Summary
Bir yaklaşım Kutanöz yaralama için doğuştan gelen bağışıklık yanıtının gerçek zamanlı algılama ve Staphylococcus aureus enfeksiyon farelerin için tanımlanır. Karşılaştırma LysM-EGFP tarafından (floresan nötrofil sahip) fareler LysM EGFP ile immünyetmezligi fare zorlanma olacak, biz anlayışımız enfeksiyon ve enfeksiyon mücadele için yaklaşımlar gelişimi önceden.
Abstract
Staphylococcus aureus (S. aureus) enfeksiyonları, metisiline dirençli lekeler, dahil olmak üzere sağlık sistemi üzerinde büyük bir yük vardır. Her yıl tırmanma S. aureus enfeksiyonu insidans hızları ile onun patojen ek araştırma için bir talep vardır. Ana bilgisayar-patojen yanıt bizim anlayışı ilerletmek ve etkili tedavi gelişmesine yol bulaşıcı hastalık hayvan modelleri. Nötrofil S. aureus enfeksiyonları abse enfeksiyonla duvar ve bakteriyel Gümrükleme kolaylaştırmak için oluşturarak denetler doğuştan gelen bağışıklık yanıtı bir birincil rol oynamaktadır; bir S. aureus deri enfeksiyonu genelde sızmak nötrofil sayısı hastalık sonucu ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. (Öncelikle nötrofil tarafından ifade edilir) lizozim M (LysM) organizatörü bölge takılı gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) sahip, LysM-EGFP fareler ile birlikte kullanıldığında içinde vivo bütün hayvan Floresans görüntüleme (FLI) sağlayan bir nötrofil göç Noninvazif ve boyuna miktarının yaralı deri içine anlamına gelir. Kollarındaki S. aureus ile birleştirildiğinde zorlanma ve sıralı içinde vivo bütün hayvan kollarındaki görüntüleme (BLI), boyuna nötrofil işe alım dinamikleri ve içinde vivo bakteri yükü yerinde izlemek mümkün olduğunu enfeksiyon çözünürlük veya ölüm enfeksiyon başlangıcı üzerinden imzalat farelerde. Fareler etkili kolonizasyon ve enfeksiyon insanlarda kolaylaştırmak virülans faktörleri S. aureus tarafından üretilen bir dizi daha dayanıklıdır. İmmünyetmezligi fareler sağlar kalıcı S. aureus incelemek için daha duyarlı hayvan modeli enfeksiyonlar ve tedavi yeteneği doğuştan gelen bağışıklık yanıtı artırmak için. Burada, S. aureus Cilt yara enfeksiyonu araştırmak için vahşi-LysM-EGFP farelerde tip birlikte yanıt-e doğru MyD88-eksik fareler (LysM-EGFP × MyD88- / - fareler) için yetiştirilen LysM-EGFP farelerde karakterize. Spektral eş zamanlı algılama çalışma nötrofil işe alım dinamiği içinde vivo FLI, içinde vivo BLI, kullanarak bakteri yükü kullanarak etkin ve boyuna ve Noninvazif zamanla iyileşmesi.
Introduction
Staphylococcus aureus Deri ve yumuşak doku enfeksiyonları (SSTIs), Amerika Birleşik Devletleri1çoğunluğu (S. aureus) hesapları. Görülme sıklığı metisiline dirençli S. aureus (MRSA) enfeksiyonlar giderek insan sebat mekanizmaları ve yeni tedavi stratejileri keşfi motive son yirmi yılda2, artmıştır. Standart tedavi MRSA enfeksiyonları için sistemik antibiyotik tedavisi, ama MRSA süresi3 giderek antibiyotiklere dirençli hale gelmiştir ve bu ilaçlar özellikle olumsuz sağlık etkileri, neden ana bilgisayarın faydalı microbiome düşürebilir Çocuk4. Preklinik çalışmalar MRSA enfeksiyonları5tedavi etmek için alternatif stratejiler inceledik ama bu yaklaşımlar kliniğe çeviren konak immün yanıt-e doğru6önlemek virülans faktörleri ortaya çıkması nedeniyle zorlu kanıtlamıştır. Ana bilgisayar-patojen dynamics bu sürücüyü S. aureus SSTIs incelemek için biz noninvaziv birleştirmek ve nötrofil sayısının boyuna dökümanları yara yatağına bakteriyel bereket Kinetik ölçüleri ile işe ve alanına yara.
Nötrofil en bol dolaşımdaki akyuvar insanlar ve ilk yardım ekipleri bir bakteriyel enfeksiyon7vardır. Nötrofil S. aureus enfeksiyonlar Reaktif oksijen türleri, proteaz, antimikrobiyal peptidler ve fonksiyonel yanıt üretimi dahil olmak üzere bakterisidal mekanizmaları nedeniyle karşı etkili ana müdahale için gerekli bir bileşeni vardır fagositoz ve nötrofil hücre dışı tuzak üretim8,9dahil olmak üzere. İnsan gibi kronik granulomatous hastalığı ve Chediak-Higashi sendromu, nötrofil işlevindeki genetik kusurların hastalarda S. aureus enfeksiyon bir artış duyarlılık gösterin. Buna ek olarak, hastaların genetik (örneğin Konjenital Nötropeni) ve Edinsel (Nötropeni kemoterapi hastalarda görülen) gibi kusurları nötrofil rakamlarla da S. aureus enfeksiyon10' a son derece açıktır. S. aureus enfeksiyonlar takas nötrofil önemi göz önüne alındığında, bağışıklık kapasitelerinin artırılması veya sayıları S. aureus lezyon içinde ayarlama enfeksiyon çözümünde etkili bir strateji ispat edebilir.
Son on yıl içinde Floresans nötrofil muhabirlerle transgenik fareler onların ticareti11,12incelemek için geliştirilmiştir. Nötrofil muhabir fareler bütün hayvan görüntüleme teknikleri ile birleştirerek kronolojik zamanmekansal analiz nötrofil doku ve organlarında izin verir. S. aureuskollarındaki suşları ile birleştirildiğinde, S. aureus bereket karşılık olarak nötrofil birikimi izlemek mümkündür ve sebat bakteriyel virülans bağlamında doğrudan ve dolaylı olarak faktörler etkilenen doku13,14,15,16nötrofil numaraları huzursuz.
Fareler S. aureus virülans ve bağışıklık kaçırma mekanizmaları için insanlardan daha az duyarlı değildir. Bu nedenle, farelerde vahşi-tip etkinliğini araştırmak için ideal bir hayvan modeli olmayabilir bir kronik S. aureus tedavisi için tedavi verilen enfeksiyon. MyD88-eksik fareler (yani, MyD88- / - fareler), fonksiyonel interleukin-1 reseptör (IL-1R) ve sinyal, Toll benzeri reseptör (TLR) göre S. aureus enfeksiyon Haritayı büyük duyarlılık yoksun bir immün fare zorlanma farelerde vahşi-tip17 ve18cilt S. aureus enfeksiyon bir siteye nötrofil kaçakçılığı bir bozulma. Floresan nötrofil muhabir MyD88- / - farelerde sahip bir fare yük gelişimi için geçerli nötrofil karşılaştırıldığında S. aureus enfeksiyon tedavisinde terapiler etkinliğinin araştırılması için alternatif bir model sağlamıştır muhabir fareler.
Bu iletişim kuralı ' S. aureus enfeksiyon farelerde immün LysM-EGFP × MyD88- / - karakterize ve zaman ders yapmak ve enfeksiyon LysM-EGFP fareler ile karşılaştırın. LysM-EGFP × MyD88- / - fareler does değil karar vermek bir kronik enfeksiyon geliştirmek ve % 75 enfeksiyon 8 gün sonra yenik düşer. İlk nötrofil işe alım önemli bir üründe 72 h enfeksiyon inflamatuvar aşamasının üzerinden oluşur ve % 50 daha az sayıda nötrofil enfeksiyon ikinci aşaması sırasında işe. - / - Fareler bu belirli yapar MyD88 zorlanma S. aureus enfeksiyon için geçerli göre hedefleme yeni tedavi teknikleri etkinliğini değerlendirmek için titiz preklinik modeli LysM-EGFP × artan duyarlılık modelleri vahşi tipi fareler, özellikle enfeksiyon karşı doğuştan gelen bağışıklık yanıtı artırmak amaçlayan teknikleri kullanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm fare çalışmalar incelendi ve kurumsal hayvan bakım ve UC Davis kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve hayvan refahı Yasası ve Sağlık Araştırma uzantısı Yasası kurallarına göre yapıldı. Steril eldiven hayvanlarla çalışırken kullandığınızdan emin olun.
1. kaynak ve konut fare
- LysM-eGFP fareler C57BL/6J genetik arka plan üzerinde türetmek12daha önce açıklandığı gibi. LysM-EGFP × MyD88- / - fareler MyD88- / - fareler üzerinde bir C57BL/6J arka plan ile geçiş LysM-EGFP fareler tarafından türetme yapıp yapmayacağınızı.
- Bir vivaryum House fareler. Bu çalışmalar için hayvanlar Kaliforniya Üniversitesi Davis cerrahi ve tek ev aşağıdaki ameliyatla önce grupta yer. 10-16 hafta yaşları arasında fare kullanın.
2. bakteriyel hazırlık ve miktar
- Kollarındaki kaldırmak S. aureus zorlanma buz erimek için-80 ° C depolama dan ilgi. Çizgi %5 sığır kan agar tabakta. 37 ° c gece (16 h) oksijen bir kuluçka çizgili plaka kuluçkaya.
Not: Bu protokol için ALC2906 SH1000 zorlanma kullanıldı. Bu zorlanma Servisi plazmid pSK236 ile Photohabdus luminescens18 luxABCDE muhabir kaset için erimiş penisilin-bağlayıcı protein 2 organizatörü içerir. - Tryptic soya suyu (TSB) 0,03 g mL saf su ve basınçlı kap TSB sterilize etmek için başına TSB tozu karıştırarak hazırlayın. Soğuyunca, steril tekniği kullanarak gerekli antibiyotik ekleyin. Bu protokol için 10 µg/mL kloramfenikol18 tekerlekli sandalye Basketbolu bioluminescence luxABCDE kaset içerir pSK236 Servisi plazmid ifade için seçmek için ekleyin.
- 3-4 ayrı kolonileri S. aureus plaka TSB 10 µg/mL kloramfenikol ile bir gecede kültür başlatmak için seçin. 37 ° c gece (16 h) incubating bir shaker bakteri kuluçkaya.
- Yeni bir bakteri kültürü gecede kültüründen bir örnek 1:50 TSB 10 µg/mL kloramfenikol ile sulandrarak başlatın. Kültür incubating bir shaker 200 devir/dakika ve 37 ° c
- S. aureus, bölme sonra iki saat izlemek optik yoğunluk 600 nm (OD600) bir Spektrofotometre üzerinde. Orta-logaritmik faz büyüme bulmak için zaman vs OD600 gözlemlemek. ALC2906 SH1000 zorlanma için 0,5 OD600 orta-logaritmik olduğunu ve 1 x 108 CFU/mL (şekil 1) bir konsantrasyon için karşılık gelir.
- OD600 0,5 olarak bakteri buz gibi DPBS ile 1:1 yıkayın. Bakteri 3000 x g ve 4 ° c de 10 dakika santrifüj kapasitesi Dikkatle süpernatant dikkatle boşaltmak ve ek soğutulmuş DPBS ve girdap iyice ekleyin. Bir kez daha için 3000 x g ve 4 ° c, 10 dk santrifüj
- Dikkatle süpernatant dikkatle boşaltmak. Bakteriyel Pelet istenen bir konsantrasyon resuspend. Bu çalışmalar, ALC2906 SH1000 3 mL toplar ve PBS, yaklaşık 2 x 108 CFU/mL bakteri konsantrasyonu için bağıntı 1.5 ml resuspend. Buz üstünde bakteri kadar kullanmak tutmak.
- Bakteri konsantrasyonu doğrulamak için bakteriyel Örnek 1:10,000 ve PBS 1:100,000 100 µL oranında seyreltin. Plaka 20 µL aliquots agar plaka üzerinde. Kuluçkaya brüt bir sınava 16 h. sayısı CFUs için oksijen bir kuluçka 37 ° C'de ve bakteri konsantrasyonu ertesi gün hesaplayın.
3. excisional deri Wounding ve S. aureus ile aşı
- 0.03 mg/mL buprenorfin hidroklorür (~0.2 mg/kg) 100 µL her fare ile mayi enjeksiyon için yönetmek.
- Yirmi dakika sonrası enjeksiyon, bir odası ile 2-3 LPM oksijen ile % 2-4 isoflurane farelerde yer 2-4. Fareler tam anestezi sonra tek tek bir burun konisi için 2-3 LPM oksijen ile % 2-4 isoflurane bağlı fare aktarın. Fareler tamamen sıkıca başparmak ve işaret parmağı arasında her arka pençe pinching tarafından anestezi doğrulayın. Hayvan için çimdik yanıt vermezse sonraki adıma geçin.
- Arkadaki fare 2 inç Bölüm 1 santim elektrik makasları ile tıraş ve kürk kupürleri temiz silin veya gazlı bez kullanarak alanı boşaltın. Aşırı iltihap neden olabilir çünkü depilatory losyon kullanmaktan kaçının.
- Temiz fare arkası ilk % 10 povidone-iyot batırılmış gazlı bez ve sonra % 70 etanol ile gazlı bez ıslanmış. Cerrahi alan merkezden dışa doğru hareket bir spiral düzende alanı temizleyin. Ameliyat öncesi kurumasını cerrahi alan yaklaşık 1 dakika bekleyin.
-
Traş iki parmak arasında gevşek fare geri tutun ve steril 6 mm punch biyopsi hazırlanan cerrahi alan ortasındaki sıkıca bastırın. Cildi gergin çekmeyin.
- Anahattın en az bir bölümünde deri yoluyla tamamen keser cilt üzerinde dairesel bir anahat oluşturmak için punch biyopsi twist. Temel fasya veya doku kesmemeye dikkat et.
- Steril makas ve forseps epidermis ve punch biyopsi tarafından baskılı dairesel desen DermIS ile kesmek için kullanın.
4. S. Aureus aşı
- 28 G insülin şırınga ile istenen kollarındaki bakteriyel inoculant doldurun. Bu çalışmada, 1 x 108 CFU/mL bir konsantrasyon yönetmek (50 µL). Birimin fazla 100 µL yönetmek değil.
-
İnoculant fasya ve doku yara arkadaki fare ortasına arasında 50 µL enjekte. İnoculant en az kaçağı veya dağılım yarayla ortasındaki bir kabarcık oluşturur emin olun.
- Dermis kenara çek, şırınga doku neredeyse paralel tutun ve direnç ani bir düşüş, fasya piercing gösterir hissedilir kadar yavaş yavaş şırınga dokusu içine itin. Dikkatle şırınga yaranın ortasına kurşun ve inoculant yavaş yavaş dağıtmak. Şırıngayı yavaşça hayvandan kaldırın.
- Steril PBS aynı hacmi yukarıda açıklandığı gibi hastalık bulaşmamış tek hayvan yaralar enjekte.
- Hayvan onun kafes dönmek. A ısı lamba altında veya üstünde bir Isıtma yastığı kafes yerleştirin ve hayvan kurtarma anestezi kadar izlemek.
5. vivo BLI ve FLI
- Araç yazılım aracılığıyla tüm hayvan Imager başlatın. 2-3 LPM oksijen ile % 2-4 isoflurane alma odası farelerde anestezi. Anestezi nosecones Görüntüleyici içinde teslim.
-
Yaralı ve virüslü fare Imager yerleştirin. Öyle ki yara gibi dümdüz fareyi getirin. Aşağıdaki sıra set-up fareler görüntü için kullanın.
- Işıma ve fotoğraf görüntüleme modu olarak seçin. 1dk küçük binning ve F/stop 1 (ışıma) ve durdurmak F/8 (fotoğraf) maruz kalma zamanı. Emisyon filtre açıktır. Görüntü kaydetmek için Al düğmesini tıklatın.
- Floresan ve fotoğraf görüntüleme modu olarak seçin. Pozlama süresi 1 s (floresan) küçük binning ve F/stop 1 ve durdurmak F/8 (fotoğraf) 465/30 bir uyarma dalga boyu ile de nm ve emisyon dalga boyu 520/20 nm yüksek lamba yoğunluğu ile. Görüntü kaydetmek için Al düğmesini tıklatın.
- Hayvan onun kafes ve İzleyicisi anestezi kurtarma kadar geri dönmek.
- Görüntü fareler yukarıda açıklandığı gibi her gün.
6. görüntü analizi
- Sayısal için görüntüleri aç.
- Faiz (ROI) büyük bir dairesel bölgeye cilt görüntüdeki her fare için çevreleyen dahil olmak üzere tüm yara alan üzerine getirin. Nötrofil içinde vivo FLI EGFP sinyalleri ve içinde vivo BLI S. aureus sinyalleri birkaç gün sonra yara kenar genişletmek ve bu çalışmalarda (şekil 2A ve 2B) dahil edildi. Ölçü ROI ve her fare için ortalama akı için kayıt değerlerini tıklatın. Karşı her sinyal (p/s) Zaman ortalama akı arsa.
-
Nötrofiller veya S. aureus yarada kesin rakamlar isterseniz, aşağıdaki deneyler yapmak.
- Nötrofil içinde vivo FLI EGFP sinyalleri sayılara ilişkilendirmek için yukarıda açıklandığı gibi C57BL/6J fareler yara ve LysM-EGFP veya LysM-EGFPxMyD88- / - bağış nötrofil (5 x 105 1 x 107) kemik iliği elde edilen bir dizi transfer doğrudan farklı yaralar üstüne. Görüntü yukarıdaki ve correlate açıklandığı gibi içinde vivo FLI EGFP nötrofil bilinen miktara sinyalleri.
- S. aureus CFU içinde vivo BLI sinyalleri ilişkilendirmek için yara ve yukarıda açıklandığı gibi fareler bulaştırmak. 1. gün sonrası enfeksiyon kayıt içinde vivo BLI sinyalleri fareler ve hemen üzerinde ötenazi ve leşleri chill. Yara tüketim, doku homojenize ve agar gecede kuluçka için üzerinde bakteriyel dilutions plakası. Ertesi gün, koloniler CFU yara belirlemek için say.
- Yara kenar ve yara (cm2) alanının ölçü üzerinde dairesel bir yatırım Getirisi yara iyileşme uyum ölçmek ve zaman (şekil 2C) vs temel kesirli değişikliğinden çizmek için.
7. istatistik
Not: Tüm verileri sunulmaktadır olarak ortalama ±SEM. p < 0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul
- Holm-Sidak yöntemini kullanarak tek bir günde iki grup arasındaki farkları belirlemek, Alfa ile 0,05 = ve her zaman noktası tek tek, tutarlı bir SD varsayarak olmadan analiz
- Tukey çoklu karşılaştırmalar posttest ile tek yönlü ANOVA tarafından aynı gün birden çok grubu arasındaki farkları karşılaştırın. Hayatta kalma deneysel gruplar arasında Mantel-Cox yöntemi ile analiz edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LysM-EGFP × MyD88- / - fareler LysM EGFP fareler S. aureus enfeksiyona daha duyarlı
Bu çalışmada, ALC290618, kullanılan S. aureus suşu canlı ve aktif metabolize bakterilerden kollarındaki sinyalleri üretir lux yapısı içeren bir plazmid ile inşa. Fareler aşısını, içinde vivo bioluminescence (BLI) teknikleri Imaging boyuna virüslü bir yara içinde bakteri yükü ölçmek için kullanılabilir. LysM-EGFP × MyD88- / - fareler ve LysM-EGFP fareler yaralı ve 1 x 107 S. aureus enfeksiyon onların duyarlılık karşılaştırmak için S. aureus yarada CFU ile enfekte. LysM-EGFP × MyD88- / - fareler enfeksiyon LysM-EGFP fareler tarafından LysM-EGFP × MyD88% 80'i ölümcül- / - fare ilk 8 gün % 0 ölümcül sırasında LysM-EGFP farelerin göre enfeksiyon sırasında gösterdi daha büyük duyarlılık gösterdi deney (şekil 3A) 15 günlük süresi. Fareler her iki suşları ~ %5 vücut ağırlığı enfeksiyonu takip kaybetti, ama LysM-EGFP × MyD88- / - fareler kayıp ağırlık (şekil 3B) kurtarmak değil iken LysM-EGFP fareler orijinal ağırlık gün 2, tarafından kurtarıldı. Yara kapatma S. aureus enfeksiyon varlığında iki suşlar arasında farklı değildi; Ancak, sterilely yaralı LysM EGFP × MyD88- / - LysM-EGFP fareler (şekil 3 c) göre yara iyileşmesinde önemli bir kusur daha önce raporlanmış19vardı. Bütün hayvan Imaging bakteri yükü günlük ölçmek için kullanılan ve gibi erken gün 1, LysM-EGFP yaraları daha yüksek bir bakteriyel yük LysM EGFP × MyD88- / - yaraları vardı. LysM-EGFP fareler enfeksiyon kontrol ve LysM-EGFP × MyD88- / - fareler günde 4 hayvan (3D şekil,E) ölünceye kadar monoton bakteriyel yük artış sergiledi süre içinde vivo BLI sinyalleri yarada, düşmüştür. Birlikte, bu verileri LysM-EGFP fareler için karşılaştırıldığında S. aureus enfeksiyona LysM-EGFP × MyD88- / - fare duyarlılık artan göstermektedir.
Nötrofil kaçakçılığı Engelli S. aureus içinde LysM-EGFP fareler için göre LysM-EGFP × MyD88- / - fareler enfekte
LysM-EGFP fare kodlanmış bir EGFP protein nedeniyle yeşil flüoresan nötrofil üretir lizozim M organizatörü12aşağı. Bu fare boyuna içinde vivo nötrofil dermal S. aureus cevaben kaçakçılığı çalışmaya kullanıldığında vardır enfeksiyon13,14,20,21,22. LysM-EGFP ve LysM-EGFP × MyD88- / - fareler üretilen yaralara nötrofil Kinetik karşılaştırmak için bir 6 mm tam kalınlıkta deri yara patolojisi üzerinde verildi ve fareler günlük görüntüsü. LysM-EGFP × LysM-EGFP fareler (şekil 4A, C) göre MyD88- / - nötrofil yaraları kaçakçılığı % 40 azalma gözlendi. 1 x 107 S. Aureus CFU hemen yaralama sonra kullanılmaya başlanan nötrofil kaçakçılığı fareler her iki suşları zayıflatılmış ama LysM EGFP × MyD88- / - fareler S. aureus enfeksiyona daha hassas olduğunu nötrofil işe alım için saygı. Enfeksiyon neden % 50 azaltmak ilk nötrofil LysM-EGFP yaraları (4B rakam) gözlenen bir % 15 düşüş göre LysM-EGFP × MyD88- / - yaralara kaçakçılığı içinde. LysM-EGFP fareler de işe yara için önemli ölçüde daha fazla nötrofil nötrofil sayısını artırmak koyamadık LysM-EGFP × MyD88- / - fareler için göre enfeksiyon (şekil 4A,C) sonraki aşamalarını sırasında bile sürekli bakteri yükü varlığı. Birlikte, bu verileri LysM-EGFP × MyD88- / - fareler S. aureus enfeksiyon onların artan duyarlılık ile tutarlıdır nötrofil işe alım bir kusur var göstermektedir.
Resim 1: OD600 ve CFU arasında korelasyon ALC2906 için sayar. 3-4 ALC2906 SH1000 kolonileri bir agar tabaktan aldı ve 10 µg/mL kloramfenikol gecede kültür ile TSB transfer. Ertesi gün, süspansiyon 1:50 10 µg/mL kloramfenikol ile TSB bölünmüş oldu ve kültürlü. Optik yoğunluk 600 nm (OD600) 2 saat sonra bir Spektrofotometre kullanarak düzenli aralıklarla ölçülen. Her ölçüm bakteri seyreltilmiş 1:100,000 buz gibi PBS ve bölünmemeli gecede kuluçka için bir agar levha üzerine yapıldı. CFUs ilk toplama hesaplamak için ertesi gün sayılır ve OD600için korelasyon. N = 3 ile 4 farklı OD600 ölçümleri deneme. başına Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: veri analizi için (ROIs) çıkarlarının temsilcisi bölge. İçinde vivo BLI ve içinde vivo FLI sinyalleri, büyük, analiz etmek için eşdeğer büyüklükteki ROIs yara üzerinde merkezli ve toplam akı (fotonlar saniyede) ölçüldü. Yara kapatma ölçmek için bir yatırım Getirisi yara kenarına uygun ve alan (cm2) ölçüldü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: LysM-EGFP × MyD88- / - fareler S. aureus enfeksiyon LysM-EGFP fareler için karşılaştırıldığında daha yatkındır. LysM-EGFP ve LysM-EGFP × MyD88- / - fareler yönetilen 6 mm ve yara patolojisi üzerinde 1 x 107 ile CFU kollarındaki S. aureus veya steril serum fizyolojik bulaşmış. Hayvanlar her gün takip ve hayatta kalma(a)ve (B) ağırlık kaydedildi. Hayvanlar her gün ölçü birimi (C) yara boyutu ve (D) bakteriyel ışıldama görüntüsü. (E) temsilcisi kollarındaki görüntüleri enfekte LysM-EGFP ve LysM-EGFP × MyD88- / - fareler tasvir edilmektedir. Ölçek çubuğu 3 mm. = ve veri temsil grubu başına 7-16 fareler A, C, D ve başına 3 fareler Grup B için ve ortalama ±SEM. ifade edilir * p = 0,05, ** p = 0,01, ***p = 0.001, *p < 0,0001 arasındaki enfekte (A, B, < / C18 > ve D) veya (C) gruplar bulaşmamış. İstatistiksel anlamlılık Mantel-Cox testi(a)ve (B-D), Holm-Sidak yöntemini kullanarak kararlı Alfa = 0,05 ve her zaman noktası analiz tek tek, tutarlı SD Lütfen bir daha büyük görmek için buraya tıklayın varsayarak olmadan Bu rakam sürümü.
Resim 4: LysM-EGFP × MyD88- / - fareler için enfekte yaralar arızalı nötrofil işe var.
LysM-EGFP ve LysM-EGFP × MyD88- / - fareler yönetilen 6 mm ve yara patolojisi üzerinde 1 x 107 ile CFU kollarındaki S. aureus veya steril serum fizyolojik bulaşmış. Hayvanlar her gün (A, B) nötrofil içeriği ölçmek için görüntüsü. (C) temsilcisi floresan görüntüleri bulaşmış ve enfekte LysM-EGFP ve LysM-EGFP × MyD88- / - fareler tasvir edilmektedir. Ölçek çubuğu 8-16 fareler grup başına 5 mm. veri temsil = ve ortalama ±SEM. ifade edilir * p < 0,05, ** p < 0,01, ve *** p < 0,001 arasındaki enfekte grupları ve # p < 0,01 arasında bulaşmamış grupları(a)ya da grafikte (B) tasvir. İstatistiksel anlamlılık Holm-Sidak(a)yöntemiyle kararlıydım Alfa ile = 0,05 ve her zaman noktası analiz tek tek, tutarlı SD ve tek yönlü ANOVA (B), varsayarak olmadan ile Tukey çoklu karşılaştırmalar sonrası test. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kollarındaki S. aureus kullanmak S. aureus enfeksiyon modelleri floresan nötrofil muhabir fare gelişmiş teknikler ile birlikte enfeksiyon tüm hayvan içinde vivo optik görüntüleme bilgimizi doğuştan gelen gelişmiş enfeksiyon bağışıklık yanıtı. Önceki çalışmalar LysM-EGFP fareyi kullanarak yukarı bir S. aureus enfekte yara enfeksiyonu ilk 24 saat içinde için 1 x 107 nötrofil işe14ve nötrofil yara işe onların yarı ömrü 1,5 gün 5 gün uzatmak olduğunu göstermiştir yanıt olarak bir S. aureus-enfekte yara22. Fareler tarafından enfeksiyon mücadele için uyarlanmış bir hayatta kalma taktik progenitör hücre (HSPC) ve hematopoetik kök için virüslü bir yara nerede onlar bakteri yok edici EGFP+ nötrofil TLR2/MyD88/PGE2 içine genişletmek kemik iliği üzerinden ticareti bağımlı bir şekilde21. Buna ek olarak, nötrofil S. aureus kurtarmak için gerekli bir kaynak MyD88- / - fare öldürücü sepsis13enfekte ekstramedullar granulopoiesis sağlar. HSPC farelerde vahşi tip içine evlat edinen transfer LysM-EGFP fareler gelen yerel nötrofil üretim süreci ve S. aureus içinde bir yara13,21mücadele içinde önemini incelemek mümkün kılar. Tam olarak nötrofil yarada sayısını ayarlamak mümkündür; Yaralarda nötrofil sayısı doğrusal olarak kadar fazla 1 x 107 nötrofil EGFP sinyali 1 x 106 ile ilişkili olan ve yaklaşık 1 x 106 nötrofil 6 mm yara14algılama sınırıdır.
Temsilcisi sonuçlarımızda boyuna nötrofil ve S. aureus Kinetik LysM-EGFP ve LysM-EGFP × MyD88- / -yaralarda karşılaştırın. Bilgimizi, bu bakteri yükü ve vahşi türü ve boyuna çözünürlük enfeksiyonu yoluyla immün fareler arasında ticareti nötrofil karşılaştıran bu ilk çalışmadır. MyD88% 50 azalma göre vahşi türü farelerde nötrofil Devletlerde bir % 15 düşüş elde edildi MyD88- / - zorlanma, S. aureus enfeksiyon nedeniyle nötrofil işe alım zayıflama derecesini özel ilgi olduğunu-/ -. S. aureus konağın immün yanıt virülans faktörleri dolaylı olarak nötrofil (yani, α-toksin, Panton-Valentine leukocidin ve kemotaksisi inhibitör proteini23 kaçakçılığı etkisizleştirmek için bilinen bir dizi üreterek kaçmasına yapabiliyor , 24), ve bizim sonuçları MyD88, büyük olasılıkla TLR2, TLR4 ve IL-1R, sinyal konak immün yanıt-e doğru kaçmak için S. aureus tarafından istihdam stratejileri üstesinden gelmek için kritik olduğunu gösterir. Virülans faktörü-nakavt S. aureus suşları bu modelde myeloid hücre ticareti13üzerindeki etkileri tanımlamak için kullanılabilir. Ayrıca, zaman- / - LysM-EGFP × MyD88 fare ile birlikte eğitimi, bu model virülans faktörleri patojenik etkileri mücadele sinyal MyD88 rolü vurgulamaktadır.
Eğer düzgün gerçekleştirilen çalışmalar değişkenlik tanıtabilirsiniz bu iletişim kuralı birkaç kritik adım vardır. Yaralama ve enfeksiyon diğer fare hastalık modellerle karşılaştırıldığında basit işlemlerdir ama onun inceliklerini değil. Cilt punch biyopsi çok keskin ve cilt altında spinotrapezius kas içine kolayca kesebilir. Bu kas ve onun fasya zarar nötrofil işe alım değiştirir ve fareler ve yaranın içinde ortalanır değil bir daha invaziv S. aureus enfeksiyon sonuçlarında arasında değişkenlik artar. Spinotrapezius kas önemli hasar ile fareler çalışmalardan dışlanmaları gerekir.
Kollarındaki değişimler bu modelde hatasının başka bir kaynaktan gelen S. aureus zorlanma zamanla, içinde vivo BLI sinyalleri ve büyüme Kinetik değiştirebilir. ALC2906 zorlanma dan S. aureus bakteriler tarafından atılan kollarındaki sinyalleri üretmek için gerekli Photorhabdus luminescens yapısı değiştirilmiş lux operon içeren bir Servisi plazmid içerir zaman25üzerinde. Seçim olmadan bir suyu kültürde SH1000 kolonileri % 97'si günde 3 kollarındaki sinyalleri üretti. Bu frekans düştü % 53 5 gün ve gün 10%2621. Böylece, bulaşıcı ders sırasında daha sonra zaman noktalarda, içinde vivo BLI sinyalleri büyük olasılıkla biraz başlayacak (< 1 günlük fark) gerçek vivo içinde bakteri yükü hafife alma. S. aureus taze gliserol hisse senetleri üzerine varış ve çalışma stokları bakterilerin sık sık değiştirme plazmid korumak için antibiyotik seçimi ile aşağı dondurmak önemlidir (yani, üç ayda) kaybını önlemek yardımcı olabilir Kollarındaki yapısı kültür bakım sırasında. Kollarındaki S. aureus daha yeni suşları stabil entegre kollarındaki yapı27,28 içeren ve büyük olasılıkla bu modelinde kullanılan ALC2906 zorlanma üzerinde bir iyileşme vardır.
Bu model lokalize dermal S. aureus eğitim yararlı iken enfeksiyonlar, sınırlamaları vardır. Bakteriyel yükünün içinde vivo BLI sinyalleri yara ve bitişik cilt için sınırlıdır. Model sepsis gibi derin invazif enfeksiyonlar için güvenilir bir okuma sağlamaz ve hayvan kan veya böbrekler13bakteri yayılmasını ölçmek için ötenazi gerekir. Daha yeni ve daha parlak mühendislik kollarındaki suşları oluşturulan iç organları27,28içinde vivo BLI sinyalleri tespiti izin. Buna ek olarak, boyuna algılama ve nötrofil ticareti izleme diğerinde ölçülemez sık solunum yolu da dahil olmak üzere S. aureus infeksiyonları ve kan enfeksiyonlar. Doku autofluorescence nedeniyle düşük duyarlılık bu model bir kısıtlamasıdır. Son zamanlarda geliştirilen ketçap fare TdTomato RFP Ly6G organizatörü altında kullanır ve bir daha yüksek sinyal gürültü oranı nedeniyle LysM-EGFP fare daha doku otomatik Floresans RFP kanal11' deki düşük.
Bu model içinde vivo BLI ve FLI emisyon sinyalleri arasında potansiyel crosstalk tartışılması çekicidir ama ihmal edilebilir düzeydedir. Biz olmadan ışık uyarma deneyleri yapmak ve sadece 520/20 filtre kullanarak içinde vivo FLI EGFP sinyalleri toplamak, biz virüslü fareleri, herhangi bir kayda değer sinyalleri toplanan sinyalleri içinde vivo FLI EGFP sinyalleri ve değil olduğunu gösteren uygulamıyor çakışma içinde vivo BLI sinyallerinin bakteri (veri gösterilmez). Bu sadece 1 saniye içinde vivo FLI ve 1 dakika içinde vivo BLI ve belirli uyarma dalga boyu filtrenin 465/30 nm ve emisyon filtre 520/20 için öncelikle sinyal koleksiyon saatini kaynaklanmaktadır nm. İçinde vivo FLI EGFP sinyalleri içinde vivo BLI sinyalleri katkısı olmadan en iyi algılanması için bu ayarları sağlar. Bu en iyi büyüklük, şekil 3D ve şekil 4Aarasında y ekseni karşılaştırırken gösterilmiştir. İçinde vivo BLI gelen sinyalleri içinde vivo BLI sinyalleri yok denecek kadar azdır ve içinde vivo FLI gözlenen sinyalleri az % 1 katkıda gösteren içinde vivo EGFP FLI sinyalleri daha az yaklaşık 100-fold.
Bu modelin gelecekteki uygulamalar artırarak S. aureus enfeksiyonu temizlemek için amacı keşfetmek ve S. aureus virülans faktörleri karakterize ve roman therapeutics test etmek için önceden klinik hayvan model olarak hizmet araştırmacılar yardımcı olacaktır bekliyoruz Doğuştan gelen bağışıklık yanıtı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Lloyd S. Miller MedImmune, Pfizer, Regeneron ve Chan Soon-Shiong Nanthealth Vakfı ve raporlanan çalışma ile ilgili olmayan danışmanlık ücretleri Noveome Biotherapeutics ve Chan Soon-Shiong Nanthealth Vakfı Hibe destek aldı Bu yazıda. Diğer yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Ulusal kurumları, sağlık hibe R01 AI129302 (SIS için) ve Farmakoloji eğitim programı tarafından desteklenen: UC Davis başucunda banka üzerinden (NIH T32 GM099608 L.S.A için). Moleküler ve genomik görüntüleme (CMGI) Kaliforniya Üniversitesi Davis üstün teknolojik destek sağlamıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352059 | |
| 6 mm Disposable Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| Bioluminescent S. aureus | Lloyd Miller, Johns Hopkins | ALC 2906 SH1000 | |
| Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics | VWR | 10118-938 | |
| Buprenoprhine hydrochloride injectable | Western Medical Supply | 7292 | 0.3 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labratory | 000664 | |
| Chloramphenicol (crystalline powder) | Fisher BioReagents | BP904-100 | |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Insulin Syringes | Becton, Dickson and Company | 329461 | 0.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'') |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software – IVIS Spectrum Series | Perkin Elmer | 128113 | |
| LysM-eGFP Mice | Thomas Graff Albert Einstein College of New York | NA | |
| Microvolume Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| MyD88 KO Mice | Jackson Labratory | 009088 | |
| Non-woven sponges | AMD- Ritmed Inc | A2101-CH | 5 cm x 5 cm |
| Povidone Iodine 10% Solution | Aplicare | 697731 | |
| Prism 7.0 | GraphPad Software | License | |
| Tryptic Soy Broth | Becton, Dickson and Company | 211825 |
References
- Moran, G. J., et al. Methicillin-Resistant S. aureus Infections among Patients in the Emergency Department. New England Journal of Medicine. 355 (7), 666-674 (2009).
- Suaya, J. A., et al. Incidence and cost of hospitalizations associated with Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections in the United States from 2001 through 2009. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 296 (2014).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T : a Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
- Blaser, M. J. Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome. Science. 352 (6285), 544-545 (2016).
- Hilliard, J. J., et al. Anti-Alpha-Toxin Monoclonal Antibody and Antibiotic Combination Therapy Improves Disease Outcome and Accelerates Healing in a Staphylococcus aureus Dermonecrosis Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 299-309 (2015).
- Proctor, R. A. Recent developments for Staphylococcus aureus vaccines: clinical and basic science challenges. European Cells & Materials. 30, 315-326 (2015).
- Mölne, L., Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of Neutrophil Leukocytes in Cutaneous Infection Caused by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 68 (11), 6162-6167 (2000).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Borregaard, N. Neutrophils, from Marrow to Microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Miller, L. S., Cho, J. S. Immunity against Staphylococcus aureus cutaneous infections. Nature Reviews Immunology. 11 (8), 505-518 (2011).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nature Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Falahee, P. C., et al. α-Toxin Regulates Local Granulocyte Expansion from Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Staphylococcus aureus-Infected Wounds. Journal of immunology. 199 (5), Baltimore, Md. 1772-1782 (2017).
- Kim, M. -H., et al. Dynamics of Neutrophil Infiltration during Cutaneous Wound Healing and Infection Using Fluorescence Imaging. Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1812-1820 (2008).
- Liese, J., Rooijakkers, S. H. M., Strijp, J. A. G., Novick, R. P., Dustin, M. L. Intravital two-photon microscopy of host-pathogen interactions in a mouse model of Staphylococcus aureus skin abscess formation. Cellular Microbiology. 15 (6), 891-909 (2013).
- Bogoslowski, A., Butcher, E. C., Kubes, P. Neutrophils recruited through high endothelial venules of the lymph nodes via PNAd intercept disseminating Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2449-2454 (2018).
- Takeuchi, O., Hoshino, K., Akira, S. Cutting Edge: TLR2-Deficient and MyD88-Deficient Mice Are Highly Susceptible to Staphylococcus aureus Infection. The Journal of Immunology. 165 (10), 5392-5396 (2000).
- Miller, L. S., et al. MyD88 Mediates Neutrophil Recruitment Initiated by IL-1R but Not TLR2 Activation in Immunity against Staphylococcus aureus. Immunity. 24 (1), 79-91 (2006).
- Macedo, L., et al. Wound healing is impaired in MyD88-deficient mice: a role for MyD88 in the regulation of wound healing by adenosine A2A receptors. The American Journal of Pathology. 171 (6), 1774-1788 (2007).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047 (2012).
- Granick, J. L., et al. Staphylococcus aureus recognition by hematopoietic stem and progenitor cells via TLR2/MyD88/PGE2 stimulates granulopoiesis in wounds. Blood. 122 (10), 1770-1778 (2013).
- Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117 (12), 3343-3352 (2011).
- Foster, T. J. Immune evasion by staphylococci. Nature Reviews Microbiology. 3 (12), 948-958 (2005).
- Gordon, R. J., Lowy, F. D. Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection. Clinical Infectious Diseases. 46 (Supplement_5), S350-S359 (2008).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047-e1003020 (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5 (9), e12580 (2010).
- Plaut, R. D., Mocca, C. P., Prabhakara, R., Merkel, T. J., Stibitz, S. Stably Luminescent Staphylococcus aureus Clinical Strains for Use in Bioluminescent Imaging. PLoS ONE. 8 (3), e59232 (2013).
- Dillen, C. A., et al. Clonally expanded γδ T cells protect against Staphylococcus aureus skin reinfection. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1026-1042 (2018).
