Summary

Humant Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G påvisning af celle-baseret analyse

Published: April 05, 2019
doi:

Summary

Celle-baserede assay er en meget udbredt metode til at påvise serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. Denne metode kan anvendes til klinisk diagnose og videnskabelige undersøgelser af neuromyelitis optisk spektrum forstyrrelser.

Abstract

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) er den kerne diagnostiske biomarkør for neuromyelitis optica spektrum forstyrrelser (NMOSD). Celle-baserede analysen (CBA) er en meget anvendt metode til at opdage anti-AQP4 IgG i humant serum med høj følsomhed og specificitet. Kort, serum anti-AQP4 IgG er fanget af AQP4-transfekteret celle, der er fastsat på biochip derefter fundet af en fluorescein-mærket sekundær antistof. Fluorescens mikroskopi er udnyttet til at visualisere fluorescens, og intensiteten af Fluorescens er evalueret af mindst to erfarne klinikere. En endelig diagnose af NMOSD kan gøres baseret på en kombination af anti-AQP4 IgG påvisning resultater, kliniske manifestationer og neuroradiological resultater. Ifølge tidligere undersøgelser, CBA er mere følsom og specifik end andre anti-AQP4 IgG påvisningsmetoder, og det kan anvendes til både klinisk diagnose og undersøgelser af NMOSD. Metoden har begrænsninger; for eksempel, mangler en international skala til at evaluere serum anti-AQP4 IgG titers stadig. Her, er en detaljeret protokol for humant serum anti-AQP4 IgG påvisning ved hjælp af CBA beskrevet.

Introduction

Serum AQP4 IgG er en core diagnostiske biomarkør for neuromyelitis optica spektrum forstyrrelser (NMOSD)1. Celle-baserede analysen (CBA) er en udbredt anti-AQP4 IgG påvisningsmetode med høj følsomhed og specificitet. Her, er en detaljeret protokol for CBA indført.

AQP4, en vand kanal protein, har seks membran-spænder enheder og to spiralformet domæner omkring en vandig pore2. Anti-AQP4 IgG er involveret i patogenesen af NMOSD gennem binding til sit mål AQP4, som er hovedsageligt placeret på endfeet af astrocytter3. Det har vist sig at anti-AQP4 IgG er positiv i cirka to tredjedele af NMOSD patienter4. I de seneste internationale diagnostiske kriterier for NMOSD, er anti-AQP4 IgG betragtes som et grundlæggende diagnostisk biomarkør5. I denne forbindelse, det er afgørende at etablere en pålidelig protokol for at opdage humant serum anti-AQP4 IgG og lette kliniske diagnose af NMOSD.

I øjeblikket er forskellige anti-AQP4 IgG påvisningsmetoderne tilgængelige, såsom CBA, væv-baserede assay, enzym-forbundet immunosorbent assay og flow flowcytometri6,7. CBA beskæftiger EU90 celler, som er transfekteret med menneskelige AQP4, til at fange anti-AQP4 IgG. Erobrede anti-AQP4 IgG er opdaget af fluorescerende sekundære antistoffer og efterfølgende visualiseret ved mikroskopi. Akkumulere beviser har vist, at CBA er mere følsom og specifik end andre anti-AQP4 IgG påvisning metoder6,7. Ifølge en meta-analyse, følsomhed og specificitet af CBA viste sig at være 76% og 99%, hvilket var højere end væv-baserede og enzym-forbundet immunosorbent undersøgelser vedrørende6. Derudover blev en multicenter sammenligning af diagnostiske assays af anti-AQP4 IgG gennemført7. Ialt 193 undersøgelse emner fra 15 europæiske diagnostiske Centre var tilmeldt7. Fire forskellige metoder blev udnyttet til at opdage serum anti-AQP4 IgG7. Det blev påvist, at CBA var mere følsom og specifik end andre metoder7. Som AQP4 er udtrykt som to store isoformer (AQP4-M1 og AQP4-M23), transfekteret anti-AQP4 IgG fange celle med enten AQP4-M1 eller AQP4-M23. Hvilken type af fange celle er imidlertid bedre resterne kontroversielle. En undersøgelse har støttet AQP4-M1 baseret CBA8, mens andre har anført, at AQP4-M23 baseret CBA er bedre7,9,10. Dog kan AQP4-M23-baserede CBA give falsk positive resultater på grund af uspecifik IgG bindende8. Jarius al.. 11 rapporterede, at der var ingen signifikant forskel i anti-AQP4 IgG opdagelse takster mellem AQP4-M1 og AQP4-M23-baseret CBAs.

I sammendrag, serum anti-AQP4 IgG er en core biomarkør for NMOSD. CBA har højere specificitet og sensitivitet end andre anti-AQP4 IgG detektionsmetoder. Det er fortsat kontroversielt, om AQP4-M1 – eller AQP4-M23-baserede CBA er bedre. I denne artikel, er en detaljeret protokol for AQP4-M1-baserede CBA beskrevet, som kan anvendes til klinisk diagnose og undersøgelser af NMOSD.

Protocol

Denne procedure blev vedtaget af den etiske komité i det første Hospital i Jilin Universitet og blev udført på cirka 1.500 emner. 1. patienten tilmelding og blod prøve indsamling Anvende laboratorium påvisning af serum anti-AQP4 IgG til klinikken patienter med chef klager og symptomer nedenfor. Udføre fysiske undersøgelser så godt.Synsnervebetændelse: patienter lider med visuelle underskud, såsom tab af visuelle felter og reduktion af synsskarphed.Akut myelitis…

Representative Results

Ved hjælp af den beskrevne procedure her, specifikke anti-AQP4 IgG serum kan detekteres. Under proceduren, blev forud fortyndede prøver, positiv kontrol og negativ kontrol føjet til felterne reaktion, som indeholder transfekteret og untransfected områder (figur 2). Fluorescens af den negative kontrol i et transfected område er primært angivet uspecifik bindingen af sekundær antistof mod de transfected celler på biochips (figur 3</…

Discussion

Vi har beskrevet et bredt tilgængelige metode til påvisning af anti-AQP4 IgG i humant serum. Anti-AQP4 IgG er nært beslægtet med NMOSD, og om oprettelse af en pålidelig anti-AQP4 IgG påvisningsmetode er afgørende for den kliniske diagnose af NMOSD. Første er anti-AQP4 IgG specifikke for NMOSD. Multipel sklerose er også en immun-medieret sygdom i centralnervesystemet og deler mange ligheder med NMOSD12. Anti-AQP4 IgG er imidlertid kun positive i NMOSD13. Andet, anti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne er taknemmelig for støtten fra tilskud fra National Science Foundation of China (nr. 31600820), The sundhed og familieplanlægning Kommissionen i Jilin provinsen (Nej 2016Q036), og videnskab og teknologi planlægning projekt af Jilin provinsen (nr. 20180520110JH).

Materials

Anti-aquaporin-4 IIFT Euroimmun FA 1128-2005-50 Contains biochip slides coated with AQP4-M1 transfected and untransfected EU 90 cells, fluorescein-labelled anti-human IgG, anti-AQP4 antibody as positive control, antibody negative sample, salt for PBS pH 7.2, Tween 20 and embedding medium. 
CellSens Dimension OLYMPUS N/A photograph software
Gel & clot activator tube Improve medical 623040202 From a local Chinese company

References

  1. Zekeridou, A., Lennon, V. A. Aquaporin-4 autoimmunity. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 2 (4), 110 (2015).
  2. Ho, J. D., et al. Crystal structure of human aquaporin 4 at 1.8 A and its mechanism of conductance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (18), 7437-7442 (2009).
  3. Takeshita, Y., et al. Effects of neuromyelitis optica-IgG at the blood-brain barrier in vitro. in vitro.Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (1), 311 (2016).
  4. Sato, D. K., et al. Distinction between MOG antibody-positive and AQP4 antibody-positive NMO spectrum disorders. Neurology. 82 (6), 474-481 (2014).
  5. Wingerchuk, D. M., et al. International consensus diagnostic criteria for neuromyelitis optica spectrum disorders. Neurology. 85 (2), 177-189 (2015).
  6. Ruiz-Gaviria, R., et al. Specificity and sensitivity of aquaporin 4 antibody detection tests in patients with neuromyelitis optica: A meta-analysis. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 4 (4), 345-349 (2015).
  7. Waters, P., et al. Multicentre comparison of a diagnostic assay: aquaporin-4 antibodies in neuromyelitis optica. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 87 (9), 1005-1015 (2016).
  8. Fryer, J. P., et al. AQP4 autoantibody assay performance in clinical laboratory service. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 1 (1), 11 (2014).
  9. Long, Y., et al. Aquaporin-4 antibody in neuromyelitis optica: re-testing study in a large population from China. The International Journal of Neuroscience. 127 (9), 790-799 (2017).
  10. Pisani, F., et al. Aquaporin-4 autoantibodies in Neuromyelitis Optica: AQP4 isoform-dependent sensitivity and specificity. PloS One. 8 (11), 79185 (2013).
  11. Jarius, S., et al. Aquaporin-4 antibody testing: direct comparison of M1-AQP4-DNA-transfected cells with leaky scanning versus M23-AQP4-DNA-transfected cells as antigenic substrate. Journal of Neuroinflammation. 11, 129 (2014).
  12. Juryńczyk, M., Craner, M., Palace, J. Overlapping CNS inflammatory diseases: differentiating features of NMO and MS. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 86 (1), 20-25 (2015).
  13. Chen, H., et al. Clinical Features of Patients with Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica Spectrum Disorders. Chinese Medical Journal. 129 (17), 2079-2084 (2016).
  14. Majed, M., Fryer, J. P., McKeon, A., Lennon, V. A., Pittock, S. J. Clinical utility of testing AQP4-IgG in CSF: Guidance for physicians. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 3 (3), 231 (2016).
  15. Jarius, S., et al. Cerebrospinal fluid antibodies to aquaporin-4 in neuromyelitis optica and related disorders: frequency, origin, and diagnostic relevance. Journal of Neuroinflammation. 7, 52 (2010).
  16. Asgari, N., et al. Disruption of the leptomeningeal blood barrier in neuromyelitis optica spectrum disorder. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (4), 343 (2017).
  17. Kim, H. J., et al. MRI characteristics of neuromyelitis optica spectrum disorder: an international update. Neurology. 84 (11), 1165-1173 (2015).
  18. Jarius, S., et al. MOG encephalomyelitis: international recommendations on diagnosis and antibody testing. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 134 (2018).
  19. Narayan, R., et al. MOG antibody disease: A review of MOG antibody seropositive neuromyelitis optica spectrum disorder. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 25, 66-72 (2018).
  20. Ogawa, R., et al. MOG antibody-positive, benign, unilateral, cerebral cortical encephalitis with epilepsy. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (2), 322 (2017).
  21. Valentino, P., Marnetto, F., Granieri, L., Capobianco, M., Bertolotto, A. Aquaporin-4 antibody titration in NMO patients treated with rituximab: A retrospective study. Neurology Neuroimmunology & Neuroinflammation. 4 (2), 317 (2016).
  22. Kessler, R. A., et al. Anti-aquaporin-4 titer is not predictive of disease course in neuromyelitis optica spectrum disorder: A multicenter cohort study. Multiple Sclerosis and Related Disorders. 17, 198-201 (2017).
  23. Mealy, M. A., et al. Aquaporin-4 serostatus does not predict response to immunotherapy in neuromyelitis optica spectrum disorders. Multiple Sclerosis. , (2017).
  24. Yang, Y., et al. The role of aquaporin-4 antibodies in Chinese patients with neuromyelitis optica. Journal of Clinical Neuroscience. 20 (1), 94-98 (2013).
  25. Kitley, J., et al. Prognostic factors and disease course in aquaporin-4 antibody-positive patients with neuromyelitis optica spectrum disorder from the United Kingdom and Japan. Brain. 135 (6), 1834-1849 (2012).

Play Video

Cite This Article
Liu, C., Zhu, M., Wang, Y. Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay. J. Vis. Exp. (146), e59014, doi:10.3791/59014 (2019).

View Video