. 5 (2), (2018).
Drumm, B. T., Sung, T. S., Zheng, H., Baker, S. A., Koh, S. D., Sanders, K. M. The effects of mitochondrial inhibitors on Ca2+signalling and electrical conductances required for pacemaking in interstitial cells of Cajal in the mouse small intestine. Cell Calcium. 72, 1-17 (2018).
Zheng, H., Drumm, B. T., Earley, S., Sung, T. S., Koh, S. D., Sanders, K. M. SOCE mediated by STIM and Orai is essential for pacemaker activity in the interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. Science Signaling. 11 (June), (2018).
Zhu, M. H., et al. A Ca(2+)-activated Cl(-) conductance in interstitial cells of Cajal linked to slow wave currents and pacemaker activity. The Journal of Physiology. 587 (20), 4905-4918 (2009).
Zhu, M. H., Sung, T. S., O’Driscoll, K., Koh, S. D., Sanders, K. M. Intracellular Ca(2+) release from endoplasmic reticulum regulates slow wave currents and pacemaker activity of interstitial cells of Cajal. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 308 (8), C608-C620 (2015).
Zhu, M. H., et al. Muscarinic activation of Ca2+-activated Cl- current in interstitial cells of Cajal. The Journal of Physiology. 589 (Pt 18), 4565-4582 (2011).
Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine. The Journal of Physiology. 480 (Pt 1), 91-97 (1994).
Huizinga, J. D., Thuneberg, L., Klüppel, M., Malysz, J., Mikkelsen, H. B., Bernstein, A. W/kit gene required for interstitial cells of cajal and for intestinal pacemaker activity. Nature. 373 (6512), 347-349 (1995).
Ordog, T., Ward, S. M., Sanders, K. M. Interstitial cells of Cajal generate electricial slow waves in the murine stomach. The Journal of Physiology. 518 (1), 257-269 (1999).
Sanders, K. M., Ward, S. M., Koh, S. D. Interstitial cells: regulators of smooth muscle function. Physiological Reviews. 94 (3), 859-907 (2014).
Ward, S. M., McLaren, G. J., Sanders, K. M. Interstitial cells of Cajal in the deep muscular plexus mediate enteric motor neurotransmission in the mouse small intestine. The Journal of Physiology. 573 (1), 147-159 (2006).
Komuro, T. Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. The Journal of Physiology. 576 (3), 653-658 (2006).
Komuro, T. Comparative morphology of interstitial cells of Cajal: ultrastructural characterization. Microscopy Research and Technique. 47 (4), 267-285 (1999).
Sanders, K. M., Ward, S. M., Koh, S. D. Interstitial Cells: Regulators of Smooth Muscle Function. Physiological Reviews. 94 (3), 859-907 (2014).
Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+dynamics in the awake mouse brain. PLoS ONE. 12 (7), e0181113 (2017).
Truett, G. E., Heeger, P., Mynatt, R., Truett, A. A., Walker, J. A., Warman, M. L. Preparation of PCR quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT). BioTechniques. 29 (52), 54 (2000).
The Jackson Laboratory. , Available from: https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:5:0::NO:5:P5_MASTER_PROTOCOL_ID,P5_JRS_CODE:27076,028865 (2017).
Drumm, B. T., et al. Ca 2+ signalling in mouse urethral smooth muscle in situ role of Ca 2+ stores and Ca 2+ influx mechanisms. The Journal of Physiology. 596 (8), 1433-1466 (2018).
Heppner, T. J., Hennig, G. W., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Rhythmic Calcium Events in the Lamina Propria Network of the Urinary Bladder of Rat Pups. Frontiers in Systems Neuroscience. 11 (December), 1-16 (2017).
Heppner, T. J., Hennig, G. W., Nelson, M. T., May, V., Vizzard, M. A. PACAP38-Mediated Bladder Afferent Nerve Activity Hyperexcitability and Ca 2 + Activity in Urothelial Cells from Mice. Journal of Molecular Neuroscience. 1, (2018).
Griffin, C. S., et al. Muscarinic Receptor Induced Contractions of the Detrusor are Mediated by Activation of TRPC4 Channels. Journal of Urology. 196 (6), 1796-1808 (2016).
Sergeant, G. P., Craven, M., Hollywood, M. A., Mchale, N. G., Thornbury, K. D. Spontaneous Ca2+waves in rabbit corpus cavernosum: Modulation by nitric oxide and cGMP. Journal of Sexual Medicine. 6 (4), 958-966 (2009).
Bradley, E., et al. Novel Excitatory Effects of Adenosine Triphosphate on Contractile and Pacemaker Activity in Rabbit Urethral Smooth Muscle. Journal of Urology. 183 (2), 801-811 (2010).
Drumm, B. T., et al. The effect of high [K + ] o on spontaneous Ca 2+ waves in freshly isolated interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. Physiological Reports. 2 (1), e00203 (2014).

Biology

Toepassingen van de Spatio-temporele Mapping en analysetechnieken deeltje te kwantificeren intracellulaire Ca^{2 +} signalering In Situ

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.