Summary
皮膚が負傷したに生得の免疫反応のリアルタイム検出とマウスの黄色ブドウ球菌感染症のためのアプローチを説明します。比較する LysM EGFP でマウス (蛍光好中球を所有) する LysM EGFP と交雑免疫不全マウス緊張、感染と戦うための方法の開発や感染症の理解を進めます。
Abstract
黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌) 感染症、メチシリン耐性の汚れを含む、医療システムに大きな負担です。毎年登山黄色ブドウ球菌感染症の罹患率、その病原性の付加的な研究のための要求があります。感染症の動物モデル宿主-病原体反応の理解を進めるし、効果的な治療法の開発に 。好中球は感染を壁し、細菌クリアランスの促進に膿瘍を形成することによって黄色ブドウ球菌感染症を制御する生得の免疫反応の主な役割を果たす黄色ブドウ球菌の皮膚感染症頻繁に潜入する好中球数は病気の結果と関連付けています。強化された緑色蛍光タンパク質 (EGFP) が (主に好中球によって表される) リゾチーム M (LysM) プロモーター領域に挿入を所有する LysM EGFP マウスと組み合わせて使用するとき全体の動物の in vivo 蛍光イメージング (FLI) を提供する、負傷者の肌に非侵襲的縦好中球移住を定量化を意味します。生物発光の黄色ブドウ球菌と組み合わせればひずみと逐次体内全体の動物生物発光イメージング (結合)、縦好中球動員ダイナミクスと体内細菌負荷のサイトの両方を監視することが可能です。解像度や死に感染症の発症から麻酔下マウスでの感染。マウスは、黄色ブドウ球菌によって生成される効果的な植民地化と人への感染を容易にする病原因子の数に優れています。免疫不全マウスは、永続的な黄色ブドウ球菌を調べるより敏感な動物モデルを提供する感染と自然免疫応答を向上させる治療の能力。ここで、黄色ブドウ球菌の皮膚感染を調査する野生型 LysM EGFP マウスと一緒に MyD88 欠損マウス (LysM EGFP × MyD88-/-マウス) に飼育されている LysM EGFP マウスにおける反応を特徴付けます。マルチ スペクトル同時検出体内 FLI、体内のバリを使用して細菌の負荷を使用して好中球動員ダイナミクスの研究を有効に、創傷治癒の長手方向と非侵襲的時間をかけて。
Introduction
黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌)は、皮膚および軟部組織感染症 (SSTIs) アメリカ合衆国1の大半を占めています。発生率のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA) 感染症は、過去二十年以上2、永続化のメカニズムと新しい治療戦略の発見の研究をやる気にさせる着実に増加しました。MRSA 感染症の標準治療は全身抗生物質療法が、MRSA は時間3でますます抗生物質に耐性となっている、これらの薬は、特に否定的な健康への影響を引き起こしているホストの有益なマイクロバイを減らすことができます。子供4。前臨床研究は、MRSA 感染症5を治療するための代替戦略を検討しているが、ホスト免疫反応6を阻止する病原因子の出現のために挑戦を証明している診療所にこれらのアプローチを翻訳します。ドライブ黄色ブドウ球菌SSTIs ホスト病原体のダイナミクスを分析、我々 は非侵襲的結合と好中球数の縦のリードアウト細菌の豊かさの運動対策で傷のベッドに募集し地域を傷します。
好中球は、細菌感染症7の最初の応答と人間の最も豊富な循環白血球です。好中球は、機能的反応抗菌ペプチド、プロテアーゼ活性酸素種の生産を含む彼らの殺菌メカニズムによる黄色ブドウ球菌の感染症に対して有効なホスト応答のために必要なコンポーネント貧食能および好中球細胞外トラップ生産8,9を含みます。慢性肉芽腫症とベイジュ症候群などの好中球機能の遺伝的欠陥の人間の患者は、黄色ブドウ球菌感染に対する感受性の増加を表示します。さらに、患者 (先天性好中球減少症) など遺伝的と (化学療法の患者に見られる好中球減少症) など取得した好中球数の欠陥も非常に受けます黄色ブドウ球菌感染症10。黄色ブドウ球菌感染症をクリアするに好中球の重要性を考えると、免疫能力を高めることや、黄色ブドウ球菌の病変内で自分の番号をチューニングは、感染症を解決する効果的な戦略を証明するかもしれない。
過去 10 年間、人身売買の11,12を勉強するトランスジェニック マウスに蛍光好中球記者が開発されてきました。好中球レポーター マウスの全体の動物のイメージング技術を組み合わせて組織や臓器における好中球の時空間解析を許可します。黄色ブドウ球菌の生物発光菌株と組み合わせると、黄色ブドウ球菌の豊かさへの応答における好中球の集積を追跡することが可能だし、細菌の病原性のコンテキストで永続化および間接的要因影響を受ける組織13,14,,1516で好中球数を混乱させます。
マウスが人間よりも黄色ブドウ球菌の病原性と免疫回避機構を受けないです。野生型マウスが理想的な動物モデルの有効性を調査するためにできない場合がありますなど、慢性的な黄色ブドウ球菌の治療に治療を与えて感染。MyD88 欠損マウス (すなわち、MyD88-/-マウス)、機能的なインターロイキン 1 受容体 (IL-1 r) および Toll 様受容 (TLR) シグナリング、ショー大きい感受性と比較すると黄色ブドウ球菌の感染もない免疫不全マウス緊張野生型マウスの17と18皮膚黄色ブドウ球菌感染症のサイト売買は好中球の機能障害。MyD88-/-マウスの好中球蛍光レポーターを所有しているマウス緊張の開発は、現在好中球に比べて黄色ブドウ球菌感染症を治療する治療法の有効性を調査するための代替モデルを提供してレポーター マウス。
このプロトコルでは、免疫不全 LysM EGFP × MyD88-/-マウスで、黄色ブドウ球菌感染症の特徴し、経過と感染する LysM EGFP マウスの解像度を比較します。LysM EGFP × MyD88-/-マウスの開発が解決しない、慢性的な感染、感染 8 日後に 75% が負けます。初期好中球動員に重要な欠陥が発生する感染症の炎症期の 72 時間以上と 50 パーセントより少数の好中球は感染の後半段階で募集します。-/-マウスは、この特定 MyD88 ひずみ現在に比べて黄色ブドウ球菌感染症をターゲットと新しい治療技術の有効性を評価するための厳格な前臨床モデル LysM EGFP × の感受性の増加モデルします。野生型マウス、特に感染に対する自然免疫応答を高めることを目指し技術を活用します。
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Protocol
すべてのマウスの研究を行った機関動物ケアとカリフォルニア大学デービス校で利用委員会によって承認され、動物福祉法と健康の研究延長行為のガイドラインに従って行われました。必ず動物を操作するときは、滅菌手袋を使用してください。
1. マウスのソースと住宅
- 派生する LysM eGFP マウス c57bl/6 j の遺伝的背景に12を前述のよう。LysM EGFP × MyD88-/-マウスで横断する LysM EGFP マウス c57bl/6 j 背景に MyD88-/-マウスを派生します。
- 家のマウス飼育箱で。これらの研究は、カリフォルニア大学デイビスと単一の建物次の外科の前にグループの動物で収容されました。10-16 週間の年齢間のマウスを使用します。
2. 細菌の準備と定量化
- 削除、発光から-80 ° C の記憶域の氷の融解の興味の黄色ブドウ球菌のひずみ。5% ウシ血液寒天培地プレート上で止めた。縞板 37 ° C 一晩 (16 h) で加湿のインキュベーターで孵化させなさい。
注: このプロトコル ALC2906 SH1000 ひずみが使用されました。この株には、 luxABCDE記者カセットPhotohabdus luminescens18から融合したペニシリン結合蛋白質 2 のプロモーターとのシャトル プラスミド pSK236 が含まれています。 - TSB 粉末、純粋な水とオートクレーブ滅菌に TSB の mL あたり 0.03 g を混合することによってトリプシン大豆スープ (TSB) を準備します。冷却、生殖不能の技術を使用して、必要に応じて抗生物質を追加します。このプロトコルでは生物発光 luxABCDE カセットが含まれています pSK236 シャトル プラスミドの表現の選択に TSB にクロラムフェニ コール18の 10 μ G/ml を追加します。
- 一晩かけて培養を開始する 10 μ G/ml のクロラムフェニ コールと TSB に黄色ブドウ球菌プレートから 3-4 独立したコロニーを拾います。37 ° C 一晩 (16 h) でインキュベーター シェーカーで細菌を孵化させなさい。
- TSB に 10 μ g/mL クロラムフェニ コールで、サンプル 1:50 を薄めて一晩文化から新しい細菌の培養を開始します。200 rpm および 37 ° C でインキュベーター シェーカーの文化
- 黄色ブドウ球菌を分割した後 2 時間監視光学密度 600 nm (外径600) 分光光度計に。外径600半ば対数相成長を見つけるために時間対を観察します。ALC2906 SH1000 株 0.5 の外径600は中旬対数であり、1 × 108 CFU/mL (図 1) の濃度に対応します。
- 外径600が 0.5 と、冷たい DPBS と 1:1 細菌を洗浄します。遠心分離機 3,000 x gと 4 ° C で 10 分間の細菌慎重に上清をデカントし、追加チルド DPBS と渦を徹底的に追加します。もう一度 3,000 x gと 4 ° C で 10 分間遠心
- 上清をデカント慎重に。必要な濃度で細菌のペレットを再懸濁します。これらの研究の ALC2906 SH1000 3 mL を収集し、1.5 mL の PBS、約 2 × 108 CFU/mL の細菌濃度に相関関係で再懸濁します。使用するまで氷の上の細菌を保ちます。
- 細菌濃度を確認の細菌サンプル 1: 10,000、1: 100,000 の PBS 100 μ L を希釈します。寒天プレート 20 μ 因数。総検査で 37 ° c 16 h. カウント CFUs の加湿インキュベーターで孵化し、細菌濃度の次の日を計算します。
3. 切除皮膚傷害と黄色ブドウ球菌の接種
- 0.03 mg/mL ブプレノルフィン塩酸塩 (~0.2 mg/kg) の 100 μ L を各腹腔内投与によるマウスに管理します。
- 20 分後注入、2-4% イソフルランと 2-3 LPM 酸素と商工会議所の場所 2-4 マウス。マウスは完全に麻酔が、かつては、2-3 LPM 2-4% イソフルランと酸素に鼻の円錐形を一度に 1 つずつ接続してマウスを転送します。マウスは完全に各後部足の親指と人差し指の間をしっかりとつまんで麻酔確認してください。動物がピンチに応答しない場合は、次の手順に進みます。
- マウスの背面に 2 インチのセクションで 1 インチを電気バリカンで剃るし、きれいなワイプやガーゼを使用して毛皮切り抜き領域をクリアします。過剰な炎症を引き起こす可能性があります脱毛ローションを使用しないでください。
- きれいなマウスの戻る最初 10% ポビドン ヨードを浸したガーゼとし、70% エタノールを浸したガーゼ。外科領域の中心から外側へ移動、螺旋状の部分をきれいに。手術前に乾燥する外科の領域の約 1 分を待ちます。
-
2 本の指の間に緩くマウス裏剃毛押しながらしっかりと準備の外科領域の中心に滅菌 6 mm のパンチ生検。ピンと張った皮膚が引っ張らないででした。
- アウトラインの少なくとも 1 つのセクションで皮膚を完全にカットのある皮膚に円形のアウトラインを作成するパンチ生検をねじる。基になる筋膜や組織を切らないように注意してください。
- 表皮と真皮パンチ生検によって捺印円形パターンをカットする滅菌はさみとピンセットを使用します。
4. s.球菌接種
- 目的の生物発光の乳酸菌で 28 G インスリン注射器を満たしなさい。本研究では 1 × 108 CFU/mL の濃度を管理 (50 μ L)。以上 100 μ L のボリュームを管理しないでください。
-
筋膜とで、マウスの背中に傷の中心組織と乳酸菌の 50 μ L を注入します。乳酸菌が漏れを最小限または分散で傷の中心に気泡を形成することを確認します。
- 側に真皮をプル、注射器を組織にほぼ平行に持ち、筋膜の穿孔を示す抵抗の急激な減少が感じられるまで、組織に注射器をゆっくりとプッシュします。慎重に傷の中心に注射器をリードし、ゆっくりと乳酸菌を分配します。動物からゆっくりと注射器を削除します。
- 上記のように感染していない動物の傷に滅菌 PBS の同じボリュームを挿入します。
- 動物を檻に戻ります。熱ランプの下でまたは加熱パッドの上にケージを置き、麻酔から回復まで動物を監視します。
5、Vivo バリと FLI
- 計測器のソフトウェアを介して全体の動物の撮像素子を初期化します。2-3 LPM 2-4% イソフルランと酸素を受けて商工会議所でマウスを麻酔します。撮像素子の内部 nosecones に麻酔を提供します。
-
撮像素子に負傷者や感染したマウスを配置します。傷ができるだけ平らになるようにマウスを配置します。以下のシーケンス設定を使用して、マウスをイメージします。
- 画像のモードとして発光し、写真を選択します。露出時間は 1 分小さなビニングし F/ストップ 1 (発光) と F/停止 8 (写真)。排出フィルターはオープンです。画像を記録するには、取得をクリックします。
- 画像のモードとして蛍光と写真を選択します。露出時間は 1 s で小さなビニングと F/停止 1 (蛍光) と F/停止 8 (写真) 465/30 の励起波長 nm と高いランプの強度と発光波長 520/20 nm。画像を記録するには、取得をクリックします。
- 動物を麻酔から回復までのケージとモニターに戻します。
- イメージとしてのマウス毎日説明上記。
6. 画像解析
- 開いている画像を定量化します。
- 利益 (率 ROI) の大きな円形の領域を画像でそれぞれのマウスの皮膚を含めて全体の創傷部にかぶせます。好中球生体内信号の FLI EGFP と体内のバリ黄色ブドウ球菌信号の数日後傷の端を越えて拡張 (図 2 aおよび2 b) これらの研究に含まれていた。測定の投資収益率と各マウス乱流熱フラックスのレコードの値をクリックします。各信号 (p/s)対時間の乱流熱フラックスをプロットします。
-
好中球や傷に黄色ブドウ球菌の絶対数が必要な場合は、次の実験を行います。
- 体内の FLI EGFP 信号に好中球数を関連付ける、前述のように、c57bl/6 j マウスを傷し、LysM EGFP または LysM EGFPxMyD88-/-ドナーから骨髄由来の好中球 (1 x 1075 5 x 10) の範囲を転送直接上にさまざまな傷。イメージとして記載されている上記と相関体内 FLI EGFP は好中球の既知量に通知します。
- 体内のバリ信号黄色ブドウ球菌CFU を関連付ける、傷し、上記のマウスに感染します。1 日目感染後レコード生体内でバリの信号にマウスから、すぐに安楽死させる、死体を冷やしなさい。傷を切除、組織を均質化し、一晩インキュベートの寒天培地に細菌希釈液をプレートします。次の日、傷口あたり CFU の決定にコロニーをカウントします。
- 傷のエッジと傷 (cm2) の測定領域を創傷治癒フィット円形 ROI を測定し、対時間 (図 2) のベースラインから分数変化をプロットします。
7. 統計
注:すべてのデータが表示されますを意味 ±SEM p < 0.05 は、統計的に有意と考えられていた。
- ホルム Sidak メソッドを使用して 1 日に 2 つのグループ間の違いを決定する、α = 0.05、および一貫性のある SD を仮定しない時間の各ポイントを個別に分析
- テューキーの多重比較, 事後に一方向の分散分析によって同じ日に複数のグループ間の違いを比較します。マントルピース コックスによる実験群間の生存率を調べた。
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Representative Results
LysM EGFP × MyD88-/-マウスは LysM EGFP マウスよりも黄色ブドウ球菌感染症の影響を受けやすい
黄色ブドウ球菌における ALC290618,使用のひずみは、ライブと積極的に代謝の細菌から発光信号を作り出すルクスコンストラクトを含むプラスミドで構成しました。マウスに接種した場合、縦感染した傷内の細菌負荷を測定する体内生物発光イメージング技術の (結合) を使用できます。LysM EGFP × MyD88-/-マウスとする LysM EGFP マウスの両方が負傷し、1 x 107 CFU 傷に黄色ブドウ球菌感染症への感受性を比較する、黄色ブドウ球菌に感染しています。LysM EGFP × MyD88-/-マウスは感染する LysM EGFP マウスの 0% の致死率と比較して感染の最初の 8 日間-/-マウスの LysM EGFP × MyD88 の 80% の致死率によって示される LysM EGFP マウスより大きい感受性を示した、実験 (図 3 a) の 15 日間の期間を全体。マウスの両系統が感染、~ 5% の体重を失ったが、LysM EGFP × MyD88-/-マウスは、体重 (図 3 b) を回復しなかった間、LysM EGFP マウスが 2 日目で元の重量を回復します。黄色ブドウ球菌感染症の存在下での創傷閉鎖 2 系統間差は認められなかったただし、薬液負傷する LysM EGFP × MyD88-/-は、以前に報告された19として LysM EGFP マウス (図 3) と比較しての創傷治癒における重大な欠陥を持っていた。全体の動物画像が毎日、細菌の負荷を測定する使用されたいたし、1 日も早く LysM EGFP × MyD88-/-傷 LysM EGFP 傷より高い細菌負担。LysM EGFP マウスは感染を制御し、LysM EGFP × MyD88-/-マウスは (図 3 D、E) 動物の死に至るまで 4 日に頭打ちになった細菌の負担の増加を展示傷、バリ信号を生体内で減少しました。一緒に、これらのデータは、LysM EGFP マウスと比較された黄色ブドウ球菌の感染する LysM EGFP × MyD88-/-マウスの感受性の増加を示しています。
好中球の人身売買が損なわれる黄色ブドウ球菌に感染する LysM EGFP マウスに比べて LysM EGFP × MyD88-/-マウス
LysM EGFP マウスを生成するエンコードされた EGFP タンパク質による蛍光好中球緑リゾチーム M プロモーター12の下流。このマウスは、皮膚ブドウ球菌に対して縦体内好中球人身売買の研究に利用されている感染症13,14,20,21,22。背部、投与した 6 mm の完全な厚さの皮膚創傷 LysM EGFP と LysM EGFP × MyD88-/-マウスの傷に好中球反応を比較してマウスを毎日イメージしました。LysM EGFP × MyD88-/- (図 4 a, C) LysM EGFP マウスに比べて傷売買は好中球の 40% の減少が観察されました。1 x 107 CFU の黄色ブドウ球菌は、負傷後すぐに導入された、マウスの両系統で減衰された好中球人身売買が LysM EGFP × MyD88-/-マウスの黄色ブドウ球菌感染に対する感受性が高かった好中球動員を尊重します。初期好中球に比べて 15% 減少 (図 4 b) LysM EGFP 傷の観察する LysM EGFP × MyD88-/-傷に人身売買の 50% を引き起こされる感染症を減少させます。LysM EGFP マウスも感染症 (図 4 a,C) LysM EGFP × MyD88-/-マウスに比べて、好中球の数を増やすことができませんでしたの後の段階で傷口にはる好中球を募集でさえも、持続的な細菌負荷の存在。一緒に、これらのデータは、LysM EGFP × MyD88-/-マウス黄色ブドウ球菌感染症への感受性の増加と一致している好中球の動員に欠陥があることを示しています。
図 1: 外径600 CFU との相関は、ALC2906 のカウントします。3 4 ALC2906 SH1000 コロニーを寒天プレートから採取し、一晩かけて培養の 10 μ G/ml のクロラムフェニ コールと TSB に転送します。次の日、懸濁液 10 μ G/ml クロラムフェニ コールと TSB に 1:50 を分割され、培養します。光学密度 600 nm (外径600) を分光光度計を使用して 2 時間の規則的間隔で測定しました。各測定細菌氷冷 PBS で一晩インキュベートの寒天プレート上に検体希釈 1: 100,000 であった。CFUs 初期濃度を計算する次の日を数え、外径600相関します。N = 4 異なる外径600の測定実験.あたり 3この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: データ解析のための利益 (ROIs) の代表的な地域です。傷口に中心と同等のサイズ ・ ロワ体内バリと体内 FLI 信号、大きく、分析して、全光束 (1 秒あたり光子) を測定しました。傷の閉鎖を測定する投資収益率だった傷の端に合わせて、エリア (cm2) を測定しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: LysM EGFP × MyD88-/-マウスは、LysM EGFP マウスと比較された黄色ブドウ球菌の感染症になりやすい。LysM EGFP と LysM EGFP × MyD88-/-マウス投与した 6 mm の背部傷し、1 x 107 CFU 発光黄色ブドウ球菌や滅菌生理食塩水で感染します。動物が毎日監視し、生存率 (A) と (B) 重量を記録しました。動物を毎日創傷サイズの測定 (C) と (D) 細菌発光をイメージしました。(E) 代表的な発光イメージは感染する LysM EGFP と LysM EGFP × MyD88-/-マウスから描かれています。スケール バー = 3 mm データは a、C、グループごとの 7-16 マウスを表し、D とあたりのマウスを 3 グループ B の平均 ±SEM として表現されます * p = 0.05 * * p = 0.01 * * *p = *p < 0.0001 0.001 間感染 (A、B、 とD) または (C) グループを感染していないようです。マントルピース コックス テスト (A) と (B D) ホルム Sidak 法を用いた統計的有意性を求めた α = 0.05 とそれぞれ時間のポイントは一貫性のある SD.してくださいここをクリックして、拡大表示すると仮定することがなく個別に分析しました。この図のバージョン。
図 4: LysM EGFP × MyD88-/-マウスは、感染した傷に欠陥のある好中球動員をあります。
LysM EGFP と LysM EGFP × MyD88-/-マウス投与した 6 mm の背部傷し、1 x 107 CFU 発光黄色ブドウ球菌や滅菌生理食塩水で感染します。動物 (a, B) 好中球コンテンツを測定する毎日をイメージしました。(C) 代表的な蛍光イメージは、感染・非感染する LysM EGFP と LysM EGFP × MyD88-/-マウスから描かれています。スケール バー = 5 mm しますデータを表すグループごとの 8-16 マウスと平均 ±SEM として表現されます * p < 0.05 * * p < 0.01 と * * * p < 0.001 間感染グループと# p < 0.01 間感染グループ (A) または、。グラフ (B) に描かれています。統計的有意性はホルム Sidak メソッド (A) を使用した α = 0.05 とそれぞれ時間のポイントは一貫性のある SD と一方通行 ANOVA (B) を仮定しない、個別に分析したテューキーの多重比較事後テスト。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
利用する発光黄色ブドウ球菌黄色ブドウ球菌感染症モデル全体の動物インビボ光イメージング技術の高度な技術と組み合わせて蛍光好中球レポーター マウスの感染が生得の知識を高度な感染に対する免疫応答。LysM EGFP マウスを使った過去の研究はことを感染症の最初の 24 時間の上の黄色ブドウ球菌感染した傷口に 1 x 107好中球リクルートに14、および好中球の傷募集拡張その半減期 1.5 日から 5 日に示されています。黄色ブドウ球菌に対応-傷22を感染しています。マウス感染と戦うために適応生き残り戦術は TLR2/MyD88/PGE2における好中球 EGFP+殺菌し、骨の髄から感染した傷口に造血幹・前駆細胞 (HSPC) 人身売買します。依存的21。さらに、黄色ブドウ球菌を救出する好中球の必須ソース感染致死的な敗血症13から MyD88-/-マウス髄コイを提供します。野生型マウスにする LysM EGFP マウスから HSPC の養子の転送では、好中球の現地生産のプロセスと傷13,21内で黄色ブドウ球菌の闘いにおけるその重要性を確認可能です。また、正確に傷口の好中球の数を調整することが可能です。傷の好中球数は EGFP 信号が 1 × 106から 1 x 107好中球より大きいと直線的相関の検出限界は約 1 × 106 6 mm 傷14好中球.
代表的な実績では、縦方向の好中球と LysM EGFP と LysM EGFP × MyD88-/-の傷に黄色ブドウ球菌の動態を比較します。私たちの知る限り、これは細菌負荷および好中球の野生型と感染の解像度を介して縦免疫不全マウスの人身売買を比較するこの最初の研究です。特に興味深いは、MyD88-/-ひずみ、MyD88 の 50% の減少と比較して野生型マウスにおける好中球人身売買で 15% の減少を誘発した黄色ブドウ球菌の感染によって引き起こされる好中球動員減衰の程度-/-.黄色ブドウ球菌は直接ない (すなわち, α-毒素、パントン ・ バレンタイン ・ ロイコシジン、および走化性阻害蛋白質23に好中球の人身売買を抑制する知られている病原因子の数を生産することによってホストの免疫反応を回避することが,24) および MyD88 伝達可能性 TLR2、TLR4、IL-1 r、黄色ブドウ球菌によるホストの免疫反応を回避するために採用戦略を克服するために重要であることが示唆します。病原性因子ノックアウト黄色ブドウ球菌に及ぼす影響骨髄球系細胞人身売買13を特徴付けるためこのモデルで系統を使用することができます。さらに、LysM EGFP × MyD88-/-マウスと併せて検討、このモデルには、MyD88 の病原因子の病原性の影響と闘うをシグナリング役割が強調表示されます。
正しく行われて研究に可変性を導入することがこのプロトコルのいくつかの重要な手順があります。他マウス病態モデルと比較して負傷と感染の手順は簡単ですが、それではなく、その複雑。皮膚パンチ生検は非常に鋭いし、spinotrapezius 筋皮膚の下に簡単にカットすることができます。この筋肉とその筋膜損傷好中球動員を変更し、マウスと傷の内で中央に配置より侵襲性黄色ブドウ球菌感染症の結果の変動を増加します。Spinotrapezius 筋肉に大きなダメージを持つマウスは、研究から除外すべき。
このモデルでエラーの別のソースは、発光の変化から体内のバリ信号と成長カイネティクスに変更することが時間をかけて黄色ブドウ球菌株。ALC2906 ひずみを含む黄色ブドウ球菌の細菌によって破棄できる発光信号を生成するために必要なPhotorhabdus luminescensの構成から変更されたluxオペロンを含むシャトル プラスミド時間25以上。選択なしスープ文化、SH1000 コロニーの 97% は、3 日目に発光信号を生産しました。この周波数は、5 日目に 53% に低下したと 10 日目の26日 21%。したがって、感染中に後の時間ポイントで体内のバリ信号可能性が高いに開始されます少し (< 1 ログ違い) 実際体内細菌負荷を過小評価します。到着時と細菌の株式を働いているをよく交換プラスミドを維持するために抗生物質の選択と黄色ブドウ球菌の新鮮なグリセロールを凍結することが重要だ (つまり, 3 ヵ月ごと) の損失を防ぐことができます、文化の保守中に発光の構造体。発光黄色ブドウ球菌の新しい系統は安定して統合された発光構造27,28を含みこのモデルで使用される ALC2906 のひずみから、改善されている可能性が高い。
このモデルはローカライズされた皮膚黄色ブドウ球菌の研究に有用、感染症の制限があります。細菌負荷の生体内でのバリの信号は、傷や隣接する皮膚に限られます。モデル、敗血症など深い侵襲性感染症のため信頼性の高い読み出しを提供せず、13の血流や腎臓に細菌の普及を測定する動物を安楽死する必要があります。新しい、明るく設計された発光菌株を生成されている内臓27,28から体内のバリ信号の検出を許可します。また、縦方向の検出および好中球人身売買の監視その他の測定できない一般的呼吸器を含む黄色ブドウ球菌の感染し、血液感染。組織の自家蛍光による感受性の低下もこのモデルの制限です。最近開発されたケチャップ マウスが Ly6G プロモーター TdTomato RFP を利用し、可能性がありますがため LysM EGFP マウスより高い信号対雑音比減少組織自動蛍光 RFP チャネル11で。
このモデルで生体内でバリや FLI 発光信号間の潜在的なクロストークが議論に値するものはごくわずか。光励起によらない実験を行うし、のみ 520/20 フィルターを用いた生体内での FLI EGFP 信号を収集、我々 従わない感染マウスからの信号をかなり収集した信号が体内の FLI EGFP 信号からである証明(データは示されていない) 菌体内のバリ信号の重なり。これは主に体内 FLI と生体内でバリの 1 分、520/20 465/30 nm、発光フィルターの特定の励起波長フィルターの唯一の 1 秒は、信号のコレクション時間 nm。これらの設定は、体内のバリ信号から貢献することがなく体内の FLI EGFP 信号の最適な検出を実現します。これが最高の3 D 図と図 4 aの y 軸の順序の大きさを比較するときに実証します。体内のバリからの信号は体内のバリ信号無視できる体内 FLI から観測された信号の 1% 未満に貢献することを示す、体内の EGFP FLI 信号より約 100 倍少ないです。
我々 はこのモデルの将来のアプリケーションに役立つ研究者の発見し黄色ブドウ球菌の病原因子の特徴し、治療薬をテストするための前臨床動物モデルとして機能を高めることによって黄色ブドウ球菌感染症をクリアすることを目指す期待、生得の免疫反応。
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Disclosures
ロイド S ミラー MedImmune、ファイザー、Regeneron、およびちゃんすぐ Shiong Nanthealth 財団、報告される作業とは無関係な Noveome 伸びて、ちゃんすぐ Shiong Nanthealth 財団からコンサルティング料から助成を受けています。この稿では。他の作家が何を開示するあります。
Acknowledgments
この作品は、国立機関の健康補助金 R01 AI129302 (S.I.S.) と薬理学のトレーニング プログラムによって支持された: に枕元にはカリフォルニア大学デービス校でベンチから (NIH T32 GM099608 L.S.A に)。分子・ ゲノム イメージング (CMGI) カリフォルニア大学デービス校では、優れた技術サポートを提供しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352059 | |
| 6 mm Disposable Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| Bioluminescent S. aureus | Lloyd Miller, Johns Hopkins | ALC 2906 SH1000 | |
| Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics | VWR | 10118-938 | |
| Buprenoprhine hydrochloride injectable | Western Medical Supply | 7292 | 0.3 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labratory | 000664 | |
| Chloramphenicol (crystalline powder) | Fisher BioReagents | BP904-100 | |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Insulin Syringes | Becton, Dickson and Company | 329461 | 0.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'') |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software – IVIS Spectrum Series | Perkin Elmer | 128113 | |
| LysM-eGFP Mice | Thomas Graff Albert Einstein College of New York | NA | |
| Microvolume Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| MyD88 KO Mice | Jackson Labratory | 009088 | |
| Non-woven sponges | AMD- Ritmed Inc | A2101-CH | 5 cm x 5 cm |
| Povidone Iodine 10% Solution | Aplicare | 697731 | |
| Prism 7.0 | GraphPad Software | License | |
| Tryptic Soy Broth | Becton, Dickson and Company | 211825 |
References
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