浸透哺乳動物の心臓のトランスムラル吸光分光法を用いた細胞代謝モニタリングのための心臓内側発射光カテーテル

Summary

ここでは、心壁全体で吸光度分光法を行うために、心内光カテーテルを通して心臓に注入された心臓に使用する方法を紹介する。得られたデータは、組織の酸素張力に関する堅牢な情報だけでなく、基板利用と膜電位に関する堅牢な情報を、このユビキタスな調製における心臓性能測定と同時に提供します。

Abstract

心筋の吸光度分光法は、ミオグロビンおよびシトクロム吸光度を介したサイトソリックおよびミトコンドリア酸素化の非破壊的評価をそれぞれ提供する。さらに、膜電位や基板入りなどのミトコンドリア代謝状態の多くの側面も推定できる。心臓壁透過光分光法を行うために、市販のサイド焼成光ファイバカテーテルを光源として隔離されたパーフューズ心臓の左心室に配置する。心臓壁を通過する光は、外部光ファイバで収集され、心臓の光分光をほぼリアルタイムで行います。伝送アプローチは、広く使用されている反射アプローチで発生する多数の表面散乱干渉を回避します。トランスムラール吸光スペクトルの変化は、染色体参照スペクトルのライブラリーを使用してデコンボルブされ、すべての既知の心臓染色体の定量的測定を同時に提供した。このスペクトルデコンボリューションアプローチは、重なり合う吸光度スペクトルに適用される一般的な二重波長法を使用して生じる可能性のある固有の誤差を排除し、適合性の定量的評価を提供しました。カスタムプログラムは、データの取得と分析のために設計され、研究者は実験中に準備の代謝状態を監視することを可能にしました。標準的な心臓灌流システムへのこれらの比較的簡単な付加は収縮、灌流および基板/酸素抽出の慣習的な手段に加えて心臓壁の代謝状態に独特な洞察を提供する。

Introduction

無傷の臓器生化学を監視するための光学吸光度分光法は、その本質的な、非破壊的な性質1、2、3、4、5に起因する広く使用されているアプローチです。 ^6,7,8,9.ミオグロビン吸光度は、平均細胞体酸素張力10、11、12の尺度を提供する。ミトコンドリアシトクロムは、フラビンのレベルでの基質入力、シトクロムb L:b_H¹³からの膜電位、およびシトクロムオキシダーゼ(COX)からの細胞内のミトコンドリアへの酸素送達に関する情報を提供します。)レドックス^状態14.Glancyらは、各複合体の活性がミトコンドリア膜電位および代謝^速度15を測定することによって決定できることを実証した。したがって、光学分光法を用いれば、外因性プローブや現在の研究システムの大きな変更を必要とせずに豊富な情報を得ることができます。本論文の目的は、暗い環境で研究を行っている唯一の大きな改変を伴う、従来の通合心臓製剤における透過光スペクトルを収集するための堅牢な方法を提示することです。

反射率吸収吸収分析は、浸透した心臓3、6、16、17、18、19の光学分光法の実行にも成功している。生体内1の心として.反射率分光法は、心臓表面に光を当て、心臓に散乱した光を集めるとともに、拡散光と鏡面反射光から構成されています。したがって、このアプローチで収集された光は、目的とする組織発光吸収と同様に、複数の散乱機構の複合体である。心臓の運動と複雑な表面のために、心臓の表面からの光反射は特に問題であり、浸透の深さと純粋に反射された光の量を変更します。

上に提示した反射吸収分光法の限界は、左心室腔に光学カテーテルを導入することによって解決され、左心室自由^壁20を横切る透過光の収集を可能にした。この種の研究に対する透過分光法の利点は、田村らによる初期侵襲的研究で高く評価された⁹現在の実装は、無傷の心臓の非常に堅牢な透過吸収分光分析を提供する様々な条件下でサイトソリック酸素化およびミトコンドリア酸化物状態に関^して21.これらの初期研究では、先端向きの電源LEDを備えた特別に製造されたカテーテルを使用して、心筋を通して白色光のサイドファイアパターンを生成しました。しかし、比較的大きなLED先端カテーテルは、中型の心臓(ウサギ、モルモットなど)での使用と必要なカスタム製作にのみ適しています。本研究では、市販の200ミクロンコア側焼成光ファイバを導線として用いた方法を紹介する。先端の有線LEDの代わりに、500マイクロの先端が付いているカテーテルはシステムの多様性を高める外的な源からのライトをリダイレクトする。このアプローチにより、ラマン散乱分光法などの用途にレーザーを含むさまざまな外部光源を使用できます。このデータを定量化するために、心臓染色体の分光量決定の精度を向上させるために公知の基準スペクトルを用いてオンライン全成分スペクトル分析が、前述^の20,22として提示される。この分析のソース コードは、作成者が要求に応じて提供します。このアプローチを用いて、心臓生化学およびミトコンドリア機能に関する情報は、心臓の調製にほとんどまたは全く影響を与えない従来の心臓機能パラメータと同時に得ることができる。心臓はミトコンドリア機能と酸素送達に重大に依存するため、古典的な注入心臓システムへのこの技術的な追加は、心臓性能のこの重要なモデルの解釈と有用性を大幅に改善します。

Protocol

すべての動物プロトコルは、国立心臓、肺、血液研究所動物ケアおよび使用委員会によって承認され、動物のケアと福祉法(7 USC 2142 § 13)に記載されているガイドラインに従って行われました。

1. 孤立したパーフューズド心臓系とパーフューサート

注: この準備は、以前の出版物²³と非常によく似ています。

1. (mmol/Lで)137.0 NaCl、5.4 KCl、1.8 CaCl 2、0.5 MgCl_2、1.0Na₂HPO 4、10.0、1.0乳酸塩、および10.0 HEPESで構成される改変クレブスヘンセレトの含有剤の4リットルを作る。
2. pHはNaOHおよびHClと37°Cで7.4に噴酸をする。
3. 1 μmの細孔膜を通して噴酸を濾過する。
4. システムを通して精製された水を流すことによって、浸透した心臓システムのすべての管および部屋をすすいでください。
5. 熱い循環水浴を使用して37°Cの温度を維持しながら、バブラーで100%O2で水槽に噴度を移し、酸素化します。
6. 12 μmの細孔膜フィルターの2を追加し、ランゲンドルフモードで再循環しながら、ファンフサートでシステムをプライム。
7. 大動脈カニューレのすぐ上のチューブクランプをチューブに取り付け、大動脈流が約10mL/分に落ちるようにネジを調整します。

2. ウサギの心臓切除と灌流

1. 心臓切除
   1. ケタミン/アセプロマジン混合物の1.5 mL内筋肉注射を介して男性ニュージーランド白ウサギ(約3キロ)を麻酔する(10:1)。
   2. 約10~15分後、完全な麻酔効果を求めて吸入して3%イソファランを投与する。
   3. つま先のつまみによって麻酔の適切な深さを確認し、その後の薬物の投与のための限界耳静脈にラインを置きます。
   4. ヘパリンの1,500単位(または1,000単位/mLの1.5 mL)を注入し、3分間循環させます。
   5. 麻酔の適切な深さを二重にチェックし、KClの6 mEq(または2 mEq/mLの3 mL)で安楽死させる。
   6. 急速に胸を開き、心臓の頂点と大通りを見つけます。心臓からできるだけ遠くに大動脈を切断し、肺静脈をできるだけ肺に近づけることによって心臓を取り除く。
      注:この初期段階での肺の除去は、以前の^出版物23とは異なるが、調製に影響を与えていない。
   7. 心臓を、手術から灌流への輸送のために氷のバケツに座って、噴酸(ステップ1.3と同じ)の小さなビーカーに心臓を置きます。
2. 心臓のカニテーション
   1. 大動脈をしっかりと結び付け、大動脈に気泡を含めないようにします。
   2. 大動脈の管クランプを取り外すことによって70 mmHgの灌流圧力で流れを開始し、外科および容器のカンニングの残りの間にこの圧力を維持する。
   3. 大動脈と他の血管から肺動脈を分離し、静脈腔と肺静脈をリゲートします。脂肪と結合組織はまだ存在を削除します。.
   4. 冠状動脈の流量と酸素張力の尺度を提供するために肺動脈をカニューレする。
   5. 血液および外科的破片を除去する準備中に心臓からの最初の流出(約10分間)を捨てる。この期間の後、噴流を再循環させる。

3. サイドファイアファイバー光学の配置

1. 光ファイバカテーテルを高出力光ファイバ結合LEDホワイト光源に接続し、視覚化に役立て、心臓に一度分光用の光を提供します。
2. 左心房の小さな付属品を切断し、僧帽弁を介して左心室にカテーテルを挿入し、それを回転させて、照らされた左心室自由壁を達成する。
3. ピックアップ光ファイバーを、心臓から約1cmで左心室の最大照明の領域の真向かいに配置します。
4. ピックアップファイバのもう一方の端を高速走査器に接続します。

4. 光学分光法

1. 完全な暗闇を得るために実験領域のライトをオフにします。
2. カスタムプログラムを起動し、分光計ドライバを組み込んで、透過光のデータ取得とリアルタイム分析を実行します。
   注: スペクトル取得および分析プログラムの統合バージョンの実行可能版は、補足コーディング ファイルとして提供されます。ソース コードは、作成者の要求に応じて利用できます。
3. すべてのプロンプトをナビゲートし、心臓分光法取得モードのオプションを選択します。次のページで、補助データ収集が行われているかどうかを示します。最後に、保存する染色体参照スペクトルとデータの両方の位置を含む取得パラメータを入力します。
4. 490 ~ 630 nm の帯域幅を入力します。
5. 2 Hz(すなわち2サンプル/秒)のサンプリングレートを入力します。
6. 光源をオフにして、暗電流、またはゼロライトのスペクトルを収集し、バックグラウンド信号レベルを補正します。
7. フィッティングルーチンで使用する必要がある染色体参照をクリックして選択します。
8. [データの取得] ページで、カテーテルとピックアップ ファイバの両方の位置を調整して、酸素化されたミオグロビンである 500 nm 領域の信号振幅に特に注意を払って、ソフトウェアに表示される透過光を最大化します。吸光度を観察する必要があります。
9. 送信された光が 600 nm 領域の検出器を飽和させていないことを確認します。
10. カテーテル照明をオフにし、光が検出されないことを確認して、収集されたスペクトルに寄与する外部光源がないことを確認します。
11. [スペクトルを保存] ボタンをクリックしてデータ収集を開始します。
12. [コントロールとして設定]をクリックすると、将来のスペクトルから現在の「コントロール」スペクトルまでの差吸収スペクトルが表示されます。
13. 任意の生理学的摂動を必要に応じて行う。
    1. プロトコル1:シアン化物が心臓性能と染色体吸収に及ぼす影響
       1. 心臓灌流から流体を再循環停止します。
       2. 注射器ポンプを使用して、大動脈カニューレの直前に異なる速度でシアン化物(pH 7で2.5〜75mM)を注入し、心臓に流れる噴射中のシアン化物の所望の濃度(0.025~1mM、大動脈流量から計算)を達成する。心臓機能および光学特性を監視する。
       3. 心壁を通る光透過と共に冠状動脈流と心拍数への影響が安定した状態にある場合は、シアン化物シリンジポンプを停止します。
    2. プロトコル2:虚血/低酸素症
       1. シアン化物の注入を停止します。
       2. 5分後、バブリングガスを100%酸素から100%窒素に切り替えて、システムから酸素を除去します。
       3. 約 10 分後、流れを停止して、虚血性/低酸素状態をシミュレートします。

5. スペクトルデータ分析

1. 透過的な心臓分析モードでプログラムを実行します。
2. 適切な分光計を選択します。
3. データファイルパスとリファレンススペクトルファイルを入力し、カテーテル光源の事前保存されたスペクトルをロードするカテーテル光源を選択します。
4. [ビンデータの読み取り]を選択します。
5. [最小値と最大波長を設定] を選択します。
6. データ分析の帯域幅を 490 ~ 630 nm と入力します。
7. [メイン メニューに戻る] を選択します。
8. 参照を読み取るを選択します。
9. 解析で使用する参照スペクトルを確認します。
10. [メイン メニューに戻る] を選択します。
11. メインメニューでタイムポイントを選択します。
12. コントロールとして T0 タイム ポイントを選択し、範囲を 100 ポイントに設定します。
13. 100点の範囲で実験期間としてT1時間を選択します。
14. [平均的な腹筋スペクトル] タブで生の差スペクトルを観察します。
15. [適合係数の計算]を選択し、[適合係数]タブをクリックして、参照スペクトル適合の時間経過を確認します。
16. メインメニューに戻り、[差異の腹筋を計算]を選択します。
17. すべての位置で T0 と ΔT1 を選択します。[差分スペクトル]ウィンドウと[参照ウェイト]ウィンドウのフィッティング要素で、適合スペクトルを観察します。
18. この手順を繰り返して、実験の他の時間ポイントを比較します。
19. メインメニューに戻ります。
20. 目的の名前を入力し、[データの保存]を選択して、他のプログラムとのさらなる分析を行うことで、データと分析をスプレッドシート レポートに保存します。
    注: 名前が入力されていない場合、レポートは入力ファイルと同じ名前で保存されます。レポートは、元の入力ファイルと同じフォルダにあるExcel 分析ファイルという名前のフォルダに保存されます。

Representative Results

使用されるシステムは、市販の小動物灌流心臓システムであるが、ウサギの心臓との使用のために大幅に変更された。変更は、主にウサギの心臓への十分な流れ送達を保証するために、すべてのチューブのボアサイズを増加させました。使用される灌流圧で、ネイティブ灌流システムの流量が少なくとも5倍の心臓を付着した流れを超えたように細心の注意が払われました。2〜12 μmの細孔膜フィルターは、心臓から任意の破片を除去するために、流体ポンプと大動脈プリロードバブルトラップチャンバの間に平行に配置されました。

ウサギの心臓から透過光
図1は、カテーテルのスペクトル(図1A)とウサギの心臓自由壁からの透過光の生スペクトルを提示する(図1B)。これらのデータは、スペクトルの青色領域における光の非常に大きな減衰を明らかにするが、ミオグロビンとミトコンドリアシトクロムからの吸光のバンドは、挿入物中の490と580 nmの間で直接観察することができる。これらの研究では、代謝的に応答性の心臓染色体に関する情報を得るために、490から630 nmの領域で十分な透過光が検出されることを保証することが重要です。外部および内部繊維の位置は、光強度を最大化するためにデータを保存する前に調整されますが、625 nm領域の検出器は飽和しません。

参照減少マイナス酸化スペクトルの心臓の参照染色体。
図2は、これらの研究で収集された差スペクトルに適合するために使用される基準スペクトルを提示する。これらの参照には、ミオグロビン、シトクロムaa₃₍代わりにシトクロムa₆₀₅およびシトクロムa_607、摂動22のタイプに応じて)、シトクロムa_580、シトクロムb_L、シトクロムb Hが含まれる。,シトクロムc,シトクロムc1,FAD,入射光の吸光度表現(I₀を示す)、すなわち、吸収されずに組織を通過した光子)とライン(可変で)図 2に示す図に示されていない、散乱を考慮して傾斜と切片を行います。いくつかのスペクトルは、純粋な基準材料の濃度が非常に低かったように、騒々しいです^22.

全実験中の基準スペクトル適合の時間経過
図3は、プロトコルのステップ5.15で計算された典型的な実験の時間経過を表す。これは、コントロールフェーズ、続いてシアン化物注入段階、続いてシアン化物洗浄、脱酸素段階、および最後に虚血から構成される。個々の染色体(ミオグロビン、シトクロムaa3、およびシトクロムc)の時間の経過とともに、冠状動脈流量と共に時間の経過とともにプロットされます。各染色体の光学密度変化は、線形最小二乗ルーチンおよび染色体の代表的なピーク(または前記染色体の最大吸光度)から得られた適合係数を乗算することによって推定される。例えば、ミオグロビン参照の適合係数に580nmのミオグロビン参照スペクトルの値を乗算します。シアン化物の添加に対するミオグロビンの急速な酸素化は、流れの増加と一致するが、シトクロムの有意な減少の前にある。この効果は、シアン化物の洗浄で部分的に回復されます。最後に、シトクロムの完全な減少とミオグロビンの脱酸素が虚血で得られる。これらのデータは、心臓の代謝状態に関する動的データが、この方法論で容易に得ることができることを示している。差分スペクトルに使用されるスペクトルの位置は、この時間コースでマークされています: Cベースライン, CNシアン化物注射, CNWシアン化物ウォッシュアウト, H N₂低酸素症 (酸素の代わりに噴泡化している窒素), HI No流虚血症 (いいえ心臓を流れるパーフューサート)。

ウサギの心臓からのシアン化物治療の対照と適合の差スペクトル
差スペクトルを得るために、2つの絶対スペクトルを減算する。各絶対スペクトルは、信号対雑音比を最適化するために、多くの(通常は100)スペクトルの平均を取ることによって得られます。図 4Aは、治療された心臓の対照(C)とシアン化物(CN)の差スペクトルを表す。図2で概説した基準スペクトルを用いて、適合スペクトルが計算される。残留スペクトルは、生データからの適合値の減算です。同じスキームは、後続のすべてのスペクトル・プレゼンテーションに使用されます。図 4Bは、図4Aに適合するために使用される基準スペクトル(図2に示す)のスペクトル振幅を示す。シトクロム鎖下の電子の流れが定常状態のシアン化物によって遮断されたため、ほとんどのシトクロムの吸光度の強い増加が観察される。さらに、シアン化物によって酸素の消費が排除されるにつれて、酸素化ミオグロビンの吸光度が増加した。図 4CはCNWおよびCNからの差スペクトルと適合の差を提示し、シアン化物効果の部分的反転を明らかにする。これは、プロトコルステップ5.18でタイムポイントを選択し、T0をCNWおよびT1をタイムコースのCN領域に移動することによって達成されました。図 4Dは、シトゾールとミトコンドリアの完全脱酸素および還元状態と制御状態を表すHIおよびCの差スペクトルを提示する。繰り返しますが、これはプロトコルステップ5.18で行われ、T0をCとT1をHIに移動しました。

冠動脈流と染色体に対するシアン化物効果の初期時間経過
図 5Aは、組織に対するシアン化物効果の開始の例を示す。ミオグロビン、シトクロムa₆₀₅およびシトクロムcの適合性は、冠状動脈流と共に単一の心臓のために提示される。これらの時間コースは、シアン化物実験のためのプロトコルステップ5.15で作成されました。個人差とベースライン (位置 1) を図 5Bに示します。スペクトルは、タイムコースの対応する位置番号(1-4)から生成された。これはプロトコルステップ5.18で行われ、T0は常に位置1にあり、その後、T1を位置2、3、4に移動することによって異なるスペクトル(2-4)が作成されました。やや驚いたのは、シトクロム酸化還元状態の有意な変化の前に流れとミオグロビン酸素化が増加したという観察であった。流れおよび発色体吸光度の変化の開始は、ベースラインからの初期変化率の線形外挿によって推定された。このアプローチを用いて、冠動脈流の変化を時間ゼロとして設定すると、ミオグロビン酸素化の増加は流れの変化後に1.71分±0.39分を開始し、シトクロムa605とシトクロムc吸光度はほぼ同じであったが、4.24分±でははるかに遅かった。0.76分、4.34分±0.77分(n= 8)。これらのデータは、シアン化物が心筋代謝状態の大きな変化が起こる前に血管^緊張24を緩和することを示唆している。この効果は、心臓筋細胞の周りの有効な用量に達する前に血管平滑筋に遭遇シアン化物によって引き起こされる可能性が高い.

コントロール心臓におけるミオグロビン酸素化の推定値
シアン化物データを完全に脱酸素ミオグロビンの総ミオグロビン酸素化と虚血データの推定値として使用し、ミオグロビンは88.2%±1.0%(n=10)のみであり、以前の^研究20と一致したと推定する。^,21歳,25.

図 1:サイド焼成光学カテーテルのスペクトル。(A)これは、カテーテルから約1cmのピックアップ繊維で検出されたカテーテルを通して遠隔光源から放射された光のスペクトルである。このジオメトリでは、心臓が存在せず、検出器が飽和しないように光源の強度が調整されます。(B)左心室に側面焼成カテーテルを挿入し、心臓からの透過光を集め、示す。インサートは、400~580 nm領域が拡大され、この領域からの光の複雑な透過を明らかにする。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2:スペクトルフィッティングに使用される心臓染色体の参照スペクトル。スペクトルは、様々な^方法22を介して収集され、還元された - 酸化(シトクロム用)および脱酸素 – 酸素化 (ミオグロビン用).I₀の場合、図 1Aのスペクトルは、単に吸光度項に変換して参照を作成します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 3: 時間の経過に合ったフローと光学の変化。各染色体の光学密度変化(ΔOD)は、単にその最大吸光度で適合した個々の染色体のスペクトルです。最大吸光度周波数は、前述の20,26であった。提示された時間コースは、ベースラインを示す1つの実験のために、続いてシアン化物注入(最大パーフューサートフローで0.10 mM)、シアン化物洗浄、窒素低酸素、窒素を窒素に置き換えることによって行われ、その後、虚血を完了する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 4:様々な条件の適合差スペクトル。(A)シアン化物注入のスペクトルからベースラインを差し引いたスペクトル。最小正方形ルーチンから得られた適合スペクトルもプロットされます。残留スペクトルは、生スペクトルとフィットスペクトルの差です。(B) 図4Aに示す適合体の作成に使用される基準スペクトル。プログラムは、図 2 の参照を、現在の差スペクトルにおける相対的な寄与度にスケーリングします。(C)Aと同じであるが、洗い流しとシアン化物注射の差スペクトルを示す。(D)Aと同じであるが、虚血とベースラインの差スペクトルを示す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 5: 選択したシトクロム、ミオグロビンおよび心臓の流れに対するシアン化物注入効果の高い時間分解能。(A)心流の時間経過、デオキシミオグロビン、減少シトクロムa_605、および減少シトクロムc.数値は、図5Bのベースラインに対して採取されたスペクトルの位置を指す。(B) 図5Aに標識された4つの位置とコントロール(位置1)の差分スペクトル。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

孤立した逆行性または働くパーフューズ心臓製剤は、心臓生理学の研究だけでなく、心臓の技術や薬物の前臨床研究の主力です。その使用の鍵は、準備の容易さ、堅牢な機能特性と実験パラメータの制御だけでなく、心臓の多くの機能パラメータを測定する能力でした。光学吸光度分光法は、組織の酸素化だけでなく、ミトコンドリア代謝活性に関する洞察を提供します。光学分光法は、主に運動や光散乱合併症のために解釈が困難な反射モードで単離された透過心臓研究で行われてきた。

心室壁透過光分光法(VWTOS)を導入し、心臓組織代謝染色体をモニタリングする堅牢な方法を提供しています。前回の出版物では、同軸^{ケーブル20}の先端にハードワイヤードされたLEDが、VWTOSの浸透心臓に使用できるユニークな心内側面発射光源を作ることを実証しました。側面発射はカテーテルの長い軸に対して垂直な光の投影を指し、心室の自由な壁を照らすのに理想的である。LEDカテーテルは心臓機能に影響を与えないほど小さいが、実験室で専門的な製造を必要とした。現在の研究では、光ファイバと互換性のある任意の光源に結合することができる500ミクロンの商用サイド焼成カテーテルの使用を提示する。これらのサイド焼成光学カテーテルは、繊維の長軸に垂直なレーザーアブレーションのために市販された。当然のことながら、私たちは光アブレーションに必要なよりもはるかに低い光電力を使用しています。より小さい繊維は、浸透マウス^ハート27のようなより小さい製剤で使用するために利用できる。この光ファイバーシステムは、心臓染色体が吸収する波長範囲(450-630 nm)の心臓壁を通して十分な照明を提供しました。心臓の外側にピックアップ光ファイバーを使用して、ミオグロビンおよびミトコンドリアシトクロムの吸光度を優れた時間分解能およびスペクトル分解能で監視することができる(図5参照)。サイドファクションファイバーのアプローチは、心臓へのカテーテルの影響を最小限に抑えるカテーテルの断面プロファイルを大幅に小さくし、心臓弁に対するより柔軟な低減インパクトを含むVWTOSのLEDカテーテルに対するいくつかの利点を有し、心室の性能、生理食べ物の噴水でショートアウトできる電気的な接続、そして最後にVWTOSのための光源選択の柔軟性を高める外部光源を使用するカテーテル。

490 nm以下の心臓の強い吸光度のために、340 nmの410-445 nmまたはNADHの領域のシトクロムのソレットバンドに関する多くの情報を生成することは困難である。したがって、450nmでのFADの広い吸光度は観察される最も低い周波数吸光度であるが、この染色体の全吸収ピークはサンプリングされない。VWTOSを使用すると、壁全体が表面反射分光法とは対照的にサンプリングされ、一般的に使用^される20は、多数の散乱問題を伴う心臓の表面のみをサンプリングするため、信号対雑音比は非常に高い。心臓壁全体をサンプリングするVWTOSは、31P検出されたアデノシン三リン酸およびクレアチンリン酸塩28、13C検出されたなど、多くの心臓代謝産物の核磁気共鳴分光法(NMRS)対策に類似している標識された代謝産物29、30は、過偏光標識31、32、および1H検出された代謝^産物33を含む。VWTOSは非磁性デバイスを用いて行うことができるため、NMRとVWTOSを同時に行うことができるのは完全に実現可能です。VWTOSは内因性染色体に限らず、pH、Ca2+、およびプラズマ膜電位の光学プローブからの吸収を監視するために使用することができます。

ノイズに優れた単一スペクトル信号を提供する2Hz(すなわち2サンプル/秒)を使用しています。より高いサンプリング率は心周期分析を可能にするが、以前の研究では、発色体吸光度の変動を打ち負かすビートがないことを実証しているので、心周期の関数として光を選択的に収集する努力はなかった。作られた³⁴.VWTOSジオメトリにより、複雑な表面散乱イベントが除去されるので、光の検出は反射方法よりも組織の動きに依存しにくくなります。我々は、重度の運動がこれらの測定を妨害する可能性があることを発見したが、リアルタイムスペクトル分析はすぐに組織染色体遷移と矛盾するスペクトル遷移を明らかにする。繰り返しますが、これは、心臓が収集繊維から大きく離れて移動し、収集された透過光の量を劇的に減少した場合にのみ発生します。

VWTOSデータは、前述の20、22、27、^{および前述の光源のスペクトルのスペクトルの参照ライブラリに基づいて、完全なスペクトルフィッティングルーチンを使用して分析されます。}単純な線形最小二乗アプローチを持つ35。このスペクトルフィッティング手順は、重なり合う吸光度スペクトルを補正し、波長の「アイソベスティック」に依存しません。このフルスペクトル解析は、一般的な二重ビーム(すなわち2つの波長)解析1、3、6に関連するアーティファクトを排除^し、問題のある20であることが示されている。完全スペクトル解析の付加的な利点は、デュアルビームプロトコルでは利用できない残留物からの適合性の生成です。

本研究では、シアン化物が心臓の光学特性に及ぼす影響に焦点を当てた。シアン化物がシトクロムオキシダーゼをブロックすると、酸素消費を阻害し、本質的にシトクロム鎖に電子がバックアップするにつれて、すべてのシトクロムの純減少をもたらします。しかし、bLおよびbHの酸化還元変化はシトクロムc13と比較して非常に小さいため、膜電位は明らかに高いままである。 酸素消費の停止に伴い、組織内の酸素張力は、噴霧に近づくべきであり、我々は、生理食べ物が逆行灌流においても心臓を浸透させるという概念と一致するシアン化物と酸素化ミオグロビンの早期増加を指摘した。モードは、サイトゾル19、20、21、36中のミオグロビンを完全に酸素化していない。酸素化ミオグロビンに対するシアン化物の最大効果と虚血で得られた完全に脱酸素スペクトルを比較すると、ミオグロビンの酸素化はわずか88%であり、これまでの研究と一致している。

ミオグロビン酸素化およびシトクロム減少に対するシアン化物の影響が一時的に解決されたことに注意することが重要です。心臓のシトクロムの酸化物状態の大きな変化が観察される前に、シアン化物の効果が冠状動脈流とミオグロビンに最初に観察されたことは驚くべきことである。血流の早期顕著な増加は、心臓細胞の総代謝効果が観察される前に動脈平滑筋24、37に及ぼす影響が起こりかねであることを示唆している。流れの増加は、呼吸の適度なシアン化物誘発の減少を伴う可能性があり、酸素送達の増加によって引き起こされる酸素化ミオグロビンの即時増加をもたらす可能性が高い。シアン化物阻害が筋細胞に広がると、冠動脈流のさらなる増加が観察される(図5aで3をマークした領域を参照)、多数の代謝因子38によって駆動される可能性が高い。血流にシアン化物の大きな初期の影響は、血管平滑筋の代謝が筋細胞の代謝よりも血管の緊張を変化させる上でより強力である可能性があることを示唆している。これらのデータは、ミトコンドリアレドックス状態の変化の前にミオグロビン酸素化が起こったので、MIoglobinはCOXよりも酸素に対する親和性がはるかに低いという確立された概念を支持する(図5)。制御条件下での脱酸素ミオグロビンのこの高レベルは、単離された生理生理生が浸透した心臓が制御条件9、19^{の下でも部分的に低酸素である可能性があることを示唆する以前の研究と一致している。20,21,27},^36,心臓生理学でこの重要なモデルを使用する場合の心臓組織の酸素化を監視することの重要性を強調する.

ここでは、単離されたパーフューズド心臓に対して透過吸収分光法を行うための実験の詳細を示す。この技術は、心臓内光ファイバを薄く焼成することにより、ウサギからマウスまでの心臓に対する使用に成功しました。最先端のフルスペクトルフィッティングルーチンを利用して、心臓染色体の複雑な光学相互作用を容易に抽出することができ、従来と同時に心筋代謝の重要な要素のほぼリアルタイム測定機能的な対策。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIOPAC data acquisition system	BIOPAC	MP150	Analog to digitial conversion
BIOPAC general purpose transducer amplifiers	BIOPAC	DA100C	Pressure monitoring
BIOPAC System skin temperature amplifier	BIOPAC	SKT100B	temperature monitoring
Compact Universal 1- and 2- Channel LED Controllers	Mightex	SLC-MA02-U	External light source power supply
Disposable pressure sensors	BIOPAC	RX104A	Pressure monitoring
Dual Syringe, Infusion Pump	KdScientific	KDS 200 / 200P LEGACY SYRINGE PUMP	drug injection
Flow-through probes	Transonic	4PXN	perusate flow monitoring
Glass Syringe	FORTUNA Optima	30 CC	Air tight fluid injection
High power fiber-coupled LED white light source	Mightex	Type-A FCS-0000	External light source
Perfused heart system	Radnoti	120101BEZ	This system was heavily modified to provide adequate flow (see manuscript)
Phase fluorimeter	Ocean Optics	NeoFox-GT	oxygen concentration
Pickup fiber optic	Thor labs	BF20HSMA01	Fiber for collecting transmitted light (pick up fiber)
PowerLab unit	AD Instruments	PowerLab 8/35	Analog to digitial conversion
Pressure transducers	BIOPAC	TSD104A	pressure monitoring
Programming environment	LABViEW	N/A	Software for driving spectrometer, digitiziing data and analysis. Code available on request
Rapid scanning spectrophotometer	Ocean Optics	QE65PRO	Rapid scanning spectrometer for spectral analysis
Side firing fiber optic	Polymicro Technologies Molex, LLC 18019 North 25th Av, Phoenic AZ 85023-1200	JTFLH200230500/1.5M	side firing fiber optic 200 microns core
Sodium cyanide	Sigma-Aldrich	380970	Metabolic inhibitor
Temperature probe	BIOPAC	TSD102A	temperature monitoring
Tubing flow modules	Transonic	TS410	perusate flow monitoring