Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

स्टैफिलोकोकस ऑरियस संक्रमण के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए एक माउस मॉडल

Published: February 28, 2019 doi: 10.3791/59015
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of California Davis, 2Department of Dermatology, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

एक दृष्टिकोण वास्तविक समय का पता लगाने के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए वर्णित है त्वचीय घाव और staphylococcus ऑरियस संक्रमण चूहों की. lysm-egfp चूहों की तुलना करके (जो फ्लोरोसेंट न्युट्रोफिल अधिकारी) एक lysm-egfp crossbred immunoकी कमी माउस तनाव के साथ, हम संक्रमण की हमारी समझ अग्रिम और संक्रमण का मुकाबला करने के लिए दृष्टिकोण के विकास.

Abstract

स्टैफिलोकोकस ऑरियस (एस ऑरियस) संक्रमण, मेथिसिलिन प्रतिरोधी दाग सहित, स्वास्थ्य देखभाल प्रणाली पर एक भारी बोझ हैं । एस ऑरियस संक्रमण की घटना दर प्रतिवर्ष चढ़ाई के साथ, इसके रोगजनन में अतिरिक्त शोध की मांग है । संक्रामक रोग के पशु मॉडल मेजबान रोगज़नक़ प्रतिक्रिया की हमारी समझ अग्रिम और प्रभावी चिकित्सा विज्ञान के विकास के लिए सीसा । न्यूट्रोफिल जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक प्राथमिक भूमिका निभाते हैं जो संक्रमण से दीवार के लिए एक फोड़ा बनाने और बैक्टीरियल निकासी की सुविधा के द्वारा एस ऑरियस संक्रमण को नियंत्रित करता है; एक एस. ऑरियस त्वचा संक्रमण में घुसपैठ करने वाले न्यूट्रोफिल की संख्या अक्सर रोग के परिणाम के साथ संबद्ध होती है । lysm-egfp चूहों, जो बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (egfp) lysozyme एम (lysm) प्रवर्तक क्षेत्र में डाला (मुख्य रूप से न्यूट्रोफिल द्वारा व्यक्त), जब वीवो पूरे जानवर प्रतिदीप्ति इमेजिंग (fli) के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया एक प्रदान न्युट्रोफिल उत्प्रवास noninvasively और अनुदैवधिक घायल त्वचा में बढ़ाता का मतलब है । जब विवो पूरे जानवर bioluminescent इमेजिंग (BLI) में एक bioluminescent एस ऑरियस तनाव और अनुक्रमिक के साथ संयुक्त, यह अनुदैर्घतापूर्वक दोनों न्यूट्रोफिल भर्ती गतिशीलता पर नजर रखने के लिए संभव है और vivo में जीवाणु बोझ में साइट पर संक्रमण के समाधान या मृत्यु की शुरुआत से एनेस्थेटाइज्ड चूहों में संक्रमण. चूहों अधिक डाह एस द्वारा उत्पादित कारकों की एक संख्या के लिए प्रतिरोधी रहे हैं कि प्रभावी औपनिवेशीकरण और मनुष्यों में संक्रमण की सुविधा. immunoकी कमी चूहों एक अधिक संवेदनशील पशु मॉडल प्रदान करने के लिए लगातार एस ऑरियस संक्रमण और चिकित्सा विज्ञान की क्षमता की जांच करने के लिए जंमजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देने के । इस के साथ साथ, हम lysm-egfp चूहों कि MyD88-कमी चूहों (lysm-egfp × MyD88-/ चूहों) जंगली प्रकार lysm-egfp चूहों के साथ साथ एस ऑरियस त्वचा घाव संक्रमण की जांच करने के लिए नस्ल किया गया है में प्रतिक्रियाओं की विशेषता है । बहुस्पेक्ट्रमी युगपत पहचान विवो फ्लि में उपयोग करके न्यूट्रोफिल भर्ती गतिशीलता का अध्ययन सक्षम किया गया, विवो बली में उपयोग करके बैक्टीरियल बोझ, और समय के साथ अनुदैवधिक रूप से घाव भरना ।

Introduction

स्टैफिलोकोकस ऑरियस (एस ऑरियस) संयुक्त राज्य अमेरिका1में त्वचा और कोमल ऊतक संक्रमण (sstis) के बहुमत के लिए खातों । methicillin-प्रतिरोधी एस ऑरियस (mrsa) संक्रमण की घटना पिछले दो दशकों में तेजी से बढ़ गया है2, हठ के तंत्र के अध्ययन को प्रेरित करने और नए उपचार रणनीतियों की खोज । mrsa संक्रमण के लिए देखभाल के मानक प्रणालीगत एंटीबायोटिक चिकित्सा है, लेकिन mrsa तेजी से समय पर एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोधी बन गया है3 और इन दवाओं मेजबान के लाभकारी microbiome कम कर सकते हैं, नकारात्मक स्वास्थ्य प्रभाव के कारण, विशेष रूप से में बच्चे4. preclinical अध्ययन वैकल्पिक रणनीतियों की जांच की है mrsa संक्रमण का इलाज5, लेकिन क्लिनिक के लिए इन तरीकों का अनुवाद डाह कारकों के उद्भव के कारण चुनौतीपूर्ण साबित कर दिया है कि मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को विफल6। के लिए मेजबान-रोगज़नक़ गतिशीलता है कि ड्राइव एस ऑरियस sstis, हम noninvasive और न्यूट्रोफिल जीवाणु बहुतायत और घाव क्षेत्र के गतिज उपायों के साथ घाव बिस्तर में भर्ती की संख्या के अनुदैर्ध्य readouts गठबंधन ।

न्यूट्रोफिल मानव में सबसे प्रचुर मात्रा में परिसंचारी ल्यूकोसाइट और एक जीवाणु संक्रमण7के लिए पहली responders हैं । न्युट्रोफिल प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, proteases, रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स और कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं के उत्पादन सहित उनके जीवाणुनाशक तंत्र के कारण एस औरियस संक्रमण के खिलाफ एक प्रभावी मेजबान प्रतिक्रिया के लिए एक आवश्यक घटक हैं फैगोसाइटोसिस और न्युट्रोफिल extracellular जाल उत्पादन सहित8,9. न्यूट्रोफिल समारोह में आनुवंशिक दोषों के साथ मानव रोगियों, जैसे क्रोनिक ग्रैन्युलोमेटस डिजीज और चेडियाक-हिगाशी सिंड्रोम, एस -ऑरियस संक्रमण के लिए एक बढ़ी हुई संवेदनशीलता दिखाते हैं । इसके अलावा, आनुवंशिक (जैसे जन्मजात न्यूट्रोपेनिया के रूप में) और अधिग्रहण (जैसे कीमोथेरेपी रोगियों में देखा न्यूट्रोपेनिया के रूप में) के साथ रोगियों न्यूट्रोफिल संख्या में दोष भी अत्यधिक एस. ऑरियस संक्रमण10के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं । समाशोधन एस में न्यूट्रोफिल के महत्व को देखते हुए ऑरियस संक्रमण, अपनी प्रतिरक्षा क्षमता बढ़ाने या एक एस के भीतर उनकी संख्या ट्यूनिंग . ऑरियस घाव संक्रमण को हल करने में एक प्रभावी रणनीति साबित हो सकती है ।

पिछले एक दशक में, प्रतिदीप्ति न्यूट्रोफिल पत्रकारों के साथ ट्रांसजेनिक चूहों उनके तस्कर11,12का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है. पूरे पशु इमेजिंग तकनीकों के साथ न्यूट्रोफिल रिपोर्टर चूहों के संयोजन ऊतकों और अंगों में न्युट्रोफ़िल के स्पेटिओटेंपोरल विश्लेषण परमिट । जब एस ऑरियसके bioluminescent उपभेदों के साथ संयुक्त, यह एस ऑरियस बहुतायत और बैक्टीरियल डाह कारकों के संदर्भ में दृढ़ता के जवाब में न्यूट्रोफिल के संचय को ट्रैक करने के लिए संभव है कि प्रत्यक्ष और परोक्ष रूप से प्रभावित ऊतक में क्षोभ न्यूट्रोफिल संख्या13,14,15,16.

चूहों कम एस के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं . ऑरियस डाह और मनुष्यों की तुलना में प्रतिरक्षा चोरी तंत्र. इस तरह के रूप में, जंगली प्रकार चूहे एक आदर्श पशु मॉडल के लिए एक दिया चिकित्सकीय की प्रभावकारिता की जांच करने के लिए पुरानी एस ऑरियस संक्रमण का इलाज नहीं हो सकता है । MyD88-कमी चूहों (यानी, MyD88-/ चूहों), कार्यात्मक interleukin-1 रिसेप्टर (आईएल-1r) और टोल की तरह रिसेप्टर (tlr) संकेतन का अभाव है कि एक प्रतिरक्षा माउस तनाव, एस के लिए अधिक से अधिक संवेदनशीलता दिखाने के लिए की तुलना में ऑरियस संक्रमण जंगली टाइप17 चूहों और त्वचा18में एस ऑरियस संक्रमण की एक साइट के लिए न्युट्रोफिल तस्करी में एक हानि । MyD88 में एक फ्लोरोसेंट न्युट्रोफिल रिपोर्टर के पास एक माउस तनाव का विकास-/ चूहों वर्तमान न्यूट्रोफिल की तुलना में एस ऑरियस संक्रमण के इलाज के लिए चिकित्सा की प्रभावकारिता की जांच के लिए एक वैकल्पिक मॉडल प्रदान की गई है रिपोर्टर चूहे.

इस प्रोटोकॉल में, हम प्रतिरक्षा lysm-egfp × MyD88-/ चूहों में एस ऑरियस संक्रमण की विशेषता है, और समय पाठ्यक्रम और lysm-egfp चूहों के साथ संक्रमण के संकल्प की तुलना करें । lysm-egfp × MyD88-/ चूहों को हल नहीं करता है कि एक पुरानी संक्रमण का विकास, और 8 दिनों के बाद संक्रमण के लिए ७५% शिकार. प्रारंभिक न्यूट्रोफिल भर्ती में एक महत्वपूर्ण दोष संक्रमण के भड़काऊ चरण के ७२ ज से अधिक होता है, और ५०% कम न्यूट्रोफिल्स संक्रमण के उत्तरार्द्ध चरण के दौरान भर्ती होते हैं । lysm की वृद्धि हुई संवेदनशीलता-egfp × MyD88-/ चूहों इस विशेष तनाव बनाता है एक कठोर पूर्व नैदानिक मॉडल की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए नए चिकित्सकीय लक्ष्यीकरण एस ऑरियस वर्तमान मॉडल की तुलना में संक्रमण है कि जंगली प्रकार चूहों का उपयोग, विशेष रूप से संक्रमण के खिलाफ जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ावा देने के लिए लक्ष्य तकनीकों.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी माउस अध्ययनों की समीक्षा की गई और UC डेविस में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित और पशु कल्याण अधिनियम और स्वास्थ्य अनुसंधान विस्तार अधिनियम के दिशानिर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया । जानवरों के साथ काम करते समय बाँझ दस्ताने का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें ।

1. माउस स्रोत और आवास

  1. एक C57BL/6j आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर lysm-egfp चूहों से व्युत्पन्न के रूप में पहले वर्णित12. एक C57BL/6j पृष्ठभूमि पर MyD88-/- चूहों के साथ lysm-egfp चूहों को पार करके lysm-egfp × MyD88-/
  2. एक vivarium में घर चूहों । इन अध्ययनों के लिए, पशु कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय में रखे गए थे, सर्जरी और एकल घर के बाद सर्जरी से पहले समूहों में डेविस । 10-16 सप्ताह की उंर के बीच चूहों का प्रयोग करें ।

2. बैक्टीरियल तैयारी और quantification

  1. -८० डिग्री सेल्सियस भंडारण से ब्याज की bioluminescent एस ऑरियस तनाव को दूर बर्फ पर गल । एक 5% गोजातीय रक्त आगर थाली पर लकीर । ३७ ° c रात भर (16 ज) में एक ह्यूमिडिफाइड इनकोबेटर में streaked थाली सेते हैं ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, ALC2906 SH1000 तनाव का इस्तेमाल किया गया था । इस तनाव penicillin-बाध्यकारी प्रोटीन 2 प्रमोटर photohabdus luminescens18से luxabcde रिपोर्टर कैसेट के लिए जुड़े साथ शटल प्लाज्मिड pSK236 शामिल हैं ।
  2. शुद्ध पानी की मिलीलीटर प्रति टीएसबी पाउडर के ०.०३ जी मिश्रण से tryptic सोया शोरबा (tsb) तैयार है, और आटोक्लेव tsb जीवाणुरहित करने के लिए । जब ठंडा, बाँझ तकनीक का उपयोग कर किसी भी आवश्यक एंटीबायोटिक दवाओं जोड़ें । इस प्रोटोकॉल में, pSK236 शटल plasmid की अभिव्यक्ति के लिए चयन करने के लिए tsb के लिए क्लॉरॅंफेनिकोल18 के 10 μg/एमएल, जिसमें bioluminescence luxabcde कैसेट शामिल हैं ।
  3. एक रातोंरात संस्कृति शुरू करने के लिए 10 μg/एमएल क्लॉरॅंफेनिकोल के साथ टीएसबी में एस. ऑरियस प्लेट से 3-4 अलग कालोनियों उठाओ । ३७ ° c रातोंरात (16 ज) पर एक incubating शेखर पर बैक्टीरिया सेते ।
  4. 10 μg/एमएल chloramphenicol के साथ tsb में एक नमूना 1:50 पतला द्वारा रातोंरात संस्कृति से एक नई बैक्टीरियल संस्कृति शुरू करो । २०० आरपीएम और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक इन्बेटिंग शेखर में संस्कृति ।
  5. एस. ऑरियसबंटवारे के दो घंटे बाद, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर ६०० एनएम (ओडी६००) पर ऑप्टिकल घनत्व की निगरानी करें । आयुध डिपो६०० बनाम समय मध्य लघुगणकीय चरण वृद्धि को खोजने के लिए निरीक्षण करते हैं । ALC2906 SH1000 तनाव के लिए, ०.५ के एक ओडी६०० मध्य लघुगणकीय है और 1 x 108 cfu/एमएल (चित्रा 1) की एकाग्रता के अनुरूप है ।
  6. जब OD६०० ०.५ है, तो आइस-कोल्ड dpbs के साथ 1:1 बैक्टीरिया धो लें । ३,००० एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए बैक्टीरिया को अपकेंद्रिकृत करें । सावधानी से अधिनंत छानना और अतिरिक्त ठंडा dpbs और भंवर अच्छी तरह से जोड़ें । ३,००० एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक बार अधिक अपकेंद्रिका ।
  7. ध्यान से डिसेंट supernatant । एक वांछित एकाग्रता में बैक्टीरियल गोली resuspend । इन अध्ययनों के लिए, इकट्ठा 3 मिलीलीटर ALC2906 SH1000 और १.५ मिलीलीटर पीबीएस में resuspend, के बारे में एक बैक्टीरिया एकाग्रता से संबंधित 2 x 108 cfu/एमएल । उपयोग तक बर्फ पर बैक्टीरिया रखें ।
  8. बैक्टीरिया की एकाग्रता की पुष्टि करने के लिए, जीवाणु नमूना 1:10000 और 1:100000 पीबीएस में पतला १०० μl । एक आगर प्लेट पर प्लेट 20 μl aliquots । ३७ डिग्री सेल्सियस पर इंसेबेट 16 एच के लिए एक ह्यूमिफाइड इनकूबेटर में सकल परीक्षा द्वारा सीयूएस की गणना करें और अगले दिन एक बैक्टीरियल एकाग्रता की गणना ।

3. excisional त्वचा घाव और एस ऑरियस के साथ inoculation

  1. intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से प्रत्येक माउस को ०.०३ मिलीग्राम/एमएल बुप्रेनोरापाइन हाइड्रोक्लोराइड (~ ०.२ मिलीग्राम/किग्रा) के १०० μl प्रशासन ।
  2. बीस मिनट बाद इंजेक्शन, जगह 2-4 चूहों के साथ एक चैंबर में 2-3 lpm ऑक्सीजन के साथ 2-4% isoflurane. एक बार चूहों पूरी तरह से एनेस्थेटिज्ड हैं, एक समय में चूहों को एक नाक शंकु के लिए एक बार में स्थानांतरित करने के लिए 2-3 lpm ऑक्सीजन के साथ 2-4% isoflurane. सत्यापित करें कि चूहों को पूरी तरह से दृढ़ता से एक अंगूठे और तर्जनी के बीच प्रत्येक रियर पंजा बन्द रखो द्वारा एनेस्थेटाइज्ड हैं । पशु चुटकी का जवाब नहीं है, तो अगले कदम के लिए आगे बढ़ें ।
  3. इलेक्ट्रिक कतरनी के साथ माउस की पीठ पर 2 इंच अनुभाग द्वारा एक 1 इंच दाढ़ी और एक साफ पोंछ या धुंध का उपयोग फर कतरनों के क्षेत्र स्पष्ट । डिपिलेटरी लोशन का उपयोग करने से बचें क्योंकि इससे अतिरिक्त सूजन हो सकती है ।
  4. 10% पोविटोन के साथ पहले माउस के पीछे साफ-आयोडीन लथपथ धुंध और फिर एक ७०% इथेनॉल लथपथ धुंध के साथ । एक सर्पिल पैटर्न में क्षेत्र को साफ, सर्जिकल क्षेत्र के केंद्र से जावक चलती है । सर्जरी से पहले शुष्क करने के लिए सर्जिकल क्षेत्र के लिए लगभग 1 मिनट रुको ।
  5. दो उंगलियों के बीच ढीला माउस के मुंडा वापस पकड़ो और दृढ़ता से तैयार सर्जिकल क्षेत्र के केंद्र में एक बाँझ 6 मिमी पंच बायोप्सी दबाएँ. त्वचा तना हुआ नहीं खींचो ।
    1. मोड़ पंच बायोप्सी त्वचा है कि पूरी तरह से रूपरेखा के कम से एक खंड में त्वचा के माध्यम से कटौती पर एक परिपत्र रूपरेखा बनाने के लिए । अंतर्निहित प्रावरणी या ऊतक में कटौती करने के लिए नहीं सावधान रहें ।
    2. पंच बायोप्सी द्वारा अंकित परिपत्र पैटर्न के बाद एपिडर्मिस और डर्मिस के माध्यम से काटने के लिए बाँझ कैंची और संदंश का प्रयोग करें ।

4. एस. ऑरियस टीका

  1. एक 28 ग्राम इंसुलिन सिरिंज को वांछित बायोलुमिनसेंट बैक्टीरियल इनॉकुलेंट के साथ भरें । इस अध्ययन में, 1 x 108 cfu/एमएल (५० μl) की एकाग्रता का प्रशासन । १०० μl से अधिक मात्रा में प्रशासन न करें ।
  2. माउस की पीठ पर घाव के केंद्र में प्रावरणी और ऊतक के बीच जीवाणुओं के ५० μl सुई । सुनिश्चित करें कि जीवाणुओं न्यूनतम रिसाव या फैलाव के साथ घाव के केंद्र पर एक बुलबुला बनाता है ।
    1. डर्मिस पक्ष को खींचो, सिरिंज लगभग ऊतक के समानांतर पकड़ है, और धीरे से ऊतकों में सिरिंज धक्का जब तक प्रतिरोध में अचानक कमी महसूस किया है, जो प्रावरणी का भेदी इंगित करता है. सावधानी से घाव के केंद्र में सिरिंज का नेतृत्व और जीवाणुओं धीरे से बांटना । सिरिंज को जानवर से धीरे से हटा दें ।
  3. ऊपर वर्णित के रूप में असंक्रमित जानवरों के घावों में बाँझ पीबीएस की एक ही मात्रा सुई.
  4. जानवर को अपने पिंजरे में लौटा दे । एक गर्मी दीपक के तहत पिंजरे या एक हीटिंग पैड के शीर्ष पर रखें, और संज्ञाहरण से वसूली जब तक पशु की निगरानी ।

5. Vivo BLI और fli में

  1. साधन सॉफ्टवेयर के माध्यम से पूरे जानवर imager इनिशियलाइज़ । 2-3 lpm ऑक्सीजन 2-4% isoflurane के साथ प्राप्त एक चैंबर में एनेस्थेटाइज़ चूहों. imager अंदर nosecones को संज्ञाहरण उद्धार ।
  2. imager में घायल और संक्रमित माउस प्लेस । माउस को ऐसे स्थान पर रखें कि घाव यथासंभव सपाट हो । चूहों की छवि के लिए निम्न अनुक्रम सेट-अप का उपयोग करें ।
    1. luminescence और इमेजिंग मोड के रूप में तस्वीर का चयन करें । एक्सपोज़र समय 1 मिनट छोटी बिनिंग और f/stop 1 (luminescence) और f/stop 8 (फ़ोटोग्राफ़) में है । उत्सर्जन फिल्टर खुलाहै । छवि रिकॉर्ड करने के लिए मोल बटन पर क्लिक करें ।
    2. प्रतिदीप्ति और फोटोग्राफ को इमेजिंग मोड के रूप में चुनें । एक्सपोजर टाइम में 1 एस है छोटी बिनिंग और f/stop 1 (प्रतिदीप्ति) और f/stop 8 (फोटोग्राफ) के साथ एक उत्तेजना तरंग दैर्घ्य के 465/30 एनएम और एक उत्सर्जन तरंगदैर्घ्य 520/20 एनएम एक उच्च लैंप तीव्रता के साथ । छवि रिकॉर्ड करने के लिए मोल बटन पर क्लिक करें ।
  3. अपने पिंजरे में पशु लौटें और संज्ञाहरण से वसूली तक की निगरानी ।
  4. छवि चूहों के रूप में दैनिक ऊपर वर्णित है ।

6. छवि विश्लेषण

  1. खुला छवियों quantified जा करने के लिए ।
  2. छवि में प्रत्येक माउस के लिए आसपास के त्वचा सहित पूरे घाव क्षेत्र पर ब्याज (ROI) का एक बड़ा परिपत्र क्षेत्र रखें । vivo fli egfp संकेतों में न्यूट्रोफिल और विवो बली एस ऑरियस सिग्नलों में कई दिनों के बाद घाव के किनारे से आगे का विस्तार होता है और इन अध्ययनों (चित्रा 2a और 2a) में शामिल किया गया था । प्रत्येक माउस के लिए माध्य फ्लक्स के लिए ROI और रिकॉर्ड मानों को मापने पर क्लिक करें. प्रत्येक संकेत (p/s) के माध्य प्रवाह को समय के साथ प्लॉट करना ।
  3. यदि घाव में न्यूट्रोफिल या एस. ऑरियस की निरपेक्ष संख्या वांछित हैं, तो निम्नलिखित प्रयोगों को निष्पादित करें ।
    1. विवो fli egfp संकेतों में, घाव C57BL/6j चूहों के रूप में ऊपर वर्णित है, और अस्थि मज्जा की एक श्रृंखला को स्थानांतरित करने के लिए न्यूट्रोफिल संख्या को सहसंबंधी करने के लिए (5 x 105 से 1 x 107) lysm से-egfp या lysm-EGFPxMyD88-/ सीधे अलग घावों के शीर्ष पर । ऊपर वर्णित छवि और न्यूट्रोफिल की ज्ञात मात्रा के लिए vivo fli egfp संकेतों में सहसंबंधित.
    2. विवो बली संकेतों में, घाव और ऊपर वर्णित चूहों को संक्रमित करने के लिए एस. ऑरियस cfu को सहसंबंधित करना । दिन 1 के बाद में संक्रमण का रिकॉर्ड vivo BLI में चूहों से संकेत और तुरंत euthanize और चिल carcasses । घाव एक्साइज, ऊतक homogenize, और रात भर ऊष्मायन के लिए आगर पर प्लेट बैक्टीरियल dilutions । अगले दिन, गणना कालोनियों घाव प्रति cfu निर्धारित करने के लिए ।
  4. घाव भरने को मापने के लिए घाव के किनारे पर एक परिपत्र रॉय फिट और घाव (सेमी2) के क्षेत्र को मापने और आधारभूत बनाम समय (चित्रा 2c) से आंशिक परिवर्तन की साजिश ।

7. सांख्यिकी

नोट: सभी डाटा को माध्य ± SEM. p < ०.०५ के रूप में प्रस्तुत किया गया सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना गया

  1. एक ही दिन पर दो समूहों के बीच मतभेद निर्धारित holm-sidak विधि का उपयोग कर, अल्फा = ०.०५ के साथ, और हर बार बिंदु व्यक्तिगत विश्लेषण, एक सुसंगत एसडी संभालने के बिना.
  2. एक ही दिन पर कई समूहों के बीच मतभेद की तुलना tukey एकाधिक-तुलना posttest के साथ एक तरफा anova । प्रयोगात्मक समूहों के बीच जीवन रक्षा mantel-कॉक्स विधि द्वारा विश्लेषण किया गया ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

lysm-egfp × MyD88-/ चूहों अधिक lysm-egfp चूहों की तुलना में एस ऑरियस संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं

इस अध्ययन में इस्तेमाल किया एस ऑरियस का तनाव, ALC290618, एक प्लाज्मिड है कि लक्स का निर्माण होता है कि लाइव और सक्रिय रूप से बैक्टीरिया metabolizing से bioluminescent संकेतों का उत्पादन होता है के साथ निर्माण किया गया था । जब चूहों में inoculated, vivo में bioluminescence इमेजिंग (BLI) तकनीकों का उपयोग किया जा सकता है अनुबद्ध एक संक्रमित घाव के भीतर बैक्टीरिया बोझ को मापने । दोनों lysm-egfp × MyD88-/ चूहों और lysm-egfp चूहों घाव और संक्रमित एस के लिए अपने संवेदनशीलता की तुलना करने के लिए घावों में एस ऑरियस के 1 एक्स 107 cfu के साथ थे. lysm-egfp × MyD88-/ चूहों lysm के संक्रमण के लिए अधिक से अधिक संवेदनशीलता से पता चला-egfp चूहों के दौरान lysm-egfp × MyD88-/- के पहले 8 दिनों के दौरान चूहों की lethality के द्वारा प्रदर्शन किया lysm-egfp चूहों की 0% लेथलिटी की तुलना में प्रयोग की संपूर्ण 15-दिन की अवधि (चित्र 3a) । चूहों के दोनों उपभेदों संक्रमण के बाद ~ 5% शरीर के वजन खो दिया है, लेकिन lysm-egfp चूहों 2 दिन से मूल वजन बरामद, जबकि lysm-egfp × MyD88-/ चूहों खो वजन (चित्रा 3b) ठीक नहीं किया । घाव का बंद एस ऑरियस संक्रमण की उपस्थिति में दो उपभेदों के बीच अलग नहीं था; हालांकि, जीवाणुरहित रूप से घायल lysm-egfp × MyD88-/- lysm-egfp चूहों की तुलना में घाव भरने में एक महत्वपूर्ण दोष था (चित्रा 3c), के रूप में पहले19रिपोर्ट. पूरे पशु इमेजिंग जीवाणु बोझ को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था दैनिक, और के रूप में दिन के रूप में जल्दी 1, lysm-egfp × MyD88-/- घाव lysm-egfp घावों की तुलना में एक उच्च जीवाणु बोझ था । lysm-egfp चूहों नियंत्रित संक्रमण और घाव में vivo BLI संकेतों में कमी आई है, जबकि lysm-egfp × MyD88-/ चूहों जीवाणु बोझ है कि 4 दिन पर पशु मृत्यु तक plateaued (चित्रा 3 डी,ई) में वृद्धि का प्रदर्शन किया । एक साथ, इन आंकड़ों lysm-egfp × MyD88-/ चूहों की वृद्धि हुई संवेदनशीलता का प्रदर्शन lysm-egfp चूहों की तुलना में एस. ऑरियस संक्रमण के लिए ।

S. ऑरियस संक्रमित lysm-egfp × MyD88-/ चूहों में lysm-egfp चूहों की तुलना में न्यूट्रोफिल तस्करी बिगड़ा हुआ है

लाइसोजाइम एम प्रवर्तक12के एक egfp प्रोटीन के कारण lysm-egfp माउस हरी फ्लोरोसेंट न्युट्रोफिल का उत्पादन करता है । इस माउस को त्वचीय एस के जवाब में विवो न्युट्रोफिल तस्करी में अनुदैर्ध्य अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है . ऑरियस संक्रमण13,14,20,21,22. न्यूट्रोफिल कैनेटीक्स की तुलना करने के लिए lysm पर उत्पादित घावों-egfp और lysm-egfp × MyD88-/ चूहों, एक 6 मिमी पूर्ण मोटाई त्वचा घाव dorsum पर प्रशासित किया गया था, और चूहों दैनिक imaged थे । घावों के लिए न्यूट्रोफिल तस्करी में ४०% की कमी lysm-egfp चूहों (चित्रा 4a, सी) की तुलना में लिज्म-egfp × MyD88 में मनाया गया । जब 1 x 107 एस ऑरियस के cfu के बाद तुरंत शुरू किया गया था घाव, न्यूट्रोफिल तस्करी चूहों के दोनों उपभेदों में तनु था, लेकिन lysm-egfp × MyD88-/ चूहों के साथ एस के लिए और अधिक संवेदनशील थे ऑरियस संक्रमण न्युट्रोफिल भर्ती को सम्मान । संक्रमण एक 15% lysm-egfp घावों (चित्रा 4b) में मनाया कमी की तुलना में lysm-egfp × MyD88-/- घावों के लिए प्रारंभिक न्यूट्रोफिल तस्करी में ५०% कमी हुई । lysm-egfp चूहों भी संक्रमण के बाद के चरणों के दौरान घाव करने के लिए काफी अधिक न्यूट्रोफिल भर्ती (चित्रा 4a,सी) lysm की तुलना में-egfp × MyD88-/ चूहों, जो न्यूट्रोफिल संख्या में भी वृद्धि करने में असमर्थ थे निरंतर जीवाणु बोझ की उपस्थिति । एक साथ, इन आंकड़ों का प्रदर्शन है कि lysm-egfp × MyD88-/ चूहों न्यूट्रोफिल भर्ती में एक दोष है, जो एस के लिए उनकी वृद्धि हुई संवेदनशीलता के अनुरूप है .

Figure 1
चित्र 1: OD६०० और cfu के बीच सहसंबंध ALC2906 के लिए मायने रखता है । 3-4 ALC2906 SH1000 कालोनियों को एक आगर प्लेट से उठाया गया और रातोंरात संस्कृति के लिए 10 μg/एमएल क्लॉरॅंफेनिकोल के साथ टीएसबी में स्थानांतरित किया गया । अगले दिन, निलंबन tsb में 1:50 10 μg/एमएल क्लॉरॅंफेनिकोल और सभ्य के साथ विभाजित किया गया था । ६०० एनएम (ओडी६००) पर ऑप्टिकल घनत्व को स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करते हुए 2 घंटे के बाद नियमित अंतरालों में मापा गया । प्रत्येक माप में बैक्टीरिया को पतला किया गया था 1:100000 आइस कोल्ड पीबीएस में और रातोंरात ऊष्मायन के लिए एक आगर प्लेट पर एलिकोटेड । cfus प्रारंभिक एकाग्रता की गणना और ओडी६००को सहसंबद्ध करने के लिए अगले दिन गिना रहे थे. N = 3 प्रयोग के अनुसार 4 अलग ओडी६०० मापन के साथ। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: हितों के प्रतिनिधि क्षेत्र (rois) डेटा विश्लेषण के लिए. vivo BLI में विश्लेषण करने के लिए और vivo fli संकेतों में, बड़े, बराबर आकार rois घाव और कुल फ्लक्स पर केंद्रित थे (प्रति सेकंड फोटॉन) मापा गया था । घाव के बंद को मापने के लिए, एक रॉय घाव किनारे और क्षेत्र (सेमी2) के लिए फिट था मापा गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: lysm-egfp × MyD88-/ चूहों अधिक lysm-egfp चूहों की तुलना में एस ऑरियस संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं । lysm-egfp और lysm-egfp × MyD88-/ चूहों डोर्सम पर एक 6 मिमी घाव प्रशासित किया गया और 1 एक्स 107 के साथ संक्रमित bioluminescent एस ऑरियस या बाँझ खारा के cfu. पशु दैनिक निगरानी और (ए) अस्तित्व और (ख) वजन दर्ज किए गए थे । जानवरों को मापने के लिए दैनिक imaged थे (C) घाव आकार और (D) बैक्टीरियल luminescence. (ङ) प्रतिनिधि बायोलुमीनिसेंट छवियाँ संक्रमित lysm-egfp और lysm-egfp × MyD88-/- चूहों से चित्रित कर रहे हैं. स्केल बार = 3 मिमी. डेटा A, C और D के लिए समूह प्रति 7-16 चूहों का प्रतिनिधित्व करता है और B के लिए प्रति समूह 3 चूहों और माध्य ± SEM के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । * p = ०.०५, * * p = ०.०१, * * *p = ०.००१, ** * *p < ०.०००१ के बीच संक्रमित (A, B, and D) या असंक्रमित (C) समूह. सांख्यिकीय महत्व mantel-कॉक्स परीक्षण का उपयोग कर निर्धारित किया गया था (एक) और holm-sidak विधि (बी डी), अल्फा = ०.०५ के साथ, और हर बार बिंदु व्यक्तिगत विश्लेषण किया गया था, एक सुसंगत एसडी संभालने के बिना. कृपया यहां क्लिक करें एक बड़ा देखने के लिए इस आंकड़े के संस्करण ।

Figure 4
चित्रा 4: lysm-egfp × MyD88-/ चूहों संक्रमित घावों को दोषपूर्ण न्युट्रोफिल भर्ती है ।
lysm-egfp और lysm-egfp × MyD88-/ चूहों डोर्सम पर एक 6 मिमी घाव प्रशासित और 1 एक्स 107 के साथ संक्रमित किया गया बीओलूमीनिसेंट एस ऑरियस या बाँझ खारा के cfu । जानवरों को मापने के लिए दैनिक imaged थे (A, B) न्यूट्रोफिल सामग्री. (ग) प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियां संक्रमित और गैर-संक्रमित lysm-egfp और lysm-egfp × MyD88-/- चूहों से चित्रित कर रहे हैं । स्केल बार = 5 मिमी. डेटा प्रति समूह 8-16 चूहोंकाप्रतिनिधित्व करते हैं और इसका अर्थ ± SEM. * p < ०.०५, * * p < ०.०१, और * * * p < ०.००१ संक्रमित समूहों के बीच और # # p < ०.०१ के बीच असंक्रमित समूहों (A) या के रूप में व्यक्त कर रहे हैं ग्राफ (ख) पर दर्शाया गया है । सांख्यिकीय महत्व holm-sidak विधि का उपयोग कर निर्धारित किया गया था (एक), अल्फा के साथ = ०.०५, और हर बार बिंदु व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण किया गया था, एक सुसंगत एसडी संभालने के बिना, और एक तरफा anova (बी), tukey के साथ एकाधिक-तुलना परीक्षण के बाद । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

एस ऑरियस संक्रमण मॉडल है कि विवो ऑप्टिकल इमेजिंग में पूरे जानवर की उन्नत तकनीकों के साथ संयोजन के रूप में एक फ्लोरोसेंट न्युट्रोफिल रिपोर्टर माउस में बायोल्मीनिसेंट एस ऑरियस संक्रमण का उपयोग जन्मजात के हमारे ज्ञान उन्नत है संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया । पिछले अध्ययन lysm-egfp माउस का उपयोग करते हुए पता चला है कि अप करने के लिए 1 एक्स 107 संक्रमण के पहले 24 घंटे में एक एस ऑरियस संक्रमित घाव को भर्ती14, और घाव भर्ती न्यूट्रोफिल १.५ दिनों से 5 दिनों के लिए अपने आधे जीवन का विस्तार एक एस ऑरियस-संक्रमित घाव22के जवाब में । संक्रमण से निपटने के लिए चूहों द्वारा अनुकूलित एक उत्तरजीविता रणनीति हेमटोपोइटिक स्टेम और जनक कोशिकाओं (एचएसपीसी) की अस्थि मज्जा से संक्रमित घाव की तस्करी कर रही है, जहां वे जीवाणुनाशक में विस्तार करते हैं+ TLR2/MyD88/ आश्रित रीति21. इसके अलावा, extrametic granulopoiesis एस ऑरियस संक्रमित MyD88-/- चूहों घातक सेप्सिस13से बचाव के लिए न्यूट्रोफिल का एक अनिवार्य स्रोत प्रदान करता है । lysm से hspc के दत्तक स्थानांतरण-egfp चूहों जंगली प्रकार चूहों में यह संभव स्थानीय न्यूट्रोफिल उत्पादन की प्रक्रिया की जांच करने के लिए और एक घाव13,21के भीतर combatting एस. ऑरियस में इसके महत्व को बनाता है । यह भी घाव में न्यूट्रोफिल की संख्या ठीक जांचना संभव है; घावों में न्यूट्रोफिल संख्या 1 एक्स 106 से 1 एक्स 107 से अधिक के लिए egfp सिग्नल के साथ रैखिक को संबद्ध करते हैं, और पता लगाने की सीमा के बारे में है 1 x 106 न्यूट्रोफिल में एक 6 मिमी14घाव.

हमारे प्रतिनिधि परिणामों में हम लिज्म-egfp और lysm-egfp × MyD88-/-के घावों में अनुदैर्ध्य न्यूट्रोफिल और एस ऑरियस कैनेटीक्स की तुलना करते हैं । हमारे ज्ञान के लिए, यह यह पहला अध्ययन है कि बैक्टीरिया का बोझ और जंगली प्रकार और प्रतिरक्षा चूहों के बीच संक्रमण के संकल्प के माध्यम से अनुदैंविम के बीच व्यापार की तुलना करता है । विशेष रुचि के न्यूट्रोफिल भर्ती क्षीणन की डिग्री है MyD88-/- तनाव में एस auरियस संक्रमण की वजह से, जो जंगली प्रकार चूहों में न्यूट्रोफिल तस्करी में एक 15% की कमी हासिल एक ५०% की तुलना में MyD88 में कमी-/ -. एस ऑरियस को परोक्ष रूप से न्युट्रोफिल तस्करी (यानी, α-टॉक्सिन, पैंटन-वेलेंटाइन ल्यूकोसिडिं, और कीमोटैक्सियों निरोधात्मक प्रोटीन23 को बाधित करने के लिए ज्ञात विरूलेंस कारकों की एक संख्या का उत्पादन करके मेजबान की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से बचने में सक्षम है । , 24), और हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि MyD88 संकेतन, TLR2, TLR4, और आईएल-1r के माध्यम से होने की संभावना है, को होस्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं से बचने के लिए एस ऑरियस द्वारा नियोजित रणनीतियों पर काबू पाने के लिए महत्वपूर्ण है । virulence फैक्टर-पीटकर एस ऑरियस उपभेदों इस मॉडल में इस्तेमाल किया जा सकता है पर उनके प्रभाव की विशेषता मायेलॉयड सेल तस्करी13. इसके अलावा, जब lysm-egfp × MyD88-/- माउस के साथ संयोजन के रूप में अध्ययन किया, इस मॉडल के लिए MyD88 की भूमिका पर प्रकाश डाला गया है डाह कारकों के रोगजनक प्रभाव combatting में संकेतन ।

इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम है कि अगर अनुचित तरीके से किया अध्ययन में परिवर्तनशीलता का परिचय कर सकते हैं । घाव और संक्रमण प्रक्रियाओं अन्य माउस रोग मॉडल की तुलना में सीधा कर रहे हैं, लेकिन यह अपनी पेचीदगियों के बिना नहीं है । त्वचा पंच बायोप्सी बहुत तेज हैं और आसानी से त्वचा के नीचे spinotrapezius मांसपेशियों में कटौती कर सकते हैं । इस मांसपेशी और उसके प्रावरणी को नुकसान पहुंचाता है न्यूट्रोफिल भर्ती और चूहों के बीच परिवर्तनशीलता बढ़ जाती है और एक और अधिक आक्रामक एस ऑरियस संक्रमण में एक परिणाम है कि घाव के भीतर केंद्रित नहीं है । स्पिनोट्रापेजियस मांसपेशी को महत्वपूर्ण क्षति के साथ चूहों को पढ़ाई से बाहर रखा जाना चाहिए ।

इस मॉडल में त्रुटि का एक अन्य स्रोत समय के साथ बायोल्मिन्सेंट एस ऑरियस तनाव में परिवर्तन से आता है, जो vivo BLI संकेतों और विकास कैनेटीक्स में बदल सकता है । ALC2906 तनाव में एक शटल प्लाज्मिड होता है जिसमें फोटोरहब्डस luminescens निर्माण से संशोधित लक्स ऑपरेन होता है जो कि बायोलुमीनसेंट संकेतों का उत्पादन करने के लिए आवश्यक होता है, जिसे एस. ऑरियस बैक्टीरिया द्वारा अस्वीकार किया जा सकता है समय के साथ25. चयन के बिना एक शोरबा संस्कृति में, SH1000 कालोनियों के ९७% दिन 3 पर bioluminescent संकेतों का उत्पादन किया । इस आवृत्ति दिन पर 5 और 21% दिन 1026पर ५३% तक गिरा दिया । इस प्रकार, बाद के समय अंक में संक्रामक पाठ्यक्रम के दौरान, vivo BLI संकेतों में संभावना थोड़ा शुरू हो जाएगा (< 1 लॉग अंतर) vivo बैक्टीरियल बोझ में वास्तविक मूल्यवान समझना । यह नीचे एंटीबायोटिक चयन के साथ एस ऑरियस के ताजा ग्लिसरीन स्टॉक्स फ्रीज करने के लिए आगमन पर प्लाज्मिड बनाए रखने और अक्सर (यानी, हर तीन महीने) के नुकसान को रोकने में मदद कर सकते है बैक्टीरिया का काम कर रहे शेयरों की जगह महत्वपूर्ण है संस्कृति के रखरखाव के दौरान बायोल्मिनिसेंट का निर्माण । बायोल्मीनिसेंट एस ऑरियस के नए उपभेदों एक stably एकीकृत bioluminescent27,28 का निर्माण होते है और ALC2906 इस मॉडल में इस्तेमाल किया तनाव पर एक सुधार की संभावना है ।

हालांकि यह मॉडल स्थानीयकृत चमड़े के संक्रमण का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है, यह सीमाएं हैं । बैक्टीरियल बोझ के विवो BLI संकेतों में घाव और आसन्न त्वचा तक सीमित है । मॉडल ऐसे सेप्सिस के रूप में गहरी इनवेसिव संक्रमण के लिए एक विश्वसनीय readout प्रदान नहीं करता है, और पशुओं के खून या गुर्दे13में बैक्टीरिया के प्रसार को मापने के लिए euthanized होना चाहिए । नए और उज्जवल इंजीनियर bioluminescent उपभेदों उत्पन्न किया गया है कि आंतरिक अंगों से vivo BLI संकेतों में का पता लगाने की अनुमति कर सकते हैं27,28. इसके अलावा, न्यूट्रोफिल तस्करी की अनुदैर्ध्य जांच और निगरानी को अन्य सामान्यतः अधिग्रहित एस. ऑरियस संक्रमणों में मापा नहीं जा सकता, जिनमें श्वसन और रक्त संक्रमण शामिल हैं । ऊतक autofluorescence के कारण कम संवेदनशीलता भी इस मॉडल की एक सीमा है । हाल ही में विकसित catchup माउस Ly6G promotion के तहत एक tdtomato rfp का इस्तेमाल करता है और rfp चैनल11में कम ऊतक ऑटो प्रतिदीप्ति के कारण lysm-egfp माउस से शोर अनुपात करने के लिए एक उच्च संकेत हो सकता है.

इस मॉडल में vivo BLI और fli उत्सर्जन संकेतों के बीच संभावित crosstalk चर्चा के योग्य है, लेकिन नगण्य है । हम प्रकाश उत्तेजना के बिना प्रयोगों प्रदर्शन और केवल 520/20 फिल्टर का उपयोग कर vivo fli egfp संकेतों में इकट्ठा करते हैं, हम संक्रमित चूहों से किसी भी प्रशंसनीय संकेतों का पालन नहीं करते, कि एकत्र संकेतों vivo fli egfp संकेतों में से हैं और नहीं से प्रदर्शन बैक्टीरिया के vivo BLI संकेतों में ओवरलैप (डेटा नहीं दिखाया गया है) । यह मुख्य रूप से संकेत संग्रह समय के कारण है, जो vivo fli में केवल 1 सेकंड के लिए और vivo BLI में 1 मिनट के लिए है, और 465/30 एनएम और 520/20 एनएम के उत्सर्जन फिल्टर का एक विशिष्ट उत्तेजना तरंग दैर्घ्य फिल्टर है । ये सेटिंग्स vivo BLI संकेतों में से योगदान के बिना vivo fli egfp संकेतों में इष्टतम खोज के लिए अनुमति देते हैं । यह सबसे अच्छा है जब आंकड़ा 3 डी और चित्रा 4aके बीच y-अक्ष के परिमाण के आदेश की तुलना का प्रदर्शन किया । vivo bli में से संकेतों के बारे में १०० है-egfp संकेतों के vivo fli में से भी कम गुना, यह दर्शाता है कि vivo BLI संकेतों में नगण्य है और के लिए योगदान से कम 1% संकेतों में से मनाया vivo fli ।

हम इस मॉडल के भविष्य के आवेदनों की उंमीद में मदद मिलेगी शोधकर्ताओं को खोजने के लिए और एस ऑरियस डाह कारकों की विशेषता है, और एक पूर्व नैदानिक पशु मॉडल के रूप में काम करने के लिए उपंयास चिकित्सा विज्ञान का परीक्षण है कि स्पष्ट करने के उद्देश्य एस ऑरियस बूस्ट द्वारा संक्रमण जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लॉयड एस मिलर medimmune, फाइजर, regeneron से अनुदान समर्थन प्राप्त हुआ है, और चान जल्द ही-shiong नार्थेलथ फाउंडेशन और नोवेम biotherapeutics से परामर्श फीस और चान जल्द ही-shiong नैन्थेल्थ फाउंडेशन कि काम करने के लिए असंबंधित है रिपोर्ट इस पत्र में । अन्य लेखकों का खुलासा कुछ भी नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम स्वास्थ्य अनुदान R01 AI129302 के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था (s.i.s. करने के लिए) और औषध विज्ञान में प्रशिक्षण कार्यक्रम: बेंच से बिस्तर पर UC डेविस में (nih T32 GM099608 से एल. एस. ए) । कैलिफोर्निया डेविस विश्वविद्यालय में आणविक और जीनोमिक इमेजिंग (cmgi) ने शानदार तकनीकी सहायता प्रदान की ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Falcon 352059
6 mm Disposable Biopsy Punch Integra Miltex 33-36
Bioluminescent S. aureus Lloyd Miller, Johns Hopkins  ALC 2906 SH1000
Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics VWR 10118-938
Buprenoprhine hydrochloride injectable Western Medical Supply 7292 0.3 mg/mL
C57BL/6J Mice Jackson Labratory 000664
Chloramphenicol (crystalline powder) Fisher BioReagents BP904-100
DPBS (1x) Gibco  14190-144
Insulin Syringes Becton, Dickson and Company 329461 0.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'')
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Perkin Elmer 124262
Living Image Software – IVIS Spectrum Series Perkin Elmer 128113
LysM-eGFP Mice Thomas Graff Albert Einstein College of New York  NA
Microvolume Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-2000
MyD88 KO Mice Jackson Labratory 009088
Non-woven sponges AMD- Ritmed Inc A2101-CH 5 cm x 5 cm
Povidone Iodine 10% Solution Aplicare 697731
Prism 7.0 GraphPad Software License 
Tryptic Soy Broth Becton, Dickson and Company 211825

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moran, G. J., et al. Methicillin-Resistant S. aureus Infections among Patients in the Emergency Department. New England Journal of Medicine. 355 (7), 666-674 (2009).
  2. Suaya, J. A., et al. Incidence and cost of hospitalizations associated with Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections in the United States from 2001 through 2009. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 296 (2014).
  3. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T : a Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
  4. Blaser, M. J. Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome. Science. 352 (6285), 544-545 (2016).
  5. Hilliard, J. J., et al. Anti-Alpha-Toxin Monoclonal Antibody and Antibiotic Combination Therapy Improves Disease Outcome and Accelerates Healing in a Staphylococcus aureus Dermonecrosis Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 299-309 (2015).
  6. Proctor, R. A. Recent developments for Staphylococcus aureus vaccines: clinical and basic science challenges. European Cells & Materials. 30, 315-326 (2015).
  7. Mölne, L., Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of Neutrophil Leukocytes in Cutaneous Infection Caused by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 68 (11), 6162-6167 (2000).
  8. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
  9. Borregaard, N. Neutrophils, from Marrow to Microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  10. Miller, L. S., Cho, J. S. Immunity against Staphylococcus aureus cutaneous infections. Nature Reviews Immunology. 11 (8), 505-518 (2011).
  11. Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nature Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
  12. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  13. Falahee, P. C., et al. α-Toxin Regulates Local Granulocyte Expansion from Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Staphylococcus aureus-Infected Wounds. Journal of immunology. 199 (5), Baltimore, Md. 1772-1782 (2017).
  14. Kim, M. -H., et al. Dynamics of Neutrophil Infiltration during Cutaneous Wound Healing and Infection Using Fluorescence Imaging. Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1812-1820 (2008).
  15. Liese, J., Rooijakkers, S. H. M., Strijp, J. A. G., Novick, R. P., Dustin, M. L. Intravital two-photon microscopy of host-pathogen interactions in a mouse model of Staphylococcus aureus skin abscess formation. Cellular Microbiology. 15 (6), 891-909 (2013).
  16. Bogoslowski, A., Butcher, E. C., Kubes, P. Neutrophils recruited through high endothelial venules of the lymph nodes via PNAd intercept disseminating Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2449-2454 (2018).
  17. Takeuchi, O., Hoshino, K., Akira, S. Cutting Edge: TLR2-Deficient and MyD88-Deficient Mice Are Highly Susceptible to Staphylococcus aureus Infection. The Journal of Immunology. 165 (10), 5392-5396 (2000).
  18. Miller, L. S., et al. MyD88 Mediates Neutrophil Recruitment Initiated by IL-1R but Not TLR2 Activation in Immunity against Staphylococcus aureus. Immunity. 24 (1), 79-91 (2006).
  19. Macedo, L., et al. Wound healing is impaired in MyD88-deficient mice: a role for MyD88 in the regulation of wound healing by adenosine A2A receptors. The American Journal of Pathology. 171 (6), 1774-1788 (2007).
  20. Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047 (2012).
  21. Granick, J. L., et al. Staphylococcus aureus recognition by hematopoietic stem and progenitor cells via TLR2/MyD88/PGE2 stimulates granulopoiesis in wounds. Blood. 122 (10), 1770-1778 (2013).
  22. Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117 (12), 3343-3352 (2011).
  23. Foster, T. J. Immune evasion by staphylococci. Nature Reviews Microbiology. 3 (12), 948-958 (2005).
  24. Gordon, R. J., Lowy, F. D. Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection. Clinical Infectious Diseases. 46 (Supplement_5), S350-S359 (2008).
  25. Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047-e1003020 (2012).
  26. Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5 (9), e12580 (2010).
  27. Plaut, R. D., Mocca, C. P., Prabhakara, R., Merkel, T. J., Stibitz, S. Stably Luminescent Staphylococcus aureus Clinical Strains for Use in Bioluminescent Imaging. PLoS ONE. 8 (3), e59232 (2013).
  28. Dillen, C. A., et al. Clonally expanded γδ T cells protect against Staphylococcus aureus skin reinfection. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1026-1042 (2018).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४४ स्टैफिलोकोकस ऑरियस जन्मजात प्रतिरक्षा न्यूट्रोफिल घाव भरने सूजन पूरे-पशु इमेजिंग
<em>स्टैफिलोकोकस ऑरियस</em> संक्रमण के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए एक माउस मॉडल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Anderson, L. S., Reynolds, M. B.,… More

Anderson, L. S., Reynolds, M. B., Rivara, K. R., Miller, L. S., Simon, S. I. A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection. J. Vis. Exp. (144), e59015, doi:10.3791/59015 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter