Summary
Hier introduceren we een methode voor het gebruik van een intra-ventrikel optische katheter in geperfundeerd harten om Absorptie spectroscopie uit te voeren over de hart muur. De verkregen gegevens bieden robuuste informatie over de zuurstofspanning van het weefsel, evenals substraat gebruik en membraanpotentiaal gelijktijdig met cardiale prestatie maatregelen in deze alomtegenwoordige voorbereiding.
Abstract
Absorptie spectroscopie van de hartspier biedt niet-destructieve beoordeling van cytosolische en mitochondriale oxygenatie via myoglobine en cytochroom-extinctie respectievelijk. Daarnaast kunnen ook talrijke aspecten van de mitochondriale metabole status zoals membraanpotentiaal en substraat invoer worden geschat. Om cardiale wand transmissie optische spectroscopie uit te voeren, wordt een in de handel verkrijgbare zijwaarts gerichte optische vezel katheter in de linker ventrikel van het geïsoleerde geperfundeerd hart als een lichtbron geplaatst. Licht dat door de hart muur loopt wordt opgevangen met een externe optische vezel om optische spectroscopie van het hart in near real-time uit te voeren. De transmissie aanpak vermijdt talrijke oppervlakte verstrooiing interferentie die zich voordoet in veel gebruikte reflectie benaderingen. Veranderingen in Transmurale extinctie Spectra werden deconvolved met behulp van een bibliotheek van chromofoor referentie spectra, die tegelijkertijd kwantitatieve maatregelen van alle bekende hart chromoforen kregen. Deze spectrale deconvolutie benadering elimineerde intrinsieke fouten die kunnen voortvloeien uit het gebruik van gemeenschappelijke dubbele golflengte methoden die worden toegepast op overlappende absorptiespectra, evenals een kwantitatieve evaluatie van de goedheid van pasvorm. Een aangepast programma is ontworpen voor het verzamelen en analyseren van gegevens, waardoor de onderzoeker de metabole toestand van het preparaat tijdens het experiment kon controleren. Deze relatief eenvoudige toevoegingen aan het standaard hart perfusie systeem bieden een uniek inzicht in de metabole toestand van de hart muur naast conventionele maatregelen van contractie, perfusie en substraat/zuurstof extractie.
Introduction
Optische extinctie spectroscopie voor bewaking intact orgel biochemie is een veel gebruikte benadering vanwege de intrinsieke, niet-destructieve natuur1,2,3,4,5, 6,7,8,9. Myoglobine extinctie biedt een meting van de gemiddelde cytosolische zuurstofspanning10,11,12. Mitochondriale cytochromen geven informatie met betrekking tot substraat binnenkomst op het niveau van flavins, membraan potentieel van cytochroom bL: bH13, en zuurstof levering aan de mitochondriën in de cel van cytochroom oxidase (Cox ) redox staat14. Glancy et al. toonde aan dat de activiteiten van elke complexen kunnen worden bepaald door het meten van het Mitochondriale membraanpotentiaal en de metabolische snelheid15. Vandaar, met behulp van optische spectroscopie, een schat aan informatie kan worden verkregen zonder de noodzaak van exogene sondes of belangrijke wijzigingen van de huidige studie systemen. Het doel van dit papier is om een robuuste methode te presenteren voor het opvangen van optische spectra in conventionele geperfundeerd hart preparaten, waarbij de enige grote modificatie studies uitvoert in een verduisterde omgeving.
Reflectantie Absorptie spectroscopie is met succes gebruikt voor het uitvoeren van optische spectroscopie van de geperfundeerd hart3,6,16,17,18,19 ook Als het hart in vivo1. Reflectantie spectroscopie bestaat uit het branden van licht op het hart oppervlak en het verzamelen van het licht verspreid door het hart, evenals diffuus en spiegelend reflecterend licht. Zo is het verzamelde licht in deze benadering een samenstelling van meerdere verstrooiings mechanismen en het weefsel chromofoor gemiddelde van belang. Als gevolg van de beweging en het complexe oppervlak van het hart, de lichtreflectie van het oppervlak van het hart is bijzonder problematisch, het veranderen van de diepte van penetratie en de hoeveelheid zuiver gereflecteerd licht.
De hierboven gepresenteerde beperkingen van de absorptie spectroscopie met reflectantie werden opgelost door een optische katheter in de linker ventrikel holte te introduceren, waardoor de verzameling van verzonden licht over de linker ventrikel vrije muur20. De voordelen van transmissie spectroscopie voor dit type studie werden gewaardeerd in vroege invasieve studies van Tamura et al.9 de huidige implementatie biedt een zeer robuuste transmissie Absorptie spectroscopie analyse van het intact hart met met betrekking tot cytosolische oxygenatie en mitochondriën redox toestand onder een verscheidenheid van voorwaarden21. Deze eerste studies gebruikten een speciaal vervaardigde katheter met een gevoede LED op de tip gericht om een zijwaarts afvuren patroon van wit licht door het myocardium te genereren. Echter, de relatief grote LED getipt katheter is alleen geschikt voor gebruik op middelgrote harten (konijn, cavia, enz.) en vereist aangepaste fabricage. In de huidige studie, een methode van het gebruik van een commercieel beschikbare 200-micron kern kant-vuren optische vezels als een lichtgeleider wordt gepresenteerd. In plaats van een bekabelde LED aan de tip, de katheter met de 500-micro Tip redirects licht van een externe bron waardoor de veelzijdigheid van het systeem. Deze aanpak maakt het gebruik van een breed scala van externe lichtbronnen, waaronder lasers voor toepassingen zoals Raman verstrooiing spectroscopie. Om deze gegevens te kwantificeren, wordt een online volledige spectrale analyse met behulp van bekende referentie Spectra ter verbetering van de nauwkeurigheid van de spectroscopische bepaling van hart chromoforen gepresenteerd zoals eerder beschreven20,22. De broncode voor deze analyse wordt op verzoek door de auteurs verstrekt. Met behulp van deze aanpak, informatie over cardiale biochemie en mitochondriale functie kan gelijktijdig worden verkregen met de conventionele cardiale functionele parameters met weinig of geen invloed op de hart voorbereiding. Omdat het hart kritisch afhankelijk is van de mitochondriale functie en de zuurstoftoevoer, zal deze technische toevoeging aan het klassieke geperfundeerd hartsysteem de interpretatie en het nut van dit belangrijke model van cardiale prestaties aanzienlijk verbeteren.
Protocol
Alle dier protocollen werden goedgekeurd door de Animal Care and use Committee van het National Heart, Lung en Blood Institute en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen beschreven in de Animal Care and Welfare Act (7 USC 2142 § 13).
1. geïsoleerd Perfused Hartsysteem en perfusaat
Opmerking: deze voorbereiding is zeer vergelijkbaar met eerdere publicaties23.
- Maak 4 liter gemodificeerde Krebs-henseleit perfusaat samengesteld uit (in mmol/L) 137,0 NaCl, 5,4 KCl, 1,8 CACL2, 0,5 MgCl2, 1,0 na2HPO4, 10,0 glucose, 1,0 lactaat, en 10,0 Hepes.
- pH de perfusaat tot 7,4 bij 37 °c met NaOH en HCL.
- Filtreer de perfusaat door een porie membraan van 1 μm.
- Spoel alle buizen en kamers van het geperfundeerd hartsysteem af door gezuiverd water door het systeem te voeren en af te tappen.
- Breng de perfusaat in de tank en zuurstofhoudende verbinding met 100% O2 met de bubbler met behoud van de temperatuur bij 37 °c met behulp van een verwarmd Circulerend waterbad.
- Voeg 2 van 12 μm porie membraanfilters toe en prime het systeem met de perfusaat tijdens recirculeren in de Langendorff-modus.
- Bevestig een slangklem op de buis recht boven de aorta canule en stel de schroef zo in dat de aorta stroom tot ongeveer 10 mL/min daalt.
2. konijn hart excisie en perfusie
- Hart excisie
- Anesthetize mannelijke Nieuw-Zeelandse witte konijnen (ongeveer 3 kg) via een 1,5 mL intramusculaire injectie van ketamine/Acepromazine mengsel (10:1).
- Ongeveer 10 – 15 minuten later, dien 3% Isofluraan toe via inademing voor een volledig verdovend effect.
- Bevestig de juiste anesthesie diepte door de teen te knijpen en plaats vervolgens een lijn in de marginale oorader voor toediening van daaropvolgende geneesmiddelen.
- Injecteer 1.500 eenheden (of 1,5 mL van 1.000 eenheden/mL) heparin en laat 3 minuten circuleren.
- Controleer de juiste diepte van de anesthesie en euthaniseer vervolgens met 6 mEq (of 3 mL van 2 mEq/mL) KCl.
- Open de kist snel, lokaliseer de Apex van het hart en de aorta. Verwijder het hart door de aorta zo ver mogelijk van het hart te snijden en de pulmonale aderen zo dicht mogelijk bij de longen te snijden.
Opmerking: het verwijderen van de longen in dit vroege stadium is anders dan de vorige publicatie23 , maar heeft geen invloed op de voorbereiding. - Plaats het hart in een kleine Beker van perfusaat (zelfde perfusaat als stap 1,3) zittend in een emmer ijs voor transport van chirurgie naar perfusie.
- Hart cannulatie
- Cannulate en bind de aorta veilig, ervoor te zorgen dat geen bubbels in de aorta lijn te nemen.
- Start de stroom bij 70 mmHg perfusiedruk door de slangklem op de aorta lijn te verwijderen en deze druk te handhaven tijdens de rest van de operatie en de cannulatie van het vat.
- Scheid de longslagader van de aorta en andere schepen en ligate de Vena ader en de Long aders. Verwijder het vet en bindweefsel nog aanwezig.
- Cannulate de longslagader om een meting van coronaire sinus debiet en zuurstofspanning te bieden.
- Gooi de eerste stroom uit het hart (gedurende ongeveer 10 minuten) tijdens de bereiding om bloed en chirurgisch vuil te elimineren. Na deze periode, recirculeren de perfusate.
3. zijwaarts afvuren Fiber Optic plaatsing
- Sluit de Fiber Optic katheter aan op een High-Power Fiber-gekoppelde LED-witte lichtbron om visualisatie te helpen en het licht voor spectroscopie eenmaal in het hart te bieden.
- Snijd een klein aanhangsel van het linker Atrium, steek de katheter in de linker ventrikel via de mitralisklep, draai het vervolgens om een verlichte linker ventrikel vrije muur te bereiken.
- Plaats de pickup Fiber Optic direct tegenover de regio van maximale verlichting van de linker ventrikel op ongeveer 1 cm van het hart.
- Sluit het andere uiteinde van de pickup Fiber aan op een Rapid Scanning spectrometer.
4. optische spectroscopie
- Schakel de lampjes in het experimentele gebied uit om volledige duisternis te verkrijgen.
- Start het aangepaste programma, met spectrometer drivers om data-acquisitie en real-time analyse van het uitgezonden licht uit te voeren.
Opmerking: een uitvoerbare versie van de geconsolideerde versie van het spectrale acquisitie-en analyseprogramma wordt geleverd als een aanvullend coderingsbestand. Broncode is op verzoek beschikbaar voor de auteurs. - Navigeer door alle prompts en selecteer opties voor geperfundeerd-acquisitie modus voor hart spectroscopie. Geef op de volgende pagina aan of het verzamelen van hulp gegevens plaatsvindt. Voer ten slotte acquisitie parameters in, inclusief locatie van zowel chromophores Reference Spectra als gegevens die moeten worden opgeslagen.
- Voer een bandbreedte van 490 – 630 nm.
- Voer een bemonsteringsfrequentie van 2 Hz in (d.w.z. 2 samples/sec).
- Verzamel een donkere stroom, of nul licht, spectrum om te corrigeren voor achtergrond signaalniveaus door de lichtbron uit te schakelen.
- Klik om de chromofoor referenties te selecteren die u wilt gebruiken in de aanpassings routine.
- Pas op de pagina gegevens ophalen de positie van zowel de katheter als de pickup-vezel aan om het uitgezonden licht op de software te maximaliseren met specifieke aandacht voor de amplitude van het signaal in de 500 nm-regio, waar de zuurstofhoudende myoglobine gemiddelde moet worden nageleefd.
- Zorg ervoor dat het verzonden licht de detector niet verzadigd in de regio 600 nm.
- Zorg ervoor dat geen externe lichtbronnen bijdragen aan het verzamelde spectrum door de katheter verlichting uit te schakelen en te bevestigen dat er nu geen licht wordt gedetecteerd.
- Start de gegevensverzameling door op de knop Spectra opslaan te klikken.
- Klik op instellen als besturingselement om het verschil extinctie spectrum van toekomstige Spectra naar het huidige "Control"-spectrum te bekijken.
- Elke fysiologische perturbatie zoals gewenst uitvoeren.
- Protocol 1: effect van cyanide op cardiale prestaties en Chromophore absorptie
- Stop Recirculerende vloeistof uit de hart perfusie.
- Injecteer met behulp van een spuitpomp cyanide (2,5 tot 75 mM bij pH 7) bij verschillende snelheden in perfusaat vlak voor de aorta-canule om de gewenste concentraties van cyanide te bereiken (0,025 tot 1 mM, berekend op basis van aorta debiet) in het vloeiende perfusaat in het hart terwijl bewaking van de hartfunctie en optische eigenschappen.
- Stop de cyanide spuitpomp wanneer de effecten op de coronaire stroming en hartslag samen met de optische transmissie door de hart Muur in steady state zijn.
- Protocol 2: ischemie/hypoxie
- Stop de cyanide infusie.
- Na 5 minuten schakelt u het borrelende gas van 100% zuurstof naar 100% stikstof om zuurstof uit het systeem te verwijderen.
- Na ongeveer 10 minuten, stop de stroom om een totale ischemische/hypoxische aandoening te simuleren.
- Protocol 1: effect van cyanide op cardiale prestaties en Chromophore absorptie
5. spectrale gegevensanalyse
- Voer het programma uit in de geperfundeerd hart analyse modus.
- Selecteer de juiste spectrometer.
- Voer het gegevensbestandspad en het referentie Spectra-bestand in en selecteer de lichtbron van de katheter, die het vooraf opgeslagen spectrum van de lichtbron van de katheter laadt.
- Selecteer Lees opslaglocatiegegevens.
- Selecteer Stel min en Max golflengtein.
- Voer de bandbreedte voor de gegevensanalyse in als 490 – 630 nm.
- Selecteer terugkeren naar het hoofd menu.
- Selecteer verwijzingen lezen.
- Bevestig de referentie spectra die u in de analyse wilt gebruiken.
- Selecteer terugkeren naar het hoofd menu.
- Selecteer tijdpunten in het hoofdmenu.
- Selecteer een T0-tijdspunt als besturingselement en stel het bereik in op 100 punten.
- Selecteer een T1-tijdpunt als de experimentele periode met een bereik van 100 punten.
- Observeer het ruwe verschil spectrum in het gemiddelde ABS. spectrum tabblad.
- Selecteer geschiktheids coëfficiënten berekenen en klik vervolgens op het tabblad geschiktheids coëfficiënten om de tijdsduur van de referentie Spectra fit te observeren.
- Keer terug naar het hoofd menu en selecteer Bereken verschil ABS.
- Selecteer t0 en ΔT1 op alle posities. Let op het ingerichte spectrum in het raam van het verschil spectrum en de montage elementen in het venster referentiegewicht .
- Herhaal deze procedure om andere tijdpunten in het experiment te vergelijken.
- Ga terug naar het hoofd menu.
- Sla gegevens en analyses op in een spreadsheet rapport door een gewenste naam te typen en gegevens opslaan te selecteren voor verdere analyse met andere Programma's.
Opmerking: als er geen naam is getypt, wordt het rapport opgeslagen met dezelfde naam als het invoerbestand. Het rapport wordt opgeslagen in een map met de naam Excel Analysis files, die zich in dezelfde map bevindt als het oorspronkelijke invoerbestand.
Representative Results
Het systeem gebruikt is een uit de plank kleine dierlijke perfusie hartsysteem maar was sterk gewijzigd voor gebruik met een konijn hart. De wijzigingen waren in de eerste plaats om de boring grootte van alle slangen te verhogen om voldoende stroomtoevoer naar het konijn hart te verzekeren. Er werd veel zorg aan gedaan om, bij de gebruikte perfusiedruk, de stroomsnelheid van het systeem van de inheemse perfusie overschreden de stroom met hart bevestigd door ten minste 5-voudige. 2 – 12 μm porie membraanfilters werden parallel geplaatst tussen de vloeistof pomp en de aorta-zeepbel trap kamer om eventuele resten van het hart te verwijderen.
Uitgezonden licht van het konijn hart
Figuur 1 presenteert het spectrum van de katheter (Figuur 1A) en het ruwe spectrum van het uitgezonden licht van de vrije wand van het konijn hart (Figuur 1B). Deze gegevens onthullen een zeer grote verzwakking van het licht in het blauwe gebied van het spectrum, maar de banden van de absorptie van myoglobine en de mitochondriale cytochromen kunnen direct worden waargenomen tussen 490 en 580 nm in de wisselplaat. Het is belangrijk in deze studies om ervoor te zorgen dat voldoende verzonden licht wordt gedetecteerd in de regio van 490 tot 630 nm om informatie te verkrijgen over de metabolische responsieve cardiale chromohores. De positionering van de externe en inwendige vezels wordt aangepast voordat gegevens worden opgeslagen om de lichtintensiteit te maximaliseren, maar niet de detector in de 625 nm-regio te verzaderen.
Referentie verlaagd minus geoxideerde spectra van referentie chromophores in het hart.
Figuur 2 presenteert de referentie spectra die worden gebruikt voor de in deze onderzoeken verzamelde verschil spectra. Deze verwijzingen omvatten myoglobine, cytochroom AA3 (alternatief cytochroom a605 en cytochroom a607, afhankelijk van het type perturbatie22), cytochroom a580, cytochroom bL, cytochroom bH , cytochroom c, cytochroom c1, FAD, een extinctie van het incident licht (aangeduid met I0, die wordt gebruikt om het gezeefde licht te vertegenwoordigen, dat wil doen, fotonen die door het weefsel gingen zonder te worden geabsorbeerd), en een lijn (met variërende helling en snijpunt voor verstrooiing, niet weergegeven in Figuur 2). Sommige Spectra zijn luidruchtig, omdat de concentratie van het zuivere referentiemateriaal zeer laag was22.
Tijdsverloop van de referentie Spectra past tijdens totaal experiment
Figuur 3 staat voor de tijdsduur van een typisch experiment berekend in stap 5,15 van het protocol. Dit bestaat uit een controlefase, gevolgd door een cyanide-injectie fase, gevolgd door een cyanide-washout, gevolgd door een deoxygenatie fase en ten slotte ischemie. De veranderingen in de individuele chromophores (myoglobine, cytochroom AA3, en cytochroom c) na verloop van tijd worden uitgezet samen met coronaire debiet. De verandering van de optische dichtheid van elke chromofoor wordt geschat door vermenigvuldiging van de geschiktheids coëfficiënt verkregen uit de lineaire kleinste kwadraten routine en de representatieve piek van de chromofoor (of de maximale absorptie van de genoemde chromofoor). Voor myoglobine wordt bijvoorbeeld de geschiktheids coëfficiënt van de myoglobine-referentie vermenigvuldigd met de waarde van het myoglobine-referentiespectrum bij 580 nm. Opmerking de snelle oxygenatie van myoglobine aan de toevoeging van cyanide wordt geëvenaard door de toename van de stroming, maar is vóór de significante afname van cytochromen. Dit effect wordt gedeeltelijk hersteld met de wegwassende werking van cyanide. Tot slot, volledige vermindering van cytochromen en deoxygenatie van myoglobine wordt verkregen met ischemie. Deze gegevens laten zien dat dynamische gegevens over de metabolische status van het hart gemakkelijk kunnen worden verkregen met deze methodologie. De positie van de spectra die worden gebruikt voor het verschil Spectra zijn gemarkeerd op deze tijd cursus als: C baseline, CN cyanide injectie, CNW cyanide washout, H N2 hypoxie (stikstof wordt borrelen in de perfusaat in plaats van zuurstof), en Hi geen stroom ischemie (geen perfusaat stroomt door het hart).
Verschil spectrum van cyanide behandeling versus controle en de pasvorm van het cyanide verschil spectrum van konijn hart.
Om een verschil spectrum te verkrijgen, worden twee absolute Spectra afgetrokken. Elk absoluut spectrum wordt verkregen door gemiddeld veel (meestal 100) spectra te nemen om de signaal-ruis verhouding te optimaliseren. Figuur 4 A vertegenwoordigt het verschil spectrum van het behandelde hart van het besturingselement (C) en CYANIDE (CN). Met behulp van de in Figuur 2beschreven referentie Spectra wordt het fitspectrum berekend. Het rest spectrum is de aftrek van de pasvorm uit de onbewerkte gegevens. Hetzelfde schema wordt gebruikt voor alle daaropvolgende spectrale presentaties. Figuur 4 B presenteert de spectra amplitudes van de referentie spectra (afgebeeld in Figuur 2) die worden gebruikt voor Figuur 4A. Sterke stijgingen van de absorptie van de meeste cytochromen worden waargenomen omdat de stroom van elektronen in de cytochroom keten door cyanide in de steady state werd geblokkeerd. Bovendien nam de absorptie van zuurstofrijk myoglobine toe naarmate het zuurstofverbruik door cyanide werd geëlimineerd. Figuur 4 C presenteert het verschil Spectra en de pasvorm van het verschil spectrum van CNW en cn, waardoor de gedeeltelijke omkering van het cyanide-effect wordt onthuld. Dit werd bereikt door het selecteren van tijdpunten in Protocol stap 5,18, het verplaatsen van T0 naar de CNW en T1 naar CN regio van de tijd cursus. Figuur 4 D presenteert het verschil spectrum van Hi en C, die staat voor de volledig deoxygenated en verminderde toestand van de cytosol en mitochondriën versus de controle voorwaarde. Nogmaals, dit werd uitgevoerd bij Protocol stap 5,18, het verplaatsen van T0 naar C en T1 naar HI.
Initiële tijdsduur van cyanide effecten op coronaire stroming en chromophores
Figuur 5 A toont een voorbeeld van de inleiding van het cyanide-effect op het weefsel. De passingen voor myoglobine, cytochroom a605 en cytochroom c samen met de coronaire stroming worden gepresenteerd voor een enkel hart. Deze tijdvakken zijn gemaakt bij Protocol stap 5,15 voor het cyanide-experiment. Het individuele verschil versus de baseline (positie 1) wordt weergegeven in Figuur 5B. De spectra werden gegenereerd op basis van het corresponderende positienummer (1-4) op de tijdsduur. Dit werd bereikt bij Protocol stap 5,18, waarbij T0 altijd in positie 1 was en vervolgens verschillende spectra (2 – 4) werden gecreëerd door T1 te verplaatsen naar positie 2, 3 en 4 respectievelijk. Enigszins verrassend was de waarneming dat stroming en myoglobine oxygenatie verhoogd vóór significante veranderingen in cytochroom redox toestand. De initiatie van de veranderingen in flow en chromofoor extinctie werd geschat door lineaire extrapolatie van de aanvankelijke veranderingssnelheid vanaf de baseline. Met behulp van deze aanpak, en het instellen van de verandering in coronaire stroming als tijd nul, de toename van myoglobine oxygenatie geïnitieerd 1,71 min ± 0,39 min na de verandering in de stroming, terwijl cytochroom A605 en cytochroom c extinctie waren bijna identiek, maar veel langzamer op 4,24 min ± 0,76 min en 4,34 min ± 0,77 min, respectievelijk (n = 8). Deze gegevens suggereren dat cyanide de vasculaire Toon24 ontspant voordat een grote verandering in de hartspier metabole toestand optreedt. Dit effect wordt waarschijnlijk veroorzaakt door cyanide geconfronteerd met de vasculaire gladde spier voordat het bereiken van effectieve dosis rond de cardiale myocyten.
Schattingen van myoglobine oxygenatie in controle harten
Door gebruik te maken van de cyanide gegevens als schatting van de totale myoglobine oxygenatie en de ischemie-gegevens voor volledig deoxygenated myoglobine, schatten we dat onder controle omstandigheden myoglobine slechts 88,2% ± 1,0% (n = 10) zuurstof was, consistent met eerdere studies20 , 21 , 25.
Figuur 1 : Spectra van de zijwaarts gerichte optische katheter. (A) dit is een spectrum van het uitgezonden licht van de externe lichtbron via de katheter gedetecteerd met de pickup vezel op ongeveer 1 cm van de katheter. In deze geometrie is het hart afwezig en wordt de intensiteit van de lichtbron afgesteld zodat de detector niet verzadigd wordt. B) de zijwaarts gerichte katheter wordt in de linker ventrikel ingebracht en het uitgezonden licht uit het hart wordt verzameld en getoond. De wisselplaat toont de 400 tot 580 nm regio uitgebreid, waardoor de complexe lichttransmissie uit deze regio wordt onthuld. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Referentie spectra van cardiale chromophores die worden gebruikt voor spectrale fitting. Spectra werden verzameld via een verscheidenheid van methoden22 en zijn van verminderde – geoxideerd (voor de cytochromen) en deoxygenated – zuurstofrijk (voor myoglobine). Voor I0wordt het spectrum in Figuur 1A eenvoudigweg omgezet in een extinctie-term om de referentie te maken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Stroom en optische veranderingen in de loop van de tijd. De optische dichtheids verandering (δod) van elk chromofoor is eenvoudigweg het individuele spectrum van chromofoor op de maximale extinctie. De maximale extinctie frequenties waren zoals eerder beschreven20,26. De gepresenteerde tijd cursus is voor één experiment, met een baseline, gevolgd door cyanide injectie (0,10 mm bij maximale perfusaat flow), cyanide washout, stikstof hypoxie uitgevoerd door het vervangen van zuurstof met stikstof, en vervolgens volledige ischemie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Inbouw verschil spectra van verschillende omstandigheden. A) spectrum van de cyanide injectie minus de basislijn. Het fit-spectrum dat wordt verkregen uit de minst vierkante routine wordt ook getekend. Het rest spectrum is het verschil tussen de RAW en fit spectra. B) de referentie spectra die worden gebruikt om de in Figuur 4Aaangegeven pasvorm te creëren. Het programma schaalt de verwijzingen in figuur 2 om naar hun relatieve bijdrage in het huidige verschil spectrum. (C) hetzelfde als in A, maar toont het verschil spectrum van wegwassende werking versus cyanide injectie. (D) hetzelfde als in A, maar toont het verschil spectrum van ischemie versus Baseline. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Hoge temporele resolutie van het cyanide-infusie effect op geselecteerde cytochromen, myoglobine en cardiale stroming. A ) tijdsverloop van de hart stroom, deoxymyoglobine, verlaagde cytochroom A605, en verlaagd cytochroom c. getallen verwijzen naar de positie van de spectra die ten opzichte van Baseline in Figuur 5Bzijn genomen. B) verschil Spectra voor de 4 posities in Figuur 5A versus controle (positie 1). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
De geïsoleerde retrograde of werkende geperfundeerd hart voorbereiding is een Mainstay in de studie van cardiale fysiologie, evenals het preklinisch onderzoek van technieken en geneesmiddelen op het hart. Sleutel tot het gebruik ervan was het gemak van de voorbereiding, robuuste functionele kenmerken en controle van experimentele parameters, evenals de mogelijkheid om veel functionele parameters van het kloppend hart te meten. Optische extinctie spectroscopie biedt inzicht in weefsel oxygenatie, evenals mitochondriën metabole activiteiten. Optische spectroscopie is voornamelijk uitgevoerd in de geïsoleerde geperfundeerd hart studies in de reflectie modus die moeilijk te interpreteren is als gevolg van bewegings-en lichtverstrooiings complicaties.
We hebben ventrikel Wall Transmission Optical spectroscopie (vwtos) geïntroduceerd om een robuuste methode te bieden voor het bewaken van metabolische chromophores in het hartweefsel. In een eerdere publicatie toonden we aan dat een LED die met de punt van de coaxkabel20 is bedraad een unieke, intracardiale, zijwaarts afvuren lichtbron maakt die gebruikt kan worden voor vwtos geperfundeerd Hearts. De zijwaarts afvuren verwijst naar de projectie van licht loodrecht op de lange as van de katheter, ideaal voor het verlichten van de vrije wand van de ventrikel. De LED-katheter was klein genoeg om de cardiale functie niet te beïnvloeden, maar vereiste gespecialiseerde fabricage in het laboratorium. De huidige studie presenteert het gebruik van een 500 micron commerciële zijwaarts afvuren katheter die kan worden gekoppeld aan elke lichtbron compatibel met Fiber Optics. Deze zijwaarts gerichte optische katheters werden commercieel ontwikkeld voor laser ablatie loodrecht op de lange as van de vezel. Natuurlijk gebruiken we lichtkracht veel lager dan nodig is voor foto ablatie. Kleinere vezels zijn beschikbaar voor gebruik op kleinere preparaten, zoals de geperfundeerd muis Heart27. Dit glasvezel systeem voorzag in een adequate verlichting door de hart Muur in het golflengtebereik waar hartchroophores absorberen (450 – 630 nm). Met behulp van een pick-up Fiber Optic aan de buitenkant van het hart, de absorptie van myoglobine en mitochondriën cytochromen kan worden bewaakt met uitstekende temporale en spectrale resolutie (Zie Figuur 5). De zijwaarts gerichte glasvezel benadering heeft verschillende voordelen ten opzichte van de LED-katheter voor VWTO'S, waaronder een veel kleiner transversale Profiel van de katheter dat de impact van de katheter op het hart minimaliseert, flexibelere vermindering van de impact op de hartklep en ventrikel prestaties, geen elektrische verbindingen die kunnen kort in de Saline perfusate, en ten slotte een katheter die gebruikmaakt van een externe lichtbron die de flexibiliteit van de selectie van de lichtbron voor VWTOS verhoogt.
Vanwege de sterke absorptie van het hart onder 490 nm is het moeilijk om veel informatie te genereren over de Soret-band van de cytochromen in het gebied van 410 – 445 nm of NADH bij 340 nm. Zo is de brede extinctie van FAD bij 450 nm de laagste frequentie absorptie die wordt waargenomen, hoewel de gehele absorptie piek van deze chromophores niet wordt bemonsterd. Met behulp van VWTOS de signaal-ruis verhouding is zeer hoog als de hele muur wordt bemonsterd in tegenstelling tot oppervlaktereflectie spectroscopie, vaak gebruikt20, die alleen het oppervlak van het hart met talrijke verstrooiings problemen monsters. VWTOS sampling de hele hart Muur is meer analoog aan nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMRS) maatregelen van vele cardiale metabolieten zoals 31P gedetecteerd adenosinetrifosfaat en creatine fosfaat28, 13C gedetecteerd gelabelde metabolieten29,30 inclusief hypergepolariseerde etiketten31,32en 1H gedetecteerd metabolieten33. Omdat de VWTO'S kunnen worden uitgevoerd met behulp van niet-magnetische apparaten, is het volledig haalbaar dat NMR en VWTO'S gelijktijdig kunnen worden uitgevoerd. VWTOS is niet beperkt tot endogene chromoforen en kan worden gebruikt om de absorptie van optische voelers voor pH, CA2 +en plasma membraanpotentiaal te bewaken.
We gebruiken 2 Hz (d.w.z. 2 samples/sec) die een uitstekend single-spectrum signaal naar ruis bieden. Hoewel hogere bemonsteringsfrequenties kunnen worden bereikt die cardiale cyclus analyse toestaan, hebben eerdere studies aangetoond dat er geen beat is om variatie in de chromofoor-extinctie te verslaan, dus geen inspanning om selectief licht te verzamelen als een functie van cardiale cyclus was gemaakt34. Door de VWTOS-geometrie is de detectie van licht minder afhankelijk van weefsel beweging dan reflectie methoden, omdat de complexe oppervlakte verstrooiing gebeurtenissen worden geëlimineerd. We vinden dat ernstige beweging deze maatregelen kan verstoren, maar de real-time spectrale analyse onthult snel spectrale overgangen die inconsistent zijn met weefsel chromofoor-overgangen. Nogmaals, dit gebeurt alleen wanneer het hart op grove wijze beweegt van de verzamel vezel drastisch verminderen van de hoeveelheid opgevangen uitgezonden licht.
De vwtos-gegevens worden geanalyseerd met behulp van een volledige spectrale aanpassings routine op basis van een referentie bibliotheek van spectra van cardiale chromophores en het spectrum van de lichtbron zoals eerder beschreven20,22,27, 35 met een eenvoudige lineaire kleinste kwadraten benadering. Deze spectrale fitting procedure compenseerde het overlappende extinctie spectrum en vertrouwt niet op "isobestic" golflengten. Deze volledige spectrum analyse elimineert artefacten die zijn gekoppeld aan gemeenschappelijke dubbele straal (d.w.z. twee golflengte) analyse1,3,6 waarvan is aangetoond dat het problematisch is20. Het extra voordeel van een volledige spectrale analyse is het genereren van een goedheid van pasvorm uit de restanten, niet beschikbaar in Dual Beam-protocollen.
In deze studie richtten we ons op het effect van cyanide op de optische eigenschappen van het hart. Omdat cyanide cytochroom-oxidase blokkeert, remt het het zuurstofverbruik en resulteert het in wezen in een netto reductie van alle cytochromen als de elektronen terug in de cytochroom keten. Echter, het membraan potentieel blijft blijkbaar hoog, als de redox veranderingen in bL en bH zijn zeer klein in vergelijking met cytochroom c13. Met de stopzetting van het zuurstofverbruik moet de zuurstofspanning in het weefsel de perfusaat benaderen en we merkten een vroege toename van zuurstofgehalte in myoglobine met cyanide in overeenstemming met de notie dat de zoutoplossing geperfectioneerd hart, zelfs in retrograde perfusie modi, is niet volledig zuurstofverrijkende myoglobine in de cytosol19,20,21,36. Het vergelijken van het maximale effect van cyanide op zuurstofrijk myoglobine met het volledig deoxygenated spectrum verkregen met ischemie onthult een myoglobine oxygenatie van slechts ongeveer 88%, consistent met eerdere studies.
Het is belangrijk om in deze studie te noteren dat de cyanide-effecten op myoglobine oxygenatie en cytochroom reductie tijdelijk werden opgelost. Het is verrassend dat de effecten van cyanide voor het eerst werden waargenomen op coronaire stroming en myoglobine voordat grote veranderingen in het hart cytochromen redox toestand werd waargenomen. De vroege gemarkeerde toename van de stroom suggereert dat een effect op arteriële gladde spieren24,37 kan optreden voordat de bruto metabole effecten in de hart cellen worden waargenomen. De toename van de stroom, mogelijk met een bescheiden cyanide geïnduceerde afname van de ademhaling, resulteert waarschijnlijk in de onmiddellijke toename van zuurstofgehalte myoglobine veroorzaakt door de toename van de zuurstoftoevoer. Met de verspreiding van de cyanide-remming naar de myocyten wordt een verdere toename van de coronaire stroming waargenomen (Zie de regio gemarkeerd met 3 in Figuur 5a), waarschijnlijk gedreven door talrijke metabole factoren38. De grote vroege impact van cyanide op stroming suggereert dat het metabolisme van de vasculaire gladde spier krachtiger kan zijn bij het veranderen van de vasculaire Toon dan het metabolisme van de myocyten. Deze gegevens ondersteunen de gevestigde opvatting dat myoglobine een veel lagere affiniteit heeft voor zuurstof dan COX, zelfs in het intacte hart, omdat myoglobine oxygenatie zich goed voordeed voor veranderingen in mitochondriën redox toestand (Figuur 5). Dit hoge niveau van deoxygenated myoglobine onder controle omstandigheden is consistent met eerdere studies die suggereren dat het geïsoleerde fysiologische zoutgehalte gedeeltelijk hypoxische kan zijn, zelfs onder controle omstandigheden9,19, 20,21,27,36, onderstrepen het belang van het monitoren van cardiale weefsel oxygenatie bij het gebruik van dit belangrijke model in cardiale fysiologie.
We presenteren hier de experimentele Details voor het uitvoeren van transmissie Absorptie spectroscopie op de geïsoleerde geperfectiongebruikt hart. We hebben deze techniek met succes aangepast voor gebruik op de harten van het konijn naar de muis met behulp van een dunne zijwaarts afvuren intracardiale optische vezel. Gebruikmakend van State of the art volledige spectrale fitting routines, kan de complexe optische interactie van de cardiale chromophores gemakkelijk worden geëxtraheerd, waardoor een near real-time meting van kritische elementen van het myocardiale metabolisme gelijktijdig met conventionele functionele maatregelen.
Disclosures
Geen belangenconflicten gedeclareerd.
Acknowledgments
Dit werk werd volledig ondersteund door het NHLBI intramurale programma (project # ZIA HL00460131).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BIOPAC data acquisition system | BIOPAC | MP150 | Analog to digitial conversion |
| BIOPAC general purpose transducer amplifiers | BIOPAC | DA100C | Pressure monitoring |
| BIOPAC System skin temperature amplifier | BIOPAC | SKT100B | temperature monitoring |
| Compact Universal 1- and 2- Channel LED Controllers | Mightex | SLC-MA02-U | External light source power supply |
| Disposable pressure sensors | BIOPAC | RX104A | Pressure monitoring |
| Dual Syringe, Infusion Pump | KdScientific | KDS 200 / 200P LEGACY SYRINGE PUMP | drug injection |
| Flow-through probes | Transonic | 4PXN | perusate flow monitoring |
| Glass Syringe | FORTUNA Optima | 30 CC | Air tight fluid injection |
| High power fiber-coupled LED white light source | Mightex | Type-A FCS-0000 | External light source |
| Perfused heart system | Radnoti | 120101BEZ | This system was heavily modified to provide adequate flow (see manuscript) |
| Phase fluorimeter | Ocean Optics | NeoFox-GT | oxygen concentration |
| Pickup fiber optic | Thor labs | BF20HSMA01 | Fiber for collecting transmitted light (pick up fiber) |
| PowerLab unit | AD Instruments | PowerLab 8/35 | Analog to digitial conversion |
| Pressure transducers | BIOPAC | TSD104A | pressure monitoring |
| Programming environment | LABViEW | N/A | Software for driving spectrometer, digitiziing data and analysis. Code available on request |
| Rapid scanning spectrophotometer | Ocean Optics | QE65PRO | Rapid scanning spectrometer for spectral analysis |
| Side firing fiber optic | Polymicro Technologies Molex, LLC 18019 North 25th Av, Phoenic AZ 85023-1200 | JTFLH200230500/1.5M | side firing fiber optic 200 microns core |
| Sodium cyanide | Sigma-Aldrich | 380970 | Metabolic inhibitor |
| Temperature probe | BIOPAC | TSD102A | temperature monitoring |
| Tubing flow modules | Transonic | TS410 | perusate flow monitoring |
References
- Arai, A. E., Kasserra, C. E., Territo, P. R., Gandjbakhche, A. H., Balaban, R. S. Myocardial oxygenation in vivo: optical spectroscopy of cytoplasmic myoglobin and mitochondrial cytochromes. American Journal of Physiology. 277, 2 Pt 2 683-697 (1999).
- Epstein, F. H., Balaban, R. S., Ross, B. D. Redox state of cytochrome aa3 in isolated perfused rat kidney. American Journal of Physiology. 243 (4), 356-363 (1982).
- Hassinen, I. E., Hiltunen, J. K., Takala, T. E. S. Reflectance spectrophotometric monitoring of the isolated perfused heart as a method of measuring the oxidation-reduction state of cytochromes and oxygenation of myoglobin. Cardiovascular Research. 15, 86-91 (1981).
- Makino, N., Kanaide, H., Yoshimura, R., Nakamura, M. Myoglobin oxygenation remains constant during the cardiac cycle. American Journal of Physiology. 245 (14), 237-243 (1983).
- Takahashi, E., Doi, K. Visualization of oxygen level inside a single cardiac myocyte. American Journal of Physiology. 268, 6 Pt 2 2561-2568 (1995).
- Heineman, F. W., Kupriyanov, V. V., Marshall, R., Fralix, T. A., Balaban, R. S. Myocardial oxygenation in the isolated working rabbit heart as a function of work. American Journal of Physiology. 262, 255-267 (1992).
- Arakaki, L. S., Burns, D. H., Kushmerick, M. J. Accurate myoglobin oxygen saturation by optical spectroscopy measured in blood-perfused rat muscle. Applied Spectroscopy. 61 (9), 978-985 (2007).
- Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. Metabolic network control of oxidative phosphorylation: multiple roles of inorganic phosphate. Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 39155-39165 (2003).
- Tamura, M., Oshino, N., Chance, B., Silver, I. A. Optical measurements of intracellular oxygen concentrations of rat heart in vitro. Archives of Biochemistry and Biophysics. 191, 18-22 (1978).
- Wright, T. J., Davis, R. W. Myoglobin oxygen affinity in aquatic and terrestrial birds and mammals. The Journal of Experimental Biology. 218, Pt 14 2180-2189 (2015).
- Wright, T. J., Davis, R. W. Myoglobin extraction from mammalian skeletal muscle and oxygen affinity determination under physiological conditions. Protein Expression and Purification. 107, 50-55 (2015).
- Shibata, T., et al. Relationship between oxygen affinity and autoxidation of myoglobin. Inorganic Chemistry. 51 (21), 11955-11960 (2012).
- Kim, N., Ripple, M. O., Springett, R. Measurement of the mitochondrial membrane potential and pH gradient from the redox poise of the hemes of the bc1 complex. Biophysical Journal. 102 (5), 1194-1203 (2012).
- Oshino, N., Jamieson, D., Sugano, T., Chance, B. Mitochondrial function under hypoxic conditions: The steady states of cytochrome a,a3 and their relation to mitochondrial energy states. Biochimica et Biophysica Acta. 368, 298-310 (1974).
- Glancy, B., Willis, W. T., Chess, D. J., Balaban, R. S. Effect of calcium on the oxidative phosphorylation cascade in skeletal muscle mitochondria. Biochemistry. 52 (16), 2793-2809 (2013).
- Figulla, H. R., Hoffmann, J., Lubbers, D. W. Evaluation of reflection spectra of the isolated heart by multicomponent spectra analysis in comparison to other evaluating methods. Advances in Experimental Medicine and Biology. 169, 821-830 (1984).
- Hoffmann, J., Lubbers, D. W., Heise, H. M. Applicability of the Kubelka-Munk theory for the evaluation of reflectance spectra demonstrated for haemoglobin-free perfused heart tissue. Physics in Medicine and Biology. 43 (12), 3571-3587 (1998).
- Fabel, H., Lubbers, D. W. Measurements of Reflection Spectra of Beating Rabbit Heart in Situ. Biochemische Zeitschrift. 341 (4), 351 (1965).
- Schenkman, K. A., Beard, D. A., Ciesielski, W. A., Feigl, E. O. Comparison of buffer and red blood cell perfusion of guinea pig heart oxygenation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), 1819-1825 (2003).
- Femnou, A. N., et al. Intracardiac light catheter for rapid scanning transmural absorbance spectroscopy of perfused myocardium: measurement of myoglobin oxygenation and mitochondria redox state. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 313 (6), 1199-1208 (2017).
- Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 704-715 (2018).
- Chess, D. J., et al. Optical spectroscopy in turbid media using an integrating sphere: mitochondrial chromophore analysis during metabolic transitions. Analytical Biochemistry. 439 (2), 161-172 (2013).
- Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. Multiparametric optical mapping of the Langendorff-perfused rabbit heart. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Coburn, R. F., Grubb, B., Aronson, R. D. Effect of cyanide on oxygen tension-dependent mechanical tension in rabbit aorta. Circulation Research. 44 (3), 368-378 (1979).
- Schenkman, K. A., Marble, D. R., Burns, D. H., Feigl, E. O. Myoglobin oxygen dissociation by multiwavelength spectroscopy. Journal of Applied Physiology. 82 (1), 86-92 (1997).
- Femnou, A. N., et al. Intracardiac light catheter for rapid scanning transmural absorbance spectroscopy of perfused myocardium: measurement of myoglobin oxygenation and mitochondria redox state. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 313 (6), 1199-1208 (2017).
- Giles, A. V., et al. Paradoxical Arteriole Constriction Compromises Cytosolic and Mitochondrial Oxygen Delivery in the Isolated Saline-Perfused Heart. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory. , (2018).
- Matthews, P. M., et al. A 31P-NMR study of some metabolic and functional effects of the inotropic agents epinephrine and ouabain, and the ionophore R02- 2985 (X537A) in the isolated, perfused rat heart. Biochimica et Biophysica Acta. 720, 163-171 (1982).
- Lewandowski, E. D., Damico, L. A., White, L. T., Yu, X. Cardiac responses to induced lactate oxidation: NMR analysis of metabolic equilibria. American Journal of Physiology. 269, 1 Pt 2 160-168 (1995).
- Lewandowski, E. D., et al. Multiplet structure of 13C NMR signal from glutamate and direct detection of tricarboxylic acid (TCA) cycle intermediates. Magnetic Resonance in Medicine. 35 (2), 149-154 (1996).
- Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: a metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magnetic Resonance in Medicine. 71 (5), 1663-1669 (2014).
- Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-(13)C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
- Pisarenko, O. I., Khlopkov, V. N., Ruuge, E. K. A 1H NMR study of succinate synthesis from exogenous precursors in oxygen-deprived rat heart mitochondria. Biochemistry International. 12 (1), 145-153 (1986).
- Kuzmiak-Glancy, S., et al. Cardiac performance is limited by oxygen delivery to the mitochondria in the crystalloid-perfused working heart. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 314 (4), 704-715 (2018).
- Schenkman, K. A., Marble, D. R., Burns, D. H., Feigl, E. O. Myoglobin oxygen dissociation by multiwavelength spectroscopy. American Journal of Physiology. 82 (1), 86-92 (1997).
- Beard, D. A., Schenkman, K. A., Feigl, E. O. Myocardial oxygenation in isolated hearts predicted by an anatomically realistic microvascular transport model. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 285 (5), 1826-1836 (2003).
- Paul, R. J. Section II: The Cardiovascular System, Vol II, Vascular Smooth Muscle. Handbook of Physiology. Bohr, D. E., Somlyo, A. P., Sparks, H. V. , American Physiological Society. 201-252 (1980).
- Feigl, E. O. Coronary physiology. Physiological Reviews. 63, 1-205 (1983).
