Biology

Kendisinin geçici eşleme ve parçacık analiz teknikleri intrasellüler Ca sinyal^{2 +} in Situ ölçmek için uygulamaları

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58989

Bernard T. Drumm¹, Grant W. Hennig², Salah A. Baker¹, Kenton M. Sanders¹

¹Department of Physiology and Cell Biology, University of Nevada Reno School of Medicine, ²Department of Pharmacology, The Robert Larner, M.D. College of Medicine, University of Vermont

Summary

Genetik olarak kodlanmış Ca^{2 +} göstergeleri (turk) nasıl yerinde Ca^{2 +} görüntüleme gerçekleştirilir kökten değişti. Veri kurtarma gibi kayıtları en üst düzeye çıkarmak için Ca^{2 +} sinyal uygun analiz gereklidir. Bu kağıt Protokoller'de Ca sinyalleri^{2 +} yerinde kronolojik zamanmekansal haritalama ve analiz parçacık tabanlı kullanarak kaydedilen miktar kolaylaştırmak.

Abstract

Kez CA^{2 +} görüntüleme izole hücre veya hücreleri sağlam dokularda belirli türleri Ca^{2 +} sinyal karmaşık desenler ortaya koymaktadır. Bu etkinlik dikkatli ve ayrıntılı analizler ve temelindeki olayları hakkında mümkün olduğunca fazla bilgi yakalamak için miktar gerektirir. Spatial, zamansal ve yoğunluk parametreleri içsel Ca^{2 +} sinyalleri sıklığı, süresi, yayma, hız ve genlik gibi hücre içi sinyal için gerekli bazı biyolojik bilgi sağlayabilir. Genellikle zaman ölçülebilir veri görüntüleme bilgileri çeviri açısından süreci ve bu sürecin alıcı veri dosyaları edinimi sonuçlarında Imaging yüksek çözünürlüklü Ca^{2 +} insan hatası ve önyargı duyarlı olabilir. Ca^{2 +} sinyalleri hücrelerden yerinde analizi genellikle faiz (ROI) görüş (FOV) bir alan içinde keyfi olarak seçilen bölgelerinden basit yoğunluk ölçümleri kullanır. Bu yaklaşım çok FOV içinde yer alan önemli sinyal bilgilerin dikkate almaz. Böylece, Ca^{2 +}boya veya optogenetic Ca^{2 +}ile elde edilen yüksek çözünürlüklü böyle kayıtlarından bilgi kurtarma maksimize etmek için görüntüleme, uygun kayma ve zamansal Analizi Ca^{2 +} sinyalleri gereklidir. Bu makalede özetlenen protokolleri nasıl veri büyük miktarda daha kapsamlı analiz ve miktar bir birleşimini kullanarak hücrelerinden kaydedilen Ca^{2 +} sinyal kolaylaştırmak için Ca^{2 +} görüntü kayıtlarından elde edilebilir anlatacağım zamanmekansal harita (STM)-tabanlı analiz ve parçacık tabanlı analiz. İletişim kuralları ayrıca nüfus yerinde uygun şekilde çözümlenebilir farklı hücresinde gözlenen sinyal Ca^{2 +} ne kadar farklı desenler açıklar. Gösterim amacıyla, yöntem hücrelerde ince bağırsak, interstisyel hücreleri turk kullanarak, Cajal (ICC), özel bir nüfus içinde sinyal Ca^{2 +} muayene edecektir.

Introduction

CA^{2 +} hücresel süreçler, kas kasılması¹^,², metabolizma³, hücre proliferasyonu³^,⁴^, gibi geniş bir kontrol eden her yerde birden bulunan hücre içi haberci bir ⁵, sinir terminallerine⁶^,⁷' nörotransmitter piyasaya uyarılması ve harekete geçirmek-in transkripsiyon faktörleri çekirdeğinde. ⁷ intrasellüler Ca^{2 +} kez geçici yükselmeler sitozolik Ca^{2 +}' biçiminde ve bunlar kendiliğinden veya agonist stimülasyon bağlı olarak hücre türü⁸kaynaklanan sinyalleri. Spatial, zamansal ve yoğunluk parametreleri içsel Ca^{2 +} sinyalleri sıklığı, süresi, yayma, hız ve genlik gibi hücre içi sinyal verme⁵için^, gerekli biyolojik bilgi verebilir misiniz ⁷ ^, ⁹. sitoplazmik Ca^{2 +} sinyalleri neden olur akını Ca^{2 +} hücre dışı uzaydan veya Ca^{2 +} sürümü endoplazmik retikulum (ER) ile gelen Ca^{2 +} yayın kanalları gibi ryanodine reseptörleri üzerinden (RyRs) ve inositol-tri-fosfat reseptörleri (IP₃Rs)¹⁰. RyRs ve IP₃Rs hem de Ca^{2 +} sinyalleri nesile katkıda bulunabilir ve çeşitli Ca^{2 +} akını mekanizmaları ile birlikte bu kanallar uyumlu açılış desenleri sinyalizasyon Ca^{2 +} içinde sayısız yol açabilir Bu rakamlara göre şekillenir ve olasılık ifade profil Ca^{2 +} akını ve yayın kanalları ve ifade ve Ca^{2 dağılımı arasındaki yakınlık Ca^{2 +} Kanal yayın, Ca^{2 +} kanal akın, açık +} geri alım ve ekstrüzyon proteinler. CA^{2 +} sinyalleri uzun ömürlü, Üniforma, birkaç saniye veya dakika bile, hücre içi mesafeler çapraz olabilir hücre içi ve hücreler arası Ca^{2 +} dalgalarının yayılmasını sürebilir yüksek yoğunluklu küresel salınımlarını şeklinde olabilir 100'den fazla µm¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶veya daha fazla Ca^{2 + gibi dağınık şekilde yerelleştirilmiş olaylar kısa}kıvılcım ve milisaniyelik zaman çizelgelerine onlarca üzerinde ortaya ve 5'ten µm¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰yaymak Ca^{2 +} puffs.

Floresan mikroskopi izole ve kültürlü hücreleri ve sağlam dokulara sinyalizasyon Ca^{2 +} izlemek için yaygın olarak kullanılmış. Geleneksel olarak, bu deneyler floresan Ca^{2 +} göstergeleri, ratiometric kullanımı dahil ve sigara ratiometric gibi Fura2, Fluo3/4 ya da Rhod2, diğerleri arasında ²¹^,²²^,²³boyuyor. Bu göstergeler hücre membran geçirgen ve sonra hücrelerde endojen esterazlar üzerinden bir ester grubu bölünme tarafından tuzak haline için dizayn edilmiştir. Hücre ve dokulara uygun dalga boylarında ışık tarafından aydınlatılmış Ca^{2 +} yüksek afinite göstergeleri için bağlama değişiklikleri floresans içinde neden oldu. Geçirgen Ca göstergeleri^{2 +} hücre kullanımı oldukça bizim anlayış yaşayan hücreleri sinyal ve uzaysal çözünürlük ve Ca^{2 +} sinyalleri raporlaması tarafından mümkün değildi miktar bu sinyallerin izin Ca^{2 +}gelişmiş Elektrofizyoloji gibi diğer yollarla. Ancak, geleneksel Ca^{2 +} göstergeleri genişletilmiş kayıt dönemleri²⁴üzerinde oluşan photobleaching gibi bazı sınırlamaları vardır. Cal520/590 gibi büyük ölçüde geliştirilmiş sinyal noise oranları ve yerel Ca^{2 +} sinyalleri²⁵algılama yeteneğini daha yeni Ca^{2 +}göstergesi Boyayıcılar, photobleaching ile ilgili sorunlar hala bazı araştırmacılar^{için bir endişe kalır 26}^,²⁷^,²⁸. Sarp photobleaching da büyütme oranı resim alma, kısıtlar ve artan nesnel güç ve resim alma daha yüksek oranda gerektiği, kayıtları için kullanılabilecek çözünürlük uyarma ıșık yoğunluğu artmış bu photobleaching artırır.

Bu sınırlamaları geleneksel Ca^{2 +} göstergesi boyalar Ca^{2 +} sinyalleri in situ olarak kaydederken şiddetlenir, örneğin ne zaman kayıt intrasellüler Ca^{2 +} sağlam dokulardan sinyalleri. Yukarıdaki sorunları nedeniyle görselleştirme sinyallerin Ca^{2 +} hücre geçirgen Ca^{2 +}göstergeler kullanarak in situ düşük güç büyütme için sınırlı edilmiş ve görüntü yakalama, müfettişler kaydetmek için yetenek zorlayıcı indirdi ve geçici veya dağınık şekilde sınırlı hücre altı Ca^{2 +} sinyalleri ölçmek. Böylece, yakalama, analiz ve yukarıda belirtildiği gibi istenen biyolojik yanıt, üretimi önemli olabilir Ca^{2 +} sinyalleri, kayma ve temporal karmaşıklığı takdir etmek zor oldu. Ca^{2 +} sinyalleri hücrelerden yerinde analizi genellikle faiz (ROI) görüş (FOV) bir alan içinde seçilen bölgelerinden basit yoğunluk ölçümleri kullanır. Sayısı, boyutu ve konumunu ROIs, araştırmacı, kapris bağımlı rasgele seçimi ciddi bir şekilde elde edilen sonuçları önyargı. Yatırım getirisi analizi ile doğal önyargı yanı sıra bu yaklaşım çok önemli dikkate almaz FOV, dinamik Ca^{2 +} olayları bir keyfi olarak seçilen içinde bulunan bilgi sinyal ROI seçilir analiz için. Ayrıca, ROIs Analizi gözlenen Ca^{2 +} sinyalleri mekansal özellikleri hakkında bilgi sağlamak başarısız olur. Örneğin, mümkün olmayabilir bir artış bir yayılmasını kaynaklanan Ca^{2 +} ayırt etmek için Ca^{2 +} sinyal bir yatırım getirisi içinde hesaplamalar olayından Ca^{2 +} dalga ve bir çok yerelleştirilmiş Ca^{2 +} serbest.

Genetik olarak kodlanmış Ca^{2 +} göstergeleri (turk) gelişiyle kökten nasıl Ca^{2 +} görüntüleme gerçekleştirilen in situ²⁹^,³⁰^,³¹^,³²^,^{33 olabilir değişti}. Turk boyalar üzerinde kullanarak birkaç avantajı vardır. En önemli belki de GECI ifade hücreleri istenmeyen arka plan kirlenme değil ilgi azaltan bir hücre belirli bir şekilde, gerçekleştirilebilir olduğunu. O photobleaching azalır geleneksel Ca^{2 +} göstergeleri turk başka bir avantajı olduğunu (floresan ve dolayısıyla photobleaching sadece gerçekleştiği sırada ne zaman hücreleri aktif), özellikle de yüksek boya yüklü örnekleri ile karşılaştırıldığında büyütme ve görüntü yüksek oranda³⁴yakalayın. Böylece, optogenetic sensörler, GCaMP dizi tanıyor gibi müfettişler kaydetmek için yetenek Turk ile görüntüleme ve kısa, yerelleştirilmiş alt hücresel Ca^{2 +} in situ sinyalleri içindeki hücreleri sinyal Ca^{2 +} araştırmak onların daha önce mümkün olmamıştır doğal ortamlar. Böyle yüksek çözünürlüklü kayıtlarından bilgi kurtarılması en üst düzeye çıkarmak için Ca^{2 +} sinyalleri uygun kayma ve zamansal analizi gereklidir. Turk bazı avantajları açık sunabilir iken, son yıllarda yapılan çalışmalarda Ca^{2 +} görüntüleme başarıyla aynı anda geleneksel kullanarak nöronların farklı nörokimyasal sınıfların büyük nüfus gerçekleştirilmesi indirdik ki unutulmamalıdır Hayvan³⁵genetik olarak kodlanmış değil Ca^{2 +} göstergeleri. Bu yaklaşım öğleden hoc immünhistokimya yüksek frekans eşitlenmiş öbek halinde ateş nöronların birden çok farklı sınıflar ortaya çıkarmak için kullanılan ve hayvan genetik değişiklikler fizyolojik ile müdahale potansiyel kaçınılması ³⁵^,³⁶anlamak için davranış araştırmacı çalışmaktadır.

Bu makalede özetlenen protokolleri daha kapsamlı çözümlemesini kolaylaştıran ve Ca^{2 +} miktar sinyalleri kaydedilen hücrelerden yerinde kronolojik zamanmekansal harita (STM) bir birleşimini kullanarak-tabanlı analiz ve parçacık tabanlı analiz. İletişim kuralları ayrıca nüfus yerinde uygun şekilde çözümlenebilir farklı hücresinde gözlenen sinyal Ca^{2 +} ne kadar farklı desenler açıklar. Gösterim amacıyla, yöntem hücrelerde ince bağırsak, interstisyel hücreleri Cajal (ICC) özel bir nüfus içinde sinyal Ca^{2 +} muayene edecektir. ICC sinyal, dinamik intrasellüler Ca^{2 +} sergi fareler GCaMPs³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^{ifade kullanarak görüntülenir gibi özel hücreler gastrointestinal (GI) sistem içinde vardır,} ⁴¹^,⁴². CA^{2 +} geçişler ICC içinde harekete geçirmek-in Ca^{2 +}için bağlı-Cl^- bağırsak düz kas hücreleri (SMCs)⁴³^{, uyarılabilirlik düzenlenmesinde önemlidir ( Ano1tarafından kodlanmış) kanalları aktive} ⁴⁴^,⁴⁵. Böylece, ICC içinde sinyal Ca^{2 +} bağırsak hareketliliği anlamak için temel bir çalışmadır. ICC anatomik olarak ayrılmış ve bağımsız olarak görüntülenmiştir iki sınıf olarak fare bağırsağı bu gösteri için mükemmel bir örnek sunar: Ben) ICC dairesel ve boyuna düz kas arasındaki bölgede yer alan katmanları, myenteric pleksus çevreleyen (ICC MY). Bu hücreler kalp pili hücreleri olarak hizmet ve yavaş dalgalar⁴⁶^,⁴⁷^,⁴⁸^,⁴⁹bilinen elektrik etkinliği oluşturduğunu; II) ICC ayrıca bir pleksus motor nöronlar (derin kas pleksus, böylece ICC DMP) terminalleri içinde zengin arasında yer vardır. Bu hücreler enterik motor neurotransmission³⁷^,³⁹^,⁴⁰^,⁵⁰tepkilerin arabulucu olarak hizmet vermektedir. ICC MY ICC DMP morfolojik ayrı ve Ca^{2 +} sinyal davranışları onların belirli görevleri yerine getirmek için kökten farklıdır. ICC MY şeklinde yildiz seklinde ve birbirine bağlı hücre boşluğu kavşak⁵¹^,⁵²üzerinden bir ağ oluştururlar. CA^{2 +} zaman uyumsuz olarak görüntülenmeyecektir FOV (60 X amacı ile görüntüsü)³⁸içinde olarak ICC benim ağ üzerinden birden çok site oluşan kısa ve dağınık şekilde yerelleştirilmiş Ca^{2 +} yayın olaylar olarak ICC MY bildiriminde sinyalleri. Bu zaman uyumsuz sinyalleri geçici düzenlenmiştir 1 saniye kümeleri, net 1 s hücresel artış Ca^{2 +}birlikte tablo zaman tutar. Bu sinyaller hücre hücre ICC ağ içinde yayar ve bu nedenle sinyal, alt hücresel sitelerden bir doku geniş Ca^{2 +} dalga oluşturulan Ca^{2 +} düzenlemek. Zamansal kümeleme ve Ca^{2 +} özetlemesi sinyalleri içinde ICC MY Ca^{2 +} geçici kümeleri (CTCs)³⁸olarak adlandırdığı. CTCs ritmik 30 dakikada kez fare (örneğin oldukça aynı süreye ve CTCs arasında benzer dönemleri) oluşur. Diğer taraftan, ICC DMP şeklinde iğ hücreleri, bazı SMCs ve varisli sinir işlemler arasında dağıtmak ve bağımsız olarak ikincil süreçleri ile bir ağ⁵¹^,⁵²oluştururlar. ICC DMP formu boşluğu kavşak ile SMCs, ancak ve işlev SIP syncytium⁵³bilinen bu büyük syncytium içinde. Hücreleri uzunlukları boyunca birden çok site CA^{2 +} sinyalleri oluşur, ancak bu geçişler değil entrained veya geçici kümelenmiş, ICC MY³⁷içinde gözlemlediği gibi. CA^{2 +} sinyalleri ICC DMP içinde değişken yoğunluklarını, süreleri ve mekansal özellikleri ile Stokastik bir şekilde meydana gelir. ICC-MY içinde sinyal Ca^{2 +} örneği kullanarak aşağıda iletişim kuralları ve ICC-DMP, hücreler in situ olarak belirli türde karmaşık sinyal analiz teknikleri açıklar. Biz indüklenebilir Cre-Lox p Sistem aktivasyonu Cre-Recombinase (Cre) bir ICC belirli düzenleyici (Kit) tarafından tahrik inducing sonra ICC, içinde sadece GCaMP6f ifade etmek için kullanılmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bütün hayvanlar kullanılan ve bu çalışmada yürütülen iletişim kuralları uyarınca Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları... Tüm yordamları kurumsal hayvan kullanımı ve bakımı Komitesi, University of Nevada, Reno tarafından kabul edildi.

1. nesil KitGCaMP6f fareler

Ai95 cross (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f fareler) ve c-Kit^{+/ Cre-ERT2} (Kit-Cre fareler ICC belirli GCaMP6f ifade hayvanlar (Kit-Cre-GCaMP6f fareler) oluşturmak için).
Not: GCaMP6f lokalize raporlama içinde bildirilen verimlilik nedeniyle kullanılan, kısa intrasellüler Ca^{2 +} in situ olarak ve içinde vivo⁵⁴sinyalleri.
Kit-Cre-GCaMP6f fareler Cre Recombinase harekete geçirmek ve sonraki GCaMP6f ifadede ICC (Şekil 1) ikna etmek için 6 – 8 hafta yaşları itibariyle tamoxifen ile enjekte.
1. Tamoxifen çözüm oluşturmak için 80 mg Tamoxifen dağıtılması ( Tablo malzemelerigörmek) 800 μL etanol içinde ( Tablo malzemelerigörmek) bir küvet ve 20 dakika için girdap.
2. Aspir yağı (genel) 20 mg/mL çözümleri oluşturmak ve sonra 30 dakika kala enjeksiyon için solüsyon içeren temizleyicide 3.2 mL ekleyin.
3. Fareler (mayi enjeksiyon; enjekte IP) 0.1 mL tamoxifen çözeltisi (2 mg tamoxifen) üç gün üst üste için ile. GCaMP6f ifade tarafından Genotipleme onaylayın ve 10 gün sonra ilk enjeksiyon fare kullanın.
  1. Her hayvan kulaktan küçük bir parça kırpma tarafından genotip fareler. Sonra sert çocuk yöntemi⁵⁵ için genomik DNA izolasyonu kulak klipleri NaOH 60 dk-75 ml için 95 ° C'de kuluçka ve Tris arabellek 75 mL tarafından etkisiz hale kullanın. Standart PCR genotip her hayvan, DNA 2 mL GCaMP6f belirli astar⁵⁶ile 20 mL tepki olarak belirlemek için kullanın. 10 mL PCR ürününün vahşi türünü belirlemek için % 2 özel jel üzerinde çalıştırmak (297 bp) ve mutant (~ 450 bp) bantları.

2. Ca^{2 +} görüntüleme için doku hazırlanması

Fare ile isoflurane Solunduğunda uyuşturan (% 4, bkz: Malzemeler tablo) havalandırılmış hood ve servikal çıkığı sonra kurban.
Keskin makas açık kullanarak fare, karın ince bağırsak çıkarın ve Krebs-zil bikarbonat çözüm (KRB) yerleştirin. İnce bağırsak mezenterik sınır boyunca açın ve herhangi bir intraluminal içeriği ile KRB silsin. Keskin diseksiyonlarının kullanarak, mukoza ve alt mukoza katmanları kaldırın.
Not: KRB çözümü var aşağıdaki kompozisyon (mM): NaCl 118.5, KCl 4.7, CaCl₂ 2.5, MgCl₂ 1.2, NaHCO₃ 23,8, KH₂PO₄ 1.2, dekstroz 11.0. Bu çözüm pH %7,4 95 O₂- %5 CO₂ile denge bubbled zaman 37 ° C'de vardır.
Küçük iğne, PIN 5 mL cilt, Sylgard kaplı 60 mm çapında çanak yukarı dönük olacak şekilde dairesel düz kas tabaka ile tabanına ince bağırsak dokusu kullanarak. 37 ° C'de ısıtılmış KRB çözümle hazırlık daha önce deneme 1 İK bir denge dönemi için sıvı.
Bu denge döneminden sonra gerçekleştirmek yerinde Ca^{2 +} görüntüleme küçük bağırsak ICC MY ve ICC DMP confocal mikroskobu (Bu iletişim kuralı Albümdeki alınan bir iplik-disk ile donatılmış confocal mikroskop ile) kullanarak. Yukarıda açıklanan turk yararları nedeniyle, yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış resimleri kullanmak (> 30 kare / saniye, FPS) Filmler ICC dinamik Ca^{2 +} sinyal elde etmek için yüksek güç hedefleri (60-100 x) ile birlikte.
Not: Doku hareketi azaltmak için nicardipine uygulamak (0.1-1 mikron)³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹daha önce açıklandığı gibi kayıtları sırasında.
Ayırt ICC MY ve ICC-DMP içinde onların farklı anatomik konumu, Morfoloji ve bazal Ca^{2 +} etkinlik kalıpları kullanarak ince bağırsak.
1. Bulun ICC-MY myenteric pleksus, ince bağırsak dairesel ve boyuna düz kas tabakaları arasında düzeyde. Onlar şeklinde, bağlı ağ (Şekil 3A) oluşturan yildiz seklinde. (Yukarıda açıklanmıştır) CTCs ~ 30 devir-dk normal bir olay ile ICC benim ağ üzerinden yaymak.
2. Diğer taraftan, ICC DMP dairesel düz kas katmanı ve submucosal pleksus arasında derin kas pleksus düzeyinde tek bir uçağı bulun. ICC DMP bir ağ oluşturmaz ve düzenli yayılıyor olaysız sergi ve bunun yerine Stokastik, yerelleştirilmiş intrasellüler Ca^{2 +} geçişler ateş şeklinde iğ hücreleri (Şekil 2A).
Kullanılan satın alma yazılım ne olursa olsun, film TIFF görüntüleri bir yığın kaydedin.

3. analiz sinyallerin Stokastik Ca^{2 +} ICC-DMP Spatio geçici eşleme (STM) kullanma

ICC DMP spatio geçici eşleme ImageJ yazılım (NIH, ABD, http://imagej.nih.jov/ij indirmek için ücretsiz) ve özel yapılmış yazılım (Volumetry, G8d, GWH, Mac OS üzerinde çalışır durumda Grant Hennig grant.hennig@ iletişim sürüm'in birleşimiyle analiz Med.UVM.edu ile ilgili Volumetry erişim ve kullanım için sorar)
Not: Tamamen yalnız ImageJ ile kendisinin zamansal bu haritalar analiz etmek için alternatif bir yaklaşım daha sonraki bölümlerde (adım 3.9 başında) mevcuttur.
Volumetry açın ve film dosyaları içeren klasörleri açmak için sağ fare tıklatma kullanın. Yaptı (sıkıştırılmamış TIFF biçiminde olmalıdır) Volumetry açmak için analiz edilecek film dosyasını tıklatın. Bir kez açıldı, filmin geniş bir alana sağ ekranın kapsayacağı mavi sınır içinde pencere (film pencere) bulunan olacak. Ekranın sol tarafındaki çizim penceresinde (üst 4/5 ini farktan çıkarırız) ve izlemeler penceresinde (alt 1/5^inci) içerir.
Filmin boyutları SHIFT tuşuna basılı tutmak ve aynı anda (MMB, azaltır boyutu) farenizin orta düğmesiyle kaydırma veya aşağı (boyutunu artırır) MMB ile kaydırma ayarlayın. Başlatmak veya 'A'; basarak oynatmayı durdurmak kayıttan yürütme hızını basarak yukarı ve aşağı ok tuşları ayarlanabilir.
Volumetry kullanarak bir STM oluşturmak için tıklatıp farenin sol düğmesine sürükleyerek sırasında ÜSTKARAKTER tuşunu basılı tutarak bir yatırım getirisi tüm bir hücreyi çizin. ROI yönünü ROI köşelerindeki MMB ile kaydırarak ayarlayın. Yatırım getirisi ne zaman yerinde çözümlenmesi için hücrenin üstünde (Şekil 2A), kullanım erişmek için film penceresinde sağ tıklama ' yatırım getirisi STMs – STMyAvg > xRow' ve Çizim penceresinde bir STM cep faaliyet oluşturmak için sol tıklayın (seçmek için bir seçenek ' STMxAvg > yRo w ', hangi biri seçili olup hücre yönünü daha x ile hizalanır üzerinde bağlıdır veya y ekseni, örneğin hücre vurgulanan Şekil 2A daha y ekseni üzerinde yönelik').
Sol klik STM Çizim penceresinde üzerinde ve ortalama arka plan gürültü çıkarma ve STM kontrastı arttırmak için ' H' basın ' P' tuşuna basın. STM 'STM yük Kaydet - kaydetmek STM .tif olarak' erişmek için üzerinde sağ tıklayarak ve ardından sol tıklatarak bir TIFF olarak kaydetmek için Kaydet.
ICC DMP analizini kalan ImageJ içinde yapılacaktır. ImageJ monitör ve bir mobil kullanıcı arabirimi üzerinde sabit bir konuma taşıyan bir araç çubuğu iki ana bileşenden oluşur. ImageJ kullanarak, ICC DMP Ca^{2 +} etkinlik (görüntü J araç çubuğundaki Dosya-Aç) STM TIFF dosyasını açın.
Açık Volumetry dikey odaklı zamanınız olacak STM oluşturdu. ImageJ TIFF dosyaları olarak RGB veya 16-bit görüntüleri otomatik olarak açılır. 'Görüntü kalitesini artırmak için resmi tıklayın sol klik ' ImageJ araç çubuğunda. İlk seçenek üzerinde kaydırma ' yazın 'açılır menü çeşitli resim biçimlerinin ortaya çıkarmak için kaydırma ' 32-bit üzerinde' ve değiştirmek için sol tıkla.
STM sağa soldan zamana karşı kolay okunur hale getirmek için sol aşağıdaki yolda ImageJ araç çubuğunda tıklayın: 'Görüntü dönüşüm Döndür 90 derece sola'. STMs linescans ImageJ Volumetry ve bu yalnız ile kullanarak^{2 +} etkinliğini aşağıda ayrıntılı in situ olarak Ca'nın oluşturmak da mümkündür.
Not: STMs oluşturulduktan sonra onlar ne olursa olsun yazılım onları oluşturmak için kullanılan aynı şekilde incelenir. STMs ImageJ içinde oluşturmak için bu alternatif yöntemi atlamak için 3,19 adıma atlayın.
STMs ImageJ ile oluşturmak için ICC DMP Ca^{2 +} etkinlik (ImageJ araç çubuğundaki Dosya-Aç) kaydını oluşturan TIFF dosyaları yığını açın. ImageJ TIFF dosyaları olarak RGB veya 16-bit görüntüleri otomatik olarak açılır. 'Görüntü kalitesini artırmak için resmi tıklayın sol klik ' ImageJ araç çubuğunda. İlk seçenek üzerinde kaydırma ' yazın 'açılır menü çeşitli resim biçimlerinin ortaya çıkarmak için kaydırma ' 32-bit üzerinde' ve değiştirmek için sol tıkla.
Arka plan gürültü (otomatik floresans veya kamera gürültüden kaynaklanan) Şimdi filmden düşülen. Sol ImageJ arabirimi 'Dikdörtgen seçim' işlevinde tıklayın ve bir yatırım getirisi (tarafından sol tıklayarak ve sürükleyerek istediğiniz boyuta ve şekline) film arka plan floresans üzerinde çizin.
ROI seçtikten sonra yaptı 'Analiz et' ImageJ araç çubuğunda tıklatın ve sonra yaptı 'Histogram' elde edilen açılır menüsünü tıklayın. Bir pop-up kutusu sonra hesaplamak için piksel aralığı değerleri hakkında soran görünür; ImageJ 'OK' yatırım getirisi önceden seçilmiş çok sol tıklama değerler var.
'Tamam' tıkladıktan sonra piksel gürültü arka plan içinde yatırım getirisi için değerleri dağılımını gösteren bir çubuk grafik içeren yeni bir pop-up kutusu görünecektir. Çubuk grafik listelenen ortalama değeri not alın ve sonra açılır kutusunu kapatın.
32-bit filmin tıklatın ve tüm FOV sol '' Seçim' kaydırma ve yaptı 'Select All üzerinde' tıklayarak ImageJ araç çubuğunda Düzenle' ortaya açılan menüden tıklayarak seçin.
Yaptı 'İşlemi' ImageJ araç çubuğunda tıklatın, 'Matematik' ilerleyin ve sol 'Çıkar' ortaya açılan menüden tıklayın.
Bir açılan kutu-ecek gözükmek nerede bir değer FOV düşülen eklenebilir. Histogram adım 3.12 Yukarıdaki içinde elde ortalama değeri girin ve 'Tamam' ı tıklatın. ImageJ sonra TIFF yığınındaki tüm çerçeveleri işlemek soracaktır (ve sadece tek kare film şu anda üzerinde). 'Evet' i tıklatın.
'Evet' tıkladıktan sonra filmin siyaha dönecek. 'Bu sorunu gidermek için resmi tıklayın sol klik ' ImageJ araç çubuğu ve kaydırma 'Ayar' üzerinde. Sol 'Parlaklık/kontrast' (B & C) için ortaya ilk seçeneği tıklayın. Bu-ecek büyütmek nerede parlaklık ve kontrast çeşitli yönlerini değiştirilebilir kutusu açılır. Sol artan kalite film ortaya çıkarmak için bir kez 'Otomatik' seçeneğini tıklayın. Bu B & C kutusunu açık ileride kullanmak için pop bırakın.
Bir Lınescan oluşturmak için önce sağ çizgi seçim aracı seçenekleri farklı satırları için ortaya çıkarmak için ImageJ arayüzü tıklayın; yaptı 'Kesimli Line' listeden seçmek için tıklatın. 'Kesimli Line' aracı seçiliyken kullanım tek yaptı bireysel bir ICC dmp orta eksen boyunca bir çizgi çizmek için bunu tıklatır. Her tek sol tıkırtı-ecek saptamak yolun belirli bu noktada ve satır sonra serbestçe daha herhangi bir istenen açıda hareket edebilir. Yolun tamamlandığında, çift yaptı hat yerde düzeltmek için tıklatın.
'Resmi tıklayın sol klik ' ImageJ araç çubuğu ve kaydırma 'Yığınları üzerinde' ve 'Reslice' seçeneği tıklayın bıraktı. Bir pop-up kutusu görüntülenir; yaptı 'Döndür 90 derece' seçeneğine tıklayın, böylece kalibre ve alanı y ekseni üzerinde olan x ekseni, zamana karşı okumak bu Lınescan soldan sağa doğru yönlendirmek. STM oluşturmak için ' Tamam' tıklatın.
STM yoğunluğu üzerinde gri tonlama olarak beyaz, beyaz veya açık gri bağlı olarak onların yoğunluğu kapalı değişen derecelerde gösterilen yüksek yoğunluklu Ca^{2 +} sinyalleri ile oluşturulur. Normalde, oluşturulan Lınescan karşıtlığını gelişmiş olması gerekir. Bunu B & C pop ' otomatik' kutusunu tıklatarak.
Lınescan floresan yoğunluğu STM rasgele piksel değerleri üzerinde sunulur. Doğru Ca genliği ölçmek için^{2 +} sinyalleri STM, floresans değerleri, STM (F) şimdi normalleştirilmiş gerekmektedir. 'Dikdörtgen seçim' işlevi ImageJ arabirimini kullanarak, bir yatırım getirisi en düzgün ve en az yoğun alanı, floresan (F₀) görüntüler STM alan üzerinde çizin.
Seçili ROI içinde yoğunluğunun ortalama değeri (F₀) elde etmek için 3.11-3.12 içinde geçen adımları yineleyin ve sonra tüm STM yaptı 'Düzenle-seçimi-Select All üzerinde' ImageJ araç çubuğundan tıklatarak seçin.
Sol 'İşlemi' ImageJ araç çubuğu ve kaydırma 'Matematik'; için tıklayın Sol 'Bölmek' ortaya seçenekler arasından tıklayın. Sonraki açılan kutusuna 3.21 adımından elde edilen ortalama değeri (F₀). Tüm STM (F₀) bölme üzerine STM siyaha dönecek; Bunu 'Otomatik' i tıklatarak B & C kutusunu pop düzeltin. Lınescan Şimdi F/F₀ifade edilen floresan yoğunluğu ile genlik için kalibre edilmiş.
STM Şu anda x ekseni üzerinde TIFF yığındaki çerçeve sayısı ve hücre y ekseni üzerinde uzunluğunu temsil eden piksel sayısını görüntüler. Zamansal ve mekansal bilgi Ca^{2 +} sinyalleri ölçmek için uzay ve zaman için STM kalibre edin. 'Resmi' ImageJ araç çubuğunda tıklayın sol klik ve "Properties" tıklayın bıraktı. Bir pop-up kutusu görüntülenir. Bu pencere içinde tamamen STM ayarlamak için uygun değerleri girin.
'Piksel genişlik için', o saniye içinde tek bir kare yakalamak için gereken süreyi girin. Örnekler için 5 fps, 0,2 değerini girin, 50 FPS girmek için 0,02, 33 FPS için değerini 0,033 vb değerini girin. 'Piksel yükseklik' için kaç mikron her piksel temsil eder (kullanılan objektif ve kamera satın alma için kullanılan üzerinde bağlıdır) girin. 'Voxel derinlik' 1'de "OK"'yi tıklatmadan önce yaptı. Başka parametre pencere içinde ayarlanması gerekir.
Not: "OK" tıkladıktan sonra STM tam genlik, uzay ve zaman için kalibre. STM genlik olarak x ekseni üzerinde F/F_0,saati saniye cinsinden belirtilecektir ve alanı y ekseni üzerinde mikron (2B rakam) ifade edilebilir belirtilecektir. CA^{2 +} STM olaylara ölçülecek hazırsınız, kalibre edilmiş STM daha sonraki bir tarihte analiz etmek için tek bir TIFF görüntüsü olarak da kaydedilebilir.
ImageJ renk kodu STM için kullanılabilecek renk kodlu arama tablosunda (AÜSS) inşa edilen bir dizi vardır. 'Resim-arama tabloları' yolundaki ImageJ araç çubuğunda sol tıklayarak bir yerleşik LUT uygulamak ve bir LUT uygulamak için seçin. Özel AÜSS yaptı 'Dosya-ithalat-LUT' yolundaki ImageJ araç çubuğundaki düğmesini tıklatıp sonra alınacak LUT seçerek STM için de alınabilir. Örneğin Şekil 2C içinde gösterilen STM alanlarında yoğun Ca^{2 +} floresans ve düşük Ca^{2 + alanları olarak soğuk renkler (siyah, mavi) olarak 'QUBPallete' (Queens University Belfast, UK), kod sıcak renkler (kırmızı, turuncu) için uygulanan özel LUT olmuştur}floresan.
Çeşitli renklerle temsil genlikleri aralığını belirtmek için bir genlik kalibrasyon çubuğunu eklemek için 'Analiz et' ImageJ araç çubuğundan tıklayın bıraktı, 'Araçlar' gidin ve 'Kalibrasyon Bar' ortaya menüsünden seçin. Seçenekleri verilen boyutu, zoom, aralığı ve STM kalibrasyon çubuğu; konumunu için Bu ayarları istediğiniz gibi ve 'Tamam' ı tıklatın. Kalibrasyon çubuğu eklediğinizde, ImageJ sağlam ve ayrı kalibrasyon çubuğu olmadan orijinali bırakarak, içeren yeni bir STM oluşturduğuna dikkat edin.
Not: Kalibrasyon bar eklerken 'Yerleşimi' kutusunu işaretli ise, yeni bir STM oluşturulmaz.
Tek tek Ca^{2 +} olayları analiz başlamak için ImageJ arabirim üzerinde 'Düz çizgi' seçici üzerinde sol tıklayın. Başlangıçta sol STM tıklayarak, düz yatay bir çizgi bir Ca^{2 +} olay Merkezi aracılığıyla paralel olarak x ekseni (zaman karşı) çizin. Satır ikinci kez (Şekil 2B) sol tıklayarak tamamlayın.
'Analiz et' ImageJ araç çubuğunda tıklatın ve 'Arsa profili' tıklayın bıraktı. Yeni bir kutu-ecek gözükmek Ca^{2 +} olay (Şekil 2E) Arsa kasalı.
Not: Bu kutu içinde 'Listesi' seçeneği çok istenirse izlemeler oluşturmak için bir elektronik tablo programına kopyalanabilmesi için oluşturulan Arsa XY değerlerden oluşan bir liste oluşturacaktır.
^{Arsa profilinde temsil Ca 2 +} olay genliği ölçmek için ImageJ arabirimde 'Düz çizgi' seçici üzerinde sol tıklayın. Sonra dikey bir çizgi Arsa profil satır taban çizgisinden Ca^{2 +} olay zirveye çizin; (ImageJ arabiriminde gösterilen) çizgi uzunluğunu ΔF/F₀ (Şekil 2E) ifade olay genliğini temsil edecek.
Edinsel genlik değeri kullanarak, Ca^{2 +} olay süresi % 50 en yüksek genlik (tam süre sonunda yarım maksimum genlik, FDHM) noktasında olay genişliği arasında düz bir çizgi çizerek ölçülebilir veya etkinliğin süresi (2E rakam) istenirse ölçülen.
Not: Denemecileri eşik geçerli Ca^{2 +} olaylar bu kayıtları için belirli ölçütlere tasarım gerekir. Bizim deneylerde Eğer onun genlik analizi için geçerli olacağı Ca^{2 +} olayları özel İçilir > kayıt denetimi bölümünde en fazla genlik olay % 15. Ancak, bu eşikleri üzerinde belirli dokulara bağlıdır ve hücrelerin altında çalışma ve doku ve hücre her türü için belirli optimizasyonu gerektirir sadece rasgele kurallar vardır.
Upstroke veya downstroke Ca^{2 +} olay komplo profili boyunca bir çizgi çizerek, artış veya düşüş oranı buna göre hesaplanabilir. Çizgi çekildikten sonra fare imleci satır başlar ve biter noktasına taşınabilirler. İmleç bu puan üzerinden sabit olduğunda, x, y koordinatları bu konum için ImageJ arayüzü sol alt tarafında görüntülenir. Böylece, elde tarafından x, y değerleri yolun başladığı için (x₁, y₁) ve biter (x₂, y₂), artış veya düşüş (ΔF/s) oranı satırının, y₂- y₁ / x₂- x₁ (Şekil 2F eğim olarak hesaplanabilir ).
Yayma veya kayma bir Ca^{2 +} olay yayılmasını hesaplamak için ImageJ arabirim üzerinde 'Düz çizgi' seçici üzerinde sol tıklayın. Sonra Ca^{2 +} olay y ekseni boyunca uzunluğu boyunca düz dikey bir çizgi çizin. (ImageJ arabiriminde gösterilen) çizgi uzunluğunu mikron (Şekil 2 g) ifade edilen olay kayma yayılmasını temsil edecek.
Yayılıyor Ca^{2 +} olay hızının olay yayılıyor cephesi boyunca bir çizgi çekerek ve hesaplama çizgisinin eğimini belirler. Bu adımda malzemelerini 3,32, x, y değerleri yolun başladığı için açıklanan benzer bir şekilde el ile gerçekleştirilebilir (x₁, y₁) ve biter (x₂, y₂); fare imlecini STM üzerinde yer alan bu değerler ImageJ arabirimi sol alt tarafında görüntülenir.
Ca^{2 +} olay miktar için istenen parametreler koleksiyonu, hücre başına temelinde her parametre için ortalama değerleri oluşturmak için bu değerleri ortalama havuz; Alternatif olarak, tüm ham değerleri onların aralığı (Şekil 2 H) göstermek için bir dağıtım histogram içinde yazın.

4. CTCs ICC-MY kullanarak parçacık quantification analizi dayalı

Volumetry PTCLs ile filmlerde analiz daha önce film kayma ve temporal kalibrasyonu dosya adını eklenecek gerekir. Volumetry içinde başlık içinde her kare eşittir ve ayrıca her piksel eşittir mikron sayısı ayrılmış saniye sayısını içeren tek bir tire ile köşeli ayraçlar içine kaplı değerleri ile çözümlenmesi için tüm dosyaları düzenleyin. Örneğin, 33 FPS'de 60 x amacı (512 x 512) ile alınan bir film [0,22 – 0.033] olması gereken dosya adını eklenmiş.
Volumetry açın ve film dosyaları içeren klasörleri açmak için sağ fare tıklatma kullanın. Sol Volumetry (Şekil 3A, sıkıştırılmamış TIFF biçiminde olmalıdır) açmak için analiz edilecek film dosyasını tıklatın.
Doğru bir şekilde Ca^{2 +} sinyal--dan tüm FOV hesaplamak için filmin ilk farklılaşma ve arka plan parazit (kamera gürültü, Otomatik floresan vb) kaldırıp sinyal gürültü oranı artırmak için Düzgünleştirme geçirecek. Film penceresinde, bir menüyü getirmek ve sağ tıklama erişim ' STK filtre-ayırt etmek ', kullanarak sağ tekrar ayırt etmek için bir değer girişi tıklayın sağ tıklayın ENTER tuşuna basın ve sol tıklayın uygulamak için (film 33 FPS 2 değeri elde için (∆t ± 66-70 msn =) iyi çalışıyor değeri görüntü yakalama artış oranı artar).
Not: Bu bağlamda farklılaşma alanlarında yoğunluğunu azaltacak belirtilen kare sayısı üzerinde hiçbir dinamik etkinliğini gösteren kayıt (piksel). Bu nedenle, '2' değeri eklediyseniz, her çerçeve kayıt kümedeki her pikseli rasgele analiz edilir ve eğer bu çerçeve içinde piksel floresans 1 kare önce ve sonra 1 kare bir dinamik değişiklik yok, yazmak--dan o piksel yoğunluğu düşülen. Böylece, dinamik olmayan arka plan gürültü kaldırılır ve sinyal-gürültü artar.
Farklılaştırılmış film Gauss filtre uygulayarak düz. Bir menüyü getirmek için film penceresinde sağ tıklayın ve sağ tıklama erişim 'STK filtre-Gauss KRNL' kullanarak, sağ daha bir değer eklemek için tıklayın (her zaman bir tek sayı kullanın, 33 FPS elde filmler için 5 değerini inşaat su kuyusu, 1.5 x 1,5 µm STDSAPMA 1.0) bir değer giriş, ENTER tuşuna basın ve sol tıklayın (Şekil 3B) uygulamak için.
Bir süre bir CTC ve ayrıca 20-40 kare oluşumunu CTC sonra ardından sakin bir dönem (20-40 kare) içerir filmin seçerek PTCLs oluşturmak için başlatın. Bunu yapmak için sağ sol tarafındaki sarı çubuğu kaydırmak için MMB kullanarak film boyunca ilerleyin.
Yapılan seçim ile kullanım sağ penceresinde film 'STK Ops-rampa DS PTCLinfo' erişim ve sol tıkırtı uygulamak için tıklama. Bu işlev aşamalı olarak maksimum yoğunluk eşiğine en düşük yoğunluk derinliklerini PTCL analiz rutin çalışır. Bu grafik olarak gürültü bir komplo olarak çizim penceresinde ve izlemeler penceresinde üç renkli izleme, olarak PTCLs, sayısı ortalama PTCL boyutu gösterilen Kırmızı izleme gösterilen yeşil izleme ve mutlak yoğunluğu gösterilen mavi izleme ile görüntülenir eşik.
Not: PTCLs sayı ve ortalama boyutunu her eşik, otomatik olarak hesaplanır ve sonra yarı manuel bir eşik şiddeti hangi kullanarak uygulanır PTCLs ortalama büyüklüğü düşmesi, kırmızı izlemesinde dönüm noktası oluştuğu başladığı, İzleme penceresi (şekil 3D, yani dağınık şekilde sınırlı gürültü PTCLs ortalama boyutunu küçültme PTCLs çok sayıda nedeniyle).
Çizim penceresinde 'H' PTCL gürültü gösterilen arsa çubuk grafik dengelemek için tuşlarını kullanın. Basarak renk düzenleri arasında geçiş yapma ' [' arka üst renkli izleri olan renkli beyaz olana.
Bir ölçme aracı getirmek ve kesişme noktalarında arsa üzerinde sol klik "F" nerede renkli araziler sağ tarafı için shift tuşuna basın. Bu tek bir dikey çizgi izleri pencerenin kaydırma çubuğundaki işaretler.
İşaretli beyaz dikey satır 4,10 adımda oluşturduğunuz ve mavi izleme üzerinde sağ tıklayarak seçili olduğundan emin yapma 't-ecek var olmak göstermek yAVG' kapalı okumak kadar izleme penceresi içinde MMB sola sağa kırmızı izleme dönüm noktasından gidin İzleme penceresinin sol tarafı daha düşük. Seçimi MMB izlemeler penceresinin içinde bir kez basarak seçimini kaldırın.
Film penceresi içinde bir renk tekerleği getirmek için ' C' tuşlarına basın, sonra basın istiyorsunuz ' eşik ayarlamak için. Geçerli PTCLs şimdi film pencere (Şekil 3 c) ve bu da emdirmek kırmızı beyaz olarak görünür. Beyaz alanlar sol fare düğmesi ile yukarı kaydırarak çıkarın.
Yukarı veya aşağı MMB renk tekerleği sarı sayısal değeri ayarlamak, bu değer 4.11 adımını yAVG değerine ayarlamak için tuþuyla ilerleyin. Bu kırmızı olarak bir etkin Ca^{2 +} her şey atar belirlenen eşik noktada geçici PTCL. Bu koordinat tabanlı parçacık dosyası olarak kaydetmek için kullanım sağ erişim için tıklama ' STK 3D-Save PTCLS 0' ve sonra sol tıklayın dosyayı kaydetmek için.
Volumetry çıkın ve yeniden açın. 4.13. adımda oluşturduğunuz PTCL dosyasını (.gpf dosyası) açın. Bu dosya türünde tüm etkin Ca^{2 +} geçişler Tekdüzen mavi PTCL (Şekil 3E) kaydedilir. Her PTCL kendi kimliği, alan ve çevre koordinatları, Devlet bayrakları (aşağıya bakın) ve sonuç dizileri ile bireysel bir varlıktır, analiz spatio-temporal özellikleri PTCLs veya PTCLs arasında kesintisiz hale getirilir.
PTCLs çözümlemesi'ni başlatmak için kalan PTCL gürültü (.gpf dosyası oluşturulduğunda oluşturulan küçük geçersiz PTCLs) erişmek için film penceresinde sağ tıklama kullanarak kaldırın ' PTCL STKOPS-bayrak ptcls > dk 70' = ve uygulamak için tıklayın bıraktı. Bu eylem-ecek bayrak PTCLs 6 µm² ' den büyük (~ çapı > 2µm) ve Volumetry 'Bayrağı 1' seçim için onları atamak. Bu tamamlandığında, onların temel mavi rengi (Şekil 3F) herhangi bir PTCLs eşiğin altında kalır, ancak bu eşiğin (bayrak 1) olan PTCLs film penceresinde, bir ışık mor renk olarak görünür.
Erişmek için film penceresinde sağ tıklama kullanarak ısı harita temsilleri PTCL etkinlik oluşturmak ' PTCL STKops StatMap bayrak ='. Bu yolu üzerinde sağ tıklayarak, analiz etmek için bir bayrak atama girilebilir. Böylece, Bayrak1 için atanmış PTCLs ölçmek isteyen varsa, sadece '1' girin, ENTER tuşuna basın ve sonra sol tıklayın uygulamak için. Bu kayıt, tüm uzunluğu için toplam PTCLs oluşumu (%) kaydı boyunca temsil eden farklı renklerle gösterilen bir ısı haritası oluşturur (Şekil 3 g, sıcak renkler belirtmek bu konumda artan oluşumu).
Isı haritaları onları 'STM yük Kaydet - kaydetmek STM .tif olarak' erişmek için doğru tıklayarak ve ardından sol tıklatarak bir TIFF olarak kaydetmek için Kaydet.
Erişmek için film penceresinde sağ tıklama kullanarak PTCL etkinliğini ölçmek ' PTCL ölçü-PTCLStats STK =', bu yolu üzerinde sağ tıklayarak, analiz etmek için bir bayrak atama girilebilir. Böylece, Bayrak1 için atanmış PTCLs ölçmek isteyen varsa, sadece '1' girin, ENTER tuşuna basın ve sonra sol tıklayın uygulamak için. Bu izleme penceresinde izleri bir dizi oluşturur.
Volumetry varsayılan olarak üst üste 4,17 adımda oluşturulan PTCL izleri üst üste. Onları ayırmak kullanarak sağ tıklama 'Hizala-ayrı izleme' erişim ve sol tıkırtı uygulamak için izleme penceresinde. Bu karşı zaman (Şekil 3 H)^{2 +} PTCL etkinlik PTCL alanı (yeşil), PTCL sayısı (kırmızı), PTCL boyutu (mavi) ve PTCL boyutu standart sapma (mavi) gösterilen filmde çizilen Ca ölçmek dört farklı PTCL izleri ortaya çıkaracaktır.
Bu izleri daha ayrıntılı analiz için bir elektronik tablo programına alınan bir metin dosyası olarak kaydedilebilir. İzlemleri kaydetmek, SHIFT tuşunu basılı tutun ve kullanmak için 'Metin olarak Assorted dökümü ROI' erişmek ve dosyayı kaydetmek için sol tıklama için izleme penceresinde sağ tıklama. Bu bilgiler daha sonra toplanan ve çubuk grafikler ya da diğer uygun grafik gösterimlerden (Şekil 3 H).
PTCLs (siteleri ateş bakmak içinYani, ) ilk geçtiği bakmak için bu ilk PTCLs farklı bayrak atama verilir. Siteleri ateş daha iyi izole etmek için ağ, yalnızca önceki kare ancak örtüşme herhangi bir parçacık parçacıklar sonraki 70 MS ile ile örtüşme değil PTCLs içinde meydana gelen olarak kabul edilir siteleri ateş.
Bu eşik uygulamak için kullanım sağ erişmek için film penceresinde tıklama ' PTCL davranış-F1 InitSites > F = 3' ve sol tıkırtı uygulamak. Bu PTCLs 'bayrak 3' başlatılıyor atar ve bu ölçüte uyan PTCLs şimdi film (Şekil 4A) kireç yeşil renkte görünür.
Volumetry da ölçmek ve ateş bir CTC sırasında onların olasılığı komplo yanı sıra belirli bir FOV PTCL ateş sitelerin sayısı Arsa olanağı tanıyor. Bu parametreler analiz etmek, PTCLs (bayrak 3) 4.16 (Şekil 4B) adımda anlatıldığı gibi başlatılması bir ısı haritası oluşturun.
Çizim penceresinde sol tıklayın ve bir renk çarkı ve basın kadar getirmek için 'C' tuşlarına basın istiyorsunuz ' eşik için. PTCLs olacak o zaman çevirmek gri ve beyaz başlatılması ısı haritası. Kaldır yalnızca geçerli PTCLs gri renkle ele kadar sol fare düğmesi ve eşik ile PTCLs ısı haritası içinde kaydırarak bembeyaz (eşik MMB ile yukarı ve aşağı kaydırarak ayarlayın).
Kullanım 'STM PTCLs-bul PTCLs 70' erişmek ve sol tıkırtı uygulamak için Çizim penceresinde ısı haritası üzerinde sağ tıklama. Bu 70 piksel² ayrı renk kodlu başlatma PTCL ya da site (Şekil 4 c) ateş PTCL tahsis edilecek boyutu daha büyük harita tüm gri PTCLs atar.
Faaliyetin her zamana karşı bu ateş sitelerin yanında doğru tıkırtı uygulamak için harita ve 'STM PTCL PTCLs oluşturmak rois' erişim ve sol tıklayarak ateş PTCL üzerinde çizmek. Bu bir yatırım getirisi çevrelerindeki ile görüntülenen siteler ateş tüm ayrı renkli PTCL ile film penceresinde yeni bir resim oluşturur.
Kullanım sağ tıklama erişmek için film penceresinde ' PTCL ölçü-PTCLpixROIBM > = 1' ve uygulamak için tıklayın bıraktı. Bu tüm faaliyetlerin içinde bu ROIs izlemeler penceresinde çizmek ve en az bir PTCL içeren tüm ROIs film penceresinde tanımlar. Varsayılan olarak, bu izleri birbirine eklenmiş. Onları ayırmak için kullanım sağ 'Hizala-ayrı izleme' erişim ve sol tıkırtı uygulamak için izleme penceresinde tıklama. İzlemleri kaydetmek, SHIFT tuşunu basılı tutun ve kullanmak için 'Metin olarak Assorted dökümü ROI' erişmek ve dosyayı kaydetmek için sol tıklama için izleme penceresinde sağ tıklama.
Her ateş site etkinliğini de bir olay harita çizilebilir. Bunu yapmak için kullanım sağ erişmek için film penceresinde tıklama ' PTCL ölçü ROI piyanola 10' = ve uygulamak için tıklayın bıraktı. Bu zamana karşı tüm ateş sitelerin bir arsa Arsa penceresinde oluşturur. Her ateş site ayrı ayrı renkli bir varlık, her biri kendi 'şeritte' olarak görüntülenir ve bu araziler (Şekil 4 dE) CTCs sırasında başlatılıyor Ca^{2 +} PTCLs sağ erişmek için üzerlerine tıklayarak bu olay haritalar kaydet karşılık ' STM Yük kaydet - STM .tif olarak Kaydet ' ve ardından sol tıklatarak bir TIFF olarak kaydetmek için.
Her atış yerinde ateş sırasında bir CTC olasılığını ölçmek için kullanım sağ erişmek için film penceresinde tıklama ' PTCL davranış işaretidir = 1' ve uygulamak için tıklayın bıraktı. Bu eşiğin PTCLs içeren tüm çerçeveleri film tanımlayacak ve bunlar film penceresinin altında dikey mavi çizgiler olarak işaretlenir.
CTCs hızlı zaman uyumsuz firing FOV ~ 1 s boşluklar arasında her CTC döngüsü ile içinde birden çok ateş sitelerden kümeleme olarak tezahür. Bu düzenlilik ve hiçbir etkin PTCLs CTCs arasında uzun boşluk daha fazla çözümleme için bir CTC tanımlamak için kullanılır.
Kullanım sağ tıklama erişmek için film penceresinde ' PTCL davranış BLOKTUR boşluğu < =' ve bir sağ tıklama üzerinde son nokta kullanarak bir numara girin. Bu komut bloklar halinde 4,28 adımda tanımlanan etkin PTCL çerçeve gruplandırır ve blok etkin PTCLs ayrı kare sayısına göre. 33 FPS kayıtlar için 10 değerini iyi çalışıyor. Eğer etkin PTCLS az 10 çerçeveleri ayrı (330 ms) tek bir bloğu (blokları daha sonra pembe dikdörtgenler olarak film penceresinin altındaki dikey mavi çizgiler üzerinde şimdi bir CTC gösteren her pembe dikdörtgen ile gösterilir) analiz için toplanır;
Kullanım 'PTCL ölçü-PTCL olay Prob' erişmek için film penceresinde sağ tıklama. Bu bir elektronik tablo programına alınan bir metin dosyası oluşturur. Bu metin dosyası veri büyük bir miktar adımları 4,16-4.23 ve katkılarından CTCs için tanımlanmış başlatma siteleri niteliğine sağlayacaktır.
Not: Metin dosyası ('etki' anılacaktır) başlatma sitelerin sayısı Haritayı piksel ve μm kalınlığında², olasılık her iki kez ateş her başlatma sitenin veya birden çok kez (% verilir) her CTC sırasında sitedeki boyutunu ortalama süresi ve boyutu Bu inisiyasyon sitede, (olarak tanımlandığı adım 4.23) CTC döngü sayısı ve her CTC döngüsü sırasında ateş ateş siteleri yüzdesi meydana gelen PTCLs. Bu bilgiler toplanır ve çubuk grafikler ya da diğer uygun grafik gösterimlerden (Şekil 4F).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kit-Cre-GCaMP6F fareler (Şekil 1), gastrointestinal sistem ICC davranışlarını yerinde yansıma sinyali dinamik Ca^{2 +} kullanarak. Confocal mikroskobu ile ICC belirli nüfusun yüksek çözünürlüklü görüntüler aynı doku içinde ancak odak (Şekil 2A)³⁷ anatomik olarak farklı uçaklarda ICC diğer nüfus gelen sinyalleri bulaşıcı olmadan elde edilebilir ^, ³⁹ ^, ⁴⁰ ^, ⁴¹. kayda kısa mümkündür (< 100 ms), membran geçirgen Ca^{2 +} göstergeleri ile mümkün değildi Ca^{2 +} olayları yerelleştirilmiş. Volumetry veya ImageJ yazılımı ile kendisinin geçici eşleme STMs tüm olayların Ca^{2 +} hücreler in situ olarak içinde oluşturmak için kullanılabilir. Bu yaklaşımı kullanarak, Ca^{2 +} tüm FOV olaylarda görüntülenmeyecektir ve sadece tek bir yatırım getirisi sınırlı aktivite kaydı yerine (Şekil 2BC), eşleştirilmiş. Bu yöntemler belirli bir FOV içinde her hücre için Genişletilebilir, sağlanması temsilcisi veri toplama--dan tüm hücreleri ve göreli genlikleri, geçici süreler, artış oranı ve geçişler, sonbahar hakkında kantitatif bilgi sağlama (Şekil 2E vb , F). STM analiz, yatırım getirisi tabanlı yoğunluğu araziler, aksine de monitör ve kayıt mekansal özellikleri, Şekil 2 giçinde gösterildiği gibi kayma yayılması ve yayılma hızı, gibi sinyal Ca^{2 +} yeteneğini sağlar. Bu bilgiler davranışları doğal ortamlarında (Şekil 2 H) hücrelerdeki sinyal Ca^{2 +} bir daha doğrusu tam görünümünü sağlamak için topladığı.

PTCL analiz birbirine bağlı hücresel ağlar içinde meydana gelen bu gibi davranışlar sinyal daha karmaşık Ca^{2 +} ölçmek için kullanılabilir. Bu uygulamalara örnek olarak ICC MY (Şekil 3Aüzerinde) gerçekleştirilen analiz tarafından sağlanır. Genellikle bu tür karmaşık hazırlıklar, arka plan gürültü ve sinyal-gürültü bir sorun olabilir. Ancak, Ca^{2 +} faaliyet film üzerinde değişiklik ve düzeltme filtreleri uygulamak için Volumetry yazılım kullanarak ve sonra gürültü (Şekil 3B-D) arka plan gürültü filtre uygulamak için gürültü eşik iletişim kuralları uygulamak karmaşık üzerinden kaldırılabilir Dinamik etkinlik kayıtları. PTCL analizi bu Şekil 3E-G, ilgili Ca^{2 +} nicel bilgi gösterildiği gibi kullanarak sinyal verici PTCL alan, PTCL sayısı PTCL boyutu Ca^{2 +} aktivasyon kayma aralıkları gösteren ve ölçerek hesaplanabilir bir FOV sinyalleri. Bu veriler Şekil 3 H'te gösterilen derlenmiş ve uygun istatistiksel analiz. Şekil 4 nasıl içindeki derinliği miktar konumu inceleyerek ve siteleri ateş Ca^{2 +} sürelerinizin ateş sinyal alt hücresel Ca^{2 +} PTCL analiz sağlar gösterir. PTCLs içine kendi zamansal özelliklerine göre farklı bayrakları ayırarak, PTCLs başlatılıyor doğru Şekil 4 c-E ve sabit veri başlatma sitelerin sayısı elde zenginliği gösterildiği gibi eşlenebilir (olarak anılacaktır ' etki alanları), piksel ve µm², olasılık her inisiyasyon sitedeki boyutunu site ya bir kez ateş veya birden çok kez (% verilir) her CTC sırasında ortalama süresi ve inisiyasyon yerinde meydana gelen PTCLs boyutunu CTC (olarak döngüleri sayısı 4.23. adımda tanımlanan) ve her CTC döngüsü sırasında ateş ateş sitelerin %. Bu teknikler miktar yatırım getirisi tabanlı analizler ile mümkün olmayan sağlam bir hücresel ağ içinde meydana gelen yerinde Ca^{2 +} sinyal ve veri madenciliği yüksek düzeyde sağlar.

Şekil 1: üretimi KitGCaMP6f farelerin. Şematik diyagramı nasıl Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f fareler) c-Kit ile geçti^{+/ Cre-ERT2} (Kit-Cre fare seti-Cre-GCaMP6f fareler oluşturmak için). Bu fareler Cre Recombinase ve sonraki GCaMP6f ifadede sadece ICC ikna etmek için 6-8 hafta yaşları itibariyle tamoxifen ile enjekte edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2: Stokastik Ca^{2 +} Analizi sinyalleri DMP-ICC kullanarak spatio geçici eşleme (STM). (A)temsilcisi görüntü dmp birkaç ICC-ince bağırsak yerinde bir Kit-Cre-GCaMP6F fare üzerinden. Yeşil bir yatırım getirisi boyutunu ve tek ICC DMP içinde bir STM Volumetry içinde oluşturmak için FOV etrafında çizmek için yatırım getirisi yönünü gösterir. (B) STM Ca^{2 +} aktivite Masası'nda A sonra vurgulanmasını ICC DMP içinde düzgün genlik, uzay ve zaman için kalibre. (C) panel B sonra gösterilen aynı STM renk kodlu bir arama tablosu (QUBPallete) ile olmuştur. (D) bir renk üzerinde görüntülenen ICC DMP Ca^{2 +} geçişler genişletilmiş görüntü kodlanmış STM, nerede ImageJ faaliyete bir arsa profil oluşturmak için zaman (x) eksen boyunca bir Ca^{2 +} olay bir çizgi çizin gösteren. (E) Arsa profil Ca^{2 +} olay vurgulanmış olması yerde satırları gösteren D, panel genlik ve etkinliğin süresini ölçmek için doğru bir şekilde çizilmiş. (F) Arsa Ca^{2 +} olay profil vurgulanır paneli olması yerde satırları gösteren D, artış oranı ve Güz olay oranını ölçmek için doğru bir şekilde çizilmiş. (G), bir rengi görüntülenen ICC DMP Ca^{2 +} geçişler genişletilmiş görüntü kodlanmış STM, nereye doğru kayma yayılmasını ölçmek için boşluk (y) ekseni bir Ca^{2 +} olay bir çizgi çizin gösteren. (H) ICC DMP havuza alınan veri temsilcisi çubuk grafik olarak genlik, süresi ve yukarıdaki adımları takip üzerinden alınan uzamsal yayılmış değerleri görüntülemek nasıl gösteren. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: ICC MY kullanarak CTCs miktar parçacık dayalı analiz. Bağırsağın bir Kit-Cre-GCaMP6F fare yerinde ICC MY bir ağdan(a)temsilcisi görüntüsü. (B) görüntü panel A gösterilen kayıt alınan Δt farklı bir filtre uğramıştır sonra ±66 – 70 ms ve Gauss filtrenin 1.5 1,5 µm, STDSAPMA 1.0 x =. (C) görüntü B videoda eşik kırmızıyla gösterilen eşiğin PTCLs ile tamamlandıktan sonra alınan. (D) PTCL izlemeler saymak ve panel B. PTCLs gösterilen film gürültü ortadan kaldırmak için bir eşik protokol boyutunda PTCL yoğunluklarda eşiğin, Ca vardı tüm bitişik pikselleri yapısını işaretlenmiş bir sel-dolgu algoritmasıyla oluşturulan demek ^{2 +} geçici PTCLs gürültü PTCLs büyük. Çok sayıda küçük ölçekli gürültü PTCLs ortaya çıktı ve PTCLs ortalama boyutunu küçültmek başladı eşik ortak bir eşik olarak tüm kayıtlar için kullanılabilir. Koordinat tabanlı Ca^{2 +} PTCL dosyasını (E) temsilcisi yansımasından oluşturulan C. (F) temsilcisi görüntü alınan E PTCL dosya sonra bir tarama kriterleri thresholded kayıt üzerinden > 6 µm² (çapı ~ 2 µm veya daha küçük) uygulandı; PTCLs yukarıdaki bu sınırı vardır (bayrak 1) hafif mor tanecik olarak bayraklı ve toplam PTCLs (bayrak 1) gösterilen geçerli PTCLs. (G) ısı haritası panel F, toplam PTCLs temsil eden renkler ile summated ile gösterilen video tüm kayıt kabul olay kaydı boyunca (sıcak renkler belirtmek bu konumda artan oluşumu). (H) temsilcisi izleri PTCL alan (mavi) ve A-G. panelinde oluşturulan PTCL dosyasından türetilmiş PTCL sayısı (kırmızı) Havuza alınan verilerin çeşitli deneyler temsilcisi çubuk grafikler izlemeler gösterilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: Analizini ICC MY kullanarak siteleri ateş Ca^{2 +} parçacık dayalı analiz. (A)temsilcisi bayrağı 1 PTCLS daha fazla bayrak 3, bayrak durumu için siteleri ateş Ca^{2 +} içine rafine sonra Şekil 3E PTCL dosyasından alınan görüntü. BAYRAK 3 (önceki kare ancak örtüşme herhangi bir parçacık parçacıklar sonraki 70 MS ile ile örtüşme değil o PTCLs ateş siteleri kabul edildi sadece) PTCLs kireç yeşil görüntülenir. (B) ısı ile toplam PTCLs kayıt boyunca oluşumu temsil eden renkler ile özetlenebilir panel A, gösterilen video tüm kayıt için harita toplam PTCLs (bayrak 3) gösterilen (sıcak renkler belirtmek bu konumda artan oluşumu). (C) temsilcisi Haritası B, her farklı talim site ile farklı bir tanımlayıcı renk ayrılan panel gösterilen siteleri ateş Ca^{2 +} . (D) temsilcisi izleri PTCL alan (mavi) ve PTCL Şekil 3Aiçinde -Goluşturulan PTCL dosyasından türetilmiş (kırmızı) saymak. (E) bireysel ateş sitelerin faaliyet bir olay haritası. Her ateş site FOV içinde zamana karşı kendi 'şeritte' renkli bir blok olarak görüntülenir. (F) temsilcisi çubuk grafikler çeşitli deneyler havuza alınan verileri gösteren site ateş olasılık ateş Ca^{2 +} için toplanan değerler gösterilir / CTC ve Ca^{2 +} sayısı ateş bir FOV siteleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kez CA^{2 +} görüntüleme olan belirli hücreleri sağlam dokularda veya ağları hücre içerisinde Ca^{2 +} geçişler karmaşık desenler ortaya koymaktadır. Bu etkinlik dikkatli ve ayrıntılı analizler ve temelindeki olayları ve bu olayların kinetik hakkında mümkün olduğunca fazla bilgi yakalamak için miktar gerektirir. STM ve PTCL analiz bu tür kayıtları vermiştir nicel veri miktarını en üst düzeye çıkarmak için bir fırsat sağlar.

Dar, iğ şeklinde morfoloji ICC dmp onları yukarıda özetlenen STMs türetilen STM analiz için uygun olun. Ancak, bu analiz için ICC MY şeklinde ve bağlı olduğu bir ağ (Şekil 3A) yildiz seklinde olan iyi uygun değildir. Ayrıca, Ca^{2 +} sinyal desenleri ICC MY daha karmaşık, birden çok site ICC benim ağ genelinde kökenli CTCs yayma olarak tezahür. Böylece, ICC MY Ağı'nın tamamında bir FOV içinde gerçekleşen etkinliği ölçmek için parçacık (PTCL) analiz özel yapılmış yazılımı (Volumetry, G8d, GWH, Mac OS üzerinde çalışır durumda Grant Hennig grant.hennig@med.uvm.edu iletişim sürümü kullanılarak uygulanmıştır ile ilgili olarak Volumetry erişim ve kullanım için sorar).

STM analiz tek hücreleri içinde ve bütün kayma ve temporal parametreleri bir dizi eleştirel analiz edilecek bir FOV hücrelerinin içinde tüm Ca^{2 +} olayları sağlar. Açıklanan protokol bu teknikler ICC-DMP fare bağırsağı uygulanabilir nasıl gösterir. Tam Şekil 2B-G, ayrıntı³⁷yılında desenleri ile karakterize sinyal Ca^{2 +} gösterildiği gibi ICC-DMP, sinyal verme Ca^{2 +} miktarının tarafından. Bu analizler kayıtları nerede ICC DMP geçmesi müdahaleler ince engelleme veya Ca^{2 +} yayın uyarıcı etkileri ölçmek için uygulanmış olan / Ca^{2 +} akın / neurotransmission yolları³⁷^,³⁹ ^, ⁴⁰ ^, ⁴¹. bu teknikleri diğer sağlam doku hazırlıklar için kolayca uygulanabilir. Örneğin, burada açıklandığı şekilde STM analiz yeni mekanik yollar üretral düz kas in situ⁵⁷yılında kaydedilen intrasellüler Ca^{2 +} dalgalar nesil katılan tanımlamak için kullanılmıştır.

STM çizilmiş yatırım getirisi (Şekil 2A) oluşturur Volumetry işlevinde yoğunluğunun ortalama bir değer olarak STMs Volumetry olarak hazırlanması bazı dikkatli gerektirir. Eğer yatırım getirisi daha geniş veya uzun Ca^{2 +} olay veya hücre ilgi daha çizilir böylece, Ca^{2 +} sinyallerin genlik potansiyel olarak seyreltilmiş. Böylece, kullanıcılar Ca^{2 +} sinyalleri veya bu sorunu hafifletmek için analiz belirli hücre mümkün olduğunca sıkı uygun olarak çoğu ROIs çizmek için dikkatli olmalısınız. Benzer şekilde, STMS ImageJ içinde tek piksel linescans kullanarak oluşturma doğru Ca^{2 +} olayları haritalama Ca^{2 +} sinyal yakınlığı ile çizilmiş çizgiyi tabi olduğu anlamına gelir. Böyle kaygıları ince iğ hücreleri ICC DMP gibi şeklinde küçük, ancak daha yildiz seklinde veya yuvarlak morfolojisi ile diğer hücre türleri bu tür bir analiz tüm Ca^{2 +} sinyaller doğru şekilde eşlemek uygun olmayan hale getirebilir. STMs analiz Volumetry veya ImageJ linescans ile yapılan ne olursa olsun için hazırlanırken sorun giderme amacıyla vurgulanır için birkaç alanları vardır. STMs. Aksi halde üzerinde herhangi bir kalibrasyon gerçekleştirme veya F/F₀ için ayarlama tutarsız ölçümleri arasında yol açabilir sonra bunu yaparken deneyler önce 32-bit için görüntü kalitesini değiştirmek önemlidir. Her zaman STM kendisi ile ImageJ açıldığında beyaz sınır üst alanında belirtilen STM görüntü kalitesini kontrol edin. Başka bir potansiyel alan tutarsızlık F₀ değeri genlik için ayarlama zaman seçmektir. F₀için bölge seçmek için bu tek tip hücre ve odak bir alanı kaplamaktadır hayati önem taşımaktadır. Bu nedenle, bu kararsız bir bazal floresans var veya hareket ya da diğer eserler nedeniyle değiştiren alanları hücrenin ideal değildir ve titiz hareket sabitleme protokolleri bu gibi durumlarda istihdam edilmelidir.

ICC-MY küçük bağırsak, PTCL analizde şebekede oluşan karmaşık, hücre altı Ca^{2 +} olaylar ölçmek için akıcı bir tekniği sağlar gibi yerinde veya kültürlü hazırlıkları içinde içeren hücresel ağlar, birbirine bağlı. Ayrıca, aynı zamanda çözümlenmesi için verilen bir FOV içinde ağındaki tüm Ca^{2 +} olayları sağlar yerine rasgele ROIs kullanarak, hangi sadece sıklığı ve şiddeti içinde yatırım getirisi hakkında bilgi. Uygulayarak diferansiyel ve Gauss kayıtları, filtreleri yumuşatma gürültü büyük miktarda değil ilgi veya nedeniyle dinamik olmayan hücrelerden bulaşıcı ışık içerebilir film kaldırılabilir bir avantajdır burada açıklanan PTCL analiz parlak noktalar veya kapanımlar. Kayıtları için uygulanan farklılaşma miktarı deneyci tarafından kullanılan satın alma oranı büyük ölçüde bağlı olacaktır unutmamak gerekir. İletişim kuralında tanımlandığı gibi filmler ayırt yüksek frekanslı ses kayıtları kaldırmak için film için filtre uygulama bir araç sağlar. 33 FPS edinme de iyi sinyal-gürültü (değeri çok düşüktür, gürültü çekilir değeri çok yüksek ise sinyal-gürültü tehlikeye girer ise) korurken arka plan gürültü çıkarmak için çalışırken bir farklılaşma değeri '2' uygulanıyor. Örneğin, 100 FPS daha hızlı edinme oranları ile uygulanan farklılaşma değerin arttırılması gerekir, '7' farklılaşma değeri yaklaşık aynı sinyal gürültü oranı için bir 33 FPS kayıt için '2' değeri olarak verir. Denemecileri bu ayarları optimize etmek gerekir buna göre kendi ürünleri ve kayıt koşulları için.

Şekil 3D açıklanan eşik protokolü farklı kayıtları farklı satın alma yazılımı ile farklı sistemlerde yapılan uygulanmak üzere bir tutarlı eşik yordam sağlar. Bu esneklik onların kayıtları aynı veri kümeleri içine derlemek için farklı sistemler üzerinde çalışan birden çok müfettişler verileri sağlar. BAYRAK sistemi içinde Volumetry kullanarak, görselleştirme ve ayrıntılı bir ağındaki siteler ateş bireysel Ca^{2 +} miktar PTCL analiz sağlar. Bilgi başlatma sitelerin sayısı piksel ve µm²sitedeki boyutunu ve PTCLs bu sitede meydana gelen ortalama süresi üzerinde elde edilebilir. Bu PTCL analiz bağırsağın alt hücresel düzeyde CTC etkinlik ilk karakterizasyonu izin ve Volumetry yazılım, PTCLs her ikisi de farklı bayraklar kullanarak site ağ ve bireysel ateş düzeyi sağlam doku sayılabilir hazırlık seti-Cre-GCaMP3 fareler³⁸. Bu ilk gözlemler, bu analiz roman Ca^{2 +} akını yollar GI ICC-mağaza-işletilen-Ca^{2 +}gibi MY çalışmaya daha fazla kullanılmıştır-giriş⁴² ve rolü GI pacemaking üzerinde sinyal mitokondrial Ca^{2 +} ⁴¹. çok yukarıda açıklanan STM analizi gibi PTCL analiz bu protokol için açıklanan dışında farklı olduğu gibi hazırlıklar için kolayca adapte edilebilir. Örneğin, bir çalışmada PTCL analiz lamina propria sıçan idrar kesesi⁵⁸^,⁵⁹ sağlam hücresel ağları içinde oluşan roman ritmik Ca^{2 +} olaylar çalışırdım ve böylece kolayca için uygulanabilir nöronal sistemleri gibi diğer karmaşık ve sağlam hücresel sistemleri. Bu kağıt Turk ile sağlam dokularda Imaging Ca^{2 +} odaklanmış iken, bu analiz teknikleri de izole hücre ve dokuların geleneksel Ca^{2 +} göstergesi boyalar ile yüklenen çalıştırılabilir. STM dayalı analiz başarıyla yerelleştirilmiş Ca^{2 +} sinyalleri ve Ca^{2 +} iğ şeklinde interstisyel hücreleri ve düz kas hücreleri hazırlıklar¹¹^,⁶⁰ çeşitli dalgalardan ölçmek için kullanılan ^, ⁶¹ ^, ⁶² ^, ⁶³. Ayrıca, burada açıklanan PTCL analiz rutinleri da in situ durumdaki ağ hazırlıkları Cal 520⁵⁸^,⁵⁹ile görüntülenmiştir uygulanmış olan. Ancak, bu çalışmalar da belirsiz hücre kimliği ve sinyal-gürültü ile ilgili sorunlar gibi iletişim kurallarını yükleme böyle boya dezavantajları korurlar.

Yukarıda resimli örnekler STM ve PTCL analiz sağlam doku hazırlıkları çeşitli bir yelpazede sinyal karmaşık Ca^{2 +} ölçmek için kullanılan son derece uysal teknikleri olduğunu göstermektedir. Yaklaşımlar daha önce düzenli olarak kullanılmış olan ve müfettişler hakkında daha önceden elde edilebilir sinyal Ca^{2 +} daha değerli nicel bilgi vermelidir yoğunluğu araziler temel geleneksel yatırım getirisi üzerinde birçok faydaları sunuyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Finansman P01 DK41315 via NIDDK tarafından sağlandı.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageJ software	NIH	1.5a	ImageJ software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit^+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Wellman, G. C., Nelson, M. T. Signaling between SR and plasmalemma in smooth muscle: Sparks and the activation of Ca2+-sensitive ion channels. Cell Calcium. 34 (3), 211-229 (2003).
Mironneau, J., Arnaudeau, S., Macrez-Lepretre, N., Boittin, F. X. Ca2+sparks and Ca2+waves activate different Ca2+-dependent ion channels in single myocytes from rat portal vein. Cell Calcium. 20 (2), 153-160 (1996).
Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1793 (6), 933-940 (2009).
Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. Calcium signalling. Current biology. 9 (5), R157-R159 (1999).
Bootman, M. D., et al. Calcium signalling—an overview. Seminars in Cell & Developmental Biology. 12 (1), 3-10 (2001).
Brain, K. L., Bennett, M. R. Calcium in sympathetic varicosities of mouse vas deferens during facilitation, augmentation and autoinhibition. The Journal of Physiology. 502 (3), 521-536 (1997).
Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).
Dupont, G., Goldbeter, A. Problems and paradigms: Oscillations and waves of cytosolic calcium: Insights from theoretical models. BioEssays. 14 (7), 485-493 (1992).
Bootman, M. D., Berridge, M. J. The elemental principles of calcium signaling. Cell. 83 (5), 675-678 (1995).
Berridge, M. J., Dupont, G. Spatial and temporal signalling by calcium. Current Opinion in Cell Biology. 6 (2), 267-274 (1994).
Drumm, B. T., et al. The role of Ca 2+ influx in spontaneous Ca 2+ wave propagation in interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. The Journal of Physiology. 593 (15), 3333-3350 (2015).
Bayguinov, P. O., Hennig, G. W., Smith, T. K. Ca 2+ imaging of activity in ICC-MY during local mucosal reflexes and the colonic migrating motor complex in the murine large intestine. The Journal of Physiology. 588 (22), 4453-4474 (2010).
Drumm, B. T., Sergeant, G. P., Hollywood, M. A., Thornbury, K. D., McHale, N. G., Harvey, B. J. The role of cAMP dependent protein kinase in modulating spontaneous intracellular Ca2+ waves in interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. Cell Calcium. 56 (3), 181-187 (2014).
Nathanson, M. H., Padfield, P. J., O’Sullivan, A. J., Burgstahler, A. D., Jamieson, J. D. Mechanism of Ca2+ wave propagation in pancreatic acinar cells. Journal of Biological Chemistry. 267 (25), 18118-18121 (1992).
Straub, S. V., Giovannucci, D. R., Yule, D. I. Calcium wave propagation in pancreatic acinar cells: functional interaction of inositol 1,4,5-trisphosphate receptors, ryanodine receptors, and mitochondria. The Journal of General Physiology. 116 (4), 547-560 (2000).
Sneyd, J., Tsaneva-Atanasova, K., Bruce, J. I. E., Straub, S. V., Giovannucci, D. R., Yule, D. I. A model of calcium waves in pancreatic and parotid acinar cells. Biophysical Journal. 85 (3), 1392-1405 (2003).
Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. Calcium sparks in smooth muscle. American Journal of Physiology. Cell. 278 (2), C235-C256 (2000).
Nelson, M. T., et al. Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks. Science. 270 (5236), 633-637 (1995).
Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks: Elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 262 (5134), 740-744 (1993).
Parker, I., Choi, J., Yao, Y. Elementary events of InsP3-induced Ca2+ liberation in Xenopus oocytes: Hot spots, puffs and blips. Cell Calcium. 20 (2), 105-121 (1996).
Diliberto, P. a, Wang, X. F., Herman, B. Confocal imaging of Ca2+ in cells. Methods in Cell Biology. 40, 243-262 (1994).
Martínez-Zaguilán, R., Parnami, G., Lynch, R. M. Selection of fluorescent ion indicators for simultaneous measurements of pH and Ca2+. Cell Calcium. 19 (4), 337-349 (1996).
Hayashi, H., Miyata, H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2. The Journal of Pharmacology & Toxicology Methods. 31 (1), 1-10 (1994).
Thomas, D., Tovey, S. C., Collins, T. J., Bootman, M. D., Berridge, M. J., Lipp, P. A comparison of fluorescent Ca2+indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+signals. Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).
Lock, J. T., Parker, I., Smith, I. F. A comparison of fluorescent Ca2+indicators for imaging local Ca2+signals in cultured cells. Cell Calcium. 58 (6), 638-648 (2015).
Flagmeier, P., et al. Ultrasensitive Measurement of Ca 2+ Influx into Lipid Vesicles Induced by Protein Aggregates. Angewandte Chemie International Edition. 56 (27), 7750-7754 (2017).
Tsutsumi, S., et al. Structure-Function Relationships between Aldolase C/Zebrin II Expression and Complex Spike Synchrony in the Cerebellum. Journal of Neuroscience. 35 (2), 843-852 (2015).
Rietdorf, K., Chehab, T., Allman, S., Bootman, M. D. Novel improved Ca indicator dyes on the market - a comparative study of novel Ca indicators with Fluo-4. Calcium Signalling: The Next Generation. , 590 (2014).
Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
Seidemann, E., et al. Calcium imaging with genetically encoded indicators in behaving primates. eLife. 5 (2016JULY), (2016).
Su, S., et al. Genetically encoded calcium indicator illuminates calcium dynamics in primary cilia. Nature Methods. 10 (11), 1105-1109 (2013).
Kaestner, L., et al. Genetically encoded Ca2+ indicators in cardiac myocytes. Circulation Research. 114 (10), 1623-1639 (2014).
Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor design. Current Opinion in Chemical Biology. 27, 90-97 (2015).
Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence. PLoS ONE. 12 (2), 1-24 (2017).
Spencer, N. J., et al. Identification of a rhythmic firing pattern in the enteric nervous system that generates rhythmic electrical activity in smooth muscle. The Journal of Neuroscience. , 3489 (2018).
Hibberd, T. J., et al. Synaptic Activation of Putative Sensory Neurons By Hexamethonium-Sensitive Nerve Pathways in Mouse Colon. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. (861), (2017).
Baker, S. A., Drumm, B. T., Saur, D., Hennig, G. W., Ward, S. M., Sanders, K. M. Spontaneous Ca(2+) transients in interstitial cells of Cajal located within the deep muscular plexus of the murine small intestine. The Journal of Physiology. 594 (12), 3317-3338 (2016).
Drumm, B. T., et al. Clustering of Ca2+ transients in interstitial cells of Cajal defines slow wave duration. The Journal of General Physiology. 149 (7), 703-725 (2017).
Baker, S. A., Drumm, B. T., Cobine, C. A., Keef, K. D., Sanders, K. M. Inhibitory Neural Regulation of the Ca2+ Transients in Intramuscular Interstitial Cells of Cajal in the Small Intestine. Frontiers in Physiology. 9 (April), 1-24 (2018).
Baker, S. A., et al. Excitatory Neuronal Responses of Ca 2+ Transients in Interstitial Cells of Cajal in the Small Intestine. eNeuro. 5 (2), (2018).
Drumm, B. T., Sung, T. S., Zheng, H., Baker, S. A., Koh, S. D., Sanders, K. M. The effects of mitochondrial inhibitors on Ca2+signalling and electrical conductances required for pacemaking in interstitial cells of Cajal in the mouse small intestine. Cell Calcium. 72, 1-17 (2018).
Zheng, H., Drumm, B. T., Earley, S., Sung, T. S., Koh, S. D., Sanders, K. M. SOCE mediated by STIM and Orai is essential for pacemaker activity in the interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. Science Signaling. 11 (June), (2018).
Zhu, M. H., et al. A Ca(2+)-activated Cl(-) conductance in interstitial cells of Cajal linked to slow wave currents and pacemaker activity. The Journal of Physiology. 587 (20), 4905-4918 (2009).
Zhu, M. H., Sung, T. S., O’Driscoll, K., Koh, S. D., Sanders, K. M. Intracellular Ca(2+) release from endoplasmic reticulum regulates slow wave currents and pacemaker activity of interstitial cells of Cajal. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 308 (8), C608-C620 (2015).
Zhu, M. H., et al. Muscarinic activation of Ca2+-activated Cl- current in interstitial cells of Cajal. The Journal of Physiology. 589 (Pt 18), 4565-4582 (2011).
Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine. The Journal of Physiology. 480 (Pt 1), 91-97 (1994).
Huizinga, J. D., Thuneberg, L., Klüppel, M., Malysz, J., Mikkelsen, H. B., Bernstein, A. W/kit gene required for interstitial cells of cajal and for intestinal pacemaker activity. Nature. 373 (6512), 347-349 (1995).
Ordog, T., Ward, S. M., Sanders, K. M. Interstitial cells of Cajal generate electricial slow waves in the murine stomach. The Journal of Physiology. 518 (1), 257-269 (1999).
Sanders, K. M., Ward, S. M., Koh, S. D. Interstitial cells: regulators of smooth muscle function. Physiological Reviews. 94 (3), 859-907 (2014).
Ward, S. M., McLaren, G. J., Sanders, K. M. Interstitial cells of Cajal in the deep muscular plexus mediate enteric motor neurotransmission in the mouse small intestine. The Journal of Physiology. 573 (1), 147-159 (2006).
Komuro, T. Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. The Journal of Physiology. 576 (3), 653-658 (2006).
Komuro, T. Comparative morphology of interstitial cells of Cajal: ultrastructural characterization. Microscopy Research and Technique. 47 (4), 267-285 (1999).
Sanders, K. M., Ward, S. M., Koh, S. D. Interstitial Cells: Regulators of Smooth Muscle Function. Physiological Reviews. 94 (3), 859-907 (2014).
Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+dynamics in the awake mouse brain. PLoS ONE. 12 (7), e0181113 (2017).
Truett, G. E., Heeger, P., Mynatt, R., Truett, A. A., Walker, J. A., Warman, M. L. Preparation of PCR quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT). BioTechniques. 29 (52), 54 (2000).
The Jackson Laboratory. , Available from: https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:5:0::NO:5:P5_MASTER_PROTOCOL_ID,P5_JRS_CODE:27076,028865 (2017).
Drumm, B. T., et al. Ca 2+ signalling in mouse urethral smooth muscle in situ role of Ca 2+ stores and Ca 2+ influx mechanisms. The Journal of Physiology. 596 (8), 1433-1466 (2018).
Heppner, T. J., Hennig, G. W., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Rhythmic Calcium Events in the Lamina Propria Network of the Urinary Bladder of Rat Pups. Frontiers in Systems Neuroscience. 11 (December), 1-16 (2017).
Heppner, T. J., Hennig, G. W., Nelson, M. T., May, V., Vizzard, M. A. PACAP38-Mediated Bladder Afferent Nerve Activity Hyperexcitability and Ca 2 + Activity in Urothelial Cells from Mice. Journal of Molecular Neuroscience. 1, (2018).
Griffin, C. S., et al. Muscarinic Receptor Induced Contractions of the Detrusor are Mediated by Activation of TRPC4 Channels. Journal of Urology. 196 (6), 1796-1808 (2016).
Sergeant, G. P., Craven, M., Hollywood, M. A., Mchale, N. G., Thornbury, K. D. Spontaneous Ca2+waves in rabbit corpus cavernosum: Modulation by nitric oxide and cGMP. Journal of Sexual Medicine. 6 (4), 958-966 (2009).
Bradley, E., et al. Novel Excitatory Effects of Adenosine Triphosphate on Contractile and Pacemaker Activity in Rabbit Urethral Smooth Muscle. Journal of Urology. 183 (2), 801-811 (2010).
Drumm, B. T., et al. The effect of high [K + ] o on spontaneous Ca 2+ waves in freshly isolated interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. Physiological Reports. 2 (1), e00203 (2014).

Biology

Kendisinin geçici eşleme ve parçacık analiz teknikleri intrasellüler Ca sinyal^{2 +} in Situ ölçmek için uygulamaları

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.