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Immunology and Infection

Um modelo do rato para avaliar a resposta imune inata à infecção de Staphylococcus aureus

Published: February 28, 2019 doi: 10.3791/59015

Summary

Uma abordagem é descrita para a detecção em tempo real da resposta imune inata de ferimento cutâneo e Staphylococcus aureus infecção de ratos. Por LysM-EGFP comparando os ratos (que possuem fluorescentes neutrófilos) com um LysM-EGFP mestiços cepa de rato imunodeficientes, avançamos nossa compreensão da infecção e o desenvolvimento de abordagens para combater a infecção.

Abstract

Staphylococcus aureus Infecções (S. aureus), incluindo manchas resistentes à meticilina, são uma enorme sobrecarga para o sistema de saúde. Com taxas de incidência de infecção de S. aureus escalada anualmente, há uma demanda para a pesquisa adicional em sua patogenicidade. Modelos animais de doenças infecciosas avançam nossa compreensão da resposta do hospedeiro-patógeno e levam ao desenvolvimento de terapêuticas eficazes. Os neutrófilos desempenham um papel primordial na resposta imune inata que controla infecções de S. aureus , formando um abscesso para parede a infecção e facilitar a remoção de bactérias; o número de neutrófilos que se infiltrar em uma infecção de pele de S. aureus , muitas vezes se correlaciona com o resultado de doença. Camundongos LysM-EGFP, que possuem a maior proteína verde fluorescente (EGFP) inserida na região promotora de lisozima M (LysM) (expressada principalmente por neutrófilos), quando usado em conjunto com imagens de fluorescência todo animal in vivo (FLI) fornecem um meios de quantificar a emigração dos neutrófilos canaliza e longitudinalmente na pele ferida. Quando combinado com um bioluminescentes S. aureus estirpe e sequencial imagem bioluminescente todo animal in vivo (BLI), é possível monitorar longitudinalmente a dinâmica do recrutamento de neutrófilos e vivo em carga bacteriana no local da infecção em ratos anestesiados desde precoce da infecção, a resolução ou a morte. Os ratos são mais resistentes a uma série de fatores de virulência produzido por S. aureus que facilitam a colonização eficaz e infecção em seres humanos. Camundongos imunodeficientes fornecem um modelo animal mais sensível para examinar persistente S. aureus infecções e a capacidade da terapêutica para impulsionar inatas respostas imunes. Neste documento, podemos caracterizar respostas em camundongos LysM-EGFP que foram criados para camundongos deficientes em MyD88 (LysM-EGFP × MyD88- / - ratos) juntamente com ratos de LysM-EGFP selvagem-tipo para investigar a infecção de ferida de pele de S. aureus . Multiespectral detecção simultânea habilitado o estudo da dinâmica de recrutamento dos neutrófilos usando FLI in vivo, carga bacteriana usando BLI in vivo e cicatrização longitudinalmente e de forma não invasiva ao longo do tempo.

Introduction

Staphylococcus aureus (S. aureus) é responsável para a maioria das infecções na pele e tecidos moles (SSTIs) no Estados Unidos1. A incidência de methicillin-resistente S. aureus (MRSA) infecções aumentou constantemente durante as últimas duas décadas2, motivando o estudo dos mecanismos de persistência e a descoberta de novas estratégias de tratamento. O padrão de atendimento para infecções por MRSA é antibioticoterapia sistêmica, mas MRSA tornou-se cada vez mais resistente aos antibióticos ao longo do tempo3 e estas drogas podem diminuir microbiome benéfico do hospedeiro, causando efeitos negativos para a saúde, especialmente em crianças4. Estudos pré-clínicos examinaram estratégias alternativas para tratamento de infecções de MRSA5, mas traduzir essas abordagens à clínica revelou-se um desafio devido ao surgimento de fatores de virulência que frustrar de respostas imunes do anfitrião6. Para dissecar a dinâmica hospedeiro-patógeno daquela unidade SSTIs de S. aureus , combinamos não invasiva e leituras longitudinais do número de neutrófilos recrutaram para o leito da ferida com medidas cinéticas de abundância bacteriana e ferida área.

Os neutrófilos são os leucócitos circulantes mais abundante nos seres humanos e as socorristas para uma infecção bacteriana7. Os neutrófilos são um componente necessário para uma resposta eficaz do hospedeiro contra S. aureus infecções devido a seus mecanismos bactericidas, incluindo a produção de espécies reativas de oxigênio, proteases, peptídeos antimicrobianos e respostas funcionais incluindo a fagocitose e a produção de neutrófilos extracelular armadilha8,9. Pacientes humanos com defeitos genéticos na função dos neutrófilos, como a doença granulomatosa crônica e síndrome de Chediak-Higashi, mostram um aumento da susceptibilidade à infecção de S. aureus . Em adição, pacientes com genética (por exemplo, neutropenia congênita) e adquirida (como visto em pacientes de quimioterapia de neutropenia) defeitos em números de neutrófilos também são altamente suscetíveis a S. aureus infecção10. Dada a importância dos neutrófilos em compensação S. aureus infecções, aumentando a sua capacidade imune ou ajuste seus números dentro de uma lesão de S. aureus pode revelar uma estratégia eficaz na resolução de infecção.

Na última década, ratos transgénicos com repórteres de neutrófilos de fluorescência foram desenvolvidos para estudar seu tráfico de11,12. Combinar os ratos repórter neutrófilos com técnicas de imagem todo animais permite análise spatiotemporal de neutrófilos em tecidos e órgãos. Quando combinado com bioluminescentes cepas de S. aureus, é possível controlar o acúmulo de neutrófilos em resposta a abundância de S. aureus e persistência no contexto da virulência bacteriana fatores que direta e indiretamente perturb neutrófilos números no tecido afetado13,14,15,16.

Os ratos são menos suscetíveis a mecanismos de evasão de virulência e imune de S. aureus que os humanos. Como tal, ratos do selvagem-tipo não podem ser um modelo animal ideal para investigar a eficácia de um dado terapêutico para tratar a crônica de S. aureus infecção. Deficiência de MyD88 ratos (ou seja, MyD88- / - ratos), uma cepa de rato imunocomprometidos que carece de receptor funcional interleucina-1 (IL-1R) e Toll-like receptor (TLR) sinalização, mostrar maior susceptibilidade à infecção de S. aureus em comparação com rato do selvagem-tipo17 e um comprometimento em tráfico de neutrófilos para um site de S. aureus infecção na pele18. Desenvolvimento de uma cepa de rato que possui um repórter neutrófilos fluorescente no MyD88- / - ratos forneceu um modelo alternativo para investigar a eficácia de terapias para tratar a infecção de S. aureus em relação ao atual neutrófilos ratos de repórter.

Neste protocolo, podemos caracterizar a infecção de S. aureus nos imunocomprometidos LysM-EGFP × MyD88- / - ratos e comparar a evolução temporal e resolução de infecção com os camundongos LysM-EGFP. LysM-EGFP × MyD88- / - ratos desenvolvem uma infecção crônica que não resolve, e 75% sucumbem à infecção após 8 dias. Um defeito significativo no recrutamento de neutrófilos inicial ocorre mais de 72 h da fase inflamatória da infecção, e menos de 50% neutrófilos recrutam durante o último estágio da infecção. O aumento da susceptibilidade da LysM-EGFP × MyD88 ratos- / - isso torna particular Coe um rigoroso modelo pré-clínicos para avaliar a eficácia de novas técnicas terapêuticas visando a infecção de S. aureus em relação ao atual que modela Utilize o selvagem-tipo ratos, especialmente técnicas com o objetivo de aumentar a resposta imune inata contra infecção.

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Protocol

Todos os estudos de rato foram revisados e aprovados pelo Comitê de uso na UC Davis e institucional Cuidado Animal e foram realizados de acordo com as diretrizes do Animal Welfare Act e o ato de extensão de pesquisa de saúde. Não se esqueça de usar luvas estéreis, ao trabalhar com animais.

1. mouse fonte e habitação

  1. Derivar de camundongos LysM-eGFP sobre um fundo genético C57BL/6J conforme descrito anteriormente,12. Derive LysM-EGFP × MyD88- / - os ratos por travessia camundongos LysM-EGFP com MyD88- / - ratos em um fundo de C57BL/6J.
  2. Ratos de casa em um viveiro. Para estes estudos, os animais estavam alojados na Universidade da Califórnia, Davis em grupos antes da cirurgia e cirurgia seguir alojada única. Use o rato entre as idades de 10-16 semanas.

2. quantificação e preparação bacteriana

  1. Remover o bioluminescentes cepa S. aureus de interesse do armazenamento-80 ° C para descongelar no gelo. Raia em uma placa de ágar de sangue bovino de 5%. Incube a placa listras em uma incubadora umidificada a 37 ° C durante a noite (16 h).
    Nota: No presente protocolo, a estirpe ALC2906 SH1000 foi usada. Esta estirpe contém o vaivém do plasmídeo pSK236 com o promotor de proteína ligadora de penicilina 2 fundido ao estojo repórter luxABCDE de Photohabdus luminescens18.
  2. Prepare o caldo tryptic soja (TSB) misturando 0,03 g de pó TSB por mL de água pura e autoclave TSB para esterilizar. Quando esfriar, adicione qualquer antibiótico necessário usando uma técnica estéril. Neste protocolo, adicione 10 µ g/mL de cloranfenicol18 para o TSB para selecionar para a expressão do plasmídeo de transporte para o pSK236, que contém a fita de luxABCDE de bioluminescência.
  3. Escolha 3-4 colónias separadas da placa de S. aureus em TSB com 10 cloranfenicol µ g/mL para iniciar uma cultura durante a noite. Incube as bactérias em um agitador de incubação a 37 ° C durante a noite (16 h).
  4. Inicie uma nova cultura bacteriana da cultura durante a noite, diluindo-se uma amostra 01:50 em TSB com 10 cloranfenicol µ g/mL. Cultura em um shaker incubação a 200 rpm e 37 ° C.
  5. Duas horas depois de dividir o S. aureus, monitorar a densidade óptica em 600 nm (OD600) em um espectrofotômetro. Observe o OD600 vs tempo para encontrar o crescimento fase meados-logarítmica. Para a tensão de ALC2906 SH1000, uma OD600 de 0.5 é meados-logarítmica e corresponde a uma concentração de 1 x 108 UFC/mL (Figura 1).
  6. Quando OD600 é 0.5, lave as bactérias 1:1 com DPBS gelada. Centrifugar as bactérias durante 10 minutos a 3.000 x g e 4 ° C. Cuidadosamente, decante o sobrenadante e adicionar adicionais DPBS refrigerados e vórtice completamente. Centrífuga, mais uma vez, durante 10 minutos a 3.000 x g e 4 ° C.
  7. Cuidadosamente, decante o sobrenadante. Resuspenda o pellet bacteriano em uma concentração desejada. Para estes estudos, coletar 3 mL de ALC2906 SH1000 e ressuspender em 1,5 mL de PBS, correlacionando a uma concentração de bactérias de cerca de 2 x 108 UFC/mL. Mantenha as bactérias no gelo até o uso.
  8. Para verificar a concentração de bactérias, dilua 100 µ l da amostra bacteriana 1:10,000 e 1: 100.000 em PBS. Placa 20 alíquotas µ l sobre uma placa de ágar. Incubar a 37 ° C numa incubadora umidificado para 16 h. Conde CFUs por exame bruto e calcular uma concentração bacteriana no dia seguinte.

3. excisional Wounding pele e inoculação com S. aureus

  1. Administre 100 µ l de cloridrato de buprenorfina 0,03 mg/mL (~0.2 mg/kg) para cada rato via intraperitoneal da injeção.
  2. Pós-injeção de vinte minutos, lugar 2-4 ratos em uma câmara com o oxigênio de 2-3 LPM com 2-4% de isoflurano. Uma vez que os ratos são totalmente anestesiados, transferi os ratos de uma vez para um cone de nariz ligado ao oxigênio de 2-3 LPM com 2-4% de isoflurano. Verifique se os ratos são totalmente anestesiados beliscando firmemente cada pata traseira entre um polegar e o indicador. Prossiga para a próxima etapa, se o animal não responder para o aperto.
  3. Raspar uma 1 polegada por secção de 2 polegadas na parte traseira do mouse com tosquiadeiras elétricas e limpar a área de recortes de pele usando uma limpeza limpa ou gaze. Evite usar creme depilatório, pois pode causar inflamação em excesso.
  4. Limpo, o parte de trás do mouse primeiro com gaze embebido iodo-povidona 10% e, em seguida, com um etanol a 70% embebido gaze. Limpe a área em um padrão espiral, movendo-se para fora do centro da área cirúrgica. Espere aproximadamente 1 min. para a área cirúrgica secar antes da cirurgia.
  5. Segure o raspado atrás o mouse levemente entre os dedos e pressione firmemente uma biópsia do perfurador estéril de 6 mm no centro da área cirúrgico preparado. Não puxe a pele esticada.
    1. Torça a biópsia do perfurador para criar um contorno circular na pele que corta totalmente através da pele pelo menos uma seção da estrutura de tópicos. Tenha cuidado para não cortar o fáscia ou tecido subjacente.
    2. Use uma tesoura esterilizada e pinça para cortar através da epiderme e derme seguindo o padrão circular imprimido pela biópsia do perfurador.

4. S. aureus inoculação

  1. Encha uma seringa de insulina de 28 G com o inóculo bacteriano bioluminescente desejado. Neste estudo, administrar uma concentração de 1 x 108 UFC/mL (50 µ l). Não administre mais de 100 µ l de volume.
  2. Injete 50 µ l de inóculo entre a fáscia e tecido no centro da ferida na parte de trás do mouse. Certifique-se de que o inóculo forma uma bolha no centro da ferida com vazamento mínimo ou dispersão.
    1. Puxe a derme para o lado, segurar a seringa quase paralela ao tecido e empurre lentamente a seringa no tecido até sentir uma súbita diminuição na resistência, que indica a perfuração da fáscia. Cuidadosamente, levar a seringa para o centro da ferida e dispense o inóculo lentamente. Remova a seringa lentamente do animal.
  3. Injete o mesmo volume de PBS estéril as feridas dos animais não infectados como descrito acima.
  4. Retorno do animal para sua gaiola. Coloque a gaiola sob uma lâmpada de calor ou em cima de uma almofada de aquecimento e monitorar o animal até a recuperação da anestesia.

5. em BLI Vivo e FLI

  1. Inicialize o tonalizador todo animal através do software do instrumento. ANESTHETIZE ratos numa câmara recebendo oxigênio 2-3 LPM com 2-4% de isoflurano. Entrega a anestesia para os nosecones dentro do sistema de imagem.
  2. Posicione o mouse infectado e ferido para a câmera. Posicione o mouse tal que a ferida é tão plana quanto possível. Use a seguinte configuração de sequência para os ratos de imagem.
    1. Selecione a luminescência e fotografar como o modo de imagem. O tempo de exposição é de 1 min no pequeno binning e F/stop 1 (luminescência) e 8 (fotografia) de F/stop. O filtro de emissão está aberto. Clique no botão adquirir para gravar a imagem.
    2. Selecione a fluorescência e fotografar como o modo de imagem. O tempo de exposição é 1 s em pequenas binning e 1 de F/stop (fluorescência) e 8 (fotografia) de F/stop com um comprimento de onda de excitação de 465/30 nm e uma nm de comprimento de onda de 520/20 de emissão com uma intensidade de luz alta. Clique no botão adquirir para gravar a imagem.
  3. Retorno do animal para sua gaiola e monitor até à recuperação da anestesia.
  4. Imagem ratos diariamente conforme descrito acima.

6. análise de imagens

  1. Abrir imagens para ser quantificada.
  2. Coloque uma grande região circular de interesse (ROI) sobre a área ferida toda incluindo circundantes da pele para cada rato na imagem. Os neutrófilos em vivo que FLI EGFP sinais e vivo em sinais BLI S. aureus estende além da borda da ferida, depois de vários dias e foram incluído nestes estudos (Figura 2A e 2B). Clique em Medida ROI e valores de registo para fluxo médio para cada rato. Traça o fluxo médio de cada sinal (p/s) versus tempo.
  3. Se o número absoluto de neutrófilos ou S. aureus na ferida é desejado, realize os experimentos seguintes.
    1. Para correlacionar números dos neutrófilos para os sinais de FLI EGFP in vivo, ferida de camundongos C57BL/6J como descrito acima e transferir uma gama de derivados da medula óssea de neutrófilos (5 x 105 1 x 107) de LysM-EGFP ou LysM-EGFPxMyD88- / - doadores diretamente em cima de ferimentos diferentes. Imagem conforme descrito acima e correlacionar a vivo em FLI EGFP sinaliza para a quantidade de neutrófilos.
    2. Para correlacionar S. aureus CFU aos sinais BLI in vivo, ferida e infectar ratos como descrito acima. No dia 1 pós-infecção registro vivo em BLI sinais de ratos e imediatamente eutanásia e frio carcaças. Impostos especiais de consumo a ferida, homogeneizar o tecido e placa bacterianas diluições em ágar para incubação durante a noite. No dia seguinte, contagem das colónias para determinar CFU por ferida.
  4. Para medir a ferida cura ajuste um ROI circular sobre a borda da ferida e a medida da área da ferida (cm2) e plotar a mudança fracionária da linha de base vs. tempo (Figura 2).

7. estatísticas

Nota: Todos os dados são apresentados como média ±SEM. p < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

  1. Determinar as diferenças entre os dois grupos em um único dia, usando o método Holm-Sidak, com alfa = 0,05 e analisar cada ponto de tempo individualmente, sem assumir uma consistente SD
  2. Compare as diferenças entre os vários grupos no mesmo dia por One-Way ANOVA com o Tukey múltiplas comparações depois do teste. Sobrevivência entre grupos experimentais foi analisada pelo método de Mantel-Cox.

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Representative Results

LysM-EGFP × MyD88- / - os ratos são mais suscetíveis à infecção de S. aureus que camundongos LysM-EGFP

A cepa de S. aureus utilizado neste estudo, ALC290618, foi construído com um plasmídeo que contém a construção de lux que produz sinais bioluminescentes de bactérias vivas e ativamente metabolisante. Quando inoculado em camundongos, bioluminescência em vivo de imagens técnicas (BLI) pode ser usada para medir a carga de bactérias dentro de uma ferida infectada longitudinalmente. Ambos LysM-EGFP × MyD88- / - ratos e camundongos LysM-EGFP foram feridos e infectados com 1 x 107 UFC de S. aureus na ferida para comparar sua susceptibilidade à infecção de S. aureus . Os ratos LysM-EGFP × MyD88- / - mostraram maior susceptibilidade à infecção do que camundongos LysM-EGFP demonstram por 80% de letalidade de LysM-EGFP × MyD88- / - ratos durante os primeiros 8 dias de infecção, em comparação com 0% de letalidade de camundongos LysM-EGFP durante o toda duração de 15 dias do experimento (Figura 3A). Ambas as cepas de ratos perderam peso corporal ~ 5%, após a infecção, mas camundongos LysM-EGFP recuperaram peso original por dia 2, enquanto LysM-EGFP × MyD88- / - ratos não recuperou o peso perdido (Figura 3B). Fechamento da ferida na presença de infecção de S. aureus não foi diferente entre as duas variedades; no entanto, sterilely feridos LysM-EGFP × MyD88- / - tinha um defeito significativo na cicatrização de feridas em comparação com camundongos LysM-EGFP (Figura 3), como relatado anteriormente,19. Todo animal de imagem foi usado para medir a carga bacteriana diariamente, e já no dia 1, LysM-EGFP × MyD88- / - feridas tinham uma carga bacteriana superior do LysM-EGFP feridas. Camundongos LysM-EGFP controlada a infecção e diminuíram em vivo BLI sinais na ferida, enquanto os ratos LysM-EGFP × MyD88- / - exibiram um aumento na carga bacteriana que se estabilizou no dia 4 até a morte de animais (Figura 3D,E). Juntos, estes dados demonstram o aumento da susceptibilidade de LysM-EGFP × MyD88- / - ratos a infecção de S. aureus em comparação com camundongos LysM-EGFP.

Tráfico de neutrófilos é prejudicado em S. aureus infectadas LysM-EGFP × MyD88- / - os ratos em comparação com camundongos LysM-EGFP

O mouse LysM-EGFP produz neutrófilos fluorescentes verdes devido a uma proteína EGFP codificado a jusante do promotor lisozima M12. Este rato tem sido utilizado para o estudo longitudinal tráfico neutrófilos in vivo em resposta a dérmica S. aureus infecção13,14,20,21,22. Para comparar a cinética dos neutrófilos para feridas produzidas na LysM-EGFP e LysM-EGFP × MyD88- / - ratos, uma ferida de pele de toda a sua espessura de 6 mm foi administrada no dorso, e os ratos foram fotografados diariamente. Foi observada uma diminuição de 40% no tráfico de neutrófilos para feridas em LysM-EGFP × MyD88- / - em comparação com camundongos LysM-EGFP (Figura 4A, C). Quando 1 x 107 UFC de S. aureus foi introduzido imediatamente após ferimento, tráfico de neutrófilos foi atenuado em ambas as cepas de ratos, mas LysM-EGFP × MyD88- / - ratos foram mais sensíveis à infecção de S. aureus com respeito ao recrutamento de neutrófilos. Infecção causada um 50% diminuição de neutrófilos inicial tráfico LysM-EGFP × MyD88- / - feridas em comparação a uma diminuição de 15% observada em feridas LysM-EGFP (Figura 4B). Camundongos LysM-EGFP recrutaram também significativamente mais neutrófilos na ferida durante as fases posteriores da infecção (Figura 4A,C) em comparação com LysM-EGFP × MyD88- / - ratos, que não foram capazes de aumentar o número de neutrófilos mesmo na presença de carga bacteriana sustentada. Juntos, estes dados demonstram que o LysM-EGFP × MyD88- / - os ratos têm um defeito no recrutamento de neutrófilos, que é consistente com sua maior suscetibilidade à infecção de S. aureus .

Figure 1
Figura 1: Correlação entre OD600 e CFU conta para ALC2906. 3-4 ALC2906 SH1000 colônias foram colhidas a partir de uma placa de ágar e transferidas para TSB com 10 cloranfenicol µ g/mL para a cultura durante a noite. No dia seguinte, a suspensão era 01:50, divididos em TSB com 10 cloranfenicol µ g/mL e culta. Densidade óptica em 600 nm (OD600) foi medido em intervalos regulares após 2 horas usando um espectrofotômetro. Em cada medição, a bactéria foi diluído 1: 100.000 em PBS gelado e aliquotadas em uma placa de ágar para incubação durante a noite. CFUs foram contados no dia seguinte calcular a concentração inicial e correlacionados com OD600. N = 3, com 4 diferentes medições de600 OD por experiência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: região representativa dos interesses (ROIs) para análise de dados. Para analisar BLI in vivo e in vivo FLI sinais, grandes, ROIs tamanhos equivalentes foram centradas sobre a ferida e o fluxo total (fótons por segundo) foi medido. Para medir o fechamento da ferida, um ROI era apto para a borda da ferida e área (cm2) foi medida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: LysM-EGFP × MyD88- / - os ratos são mais suscetíveis à infecção de S. aureus em comparação com camundongos LysM-EGFP. LysM-EGFP e LysM-EGFP × MyD88- / - ratos foram administrados um 6mm ferida no dorso e infectados com 1 x 107 UFC de bioluminescentes S. aureus ou soro fisiológico estéril. Os animais foram monitorados diariamente e sobrevivência do (A) e (B) peso foram gravadas. Os animais foram fotografados diariamente para o tamanho do ferimento de medida (C) e (D) bacteriana luminescência. (E) imagens bioluminescentes representativas são retratadas de infectados LysM-EGFP e LysM-EGFP × MyD88- / - ratos. Barra de escala = 3 mm. dados representam 7-16 ratos por grupo para A, C, e D e 3 ratos por grupo para B e são expressos como média ±SEM. * p = 0,05, * * p = 0,01, * * *p = 0,001, *p < 0,0001 entre infectados (A, B, < / C18 > e D) ou (C) grupos de infectados. Significância estatística foi determinada utilizando o teste de Mantel-Cox (A) e o método de Holm-Sidak (B-D), com alfa = 0,05 e cada vez que ponto foi analisado individualmente, sem assumir uma consistente SD. por favor clique aqui para ver um maior versão desta figura.

Figure 4
Figura 4: LysM-EGFP × MyD88- / - os ratos têm o recrutamento dos neutrófilos defeituoso para feridas infectadas.
LysM-EGFP e LysM-EGFP × MyD88- / - ratos foram administrados um 6mm ferida no dorso e infectados com 1 x 107 UFC de bioluminescentes S. aureus ou soro fisiológico estéril. Os animais foram fotografados diariamente para medir o teor de neutrófilos (A, B). (C) imagens fluorescentes representativas são retratadas de infectados e não infectados LysM-EGFP e LysM-EGFP × MyD88- / - ratos. Barra de escala = 5 mm. representam dados 8-16 ratos por grupo e são expressos como média ±SEM. * p < 0.05, * * p < 0,01, e * * * p < 0,001 entre grupos de infectados e # p < 0,01 entre não infectados grupos (A) ou como retratado no gráfico (B). Significância estatística foi determinada utilizando o método de Holm-Sidak (A), com alfa = 0,05 e cada vez que ponto foi analisado individualmente, sem assumir um SD consistente e ANOVA One-Way (B), com as múltiplas de Tukey-comparações pós-teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Modelos de infecção de S. aureus que utilizam bioluminescentes S. aureus infecção em um rato de repórter neutrófilos fluorescente em conjunto com técnicas avançadas de imagem óptica em vivo todo animal tem nossa conhecimento avançado da inata resposta imune à infecção. Usando o mouse LysM-EGFP de estudos anteriores mostraram que acima de 1 x 107 neutrófilos recruta para uma ferida infectada de S. aureus durante as primeiras 24 horas de infecção14e ferida-recrutados neutrófilos estendem sua meia-vida de 1,5 dias a 5 dias em resposta a um S. aureus-infectados ferida22. Uma tática de sobrevivência adaptada por ratos para combater a infecção é o tráfico de tronco hematopoiético e células progenitoras (HSPC) de uma ferida infectada da medula óssea onde eles expandem em bactericida neutrófilos EGFP+ em um TLR2/MyD88/PGE2 21. forma dependente. Além disso, extra-medulares granulopoiesis fornece uma fonte essencial de neutrófilos para resgatar o S. aureus infectado MyD88- / - ratos de sepse letal13. Transferência adotiva de HSPC de camundongos LysM-EGFP em ratos tipo selvagem torna possível examinar o processo de produção local dos neutrófilos e sua importância na luta contra o S. aureus dentro de uma ferida de13,21. Também é possível calibrar precisamente o número de neutrófilos na ferida; número de neutrófilos nas feridas correlaciona linearmente com sinal EGFP de 1 x 106 para maior que 1 x 107 neutrófilos e o limite de detecção é de cerca de 1 x 106 neutrófilos em uma ferida de 6mm14.

Em nossos resultados representativos comparamos neutrófilos longitudinal e cinética de S. aureus nas feridas LysM-EGFP e LysM-EGFP × MyD88- / -. A nosso conhecimento, é o primeiro estudo que compara a carga bacteriana e neutrófilos tráfico entre tipo selvagem e ratos imunodeprimidos longitudinalmente através de resolução da infecção. De particular interesse é o grau de atenuação de recrutamento de neutrófilos, causada pela infecção de S. aureus em MyD88- / - cepa, que provocou uma diminuição de 15% no tráfico neutrófilos de ratos tipo selvagem, comparados com uma diminuição de 50% no MyD88-/ -. S. aureus é capaz de escapar a resposta de imune do hospedeiro, produzindo uma série de fatores de virulência conhecido indiretamente inibir tráfico de neutrófilos (ou seja,, α-toxina, leukocidin de Panton-Valentine e quimiotaxia proteína inibitória23 , 24), e nossos resultados indicam que a sinalização MyD88, provavelmente através de TLR2, TLR4 e IL-1R, é fundamental para superar as estratégias empregadas por S. aureus para iludir respostas imunes de anfitrião. Factor de virulência-nocaute S. aureus estirpes podem ser usadas neste modelo para caracterizar o seu efeito em células mieloides tráfico de13. Além disso, quando estudou em conjunto com o LysM-EGFP × MyD88- / - mouse, este modelo destaca o papel do MyD88 sinalização na luta contra os efeitos patogénicos de fatores de virulência.

Existem vários passos críticos no presente protocolo que se realizada de forma inadequada pode introduzir variabilidade nos estudos. Os procedimentos de ferimento e infecção são simples em comparação com outros modelos de doença de rato, mas não é sem seus meandros. Biópsias de pele soco são muito afiadas e podem facilmente cortar no músculo spinotrapezius abaixo da pele. Danificar este músculo e sua fáscia altera o recrutamento dos neutrófilos e aumenta a variabilidade entre ratos e um resulta em uma infecção de S. aureus mais invasivo que não é centralizado dentro da ferida. Ratos com danos significativos para o músculo spinotrapezius devem ser excluídos de estudos.

Outra fonte de erro neste modelo vem de alterações no bioluminescentes cepa S. aureus , ao longo do tempo, que pode alterar em vivo BLI sinais e cinética de crescimento. A tensão de ALC2906 contém um plasmídeo de transporte que contém o operon modificados lux de construção Photorhabdus luminescens que é necessário para produzir os sinais bioluminescentes, que podem ser descartados pela bactéria S. aureus ao longo do tempo25. Em um caldo de cultura sem seleção, 97% das colônias SH1000 produziu bioluminescentes sinais no dia 3. Esta frequência caiu para 53% no dia 5 e 21% em 10 dia26. Assim, nos pontos de tempo mais tarde durante o curso infeccioso, os sinais BLI em vivo provavelmente começará a ligeiramente (< diferença 1 log) subestima a carga bacteriana reais na vivo . É importante congelar para baixo de estoques de glicerol frescos de S. aureus com seleção de antibióticos para manter o plasmídeo à chegada e substituindo o trabalho estoques de bactérias frequentemente (ou seja,, cada três meses) pode ajudar a prevenir a perda do bioluminescente construção durante a manutenção da cultura. Novas cepas de bioluminescentes S. aureus contêm um constructo bioluminescentes integrado estàvel27,28 e são provavelmente uma melhoria sobre a ALC2906 as estirpes utilizadas neste modelo.

Enquanto este modelo é útil para estudar dérmicas localizadas S. aureus infecções, tem limitações. Os sinais BLI in vivo da carga bacteriana é limitado para a ferida e a pele adjacente. O modelo não fornece uma leitura confiável para infecções profundas invasivas tais como sepse, e os animais devem ser sacrificados para medir a difusão de bactérias para a corrente sanguínea ou rins13. Mais recentes e mais brilhante projetou bioluminescentes estirpes foram geradas que pode permitir a detecção de sinais BLI in vivo de órgãos internos27,28. Além disso, a pesquisa longitudinal e ao controlo do tráfico de neutrófilos não podem ser medidos em outras comumente adquirida S. aureus infecções, incluindo respiratório e infecções do sangue. Sensibilidade reduzida devido a autofluorescência de tecido também é uma limitação deste modelo. O rato de Catchup recentemente desenvolvido utiliza um TdTomato RFP sob o promotor Ly6G e pode ter um sinal / ruído maior do que o mouse LysM-EGFP devido à reduzida fluorescência de auto tecido na RFP canal11.

A potencial interferência entre sinais de emissão BLI e FLI in vivo neste modelo é digna de discussão, mas é insignificante. Se realizar experimentos sem excitação luz e só recebem sinais de FLI EGFP in vivo usando o filtro de 520/20, não observamos sinais apreciáveis de ratos infectados, demonstrando que os sinais coletados são sinais de FLI EGFP in vivo e não de sobreposição dos sinais BLI in vivo das bactérias (dados não mostrados). Isto é principalmente devido ao tempo de coleta de sinal, que é apenas 1 segundo para um filtro de comprimento de onda de excitação específica do filtro de 465/30 nm e emissão de 520/20 e 1 minuto para BLI in vivo e in vivo FLI nm. Essas configurações permitam óptima detecção de sinais de FLI EGFP em vivo sem contribuição de sinais BLI in vivo. Este é o melhor demonstrada comparando-se a ordem de grandeza do eixo y entre Figura 3D e Figura 4A. Os sinais do BLI in vivo é aproximadamente 100-fold menos do que os sinais de FLI da EGFP in vivo, indicando que os sinais BLI in vivo são negligenciáveis e contribuem para menos de 1% dos sinais observados de FLI in vivo.

Esperamos que as aplicações futuras deste modelo ajudará pesquisadores descobrir e caracterizar os fatores de virulência de S. aureus e servir como um modelo animal pré-clínico para testar novas terapêuticas que visam limpar a infecção de S. aureus , aumentando a resposta imune inata.

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Disclosures

Lloyd S. Miller recebeu apoio de concessão da MedImmune, Pfizer, Regeneron e Chan Soon-Shiong Nanthealth Fundação e consultoria taxas de Noveome Biotherapeutics e Fundação de Nanthealth Chan Soon-Shiong que estão relacionadas com o trabalho relatado Neste trabalho. Os outros autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pela National institutos de saúde subsídios R01 AI129302 (para s.i.s.) e o programa de formação em farmacologia: da bancada ao lado da cama na UC Davis (NIH T32 GM099608 para L.S.A). O Molecular e genômica Imaging (CMGI) na Universidade da Califórnia Davis fornecido suporte tecnológico soberbo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Falcon 352059
6 mm Disposable Biopsy Punch Integra Miltex 33-36
Bioluminescent S. aureus Lloyd Miller, Johns Hopkins  ALC 2906 SH1000
Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics VWR 10118-938
Buprenoprhine hydrochloride injectable Western Medical Supply 7292 0.3 mg/mL
C57BL/6J Mice Jackson Labratory 000664
Chloramphenicol (crystalline powder) Fisher BioReagents BP904-100
DPBS (1x) Gibco  14190-144
Insulin Syringes Becton, Dickson and Company 329461 0.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'')
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Perkin Elmer 124262
Living Image Software – IVIS Spectrum Series Perkin Elmer 128113
LysM-eGFP Mice Thomas Graff Albert Einstein College of New York  NA
Microvolume Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-2000
MyD88 KO Mice Jackson Labratory 009088
Non-woven sponges AMD- Ritmed Inc A2101-CH 5 cm x 5 cm
Povidone Iodine 10% Solution Aplicare 697731
Prism 7.0 GraphPad Software License 
Tryptic Soy Broth Becton, Dickson and Company 211825

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Um modelo do rato para avaliar a resposta imune inata à infecção de <em>Staphylococcus aureus</em>
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Anderson, L. S., Reynolds, M. B.,More

Anderson, L. S., Reynolds, M. B., Rivara, K. R., Miller, L. S., Simon, S. I. A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection. J. Vis. Exp. (144), e59015, doi:10.3791/59015 (2019).

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