Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Intra-hjerte side-fyring lys kateter til overvågning cellulære metabolisme ved hjælp af Transmural absorbans spektroskopi af Perfamale pattedyr hjerter

Published: May 12, 2019 doi: 10.3791/58992
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Laboratory of Cardiac Energetics, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Department of Biomedical Engineering, The George Washington University

Summary

Her introducerer vi en metode til at bruge et intra-ventrikel optisk kateter i perfvant hjerter til at udføre absorbans spektroskopi på tværs af hjertevæggen. De indhentede data giver solide oplysninger om vævs iltspændinger samt substrat udnyttelse og membran potentiale samtidig med hjerte præstations foranstaltninger i denne allestedsnærværende forberedelse.

Abstract

Absorbans spektroskopi af hjertemusklen giver ikke-destruktiv vurdering af cytosolisk og mitokondrie iltning via myoglobin og cytochrom absorbans hhv. Desuden, talrige aspekter af mitokondrie metaboliske status såsom membran potentiale og substrat indgang kan også estimeres. For at udføre hjertevægtransmission optisk spektroskopi, er et kommercielt tilgængeligt side fyring optisk fiber kateter placeret i venstre ventrikel af det isolerede perfileret hjerte som en lyskilde. Lys passerer gennem hjertet væggen er indsamlet med en ekstern optisk fiber til at udføre optisk spektroskopi af hjertet i nær realtid. Transmissions metoden undgår talrige overflade sprednings forstyrrelser, der forekommer i udbredte refleksions tilgange. Ændringer i transmural absorbans Spectra blev devolveret ved hjælp af et bibliotek af kromophore reference spektre, der giver kvantitative målinger af alle de kendte kardiale chromophorer samtidigt. Denne spektral dekoncentreringsmetoder eliminerede iboende fejl, der kan skyldes brug af almindeligt dobbelte bølgelængde metoder anvendes til overlappende absorbans Spectra, samt forudsat en kvantitativ vurdering af godhed af pasform. Et brugerdefineret program var designet til dataindsamling og analyse, som tillod investigator at overvåge den metaboliske tilstand af præparatet under forsøget. Disse relativt enkle Tilføjelser til standarden hjerte perfusion system giver en unik indsigt i den metaboliske tilstand af hjertevæggen ud over konventionelle foranstaltninger af sammentrækning, perfusion, og substrat/ilt udvinding.

Introduction

Optisk absorbans spektroskopi til overvågning af intakt organ biokemi er en bredt anvendt tilgang på grund af dens iboende, ikke-destruktiv natur1,2,3,4,5, 6,7,8,9. Myoglobin absorbans giver et mål for den gennemsnitlige cytosolisk oxygen spænding10,11,12. Mitokondrie cytokromer der giver oplysninger om substrat indgang på niveau med flavins, membran potentiale fra cytochrom bL: bH13, og ilt levering til mitokondrier i cellen fra cytochrom oxidase (Cox ) redox State14. Glancy et al. påvist, at aktiviteterne i de enkelte komplekser kan bestemmes ved at måle mitokondriel membranpotentialet og metaboliseringsraten15. Derfor, ved hjælp af optisk spektroskopi, et væld af oplysninger kan opnås uden behov for eksogene sonder eller større ændringer af nuværende studie systemer. Formålet med dette papir er at fremlægge en robust metode til opsamling af transmissions optiske spektre i konventionelle perfetat hjerte præparater med den eneste større modifikation, der udfører undersøgelser i et mørkt miljø.

Refleksions absorptions spektroskopi er med held blevet anvendt til at udføre optisk spektroskopi af perfbrugt Heart3,6,16,17,18,19 samt som hjertet i vivo1. Refleksions spektroskopi består af at hæmme lyset på hjertets overflade og samle lyset spredt gennem hjertet samt diffus og spejlvendt lys. Således, det indsamlede lys i denne tilgang er en sammensat af flere spredning mekanismer samt vævet kromoforholdig abscisse af interesse. På grund af bevægelse og komplekse overflade af hjertet, lyset refleksion fra overfladen af hjertet er særligt problematisk, ændre dybden af penetration og mængden af rent reflekteret lys.

Begrænsningerne af refleksions absorption spektroskopi præsenteret ovenfor blev løst ved at indføre et optisk kateter i venstre ventrikel hulrum, tillader indsamling af transmitteres lys på tværs af venstre ventrikel fri væg20. Fordelene ved transmission spektroskopi for denne type undersøgelse blev værdsat i tidlige invasive undersøgelser af Tamura et al.9 den nuværende gennemførelse giver en meget robust transmission absorption spektroskopi analyse af det intakte hjerte med med hensyn til cytosolisk iltning og mitokondrier redox tilstand under en række betingelser21. Disse indledende undersøgelser brugte et specielt fabrikeret kateter med en drevet LED på spidsen orienteret til at generere en side-fyring mønster af hvidt lys gennem myokardiet. Men det relativt store LED tippet kateter er kun egnet til brug på medium størrelse hjerter (kanin, marsvin, etc.) og krævede brugerdefinerede fabrikation. I den nuværende undersøgelse, en metode til at bruge en kommercielt tilgængelige 200-micron kerne side-fyring optisk fiber som en lys guide er præsenteret. I stedet for en kablet LED på spidsen, kateteret med 500-mikro spids omdirigerer lys fra en ekstern kilde øge alsidigheden af systemet. Denne fremgangsmåde gør det muligt at anvende en lang række eksterne lyskilder, herunder lasere til applikationer såsom Raman spredning spektroskopi. For at kvantificere disse data præsenteres en online fuld multikomponent spektralanalyse med kendt reference spektre for at forbedre nøjagtigheden af den spektroskopiske bestemmelse af hjertets kromophorer som tidligere beskrevet20,22. Kildekoden til denne analyse vil blive leveret af forfatterne efter anmodning. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, oplysninger om kardiel biokemi og mitokondrie funktion kan opnås samtidig med de konventionelle hjerte funktionelle parametre med ringe eller ingen indvirkning på hjertet forberedelse. Da hjertet er kritisk afhængig af mitokondrie funktion og ilttilførsel, vil denne tekniske tilføjelse til det klassiske perfaralt hjerte system i høj grad forbedre fortolkningen og nytten af denne vigtige model af hjertets ydeevne.

Protocol

Alle dyre protokoller blev godkendt af det nationale hjerte, lunge, og blod Institut Animal Care og brug udvalg og udført i overensstemmelse med de retningslinjer, der er beskrevet i loven om dyrepasning og velfærd (7 USC 2142 § 13).

1. isoleret Perfileret hjerte system og Perfusat

Bemærk: denne forberedelse er meget lig tidligere publikationer23.

  1. Lav 4 liter modificeret Krebs-Henseleit perfusat sammensat af (i mmol/L) 137,0 NaCl, 5,4 KCl, 1,8 CaCl2, 0,5 mgcl2, 1,0 na2HPO4, 10,0 GLUCOSE, 1,0 lactat, og 10,0 Hepes.
  2. pH perfusatet til 7,4 ved 37 °C med NaOH og HCl.
  3. Filtrer perfusatet gennem en 1 μm pore membran.
  4. Skyl alle rør og kamre i det perfopylne hjerte system ved at køre og dræne renset vand gennem systemet.
  5. Perfusatet overføres til tanken og oxygenat med 100% O2 med bubbler, mens temperaturen holdes ved 37 °c ved hjælp af et opvarmet cirkulerende vandbad.
  6. Tilsæt 2 af 12 μm pore membranfiltre og Prime systemet med perfusatet, mens du recirkulerer i Langendorff-tilstanden.
  7. Fastgør en slange klemme på røret lige over aorta kanylen og Juster skruen, så aorta strømmen falder til ca. 10 mL/min.

2. kanin hjerte excision og perfusion

  1. Hjerte excision
    1. Anesthetize mandlige New Zealand hvide kaniner (ca. 3 kg) via en 1,5 mL intramuskulær injektion af ketamin/Acepromazin blanding (10:1).
    2. 10 – 15 minutter senere, administreres 3% isofluran via inhalation for en fuldstændig bedøvelses virkning.
    3. Bekræft korrekt dybde af anæstesi ved tå klemning og derefter placere en linje i den marginale øre vene til administration af efterfølgende lægemidler.
    4. Injicer 1.500 enheder (eller 1,5 mL af 1.000 enheder/mL) heparin og lad cirkulere i 3 minutter.
    5. Dobbelttjek korrekt dybde af anæstesi og derefter aflive med 6 meq (eller 3 ml af 2 meq/ml) af KCl.
    6. Hurtigt åbne brystet, finde hjertets spids og aorta. Fjern hjertet ved at skære aorta så langt fra hjertet som muligt og skære de pulmonale vener så tæt på lungerne som muligt.
      Bemærk: fjernelse af lunger på dette tidlige stadium er anderledes end tidligere publikation23 , men har ikke indflydelse på præparatet.
    7. Placer hjertet i et lille bæger af perfusat (samme perfusat som Step 1,3), der sidder i en spand is til transport fra kirurgi til perfusion.
  2. Hjerte-kanyle
    1. Kanyle og binde aorta sikkert, og sørg for ikke at medtage eventuelle bobler i ATIC linje.
    2. Start flow ved 70 mmHg perfusions tryk ved at fjerne slangeklemmen på aorta linjen og opretholde dette tryk under den resterende del af operationen og Karens kanyle.
    3. Adskil lungearterien fra aorta og andre fartøjer og ligere Vena cavae og pulmonale vener. Fjerne fedt og bindevæv stadig til stede.
    4. Bannulere lungearterien for at give et mål for koronar sinus strømningshastighed og iltspænding.
    5. Kassér det indledende flow ud af hjertet (i ca. 10 minutter) under tilberedningen for at eliminere blod og kirurgisk snavs. Efter denne periode, recirkulere perfusate.

3. side-fyring fiberoptisk anbringelse

  1. Tilslut fiberoptiske kateter til en High-Power fiber-koblet LED hvid lyskilde til at hjælpe visualisering samt give lys for spektroskopi en gang i hjertet.
  2. Skær et lille vedhæng af det venstre atrium, Indsæt katetret i den venstre ventrikel via mitralventilen, og drej den for at opnå en belyst venstre ventrikel fri væg.
  3. Placer pickup fiberoptik direkte modsat regionen af maksimal belysning af venstre ventrikel på ca. 1 cm fra hjertet.
  4. den anden ende af opsamlings fibrene til et hurtigt scannings spektrometer.

4. optisk spektroskopi

  1. Sluk lysene i forsøgsområdet for at opnå fuldstændig mørke.
  2. Start det brugerdefinerede program, indarbejde spektrometer drivere til at udføre dataindsamling og real-time analyse af det transmitterede lys.
    Bemærk: en eksekverbar version af den konsoliderede version af spektral anskaffelses-og analyseprogrammet leveres som en supplerende kodnings fil. Kildekode er anvendelig af opfordre hen til den forfatteres.
  3. Naviger gennem alle prompter, vælge muligheder for perfbrugt hjerte spektroskopi erhvervelse tilstand. På næste side angiver du, om der sker indsamling af ekstra data. Endelig skal du indtaste anskaffelses parametre, herunder placering af både kromoforer reference Spectra og data, der skal gemmes.
  4. Indtast en båndbredde på 490 – 630 nm.
  5. Angiv en samplingfrekvens på 2 Hz (dvs. 2 prøver/sek.).
  6. Saml en mørk strøm, eller nul lys, spektrum til at korrigere for baggrunds signal niveauer ved at slukke for lyskilden.
  7. Klik for at vælge de kromophore referencer, der ønskes anvendt i tilpasnings rutinen.
  8. På siden Hent data skal du justere positionen for både kateteret og pickup fiber for at maksimere det transmitterede lys, som vises på softwaren med særlig vægt på signal amplitude i 500 nm-regionen, hvor den oxygenerede myoglobin abscisse skal observeres.
  9. Sørg for, at det transmitterede lys ikke mættede detektoren i 600 nm-regionen.
  10. Sørg for, at ingen eksterne lyskilder bidrager til det indsamlede spektrum ved at slukke for kateter belysningen og bekræfte, at der nu ikke er noget lys.
  11. Start dataindsamlingen ved at klikke på knappen Gem Spectra .
  12. Klik på Indstil som kontrol for at se forskellen absorbans spektrum fra fremtidige spektre til den nuværende "Control" spektrum.
  13. Udføre enhver fysiologisk forstyrrelse som ønsket.
    1. Protokol 1: virkningen af cyanid på hjertets ydeevne og Chromophore absorption
      1. Stop recirkulations væsken fra hjertets perfusion.
      2. Ved hjælp af en sprøjtepumpe indsprøjtes cyanid (2,5 til 75 mM ved pH 7) ved forskellige hastigheder i perfusat lige før aorta kanylen for at opnå de ønskede koncentrationer af cyanid (0,025 til 1 mM, beregnet ud fra aorta strømningshastighed) i den strømmende perfusat i hjertet, mens overvågning af hjertets funktion og optiske egenskaber.
      3. Stop cyanid sprøjtepumpen, når effekten på koronar flow og hjertefrekvens sammen med den optiske transmission gennem hjertevæggen er ved steady state.
    2. Protokol 2: iskæmi/hypoksi
      1. Stop cyanid infusion.
      2. Efter 5 minutter skiftes boblende gas fra 100% ilt til 100% nitrogen for at fjerne ilt fra systemet.
      3. Efter ca. 10 minutter skal du stoppe flowet for at simulere en total iskæmisk/hypoxisk tilstand.

5. analyse af spektraldata

  1. Kør programmet i perfbrugt hjerte analyse tilstand.
  2. Vælg det relevante spektrometer.
  3. Indtast data filsti og reference Spectra fil og vælg kateter lyskilde, som indlæser det præ-gemte spektrum af kateter lyskilden.
  4. Vælg Læs placerings data.
  5. Vælg Indstil min og Max bølgelængde.
  6. Indtast båndbredden for dataanalysen som 490 – 630 nm.
  7. Vælg Vend tilbage til hovedmenuen.
  8. Vælg Læs referencer.
  9. Bekræft reference spektrene, som skal bruges i analysen.
  10. Vælg Vend tilbage til hovedmenuen.
  11. Vælg tidspunkter i hovedmenuen.
  12. Vælg et t0-tidspunkt som kontrolelement, og Indstil intervallet til 100 point.
  13. Vælg et T1-tidspunkt som forsøgsperiode med en rækkevidde på 100 point.
  14. Overhold den rå forskel spektrum i gennem snit ABS. Spectrum fanen.
  15. Vælg Beregn justeringskoefficienter , og klik derefter på fanen Tilpas koefficienter for at observere tidsforløbet for referencen Spectra fit.
  16. Vend tilbage til hovedmenuen , og vælg Beregn difference ABS.
  17. Vælg t0 og ΔT1 på alle positioner. Overhold det monterede spektrum i vinduet difference spektrum og monteringselementer i Reference vægt vinduet.
  18. Gentag denne procedure for at sammenligne andre tidspunkter i eksperimentet.
  19. Vend tilbage til hovedmenuen.
  20. Gem data og analyser i et regnearksrapport ved at indtaste et ønsket navn og vælge Gem data til yderligere analyse med andre programmer.
    Bemærk: Hvis der ikke indtastes et navn, gemmes rapporten med samme navn som inputfilen. Rapporten gemmes i en mappe med navnet Excel-analyse filer, der er placeret i samme mappe som den oprindelige inputfil.

Representative Results

Det anvendte system er en off hylden lille dyr perfusion hjerte system, men blev stærkt modificeret til brug med en kanin hjerte. Ændringerne var primært at øge bore størrelsen af alle slanger for at sikre passende flow levering til kanin hjerte. Stor omhu blev gjort for at forsikre, ved perfusions tryk anvendte, strømningshastigheden af det Native perfusion system overskredet strømmen med hjerte fastgjort af mindst 5-fold. 2 – 12 μm pore membranfiltre blev placeret parallelt mellem væske pumpen og aorta preload boble fælde kammer for at fjerne eventuelle rester fra hjertet.

Overført lys fra kanin hjertet
Figur 1 præsenterer katetrets spektrum (figur 1A) og det rå spektrum af det transmitterede lys fra kanin hjertets frie væg (figur 1B). Disse data afslører en meget stor dæmpning af lys i det blå område af spektret, men båndene af absorbans fra myoglobin og mitokondrie cytokromer der kan observeres direkte mellem 490 og 580 nm i skæret. Det er vigtigt i disse undersøgelser at sikre, at der påvises tilstrækkeligt overført lys i regionen fra 490 til 630 nm for at indhente oplysninger om de metabolisk Responsive kardiale chromophorer. Placeringen af de eksterne og interne fibre justeres før lagring af data for at maksimere lysintensiteten, men ikke mægle detektoren i 625 nm-regionen.

Reference reduceret minus oxiderede spektre af reference Kromophorer i hjertet.
Figur 2 viser reference spektre, der anvendes til at passe til den forskel, spektre indsamlede i disse studier. Disse referencer omfatter myoglobin, cytochrom AA3 (alternativt cytochrom a605 og cytochrom a607, afhængigt af typen af forstyrrelse22), cytochrom a580, cytochrom bL, cytochrom bH , cytochrom c, cytochrom c1, fad, en absorbans repræsentation af hændelsen lys (angivet i0, som bruges til at aflægge regnskab for sigtet lys, der er, fotoner, der gik gennem vævet uden at blive absorberet), og en linje (med varierende hældning og afskæring for at gøre det til en spredning, ikke vist i figur 2). Nogle Spectra er støjende, da koncentrationen af det rene referencemateriale var meget lavt22.

Tidsforløb for reference spektre passer under totalt eksperiment
Figur 3 repræsenterer tidsforløbet for et typisk eksperiment beregnet i trin 5,15 i protokollen. Dette består af en kontrolfase, efterfulgt af en cyanid injektion fase, efterfulgt af en cyanid udvaskes, efterfulgt af en deoxygenations fase, og endelig iskæmi. Ændringerne i de enkelte chromophorer (myoglobin, cytochrom AA3, og cytochrom c) over tid er afbildet over tid sammen med koronar strømningshastighed. Den optiske tæthed ændring af hver kromophore anslås ved at multiplicere fit koefficient opnået fra den lineære mindste kvadrater rutine og den repræsentative peak af kromophore (eller den maksimale absorbans af nævnte kromophore). For eksempel, for myoglobin, den pasform koefficient af myoglobin reference er ganget med værdien af myoglobin referencespektrum ved 580 nm. Bemærk den hurtige iltning af myoglobin til tilsætning af cyanid matches af stigningen i flow, men er før den betydelige reduktion af cytochromes. Denne effekt er delvist genvundet med udvaskningen af cyanid. Endelig, fuld reduktion af cytokromer der og deoxygenering af myoglobin er opnået med iskæmi. Disse data viser, at dynamiske data vedrørende hjertets metaboliske status let kan opnås med denne metode. Placeringen af spektrene, der anvendes til forskellen Spectra er markeret på dette tidspunkt som: C baseline, CN cyanid injektion, CNW cyanid udskylning, H N2 hypoksi (nitrogen er bukkede i perfusat i stedet for ilt), og Hi ingen flow iskæmi (ingen perfusat flyder gennem hjertet).

Forskel spektrum af Cyanidbehandling versus kontrol og pasform af cyanid forskel spektrum fra kanin hjerte.
For at opnå et differens spektrum trækkes to absolutte spektre. Hvert absolutte spektrum opnås ved at tage et gennemsnit på mange (typisk 100) spektre for at optimere signal til støjforhold. Figur 4 A repræsenterer forskellen spektrum af kontrol (C) og cyanid (cn) behandlet hjerte. Ved hjælp af reference spektrene, der er skitseret i figur 2, beregnes fit-spektret. Rest spektret er subtraktionen af pasformen fra rådataene. Den samme ordning anvendes til alle de efterfølgende spektral præsentationer. Figur 4 B præsenterer spektre amplituder i reference spektrene (vist i figur 2), som anvendes til at montere figur 4A. Kraftige stigninger i absorbans af de fleste cytochromer observeres som strømmen af elektroner ned cytochrom kæden blev blokeret af cyanid i steady state. Desuden steg absorbansen af oxygeneret myoglobin, da forbruget af ilt blev elimineret ved cyanid. Figur 4 C præsenterer forskellen spektre og pasform af forskellen spektrum fra CNW og cn, afslører den delvise tilbageførsel af cyanid effekt. Dette blev opnået ved at vælge tidspunkter i protokol trin 5,18, flytte t0 til CNW og T1 til CN region af tidsforløbet. Figur 4 D præsenterer forskellen spektrum af Hi og C, som repræsenterer den fuldt deoxygenerede og reducerede tilstand af cytosol og mitochondrier versus kontroltilstand. Igen, dette blev udført på protokol Step 5,18, flytte t0 til C og T1 til HI.

Indledende tidsforløb med cyanid påvirkning af koronar flow og kromoforer
Figur 5 A viser et eksempel på initiering af cyanid effekten på vævet. De passer til myoglobin, cytochrom en605 og cytochrom c sammen med koronar flow er præsenteret for et enkelt hjerte. Disse tids kurser blev oprettet på protokol trin 5,15 for cyanid eksperimentet. Den individuelle forskel i forhold til baseline (position 1) er vist i figur 5B. Spektrene blev genereret fra det tilsvarende positionsnummer (1-4) på tids kurset. Dette blev opnået ved protokol Step 5,18, hvor t0 altid var i position 1, og efterfølgende blev der skabt forskellige spektre (2 – 4) ved at flytte T1 til henholdsvis position 2, 3 og 4. Noget overraskende var observation, at flow og myoglobin iltning steg før væsentlige ændringer i Cytochrom redox tilstand. Initieringen af ændringerne i flow og kromophore absorbans blev anslået ved lineær ekstrapolation af den oprindelige ændring fra baseline. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, og indstilling af ændringen i koronar flow som tid nul, stigningen i myoglobin iltning initieret 1,71 min ± 0,39 min efter ændringen i flow, mens cytochrom A605 og cytochrom c absorbans var næsten identiske, men meget langsommere ved 4,24 min ± henholdsvis 0,76 min og 4,34 min ± 0,77 min. (n = 8). Disse data tyder på, at cyanid slapper vaskulære tone24 før en større ændring i hjertemusklens metaboliske tilstand opstår. Denne effekt er sandsynligvis forårsaget af cyanid støder på den vaskulære glatte muskulatur før at nå effektiv dosis omkring hjertets myocytter.

Estimater af myoglobin iltning i kontrol hjerter
Ved hjælp af cyanid data som et skøn over total myoglobin iltning og iskæmi data for fuldt deoxygeneret myoglobin, vi anslår, at under kontrolbetingelser myoglobin var kun 88,2% ± 1,0% (n = 10) oxygenerede, i overensstemmelse med tidligere undersøgelser20 , 21 , 25.

Figure 1
Figur 1 : Spektre fra det optiske kateter med side fyring. (A) dette er et spektrum af det udsendte lys fra fjernlys kilden gennem kateteret detekteret med pickup fiber på ca. 1 cm fra kateteret. I denne geometri er hjertet fraværende, og intensiteten af lyskilden er indstillet, så detektoren ikke mægle. B) det side affyrings kateter indsættes i venstre ventrikel, og det transmitterede lys fra hjertet opsamles og vises. Skæret viser udvidet 400 til 580 nm regionen, hvilket afslører den komplekse overførsel af lys fra denne region. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Reference spektre af hjertechromophorer, der anvendes til spektral montering. Spectra blev indsamlet via en række forskellige metoder22 og er af reduceret – oxideret (for cytochromes) og deoxygenated – oxygeneret (for myoglobin). For jeg0, er spektret i figur 1A simpelthen konverteret til en absorbans sigt for at gøre henvisningen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Flow og optiske ændringer over tid. Den optiske densitet ændring (δod) af hver kromophore er simpelthen den monterede individuelle kromoforholdig spektrum ved sin maksimale absorbans. De maksimale absorbans frekvenser var som tidligere beskrevet20,26. Den præsenterede tid kursus er for et eksperiment, der viser en baseline, efterfulgt af cyanid injektion (0,10 mm ved maksimal af flow), cyanid udskylning, nitrogen hypoksi udføres ved at erstatte ilt med kvælstof, og derefter fuldføre iskæmi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Monteret forskel spektre af forskellige forhold. A) spektret af cyanid indsprøjtningen minus basislinjen. Fit spektret opnået fra den mindst firkantede rutine er også plottet. Rest spektret er forskellen mellem de rå og fit Spectra. B) reference spektre, der anvendes til at skabe den pasform, som er præsenteret i figur 4A. Programmet skalerer referencerne i figur 2 til deres relative bidrag i det aktuelle difference spektrum. (C) samme som i A, men viser forskellen spektrum af udvaskningen versus cyanid injektion. (D) samme som i A, men viser forskellen spektrum af iskæmi versus baseline. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Høj tidsmæssig opløsning af cyanid Infusions effekt på udvalgte cytochromer, myoglobin og hjertets flow. (A) tidsforløbet af hjertets flow, deoxymyoglobin, reduceret cytochrom a605, og reducerede cytochrom c. tal refererer til positionen af spektrene taget i forhold til baseline i figur 5B. B) forskel spektre for de 4 positioner, der er mærket i figur 5A kontra kontrol (position 1). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den isolerede tilbage eller arbejder perfektioneres hjerte forberedelse er en grundpille i studiet af hjertets fysiologi samt den prækliniske undersøgelse af teknikker og lægemidler på hjertet. Nøglen til dens anvendelse har været den lette forberedelse, robuste funktionelle egenskaber og kontrol af eksperimentelle parametre samt evnen til at måle mange funktionelle parametre i det bankende hjerte. Optisk absorbans spektroskopi giver indsigt i vævs oxygenering samt mitokondrier metaboliske aktiviteter. Optisk spektroskopi har primært udført i de isolerede perfbrugte hjerteundersøgelser i refleksions tilstand, at det er vanskeligt at fortolke på grund af bevægelse og let spredning komplikationer.

Vi har introduceret ventrikel væg transmission optisk spektroskopi (VWTOS) at give en robust metode til overvågning af hjertevæv metaboliske chromophores. I en tidligere publikation viste vi, at en LED-hardwired til spidsen af koaksialkablet20 gør en unik intrakardiel side-fyring lyskilde, der kan bruges til vwtos perfbrugte hjerter. Den side-fyring refererer til projektion af lys vinkelret på den lange akse af kateteret, ideel til belysning af ventrikel fri væg. LED kateteret var lille nok til ikke at påvirke hjertets funktion, men krævede specialiseret fabrikation i laboratoriet. Den nuværende undersøgelse præsenterer brugen af en 500 micron kommerciel side fyring kateter, der kan kobles til enhver lyskilde kompatibel med fiberoptik. Disse side-fyring optiske katetre blev kommercielt udviklet til laser ablation vinkelret på den lange akse af fiber. Naturligvis bruger vi lys strøm meget lavere end nødvendigt for photoablation. Mindre fibre er tilgængelige til brug på mindre præparater som den perfuse mus hjerte27. Dette fiberoptiske system leverede tilstrækkelig belysning gennem hjertevæggen i bølgelængdeområdet, hvor hjertechromophorer absorberer (450 – 630 nm). Ved hjælp af en pickup fiberoptik på yderside af hjertet, kan absorbans af myoglobin og mitokondrier cytokromer der overvåges med fremragende tidsmæssig og spektral opløsning (Se figur 5). Den side-fyring fiberoptisk tilgang har flere fordele i forhold til LED kateter for VWTOS, herunder en meget mindre tværsnits profil af kateteret, der minimerer virkningen af kateteret på hjertet, mere fleksibel reducere virkningen på hjerteklap og ventrikel præstation, ingen elektriske forbindelser, der kan kort ud i saltopløsning perfusate, og endelig et kateter, der bruger en ekstern lyskilde, der øger fleksibiliteten af lyskilde valg for VWTOS.

På grund af den stærke absorbans af hjertet under 490 nm, er det vanskeligt at generere meget information om soret båndet af cytokromer der i regionen 410-445 nm eller NADH ved 340 nm. Således er den brede absorbans af FAD ved 450 Nm den laveste frekvens absorbans, der observeres, selv om hele absorptions toppen af dette kromophorer ikke er afprøvet. Ved hjælp af VWTOS signal til støjforhold er meget høj, da hele væggen er udtaget i modsætning til overflade refleksion spektroskopi, almindeligvis anvendes20, som kun prøver overfladen af hjertet med talrige spredning spørgsmål. VWTOS prøveudtagning hele hjertevæggen er mere analog med nuklear magnetisk Resonansspektroskopi (NMRS) målinger af mange hjerte metabolitter såsom 31P detekteret adenosintrifosfat og kreatinphosphat28, 13C påvist mærket metabolitter29,30 inklusive hyperpolariserede etiketter31,32og 1t detekterede metabolitter33. Da VWTOS kan udføres ved hjælp af ikke-magnetiske anordninger, er det helt muligt, at NMR og VWTOS kan udføres samtidigt. VWTOS er ikke begrænset til endogene chromophorer og kan bruges til at overvåge absorption fra optiske sonder for pH, ca2 +og plasma membran potentiale.

Vi bruger 2 Hz (dvs. 2 prøver/sekund), som giver fremragende enkelt spektrum signal til støj. Selv om højere prøveudtagnings rater kan opnås, der tillader kardiel cyklus analyse, tidligere undersøgelser har vist, at der er ingen Beat at slå variation i kromophore absorbans, så ingen indsats for selektivt at indsamle lys som en funktion af hjerte cyklus var lavet34. På grund af VWTOS geometri er påvisning af lys mindre afhængig af vævs bevægelse end refleksions metoder, da de komplekse overflade sprednings hændelser elimineres. Vi finder, at svær bevægelse kan forstyrre disse foranstaltninger, men realtid spektralanalyse afslører hurtigt spektral overgange uoverensstemmende med vævs kromophore overgange. Igen, dette sker kun, når hjertet bevæger sig groft væk fra indsamlingen fiber dramatisk reducere mængden af indsamlede transmitterede lys.

Vwtos-data analyseres ved hjælp af fuld spektral tilpasnings rutine baseret på et reference bibliotek af spektre af hjertechromophorer og lyskildens spektrum som tidligere beskrevet20,22,27, 35 med en simpel lineær mindste kvadraters tilgang. Denne spektral monteringsprocedure kompenserede for overlappende absorbans spektrum og er ikke afhængig af "isobestiske" bølgelængder. Denne komplette spektrum analyse eliminerer artefakter forbundet med fælles dobbeltstråle (dvs. to bølgelængde) analyse1,3,6 , som har vist sig at være problematisk20. Den ekstra fordel ved fuld spektralanalyse er genereringen af en godhed af pasform fra residualerne, ikke tilgængelig i Dual Beam protokoller.

I denne undersøgelse fokuserede vi på virkningen af cyanid på hjertets optiske egenskaber. Som cyanid blokke cytochrom oxidase, det hæmmer iltforbrug og hovedsagelig resulterer i en nettoreduktion af alle de cytochromer som elektroner tilbage op i Cytochrom kæden. Men membranpotentialet tilsyneladende fortsat høj, da redox ændringer i bL og bH er meget små sammenlignet med cytochrom c13. Med ophør af iltforbrug bør iltspændingen i vævet nærme sig perfusatet, og vi bemærkede en tidlig stigning i oxygeneret myoglobin med cyanid i overensstemmelse med forestillingen om, at det saltholdige perfoerede hjerte, selv i retrograd perfusion tilstande, er ikke fuldt oxygenerende myoglobin i cytosol19,20,21,36. Sammenligning af den maksimale effekt af cyanid på oxygeneret myoglobin med det fuldt deoxygenerede spektrum opnået med iskæmi afslører en myoglobin iltning på kun omkring 88%, i overensstemmelse med tidligere undersøgelser.

Det er vigtigt at bemærke i denne undersøgelse, at cyanid virkningerne på myoglobin iltning og cytochrom reduktion blev tidsmæssigt løst. Det er overraskende, at virkningerne af cyanid blev først observeret på koronar flow og myoglobin før store ændringer i hjertets cytokromer der redox tilstand blev observeret. Den tidlige markante stigning i strømmen tyder på, at en effekt på arteriel glat muskulatur24,37 kan forekomme, før der observeres grove metaboliske virkninger i hjerte cellerne. Stigningen i flow, potentielt med en beskeden cyanid induceret fald i respiration, sandsynligvis resulterer i den umiddelbare stigning i oxygeneret myoglobin forårsaget af stigningen i ilt levering. Med udbredelsen af cyanid hæmning til myocytterne observeres en yderligere stigning i koronar strømmen (Se regionen markeret 3 i figur 5a), sandsynligvis drevet af talrige metaboliske faktorer38. Den store tidlige virkning af cyanid på flow tyder på, at metabolismen af den vaskulære glatte muskulatur kan være mere potent i at ændre vaskulær tone end metabolismen af myocytterne. Disse data understøtter den veletablerede forestilling om, at myoglobin har en meget lavere affinitet for ilt end Cox, selv i det intakte hjerte, da myoglobin iltning forekom godt før ændringer i mitokondrien redox-tilstand (figur 5). Dette høje niveau af deoxygeneret myoglobin under kontrolforhold er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der tyder på, at det isolerede saltvands perfokat hjerte kan være delvist hypoxisk selv under kontrolbetingelser9,19, 20,21,27,36, understreger vigtigheden af at overvåge hjertevæv iltning, når du bruger denne vigtige model i hjertets fysiologi.

Vi præsenterer her de eksperimentelle detaljer for at gennemføre transmission absorption spektroskopi på den isolerede perfektioneres hjerte. Vi har med succes tilpasset denne teknik til brug på hjerterne fra kanin til mus ved hjælp af en tynd side-fyring intrakardiel optisk fiber. Udnytte State of the art fuld spektral montering rutiner, den komplekse optiske interaktion af hjertets kromoforer kan let udvindes giver, en nær real-time måling af kritiske elementer af Myokardie metabolisme samtidig med konventionelle funktionelle foranstaltninger.

Disclosures

Ingen interessekonflikter anmeldt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev fuldt understøttet af NHLBI murene program (projekt # ZIA HL00460131).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BIOPAC data acquisition system BIOPAC MP150 Analog to digitial conversion
BIOPAC general purpose transducer amplifiers BIOPAC DA100C Pressure monitoring
BIOPAC System skin temperature amplifier BIOPAC SKT100B temperature monitoring
Compact Universal 1- and 2- Channel LED Controllers Mightex SLC-MA02-U External light source power supply
Disposable pressure sensors BIOPAC RX104A Pressure monitoring
Dual Syringe, Infusion Pump KdScientific KDS 200 / 200P LEGACY SYRINGE PUMP drug injection
Flow-through probes Transonic 4PXN perusate flow monitoring
Glass Syringe FORTUNA Optima 30 CC Air tight fluid injection
High power fiber-coupled LED white light source Mightex Type-A FCS-0000 External light source
Perfused heart system Radnoti 120101BEZ This system was heavily modified to provide adequate flow (see manuscript)
Phase fluorimeter Ocean Optics NeoFox-GT oxygen concentration
Pickup fiber optic Thor labs BF20HSMA01 Fiber for collecting transmitted light (pick up fiber)
PowerLab unit AD Instruments PowerLab 8/35 Analog to digitial conversion
Pressure transducers BIOPAC TSD104A pressure monitoring
Programming environment LABViEW N/A Software for driving spectrometer, digitiziing data and analysis. Code available on request
Rapid scanning spectrophotometer Ocean Optics QE65PRO Rapid scanning spectrometer for spectral analysis
Side firing fiber optic Polymicro Technologies Molex, LLC 18019 North 25th Av, Phoenic AZ 85023-1200 JTFLH200230500/1.5M  side firing fiber optic 200 microns core 
Sodium cyanide Sigma-Aldrich 380970 Metabolic inhibitor
Temperature probe BIOPAC TSD102A temperature monitoring
Tubing flow modules Transonic TS410 perusate flow monitoring

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arai, A. E., Kasserra, C. E., Territo, P. R., Gandjbakhche, A. H., Balaban, R. S. Myocardial oxygenation in vivo: optical spectroscopy of cytoplasmic myoglobin and mitochondrial cytochromes. American Journal of Physiology. 277, 2 Pt 2 683-697 (1999).
  2. Epstein, F. H., Balaban, R. S., Ross, B. D. Redox state of cytochrome aa3 in isolated perfused rat kidney. American Journal of Physiology. 243 (4), 356-363 (1982).
  3. Hassinen, I. E., Hiltunen, J. K., Takala, T. E. S. Reflectance spectrophotometric monitoring of the isolated perfused heart as a method of measuring the oxidation-reduction state of cytochromes and oxygenation of myoglobin. Cardiovascular Research. 15, 86-91 (1981).
  4. Makino, N., Kanaide, H., Yoshimura, R., Nakamura, M. Myoglobin oxygenation remains constant during the cardiac cycle. American Journal of Physiology. 245 (14), 237-243 (1983).
  5. Takahashi, E., Doi, K. Visualization of oxygen level inside a single cardiac myocyte. American Journal of Physiology. 268, 6 Pt 2 2561-2568 (1995).
  6. Heineman, F. W., Kupriyanov, V. V., Marshall, R., Fralix, T. A., Balaban, R. S. Myocardial oxygenation in the isolated working rabbit heart as a function of work. American Journal of Physiology. 262, 255-267 (1992).
  7. Arakaki, L. S., Burns, D. H., Kushmerick, M. J. Accurate myoglobin oxygen saturation by optical spectroscopy measured in blood-perfused rat muscle. Applied Spectroscopy. 61 (9), 978-985 (2007).
  8. Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. Metabolic network control of oxidative phosphorylation: multiple roles of inorganic phosphate. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39155-39165 (2003).
  9. Tamura, M., Oshino, N., Chance, B., Silver, I. A. Optical measurements of intracellular oxygen concentrations of rat heart in vitro. Archives of Biochemistry and Biophysics. 191, 18-22 (1978).
  10. Wright, T. J., Davis, R. W. Myoglobin oxygen affinity in aquatic and terrestrial birds and mammals. The Journal of Experimental Biology. 218, Pt 14 2180-2189 (2015).
  11. Wright, T. J., Davis, R. W. Myoglobin extraction from mammalian skeletal muscle and oxygen affinity determination under physiological conditions. Protein Expression and Purification. 107, 50-55 (2015).
  12. Shibata, T., et al. Relationship between oxygen affinity and autoxidation of myoglobin. Inorganic Chemistry. 51 (21), 11955-11960 (2012).
  13. Kim, N., Ripple, M. O., Springett, R. Measurement of the mitochondrial membrane potential and pH gradient from the redox poise of the hemes of the bc1 complex. Biophysical Journal. 102 (5), 1194-1203 (2012).
  14. Oshino, N., Jamieson, D., Sugano, T., Chance, B. Mitochondrial function under hypoxic conditions: The steady states of cytochrome a,a3 and their relation to mitochondrial energy states. Biochimica et Biophysica Acta. 368, 298-310 (1974).
  15. Glancy, B., Willis, W. T., Chess, D. J., Balaban, R. S. Effect of calcium on the oxidative phosphorylation cascade in skeletal muscle mitochondria. Biochemistry. 52 (16), 2793-2809 (2013).
  16. Figulla, H. R., Hoffmann, J., Lubbers, D. W. Evaluation of reflection spectra of the isolated heart by multicomponent spectra analysis in comparison to other evaluating methods. Advances in Experimental Medicine and Biology. 169, 821-830 (1984).
  17. Hoffmann, J., Lubbers, D. W., Heise, H. M. Applicability of the Kubelka-Munk theory for the evaluation of reflectance spectra demonstrated for haemoglobin-free perfused heart tissue. Physics in Medicine and Biology. 43 (12), 3571-3587 (1998).
  18. Fabel, H., Lubbers, D. W. Measurements of Reflection Spectra of Beating Rabbit Heart in Situ. Biochemische Zeitschrift. 341 (4), 351 (1965).
  19. Schenkman, K. A., Beard, D. A., Ciesielski, W. A., Feigl, E. O. Comparison of buffer and red blood cell perfusion of guinea pig heart oxygenation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), 1819-1825 (2003).
  20. Femnou, A. N., et al. Intracardiac light catheter for rapid scanning transmural absorbance spectroscopy of perfused myocardium: measurement of myoglobin oxygenation and mitochondria redox state. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 313 (6), 1199-1208 (2017).
  21. Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 704-715 (2018).
  22. Chess, D. J., et al. Optical spectroscopy in turbid media using an integrating sphere: mitochondrial chromophore analysis during metabolic transitions. Analytical Biochemistry. 439 (2), 161-172 (2013).
  23. Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. Multiparametric optical mapping of the Langendorff-perfused rabbit heart. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
  24. Coburn, R. F., Grubb, B., Aronson, R. D. Effect of cyanide on oxygen tension-dependent mechanical tension in rabbit aorta. Circulation Research. 44 (3), 368-378 (1979).
  25. Schenkman, K. A., Marble, D. R., Burns, D. H., Feigl, E. O. Myoglobin oxygen dissociation by multiwavelength spectroscopy. Journal of Applied Physiology. 82 (1), 86-92 (1997).
  26. Femnou, A. N., et al. Intracardiac light catheter for rapid scanning transmural absorbance spectroscopy of perfused myocardium: measurement of myoglobin oxygenation and mitochondria redox state. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 313 (6), 1199-1208 (2017).
  27. Giles, A. V., et al. Paradoxical Arteriole Constriction Compromises Cytosolic and Mitochondrial Oxygen Delivery in the Isolated Saline-Perfused Heart. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory. , (2018).
  28. Matthews, P. M., et al. A 31P-NMR study of some metabolic and functional effects of the inotropic agents epinephrine and ouabain, and the ionophore R02- 2985 (X537A) in the isolated, perfused rat heart. Biochimica et Biophysica Acta. 720, 163-171 (1982).
  29. Lewandowski, E. D., Damico, L. A., White, L. T., Yu, X. Cardiac responses to induced lactate oxidation: NMR analysis of metabolic equilibria. American Journal of Physiology. 269, 1 Pt 2 160-168 (1995).
  30. Lewandowski, E. D., et al. Multiplet structure of 13C NMR signal from glutamate and direct detection of tricarboxylic acid (TCA) cycle intermediates. Magnetic Resonance in Medicine. 35 (2), 149-154 (1996).
  31. Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: a metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magnetic Resonance in Medicine. 71 (5), 1663-1669 (2014).
  32. Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-(13)C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
  33. Pisarenko, O. I., Khlopkov, V. N., Ruuge, E. K. A 1H NMR study of succinate synthesis from exogenous precursors in oxygen-deprived rat heart mitochondria. Biochemistry International. 12 (1), 145-153 (1986).
  34. Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 704-715 (2018).
  35. Schenkman, K. A., Marble, D. R., Burns, D. H., Feigl, E. O. Myoglobin oxygen dissociation by multiwavelength spectroscopy. American Journal of Physiology. 82 (1), 86-92 (1997).
  36. Beard, D. A., Schenkman, K. A., Feigl, E. O. Myocardial oxygenation in isolated hearts predicted by an anatomically realistic microvascular transport model. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), 1826-1836 (2003).
  37. Paul, R. J. Section II: The Cardiovascular System, Vol II, Vascular Smooth Muscle. Handbook of Physiology. Bohr, D. E., Somlyo, A. P., Sparks, H. V. , American Physiological Society. 201-252 (1980).
  38. Feigl, E. O. Coronary physiology. Physiological Reviews. 63, 1-205 (1983).

Tags

Bioengineering hjertefunktion hjerte metabolisme mitokondrier myoglobin cytochrom oxidase cytochrom c cytochrom b FAD mitokondrier membran potentiale vævs iltning optisk spektroskopi spektral montering
Intra-hjerte side-fyring lys kateter til overvågning cellulære metabolisme ved hjælp af Transmural absorbans spektroskopi af Perfamale pattedyr hjerter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Femnou, A. N., Giles, A., Balaban,… More

Femnou, A. N., Giles, A., Balaban, R. S. Intra-cardiac Side-Firing Light Catheter for Monitoring Cellular Metabolism using Transmural Absorbance Spectroscopy of Perfused Mammalian Hearts. J. Vis. Exp. (147), e58992, doi:10.3791/58992 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter