Summary
Ett tillvägagångssätt beskrivs för realtid detektering av medfödda immunsvaret mot kutan såra och Staphylococcus aureus infektion av möss. Genom att jämföra LysM-andra möss (som äger fluorescerande neutrofiler) med en LysM-andra korsavlade nedsatt immunförsvar mus stam, vi i förväg vår förståelse av infektion och utveckling av metoder för att bekämpa infektion.
Abstract
Staphylococcus aureus (S. aureus) infektioner, inklusive meticillinresistenta fläckar, är en enorm belastning på sjukvården. Med incidensen av S. aureus infektion klättring årligen, finns det en efterfrågan på ytterligare forskning i dess patogenicitet. Djurmodeller av smittsam sjukdom avancera vår förståelse av värd-patogen svar och leda till utveckling av effektiva therapeutics. Neutrofiler har en primär roll i det medfödda immunsvaret som styr S. aureus infektioner genom att bilda en böld för att skärma av infektionen och underlätta bakteriell clearance; antalet neutrofiler som infiltrerar en S. aureus hudinfektion ofta korrelerar med sjukdom resultatet. LysM-andra möss, som äger förbättrade grönt fluorescerande protein (andra) infogas i regionen lysozym M (LysM) arrangören (uttryckt primärt av neutrofiler), när den används tillsammans med i vivo hela djur fluorescens imaging (FLI) ger en sätt att kvantifiera neutrofila emigration noninvasivt och longitudinellt in skadade huden. När de kombineras med en självlysande S. aureus -stam och sekventiell Invivo hela djur självlysande tänkbar (BLI), det är möjligt att longitudinellt övervaka både neutrofila rekrytering dynamics och i vivo bakteriella börda på platsen för infektion hos sövda möss från uppkomsten av infektion till upplösning eller död. Möss är mer motståndskraftiga mot ett antal virulensfaktorer som produceras av S. aureus som underlättar effektiv kolonisation och infektion hos människa. Nedsatt immunförsvar möss ger en känsligare djurmodell för att undersöka ihållande S. aureus infektioner och therapeutics förmåga att öka medfödda immunsvar. Häri, karakterisera vi svar i LysM-andra möss som har fötts till MyD88-brist möss (LysM-andra × MyD88- / - möss) tillsammans med vildtyp LysM-andra möss att undersöka S. aureus hud sårinfektion. Multispektrala samtidiga upptäckt aktiverade studie av neutrofila rekrytering dynamik med hjälp av Invivo FLI, bakteriell belastning med hjälp av Invivo BLI, och sårläkning längdriktningen och noninvasivt över tid.
Introduction
Staphylococcus aureus (S. aureus) står för majoriteten av hud- och mjukdelsinfektioner (ssti) i USA1. Förekomsten av meticillinresistenta S. aureus (MRSA) infektioner har ökat stadigt under de senaste två decennier2, motivera studiet av mekanismerna för persistens och upptäckten av nya behandlingsstrategier. Vårdstandard för MRSA-infektioner är systemisk antibiotikabehandling, men MRSA har blivit allt mer resistenta mot antibiotika över tid3 och dessa läkemedel kan minska värdens fördelaktigt microbiom, orsakar negativa hälsoeffekter, särskilt i barn4. Prekliniska studier har undersökt alternativa strategier för att behandla MRSA infektioner5, men att översätta dessa synsätt till kliniken har bevisat utmanande på grund av uppkomsten av virulensfaktorer som omintetgöra värd immunsvar6. För att dissekera värd-patogen dynamik som driver S. aureus mjukdelsinfektioner, vi kombinerar noninvasiv och längsgående avläsning av antalet neutrofiler rekryteras till såret sängen med kinetic åtgärder av bakteriell överflöd och såryta.
Neutrofiler är den vanligast förekommande cirkulerande Leukocyten hos människor och de första responders till en bakteriell infektion7. Neutrofiler är en nödvändig komponent för en effektiv värdrespons mot S. aureus infektioner på grund av deras bakteriedödande mekanismer, inbegripet produktion av reaktiva syreradikaler, proteaser, antimikrobiella peptider och funktionella Svaren inklusive fagocytos och neutrofila extracellulära fälla produktion8,9. Mänskliga patienter med genetiska defekter i neutrofil funktion, till exempel kronisk granulomatös sjukdom och Chediak-Higashi syndromet, visar en ökad mottaglighet för S. aureus infektion. Dessutom, patienter med genetiska (såsom kongenital neutropeni) och förvärvade (t.ex. neutropeni hos patienter som får cytostatika) defekter i neutrofila siffror också är mycket mottagliga för S. aureus infektion10. Med tanke på vikten av neutrofiler i clearing S. aureus infektioner, kan förbättra deras immun kapacitet eller trimma sina siffror inom en S. aureus lesion vara en effektiv strategi för att lösa infektion.
Under det senaste årtiondet, har transgena möss med fluorescens neutrofila reportrar utvecklats för att studera deras människohandel11,12. Att kombinera neutrofila reporter möss med hela djur avbildningstekniker tillåter spatiotemporal analys av neutrofiler i vävnader och organ. Kombination med självlysande stammar av S. aureus, det är möjligt att spåra ansamling av neutrofiler i svar till S. aureus överflöd och uthållighet i samband med bakteriell virulens faktorer som direkt och indirekt stör neutrofila nummer i drabbade vävnaden13,14,15,16.
Möss är mindre mottagliga för S. aureus virulens och immune evasion mekanismer än människor. Som sådan, vildtyp möss inte kan vara en idealisk djurmodell att undersöka effekten av en tanke terapeutiska att behandla kronisk S. aureus infektion. MyD88-brist möss (dvs, MyD88- / - möss), en immunkomprometterade mus stam som saknar funktionell interleukin-1 receptor (IL-1R) och Toll-liknande receptorer (TLR) signalering, Visa större känslighet för S. aureus infektion jämfört vildtyp möss17 och en nedskrivning i neutrofila människohandel till en plats av S. aureus infektion i huden18. Utveckling av en mus stam som äger en fluorescerande neutrofila reporter i MyD88- / - möss har lämnat en alternativ modell för att undersöka effekten av terapier att behandla S. aureus -infektion jämfört med nuvarande antal neutrofila reporter möss.
I detta protokoll, vi karakterisera S. aureus -infektion hos immunsupprimerade LysM-andra × MyD88- / - möss och jämföra tidsförlopp och upplösning av infektion med LysM-andra möss. LysM-andra × MyD88- / - möss utvecklar en kronisk infektion som inte försvinner, och 75% duka till infektion efter 8 dagar. En betydande brist i inledande neutrofila rekrytering sker över 72 h den inflammatoriska fasen av infektion, och 50% färre neutrofiler rekrytera under det senare skedet av infektionen. Ökad känslighet av den LysM-andra × MyD88- / - möss gör detta särskild stam en rigorös preklinisk modell för att utvärdera effekten av nya terapeutiska tekniker inriktning S. aureus -infektion jämfört med nuvarande modeller som utnyttja vildtyp möss, speciellt tekniker som syftar till att öka medfödda immunsvaret mot infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla studier har granskats och godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén vid UC Davis och utfördes enligt riktlinjerna i djurskyddslagen och lagen om hälsa forskning filändelsen. Var noga med att använda sterila handskar när du arbetar med djur.
1. mus källa och bostäder
- Härleda LysM-andra möss på C57BL/6J genetiska bakgrund som tidigare beskrivits12. Härleda LysM-andra × MyD88- / - möss av korsningen LysM-andra möss med MyD88- / - möss på C57BL/6J bakgrund.
- Hus möss i ett vivarium. För dessa studier, djur har varit inhysta på University of California, Davis i grupper före kirurgi och enda inhysta efter operationen. Använda möss i åldrarna 10-16 veckor.
2. bakteriell förberedelse och kvantifiering
- Ta bort den självlysande S. aureus -stam av intresse från-80 ° C lagring Tina på is. Strimma på en 5% nötblodagar tallrik. Inkubera strimmiga plattan i en fuktad inkubator vid 37 ° C över natten (16 h).
Obs: I detta protokoll användes ALC2906 SH1000 stammen. Denna stam innehåller den Transfer plasmiden pSK236 med promotorn penicillinbindande protein 2 smält i luxABCDE reporter kassetten från Photohabdus hjälp18. - Förbered tryptic soy buljong (TSB) genom att blanda 0,03 g TSB pulver per mL rent vatten och autoklav TSB att sterilisera. När svalnat, Lägg till eventuella nödvändiga antibiotika med steril teknik. I detta protokoll, lägga till 10 µg/mL kloramfenikol18 TSB välja för uttryck av pSK236 Transfer plasmiden, som innehåller mareld luxABCDE kassett.
- Plocka 3-4 separata kolonier från S. aureus plattan i TSB med 10 µg/mL kloramfenikol att starta en övernattning kultur. Inkubera bakterier på en ruvande shaker vid 37 ° C över natten (16 h).
- Starta en ny bakterieodling från övernattning kulturen genom att späda provet 1:50 in i TSB med 10 µg/mL kloramfenikol. Kultur i en ruvande shaker vid 200 rpm och 37 ° C.
- Två timmar efter uppdelning av S. aureus, övervaka den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) på en spektrofotometer. Observera den OD600 vs tid att hitta mitten av-logaritmiska fas tillväxt. För ALC2906 SH1000 stam, en OD600 0,5 är mitten-logaritmisk och motsvarar en koncentration av 1 x 108 CFU/mL (figur 1).
- När OD600 är 0,5, tvätta bakterier 1:1 med iskall DPBS. Centrifugera bakterierna i 10 min på 3 000 x g och 4 ° C. Försiktigt Dekantera supernatanten och lägga till ytterligare kylda DPBS och vortex grundligt. Centrifugera gång under 10 minuter vid 3 000 x g och 4 ° C.
- Noggrant Dekantera supernatanten. Återsuspendera pelleten bakteriell vid en önskad koncentration. För dessa studier, samla 3 mL ALC2906 SH1000 och återsuspendera i 1,5 mL PBS, korrelera till en bakterier koncentration av ca 2 x 108 CFU/mL. Hålla bakterier på is fram till användning.
- För att kontrollera bakterier koncentration, späd 100 µL av bakteriella prov 1:10,000 och 1:100,000 i PBS. Tallrik 20 µL portioner på en agarplatta. Inkubera vid 37 ° C i en fuktad inkubator för 16 h. greve CFUs av brutto undersökning och beräkna en bakteriell koncentration dagen efter.
3. excisional hud Wounding och inympning med S. aureus
- Administrera 100 µL av 0,03 mg/mL buprenorfinhydroklorid (~0.2 mg/kg) till varje mus via intraperitoneal injektion.
- Tjugo minuter efter injektion, plats 2-4 möss i en kammare med 2-3 LPM syre med 2-4% isofluran. När möss är fullt anesthetized, överföra mössen en i taget till en Kona ansluten till 2-3 LPM syre med 2-4% isofluran. Verifiera möss bedövas fullt ut genom att nypa fast varje bakre tass mellan tummen och pekfingret. Fortsätt till nästa steg om djuret inte reagerar på att nypa.
- Raka en 1 tums av 2 tums delen på baksidan av musen med elektriska hårklippningsmaskiner och rensa området av päls gräsklippet med en ren torka eller gasväv. Undvik att använda hårborttagningsprodukter lotion eftersom det kan orsaka överflödig inflammation.
- Rengör fuktad baksidan av musen först med 10% povidonjod indränkt kompress och sedan med en 70-procentig etanol kompress. Ren området i ett Spiralmönster, flytta utåt från mitten av det kirurgiska området. Vänta ca 1 min för kirurgiska området torka före operation.
-
Håll den rakade baksidan av musen löst mellan två fingrar och tryck fast en steril 6 mm punch biopsi vid mitten av det beredda kirurgiska området. Dra inte huden spänd.
- Twist punch biopsi för att skapa en cirkulär disposition på huden som fullt skär igenom huden i minst ett avsnitt av dispositionen. Var noga med att inte skära in i underliggande fascia eller vävnad.
- Använd steril sax och pincett för att skära igenom epidermis och dermis efter den cirkulära mönster präglade av punch biopsi.
4. S. aureus inympning
- Fyll en 28 G insulinspruta med den önskade självlysande bakteriell ympmedel. I denna studie, administrera en koncentration av 1 x 108 CFU/mL (50 µL). Administrera inte mer än 100 µL av volym.
-
Injicera 50 µL av ympmedel mellan fascia och vävnad i mitten av såret på baksidan av musen. Se till att ympmedel bildar en bubbla i mitten av såret med minimalt läckage eller dispersion.
- Dra dermis till sidan, håll sprutan nästan parallellt med vävnaden och tryck långsamt in sprutan i vävnaden tills en plötslig minskning av motstånd känns, vilket indikerar piercing i fascia. Försiktigt leda sprutan in i centrera av såret och fördela ympmedel långsamt. Ta bort sprutan långsamt från djuret.
- Injicera samma volym av steril fosfatbuffrad Koksaltlösning i såren oinfekterade djur som beskrivs ovan.
- Tillbaka djuret till sin bur. Placera buren under en värmelampa eller ovanpå en värmedyna och övervaka djuret tills återhämtning från anestesi.
5. i Vivo BLI och FLI
- Initiera hela djur kameran via instrumentet programvaran. Söva möss i en kammare tar emot 2-3 LPM syre med 2-4% isofluran. Leverera anestesi till nosecones inuti kameran.
-
Placera musen för skadad och infekterad i kameran. Placera musen så att såret är lika platt som möjligt. Använd följande sekvens set-up till bild möss.
- Välj luminiscens och fotografera som tänkbar läge. Exponeringstiden är 1 min på små binning och F/stop 1 (luminiscens) och F/stop 8 (fotografi). Utsläpp filtret är öppen. Klicka på knappen Hämta för att spela in bilden.
- Välj fluorescens och fotografera som tänkbar läge. Exponeringstiden är 1 s vid små binning och F/stop 1 (fluorescens) och F/stop 8 (fotografi) med en magnetisering våglängd av 465/30 nm och en utsläpp våglängd 520/20 nm med en hög lampa intensitet. Klicka på knappen Hämta för att spela in bilden.
- Tillbaka djuret till sin bur och monitor tills återhämtning från anestesi.
- Bild möss dagligen som beskrivs ovan.
6. bildanalys
- Öppna bilder att kvantifieras.
- Placera en stor cirkulär region av intresse (ROI) över hela sårområdet inklusive omgivande hud för varje mus i bilden. De neutrofila Invivo FLI EGFP signaler och Invivo BLI S. aureus signaler sträcker sig utanför såret kanten efter flera dagar och inkluderades i dessa studier (figur 2A och 2B). Klicka på Åtgärd ROI och posten värden för medelvärdet flux för varje mus. Rita den genomsnittliga fluxen varje signal (p/s) kontra tid.
-
Om absoluta antalet neutrofiler eller S. aureus i såret önskas, utföra de följande experiment.
- För att korrelera neutrofila nummer på Invivo FLI EGFP signaler, sår C57BL/6J möss som beskrivs ovan, och överföra en rad benmärg-derived neutrofiler (5 x 105 till 1 x 107) från LysM-andra eller LysM-EGFPxMyD88- / - givare direkt ovanpå olika sår. Bild som beskrivs ovan och korrelerar det Invivo FLI EGFP signaler till den känd mängden neutrofiler.
- För att korrelera S. aureus CFU på Invivo BLI signaler, sår och smitta möss som beskrivs ovan. Dag 1 efter infektion rekord i vivo BLI signaler från möss och omedelbart avliva och chill slaktkroppar. Punktskatt såret, homogenisera vävnaderna och tallrik bakteriell spädningar på agar för natten inkubation. Nästa dag, räkna kolonier att bestämma CFU per sår.
- Att mäta såret helande passform en cirkulär ROI över såret kant och mått området på såret (cm2) och rita fraktionerad förändringen från baseline vs. tid (figur 2 c).
7. statistik
Obs: Alla data presenteras som genomsnittlig ±SEM. p < 0.05 ansågs statistiskt signifikant
- Ta reda på skillnaderna mellan två grupper på en enda dag med metoden Holm-Sidak, med alfa = 0,05 och analysera varje tidpunkt individuellt, utan antar en konsekvent SD.
- Jämföra skillnader mellan flera grupper på samma dag av envägs ANOVA med den Tukey multipel-jämförelser posttest. Överlevnad mellan experimentella grupper analyserades av metoden Mantel-Cox.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LysM-andra × MyD88- / - möss är mer mottagliga för S. aureus infektion än LysM-andra möss
Stam av S. aureus används i denna studie, ALC290618, byggdes med en plasmid som innehåller de lux -konstruktion som producerar självlysande signaler från levande och aktivt Fettnedbrytande bakterier. När inokuleras i möss, kan i vivo mareld imaging (BLI) tekniker användas att longitudinellt mäta bakterier börda inom ett infekterat sår. Både LysM-andra × MyD88- / - möss och LysM-andra möss sårade och infekterade med 1 x 107 CFU av S. aureus i såret att jämföra deras känslighet för S. aureus infektion. LysM-andra × MyD88- / - möss visade större känslighet för infektioner än LysM-andra möss visat av 80% dödlighet LysM-andra × MyD88- / - möss under de första 8 dagarna av infektion jämfört med 0% dödlighet av LysM-andra möss under den 15-dagars hela experimentet (figur 3A). Båda stammar av möss förlorade ~ 5% kroppsvikt efter infektion, men LysM-andra möss återställt ursprungliga vikt av dag 2, medan LysM-andra × MyD88- / - möss inte återkrävt förlorade vikt (figur 3B). Sårslutning i närvaro av S. aureus infektion skiljde sig inte mellan de två stammarna; sterilely sårade LysM-andra × MyD88- / - hade dock en betydande brist i sårläkning jämfört med LysM-andra möss (figur 3 c), som tidigare rapporterats19. Hela djuret imaging användes för att mäta bakteriell börda dagligen, och så tidigt som dag 1, LysM-andra × MyD88- / - sår hade en högre bakteriell belastning än LysM-andra sår. LysM-andra möss kontrollerade infektion och minskade Invivo BLI signaler i såret, medan LysM-andra × MyD88- / - möss uppvisade en ökning av bakteriell börda som nått sitt tak på dag 4 till djurs död (figur 3D,E). Tillsammans, visar dessa uppgifter på ökad känslighet för LysM-andra × MyD88- / - möss för S. aureus -infektion jämfört med LysM-andra möss.
Neutrofila människohandel är nedsatt hos S. aureus infekterade LysM-andra × MyD88- / - möss jämfört med LysM-andra möss
LysM-andra musen producerar grön fluorescerande neutrofiler på grund av ett andra protein kodade nedströms av lysozym M arrangören12. Denna mus har använts för att studera längsgående Invivo neutrofila människohandel svar på dermal S. aureus infektion13,14,20,21,22. För att jämföra neutrofila kinetik till sår som produceras på LysM-andra och LysM-andra × MyD88- / - möss, en 6 mm full tjocklek hud sår administrerades på handryggen och möss var avbildade dagligen. En 40% minskning av neutrofila människohandel till sår hos LysM-andra × MyD88- / - jämfört med LysM-andra möss (figur 4A, C). När 1 x 107 CFU av S. aureus infördes omedelbart efter såra, neutrofila människohandel var försvagat i båda stammar av möss, men LysM-andra × MyD88- / - möss var mer känsliga för S. aureus infektion med avseende på neutrofila rekrytering. Infektion som orsakat en 50% minskning av inledande neutrofiler människohandel till LysM-andra × MyD88- / - sår jämfört med en minskning med 15% observerats i LysM-andra sår (figur 4B). LysM-andra möss rekryterade också betydligt mer neutrofiler i såret under de senare stadierna av infektion (figur 4A,C) jämfört med LysM-andra × MyD88- / - möss, som kunnat öka neutrofila antal även i de förekomsten av ihållande bakteriell börda. Tillsammans, visar dessa data att LysM-andra × MyD88- / - möss har en defekt i neutrofila rekrytering, vilket är förenligt med deras ökad mottaglighet för S. aureus infektion.
Figur 1: Korrelation mellan OD600 och CFU räknar för ALC2906. 3-4 ALC2906 SH1000 kolonier var plockade från en agarplatta och överförs till TSB med 10 µg/mL kloramfenikol för övernattning kultur. Nästa dag, fjädringen var split 1:50 in i TSB med 10 µg/mL kloramfenikol och odlade. Optisk densitet på 600 nm (OD600) mättes i stamgästmellanrum efter 2 timmar med en spektrofotometer. Vid varje mätning var bakterierna utspädda 1:100,000 i iskalla PBS och aliquoted på en agarplatta för natten inkubation. CFUs var räknas följande dag för att beräkna den ursprungliga koncentrationen och korrelerade till OD600. N = 3 med 4 olika OD600 mätningar per experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representanten regionen intressen (ROIs) för dataanalys. För att analysera Invivo BLI och Invivo FLI signaler, stora, motsvarande storlek ROIs var centrerad över såret och total flux (fotoner per sekund) mättes. För att mäta sårslutning, var en ROI passa till såret kanten och området (cm2) mättes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: LysM-andra × MyD88- / - möss är mer mottagliga för S. aureus -infektion jämfört med LysM-andra möss. LysM-andra och LysM-andra × MyD88- / - möss administrerades en 6 mm sår på handryggen och infekterade med 1 x 107 CFU av självlysande S. aureus eller steril koksaltlösning. Djur övervakades dagligen och (A) överlevnad och (B) vikt registrerades. Djur var avbildade dagligen till åtgärd (C) såret storlek och (D) bakteriell luminiscens. (E) representativa självlysande bilder skildras från infekterade LysM-andra och LysM-andra × MyD88- / - möss. Skalstapeln = 3 mm. Data representerar 7-16 möss per grupp för A, C, och D och 3 möss per grupp för B och uttrycks som genomsnittlig ±SEM. * p = 0,05, ** p = 0,01, ***p = 0,001, *p < 0,0001 mellan infekterade (A, B, < / C18 > och D) eller infekterade (C) grupper. Statistisk signifikans bestämdes med hjälp av Mantel-Cox test (A) och metoden Holm-Sidak (B-D), med alfa = 0,05 och varje tid punkt analyserades individuellt, utan antar en konsekvent SD. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: LysM-andra × MyD88- / - möss har defekta neutrofila rekrytering till infekterade sår.
LysM-andra och LysM-andra × MyD88- / - möss administrerades en 6 mm sår på handryggen och infekterade med 1 x 107 CFU av självlysande S. aureus eller steril koksaltlösning. Djur var avbildade dagligen för att mäta (A, B) neutrofila innehåll. (C) representativa fluorescerande bilder skildras från infekterade och icke-infekterade LysM-andra och LysM-andra × MyD88- / - möss. Skalstapeln = 5 mm. Data representerar 8-16 möss per grupp och uttrycks som genomsnittlig ±SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, och *** p < 0,001 mellan smittade grupper och # p < 0,01 mellan infekterade grupper (A) eller som avbildad på grafen (B). Statistisk signifikans bestämdes med metoden Holm-Sidak (A), med alfa = 0,05 och varje tid punkt analyserades individuellt, utan antar en konsekvent SD och envägs ANOVA (B), med Tukey multipel-jämförelser efter provningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
S. aureus infektion modeller som utnyttjar självlysande S. aureus infektion i en fluorescerande neutrofila reporter mus tillsammans med avancerade tekniker i hela djur Invivo optisk imaging har avancerade vår kunskap om den medfödda immunsvar mot infektion. Tidigare studier med LysM-andra musen har visat att upp till 1 x 107 neutrofiler rekrytera till ett S. aureus infekterade sår under de första 24 h av infektion14och sår-rekryteras neutrofiler utöka sin halveringstid från 1,5 dagar till 5 dagar som svar på en S. aureus-infekterade såret22. En överlevnad taktik anpassad av möss att bekämpa infektion handel av hematopoetiska stamceller och stamceller (HSPC) till ett infekterat sår från benmärgen där de expandera till bakteriedödande andra+ neutrofiler i en TLR2/MyD88/PGE2 koncentrationsberoende sätt21. Extramedullär granulopoes innehåller dessutom en viktig källa av neutrofiler att rädda S. aureus infekterade MyD88- / - möss från dödlig sepsis13. Överföring av HSPC från LysM-andra möss till vildtyp möss gör det möjligt att undersöka lokala neutrofila produktionsprocessen och dess betydelse i kampen mot S. aureus inom en såret13,21. Det är också möjligt att kalibrera just antalet neutrofiler i såret; neutrofila nummer i sår korrelerar linjärt med andra signalen från 1 x 106 till större än 1 x 107 neutrofiler och detektionsgränsen är ca 1 x 106 neutrofiler i en 6 mm såret14.
I våra representativa resultat jämför vi längsgående neutrofiler och S. aureus kinetics i såren för LysM-andra och LysM-andra × MyD88- / -. Vår kunskap är detta den första studien som jämför den bakteriella bördan och neutrofiler handel mellan vildtyp och immunsupprimerade möss längdriktningen genom upplösning av infektion. Av särskilt intresse är graden av neutrofila rekrytering dämpning orsakad av S. aureus infektion i MyD88- / - stam, som framkallade en 15% minskning av neutrofila människohandel vildtyp möss jämfört med en minskning på 50% av MyD88-/ -. S. aureus är kunna undgå värdens immunförsvaret genom att producera ett antal virulensfaktorer kända för att hämma indirekt neutrofila människohandel (dvs., α-toxin, Panton-Valentine leukocidin och chemotaxisna hämmande protein23 , ( 24), och våra resultat visar att MyD88 signalering, sannolikt genom TLR2, TLR4 och IL-1R, är avgörande för att övervinna de strategier som anställd av S. aureus att kringgå värd immunsvar. Virulens faktor-knockout S. aureus stammar kan användas i denna modell för att karakterisera deras effekt på myeloida cell människohandel13. Ytterligare, när studeras i samband med LysM-andra × MyD88- / - musen, denna modell belyser rollen av MyD88 signalering i kampen mot de patogena effekterna av virulensfaktorer.
Det finns flera kritiska steg i detta protokoll som om utförts felaktigt kan införa variabilitet i studier. Såra och infektion förfarandena är enkelt jämfört med andra mus sjukdomsmodeller, men det är inte utan dess krångligheter. Huden punch biopsier är mycket vassa och kan enkelt skuren i spinotrapezius muskeln under huden. Skadar denna muskel och dess fascia förändrar neutrofila rekrytering och ökar variationen mellan möss och en resulterar i en mer invasiv S. aureus -infektion som inte är centrerad i såret. Möss med betydande skador på spinotrapezius muskeln bör uteslutas från studier.
En annan felkälla i denna modell kommer från förändringar i den självlysande S. aureus -stam över tiden, vilket kan förändra Invivo BLI signaler och tillväxt kinetik. Den ALC2906 stammen innehåller en shuttle plasmid som innehåller den modifierade lux operon från Photorhabdus hjälp -konstruktion som krävs för att producera de självlysande signaler, som kan kastas av S. aureus bakterier över tid25. I en buljong kultur utan urval producerade 97% av SH1000 kolonier självlysande signaler på dag 3. Denna frekvens sjunkit till 53% på dag 5 och 21% på dag 1026. Därmed, vid senare tidpunkter under smittsamma, Invivo BLI signalerna kommer sannolikt börjar något (< 1 log skillnaden) underskattar den faktiska in-vivo bakteriella bördan. Det är viktigt att frysa ner färska glycerol bestånd av S. aureus med antibiotika urval att upprätthålla plasmiden vid ankomsten och ersätta fungerande lager av bakterier ofta (dvs., var tredje månad) kan förhindra förlust av den självlysande konstruktion under kultur underhåll. Nyare stammar av självlysande S. aureus innehåller ett stabilt integrerat självlysande konstruera27,28 och är sannolikt en förbättring över den ALC2906 stammen används i denna modell.
Även denna modell är användbart för att studera lokaliserade dermal S. aureus infektioner, det har begränsningar. Invivo BLI signalerar av bakteriell börda begränsas till såret och angränsande hud. Modellen ger inte en tillförlitlig avläsning för djupt invasiva infektioner såsom sepsis och djur måste bli euthanized för att mäta spridning av bakterier i blodet eller njurar13. Nyare och ljusare konstruerade självlysande stammar har genererats som kan möjliggöra upptäckt av Invivo BLI signaler från inre organ27,28. Dessutom längsgående identifiering och övervakning av neutrofila människohandel kan inte mätas i andra vanligen förvärvade S. aureus infektioner, inklusive respiratoriska och blod infektioner. Minskad känslighet på grund av vävnad autofluorescens är också en begränsning av denna modell. Nyligen utvecklade Catchup musen använder en TdTomato RFP under Ly6G Promotorn och kan ha en högre signal-brus-förhållande än LysM-andra musen beror på reducerad vävnad auto fluorescens i RFP kanal11.
Potentiella överhörning mellan Invivo BLI och FLI utsläpp signaler i denna modell är värdig diskussion men är försumbar. Om vi utför experiment utan ljus excitation och bara samla in vivo FLI EGFP signaler med filtret 520/20, iakttar vi inte någon märkbar signaler från infekterade möss, visar att insamlade signaler är från Invivo FLI EGFP signaler och inte från överlappning av Invivo BLI signaler av bakterier (inga data anges). Detta beror främst på den signal collection tid, vilket är bara 1 sekund för Invivo FLI och 1 minut för Invivo BLI en specifik våglängd excitationsfilter 465/30 nm och utsläpp filter 520/20 nm. Dessa inställningar gör för optimal detektering av Invivo FLI EGFP signaler utan bidrag från Invivo BLI signaler. Detta framgår bäst när man jämför storleksordningen av y-axeln mellan 3D-figur och figur 4A. Signalerna från den Invivo BLI är ca 100-fold mindre än Invivo FLI av andra signaler, som visar att Invivo BLI signalerna är försumbar och bidrar till mindre än 1% av de signaler som observeras från Invivo FLI.
Vi förväntar oss att framtida tillämpningar av denna modell hjälper forskare upptäcka och karaktärisera S. aureus virulensfaktorer och fungera som en prekliniska djurmodeller att testa nya behandlingar som syftar till att rensa S. aureus infektion genom att öka den medfödda immunsvar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Lloyd S. Miller har fått bidragsstöd från MedImmune, Pfizer, Regeneron, och Chan snart-Shiong Nanthealth Foundation och konsultarvoden från Noveome Biotherapeutics och Chan snart-Shiong Nanthealth Foundation som är relaterade till det arbete som rapporterade i detta papper. De andra författarna inte har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av nationella institut för hälsa bidrag R01 AI129302 (till S.I.S.) och programmet utbildning i farmakologi: från bänken till säng vid UC Davis (NIH T32 GM099608 till L.S.A). Den molekylära och genomisk Imaging (CMGI) vid University of California Davis gav fantastiskt tekniska stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352059 | |
| 6 mm Disposable Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| Bioluminescent S. aureus | Lloyd Miller, Johns Hopkins | ALC 2906 SH1000 | |
| Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics | VWR | 10118-938 | |
| Buprenoprhine hydrochloride injectable | Western Medical Supply | 7292 | 0.3 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labratory | 000664 | |
| Chloramphenicol (crystalline powder) | Fisher BioReagents | BP904-100 | |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Insulin Syringes | Becton, Dickson and Company | 329461 | 0.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'') |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software – IVIS Spectrum Series | Perkin Elmer | 128113 | |
| LysM-eGFP Mice | Thomas Graff Albert Einstein College of New York | NA | |
| Microvolume Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| MyD88 KO Mice | Jackson Labratory | 009088 | |
| Non-woven sponges | AMD- Ritmed Inc | A2101-CH | 5 cm x 5 cm |
| Povidone Iodine 10% Solution | Aplicare | 697731 | |
| Prism 7.0 | GraphPad Software | License | |
| Tryptic Soy Broth | Becton, Dickson and Company | 211825 |
References
- Moran, G. J., et al. Methicillin-Resistant S. aureus Infections among Patients in the Emergency Department. New England Journal of Medicine. 355 (7), 666-674 (2009).
- Suaya, J. A., et al. Incidence and cost of hospitalizations associated with Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections in the United States from 2001 through 2009. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 296 (2014).
- Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T : a Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
- Blaser, M. J. Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome. Science. 352 (6285), 544-545 (2016).
- Hilliard, J. J., et al. Anti-Alpha-Toxin Monoclonal Antibody and Antibiotic Combination Therapy Improves Disease Outcome and Accelerates Healing in a Staphylococcus aureus Dermonecrosis Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 299-309 (2015).
- Proctor, R. A. Recent developments for Staphylococcus aureus vaccines: clinical and basic science challenges. European Cells & Materials. 30, 315-326 (2015).
- Mölne, L., Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of Neutrophil Leukocytes in Cutaneous Infection Caused by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 68 (11), 6162-6167 (2000).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Borregaard, N. Neutrophils, from Marrow to Microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Miller, L. S., Cho, J. S. Immunity against Staphylococcus aureus cutaneous infections. Nature Reviews Immunology. 11 (8), 505-518 (2011).
- Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nature Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Falahee, P. C., et al. α-Toxin Regulates Local Granulocyte Expansion from Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Staphylococcus aureus-Infected Wounds. Journal of immunology. 199 (5), Baltimore, Md. 1772-1782 (2017).
- Kim, M. -H., et al. Dynamics of Neutrophil Infiltration during Cutaneous Wound Healing and Infection Using Fluorescence Imaging. Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1812-1820 (2008).
- Liese, J., Rooijakkers, S. H. M., Strijp, J. A. G., Novick, R. P., Dustin, M. L. Intravital two-photon microscopy of host-pathogen interactions in a mouse model of Staphylococcus aureus skin abscess formation. Cellular Microbiology. 15 (6), 891-909 (2013).
- Bogoslowski, A., Butcher, E. C., Kubes, P. Neutrophils recruited through high endothelial venules of the lymph nodes via PNAd intercept disseminating Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2449-2454 (2018).
- Takeuchi, O., Hoshino, K., Akira, S. Cutting Edge: TLR2-Deficient and MyD88-Deficient Mice Are Highly Susceptible to Staphylococcus aureus Infection. The Journal of Immunology. 165 (10), 5392-5396 (2000).
- Miller, L. S., et al. MyD88 Mediates Neutrophil Recruitment Initiated by IL-1R but Not TLR2 Activation in Immunity against Staphylococcus aureus. Immunity. 24 (1), 79-91 (2006).
- Macedo, L., et al. Wound healing is impaired in MyD88-deficient mice: a role for MyD88 in the regulation of wound healing by adenosine A2A receptors. The American Journal of Pathology. 171 (6), 1774-1788 (2007).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047 (2012).
- Granick, J. L., et al. Staphylococcus aureus recognition by hematopoietic stem and progenitor cells via TLR2/MyD88/PGE2 stimulates granulopoiesis in wounds. Blood. 122 (10), 1770-1778 (2013).
- Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117 (12), 3343-3352 (2011).
- Foster, T. J. Immune evasion by staphylococci. Nature Reviews Microbiology. 3 (12), 948-958 (2005).
- Gordon, R. J., Lowy, F. D. Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection. Clinical Infectious Diseases. 46 (Supplement_5), S350-S359 (2008).
- Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047-e1003020 (2012).
- Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5 (9), e12580 (2010).
- Plaut, R. D., Mocca, C. P., Prabhakara, R., Merkel, T. J., Stibitz, S. Stably Luminescent Staphylococcus aureus Clinical Strains for Use in Bioluminescent Imaging. PLoS ONE. 8 (3), e59232 (2013).
- Dillen, C. A., et al. Clonally expanded γδ T cells protect against Staphylococcus aureus skin reinfection. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1026-1042 (2018).
