Summary
Se describe un enfoque para la detección en tiempo real de la respuesta inmune innata a heridas cutáneas y la infección de Staphylococcus aureus de los ratones. Por que comparan LysM-EGFP ratones (que poseen fluorescentes neutrófilos) con un LysM-EGFP mestizas cepa de ratón inmunodeficiente, avanzar en nuestra comprensión de la infección y el desarrollo de enfoques para combatir la infección.
Abstract
Staphylococcus aureus Infecciones (S. aureus), incluyendo las manchas resistentes a la meticilina, son una enorme carga en el sistema de salud. Con tasas de incidencia de infección de S. aureus que sube anualmente, hay una demanda para la investigación adicional en su patogenicidad. Modelos animales de enfermedades infecciosas avanzan nuestro entendimiento de la respuesta del huésped-patógeno y conducen al desarrollo de la terapéutica eficaz. Neutrófilos juegan un papel primario en la respuesta inmune innata que controla las infecciones de S. aureus mediante la formación de un absceso de la pared la infección y facilitar la remoción bacteriana; el número de neutrófilos que infiltran a menudo una infección de la piel de S. aureus se correlaciona con el resultado de la enfermedad. Ratones LysM-EGFP, que poseen la mayor proteína verde fluorescente (EGFP) en la región del promotor lisozima M (LysM) (expresada sobre todo por los neutrófilos), cuando se utiliza junto con imágenes de fluorescencia de todo animal en vivo (FLI) proporcionan un medio de cuantificar la emigración de neutrófila no invasor y longitudinalmente en la piel herida. Cuando se combina con un bioluminiscente S. aureus cepa y secuencial en vivo todo animal bioluminiscente la proyección de imagen (BLI), es posible monitorizar longitudinalmente la dinámica de reclutamiento de neutrófilos y la carga bacteriana en vivo en el sitio de infección en ratones anestesiados de aparición de la infección a la resolución o la muerte. Los ratones son más resistentes a un número de factores de virulencia de S. aureus que facilitan la efectiva colonización y la infección en seres humanos. Ratones inmunodeficientes son un modelo animal más sensible para examinar persistente S. aureus las infecciones y la capacidad de la terapéutica para estimular la respuesta inmune innata. Aquí, se caracterizan las respuestas en ratones LysM-EGFP que han sido criados a los ratones deficientes en MyD88 (EGFP LysM × MyD88- / - ratones) junto con ratones de tipo salvaje LysM-EGFP investigar S. aureus piel infección de la herida. Detección simultánea multiespectral había habilitado estudio de dinámica de reclutamiento de neutrófilos mediante el uso de FLI en vivo, carga bacteriana mediante el uso de BLI en vivo y cicatrización longitudinalmente y no invasor con el tiempo.
Introduction
Staphylococcus aureus (S. aureus) representa la mayoría de la piel y las infecciones de tejidos blandos (SETSI) en los Estados Unidos1. La incidencia de methicillin-resistente S. aureus (MRSA) infecciones ha aumentado constantemente en los últimos dos décadas2, motivar el estudio de los mecanismos de persistencia y el descubrimiento de nuevas estrategias de tratamiento. El estándar del cuidado para las infecciones de MRSA es la terapia antibiótico sistémica, pero MRSA se ha convertido en cada vez más resistente a los antibióticos en tiempo3 y estas drogas pueden disminuir la microbioma beneficiosos del anfitrión, causando efectos negativos en la salud, especialmente en los niños4. Estudios preclínicos han examinado estrategias alternativas para el tratamiento de las infecciones de MRSA5, pero traducir estos enfoques a la clínica ha demostrado ser un reto debido a la aparición de factores de virulencia que frustrar anfitrión inmunorespuestas6. Para diseccionar la dinámica huésped-patógeno que impulsan S. aureus SETSI, combinamos no invasiva y longitudinales lecturas del número de neutrófilos reclutaron al lecho de la herida con medidas cinéticas de la abundancia bacteriana y área de la herida.
Neutrófilos son los leucocitos circulantes más abundantes en los seres humanos y los primeros respondientes a una infección bacteriana7. Neutrófilos son un componente necesario para una respuesta eficaz del anfitrión contra infecciones por S. aureus debido a sus mecanismos bactericidas, incluyendo la producción de especies reactivas del oxígeno, proteasas, péptidos antimicrobianos y respuestas funcionales como fagocitosis neutrófilo trampa extracelular producción8,9. Pacientes humanos con defectos genéticos en la función del neutrófilo, como el síndrome de Chediak-Higashi, enfermedad granulomatosa crónica muestran una mayor susceptibilidad a la infección por S. aureus . Además, los pacientes con genética (como la neutropenia congénita) y adquiridas (como la neutropenia en pacientes de la quimioterapia) defectos en los números de neutrófilos también son altamente susceptibles a la infección de S. aureus 10. Dada la importancia de los neutrófilos en la limpieza de las infecciones de S. aureus , potenciar su capacidad inmune o templar sus números dentro de una lesión de S. aureus puede resultar una estrategia eficaz en la resolución de la infección.
En la última década, se han desarrollado ratones transgénicos con reporteros neutrófilo fluorescencia para estudiar su tráfico de11,12. Combinación de ratones reportero neutrófilo con técnicas de imagen todo animales permite análisis espacio-temporales de los neutrófilos en los tejidos y órganos. Cuando se combina con bioluminiscentes cepas de S. aureus, es posible rastrear la acumulación de neutrófilos en respuesta a la abundancia de S. aureus y persistencia en el contexto de la virulencia bacteriana factores que directa e indirectamente perturbar el número de neutrófilo en el tejido afectado13,14,15,16.
Los ratones son menos susceptibles a S. aureus virulencia e inmune mecanismos de evasión que los seres humanos. Como tal, ratones de tipo salvaje no pueden ser un modelo animal ideal para investigar la eficacia de un dado terapéutica para el tratamiento crónico de S. aureus la infección. Ratones deficientes en MyD88 (es decir, MyD88- / - ratones), una cepa de ratón immunocompromised que carece de receptores funcionales de interleukin-1 (IL-1R) y Toll-like receptor (TLR) de señalización, mostrar mayor susceptibilidad a la infección por S. aureus en comparación con ratones de tipo salvaje17 y un deterioro en el tráfico de neutrófilos al sitio de la infección de S. aureus en la piel18. Desarrollo de una cepa de ratón que posee un reportero fluorescente neutrófilo en ratones- / - MyD88 ha proporcionado un modelo alternativo para la investigación de la eficacia de terapias para tratar la infección de S. aureus en comparación con el actual recuento de neutrófilos ratones de reportero.
En este protocolo, caracterizan a la infección de S. aureus en los inmunocomprometidos LysM-EGFP × MyD88- / - ratones y comparar la evolución temporal y la resolución de la infección con los ratones LysM-EGFP. MyD88- / - ratones de EGFP LysM × desarrollan una infección crónica que no se resuelve, y 75% sucumben a la infección después de 8 días. Un defecto importante en el reclutamiento inicial de neutrófilo ocurre más de 72 h de la fase inflamatoria de la infección, y reclutan neutrófilos de menos de 50% durante la última etapa de la infección. El aumento de la susceptibilidad del × LysM-EGFP MyD88- / - ratones hace que este particular colar un riguroso modelo preclínico para evaluar la eficacia de nuevas técnicas terapéuticas dirigidas a la infección por S. aureus en comparación con el actual modelos utilizar ratones de tipo salvaje, especialmente las técnicas con el objetivo de potenciar la respuesta inmune innata contra la infección.
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Protocol
Se revisaron todos los estudios del ratón fueron realizados según los lineamientos de la ley de Bienestar Animal y la ley de extensión de investigación de salud y aprobado por el cuidado institucional de animales y uso en UC Davis. Asegúrese de usar guantes estériles cuando se trabaja con animales.
1. ratón fuente y vivienda
- EGFP LysM ratones en un fondo genético de C57BL/6J se derivan como se describió anteriormente12. Derivan LysM-EGFP × MyD88- / - ratones por los ratones de EGFP LysM cruce con MyD88- / - los ratones sobre un fondo de C57BL/6J.
- Ratones de la casa en un vivero. Para estos estudios, los animales fueron alojados en la Universidad de California, Davis en grupos antes de la cirugía y solo ubicado después de la cirugía. Utilizar ratones entre las edades de 10-16 semanas.
2. cuantificación y preparación bacteriana
- Quitar el bioluminiscente S. aureus cepa de interés de-80 ° C almacenamiento para descongelar el hielo. Rayado en una placa de agar sangre bovina 5%. Incube la placa veteada en un incubador humedecido a 37 ° C durante la noche (16 h).
Nota: En el presente Protocolo, se utilizó la cepa SH1000 ALC2906. Esta cepa contiene el servicio de transporte al plásmido pSK236 con el promotor de la proteína de unión a penicilina 2 fusionado en el casete de reportero luxABCDE de Photohabdus luminescens18. - Preparar el caldo de soja tríptica (TSB) mezclando 0,03 g de polvo TSB por mL de agua pura y autoclave TSB para esterilizar. Cuando haya enfriado, añadir algún antibiótico necesario utilizando una técnica estéril. En este protocolo, añadir 10 μg/mL de cloranfenicol18 al TSB para seleccionar para la expresión del plásmido pSK236 de transporte, que contiene el cartucho de luxABCDE de bioluminiscencia.
- Selección de colonias separadas 3-4 de la placa de S. aureus en TSB con 10 cloranfenicol μg/mL para iniciar una cultura de la noche a la mañana. Incubar las bacterias en un agitador de incubación a 37 ° C durante la noche (16 h).
- Iniciar un nuevo cultivo bacteriano de la cultura durante la noche diluyendo una muestra 1:50 en TSB con 10 cloranfenicol μg/mL. Cultura en una incubación agitador a 200 rpm y 37 ° C.
- Dos horas después de partir el S. aureus, monitorear la densidad óptica a 600 nm (OD600) en un espectrofotómetro. Observar el OD600 vs tiempo para encontrar medio logarítmicos de la fase de crecimiento. Para la cepa de ALC2906 SH1000, un OD600 de 0.5 es medio logarítmicos y corresponde a una concentración de 1 x 108 UFC/mL (figura 1).
- Cuando OD600 es de 0,5, lave las bacterias 1:1 con DPBS helada. Centrifugue las bacterias durante 10 minutos a 3.000 x g a 4 ° C. Cuidadosamente decantar el sobrenadante y agregar adicional DPBS fría y agitar bien. Centrífuga una vez más durante 10 minutos a 3.000 x g a 4 ° C.
- Decantar con cuidado el sobrenadante. Resuspender el precipitado bacteriano a una concentración deseada. Para estos estudios, recoger 3 mL de ALC2906 SH1000 y resuspender en 1,5 mL de PBS, correlacionando a una concentración de bacterias de unos 2 x 108 UFC/mL. No bacterias en hielo hasta su uso.
- Para verificar la concentración de bacterias, diluir 100 μl de la muestra bacteriana 1: 10,000 y 1: 100.000 en PBS. Alícuotas de la placa 20 μl en una placa de agar. Incubar a 37 ° C en una incubadora humidificada por 16 h. recuento de UFC por examen macroscópico y calcular una concentración bacteriana al día siguiente.
3. la piel herir e inoculación con S. aureus
- Administrar 100 μl de clorhidrato de buprenorfina de 0.03 mg/mL (~0.2 mg/kg) para cada ratón mediante inyección intraperitoneal.
- Veinte minutos después de la inyección, lugar 2-4 ratones en una cámara con oxígeno 2-3 LPM con 2-4% de isoflurano. Una vez que los ratones están completamente anestesiados, transferir los ratones uno a la vez a un cono de nariz conectada a oxígeno de 2-3 LPM con 2-4% de isoflurano. Verificar ratones están completamente anestesiados firmemente pellizcando cada pata trasera entre un pulgar y el índice. Proceder al siguiente paso si el animal no responde a la pizca.
- Afeitarse una 1 pulgada de sección de 2 pulgadas en la parte posterior del ratón con Tijeras eléctricas y despeje la zona de recortes de piel usando un trapo limpio o una gasa. Evitar el uso de crema depilatoria ya que puede causar inflamación excesiva.
- Limpiar la parte posterior del ratón primero con una gasa empapada povidona-yodo al 10% y luego con un 70% de etanol había empapado gasa. Limpie la superficie en un patrón espiral, moviéndose hacia afuera desde el centro del área quirúrgica. Espere aproximadamente 1 minuto para el área quirúrgico se seque antes de la cirugía.
-
Sostenga el afeitado la parte trasera del ratón libremente entre dos dedos y presione firmemente una biopsia del sacador estéril 6 mm en el centro de la zona quirúrgica preparada. No tire la piel tensa.
- La biopsia del sacador para crear un contorno circular en la piel que corta completamente a través de la piel en al menos una sección del contorno de la torcedura. Tenga cuidado de no cortar la fascia o tejido subyacente.
- Utilizar tijeras estériles y pinza para cortar a través de la epidermis y dermis siguiendo el patrón circular impreso por la biopsia del sacador.
4. S. aureus la inoculación
- Llene una jeringa de insulina 28 G con el inoculante bacteriano bioluminiscente deseado. En este estudio, administrar una concentración de 1 x 108 UFC/mL (50 μL). No administrar más de 100 μl de volumen.
-
Inyectar 50 μl de inoculante entre la fascia y el tejido en el centro de la herida en la parte trasera del ratón. Asegúrese de que el inoculante forma una burbuja en el centro de la herida con un mínimo de fuga o dispersión.
- Tire de la dermis al lado, sostenga la jeringa casi paralelo al tejido y empuje lentamente la jeringa en el tejido hasta que sienta una disminución súbita en la resistencia, que indica la perforación de la fascia. Con cuidado llevar la jeringa en el centro de la herida y dispensar el inoculante lentamente. Retire la jeringa poco a poco el animal.
- Inyectar el mismo volumen de PBS estéril en las heridas de los animales no infectados, como se describe anteriormente.
- Devolver el animal a su jaula. Coloque la jaula bajo una lámpara de calor o sobre una almohada y controlar al animal hasta la recuperación de la anestesia.
5. en Vivo BLI y FLI
- Inicializar el conjunto animal reproductor de imágenes a través del software del instrumento. Anestesiar ratones en una cámara de recibir oxígeno de 2-3 LPM con 2-4% de isoflurano. Entregar anestesia a los nosecones dentro del reproductor de imágenes.
-
Coloque el ratón herido e infectado en el reproductor de imágenes. Coloque el ratón que la herida es tan plana como sea posible. Utilice la siguiente configuración de secuencia para los ratones de la imagen.
- Seleccione la luminiscencia y la fotografía como modo de proyección de imagen. El tiempo de exposición es de 1 minuto en binning pequeño y F/stop 1 (luminiscencia) y F/stop 8 (fotografía). El filtro de emisión está abierto. Haga clic en el botón adquirir para grabar la imagen.
- Seleccione la fluorescencia y la fotografía como modo de proyección de imagen. El tiempo de exposición es 1 s con pequeño binning y F/stop 1 (fluorescencia) y F/stop 8 (fotografía) con una longitud de onda de excitación de 465/30 nm y una emisión longitud de onda 520/20 nm con una intensidad alta de la lámpara. Haga clic en el botón adquirir para grabar la imagen.
- Devolver el animal a su jaula y monitor hasta recuperación de la anestesia.
- Imagen ratones diariamente como se describe arriba.
6. Análisis de la imagen
- Imágenes abiertas a cuantificarse.
- Coloque una región circular grande de interés (ROI) sobre el área de la herida todo incluyendo piel para cada ratón en la imagen circundante. El neutrófilo en vivo que FLI EGFP señales y señales en vivo de BLI S. aureus se extienden más allá del borde de la herida después de varios días y se incluyeron en estos estudios (figura 2A y 2B). Haga clic en Medida de retorno de la inversión y valores de registros de flujo promedio para cada ratón. Trazar el flujo promedio de cada señal (p+s) versus tiempo.
-
Si se desean que los números absolutos de neutrófilos o S. aureus en la herida, realizar los siguientes experimentos.
- Para correlacionar el neutrófilos números a las señales en vivo de FLI EGFP, ratones C57BL/6J como se describió anteriormente la herida y transferencia de una gama de médula ósea de neutrófilos (5 x 105 a 1 x 107) de EGFP LysM o LysM-EGFPxMyD88- / - donantes directamente sobre las heridas diferentes. Imagen tal como se describe arriba y correlación la EGFP FLI en vivo señales a la cantidad conocida de neutrófilos.
- Para S. aureus UFC se correlacionan con las señales en vivo de BLI, herida e infectar ratones como se describió anteriormente. Día 1 post-infección registro en vivo BLI las señales de los ratones y de inmediato eutanasia y enfriar las canales. Suprimir la herida, homogeneizar el tejido y placa bacterianas diluciones en agar para la incubación de noche. Al día siguiente, contar las colonias para determinar UFC por herida.
- Para medir la herida curativo ajuste un ROI circular sobre el borde de la herida y medir el área de la herida (cm2) y el cambio fraccional de la línea de base versus tiempo (figura 2).
7. estadísticas
Nota: Todos los datos se presentan como media ±SEM. p < 0.05 fueron considerados estadísticamente significativos
- Determinar las diferencias entre dos grupos en un solo día mediante el método de Holm-Sidak, con alfa = 0.05 y analizar cada punto del tiempo individualmente, sin asumir una SD compatible
- Comparar las diferencias entre varios grupos el mismo día por ANOVA unidireccional con el postest de comparaciones múltiples de Tukey. Supervivencia entre los grupos experimentales se analizó por el método de Mantel-Cox.
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Representative Results
MyD88- / - ratones de EGFP LysM × son más susceptibles a la infección por S. aureus que ratones LysM-EGFP
La cepa de S. aureus utilizados en este estudio, ALC290618, fue construido con un plásmido que contiene el concepto de lux que produce señales bioluminiscentes de bacteria metabolizante activamente y en vivo. Cuando se inocula en ratones, bioluminiscencia en vivo (BLI) técnicas de imagen puede utilizarse para medir longitudinalmente carga de bacterias en una herida infectada. EGFP LysM × MyD88- / - ratones y ratones de EGFP LysM resultaron heridos e infectados con 1 x 107 UFC de S. aureus en la herida para comparar su susceptibilidad a la infección por S. aureus . EGFP LysM × MyD88- / - ratones mostraron mayor susceptibilidad a la infección de ratones de EGFP LysM demostraron por 80% mortalidad de EGFP LysM × MyD88- / - ratones durante los primeros 8 días de la infección en comparación con 0% de mortalidad de ratones LysM-EGFP durante el toda duración de 15 días del experimento (Figura 3A). Ambas cepas de ratones perdieron ~ 5% del peso corporal después de la infección, pero ratones LysM-EGFP recuperaron peso original por día 2, mientras que MyD88- / - ratones de EGFP LysM × no recuperé el peso perdido (figura 3B). Cierre de herida en presencia de infección por S. aureus no fue diferente entre las dos cepas; sin embargo, sterilely heridos × LysM-EGFP MyD88- / - tenía un defecto importante en la cicatrización de heridas en comparación con ratones LysM-EGFP (figura 3), como previamente divulgados19. Todo animal la proyección de imagen se utilizó para medir la carga bacteriana diariamente, y tan pronto como día 1, EGFP LysM × MyD88- / - las heridas tenían una mayor carga bacteriana de heridas LysM-EGFP. LysM-EGFP ratones controlada la infección y disminución de las señales en vivo de BLI en la herida, mientras × MyD88- / - ratones de EGFP LysM exhibieron un aumento en la carga bacteriana que tocado techo el día 4 hasta la muerte de animales (figura 3D,E). Juntos, estos datos demuestran la mayor susceptibilidad de MyD88- / - ratones de EGFP LysM × a la infección por S. aureus en comparación con ratones LysM-EGFP.
Tráfico de neutrófilos se deteriora en S. aureus infectados × MyD88- / - ratones LysM-EGFP en comparación con ratones LysM-EGFP
El ratón LysM-EGFP produce neutrófilos fluorescentes verdes debido a una proteína EGFP codificado aguas abajo de la de promotor de lisozima M12. Este ratón ha sido utilizado para el estudio longitudinal en vivo neutrófilo trata de respuesta a cutáneo S. aureus la infección13,14,20,21,22. Para comparar la cinética de neutrófilo a las heridas producidas en LysM-EGFP y MyD88- / - ratones de EGFP LysM ×, se administró una herida de piel completo del grueso de 6 mm en el dorso, y ratones fueron reflejados diariamente. Se observó una disminución de 40% en el tráfico de neutrófilos a las heridas en LysM-EGFP × MyD88- / - en comparación con ratones LysM-EGFP (Figura 4A, C). 1 x 107 UFC de S. aureus se introdujo inmediatamente después de herir, tráfico de neutrófilos fue atenuado en ambas cepas de ratones, pero MyD88- / - ratones de EGFP LysM × eran más sensibles a la infección por S. aureus con respecto al reclutamiento de neutrófilo. Infección causada un 50% la disminución inicial de neutrófilos con EGFP LysM × MyD88- / - heridas en comparación con una disminución del 15% observada en las heridas LysM-EGFP (Figura 4B). Ratones de EGFP LysM también reclutaron significativamente más neutrófilos a la herida durante las últimas etapas de la infección (Figura 4A,C) en comparación con EGFP LysM × MyD88- / - ratones, que fueron incapaces de aumentar el número de neutrófilo incluso en el presencia de carga bacteriana sostenido. Juntos, estos datos demuestran que MyD88- / - ratones de EGFP LysM × tienen un defecto en el reclutamiento de neutrófilo, que es consistente con su mayor susceptibilidad a la infección por S. aureus .
Figura 1: Correlación entre OD600 y UFC cuenta para ALC2906. 3-4 ALC2906 SH1000 colonias fueron recogidas de una placa de agar y transferidas en TSB con 10 cloranfenicol μg/mL para la cultura durante la noche. Al día siguiente, la suspensión fue dividir 1:50 en TSB con 10 cloranfenicol μg/mL y cultivadas. Densidad óptica a 600 nm (OD600) fue medido en intervalos regulares después de 2 horas, usando un espectrofotómetro. En cada medición la bacteria fue diluido 1: 100.000 en PBS helado y alícuotas sobre una placa de agar para la incubación de noche. Unidades formadoras de colonias fueron contados al día siguiente calcular la concentración inicial y correlacionada con OD600. N = 3 con 4 diferentes medidas de600 OD por experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: región representativa de los intereses (ROIs) para análisis de datos. Para analizar en vivo BLI y señales en vivo de FLI, grande, ROIs tamaño equivalente se centraron sobre la herida y se midió el flujo total (fotones por segundo). Para medir el encierro de la herida, se ajustó un ROI para el borde de la herida y se midió el área (cm2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: × Los LysM-EGFP MyD88- / - ratones son más susceptibles a la infección de S. aureus en comparación con ratones LysM-EGFP. LysM-EGFP y LysM-EGFP × MyD88- / - ratones administraron 6 mm herida en el dorso e infectados con 1 x 107 UFC de S. aureus de bioluminiscente o solución salina estéril. Los animales fueron monitoreados diariamente y supervivencia (A) y (B) peso fueron registrados. Animales se desliza día medida (C) tamaño de la herida y luminiscencia bacteriana (D). Imágenes bioluminiscentes representativas (E) están representados de infectados LysM-EGFP y MyD88- / - ratones de EGFP LysM ×. Barra de escala = 3 mm. datos representan 7 16 ratones por grupo para A, C, y D y 3 ratones por grupo b y se expresan como media ±SEM. * p = 0.05, ** p = 0.01, ***p = 0.001, *p < 0.0001 entre infectados (A, B, < / C18 > y D) o no infectados (C) grupos. Significación estadística se determinó mediante la prueba de Mantel-Cox (A) y el método de Holm-Sidak (B-D), con alfa = 0,05 y cada tiempo punto se analizó individualmente, sin asumir un constante SD. por favor haga clic aquí para ver una mayor versión de esta.
Figura 4: MyD88- / - ratones de EGFP LysM × tienen defectuoso reclutamiento neutrófilo para heridas infectadas.
EGFP LysM y LysM-EGFP × MyD88- / - ratones administraron 6 mm herida en el dorso e infectados con 1 x 107 UFC de S. aureus de bioluminiscente o solución salina estéril. Los animales fueron reflejados diariamente para medir contenido de neutrófilos (A, B). (C) imágenes fluorescentes representativas son representados de infectados y no infectados LysM-EGFP y LysM-EGFP × MyD88- / - ratones. Barra de escala = 5 mm. representar datos 8-16 ratones por grupo y se expresan como media ±SEM. * p < 0.05, ** p < 0.01, y *** p < 0.001 entre infectados por grupos y # p < 0.01 entre no infectados (A) los grupos o como representado en el gráfico (B). Significación estadística se determinó mediante el método de Holm-Sidak (A), con alfa = 0.05 y cada punto se analizó individualmente, sin asumir una SD coherente y unidireccional ANOVA (B), el tiempo con las comparaciones múltiples de Tukey post-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Modelos de infección de S. aureus que utilizan bioluminiscente S. aureus la infección en un ratón fluorescente reportera neutrófilo junto con técnicas avanzadas de proyección de imagen óptica in vivo todo animal ha avanzado nuestro conocimiento de lo innato respuesta inmune a la infección. Estudios anteriores utilizando el ratón LysM-EGFP han demostrado que hasta 1 x 107 neutrófilos recluta a una herida infectada de S. aureus en las primeras 24 h de infección14y neutrófilos reclutados herida extienden su vida media de 1,5 días a 5 días en respuesta a un S. aureus-infectada herida22. Una táctica de supervivencia adaptada por ratones contra la infección se trata de vástago de hematopoietic y células progenitoras (HSPC) a una herida infectada de la médula ósea donde ampliar en neutrófilos EGFP+ bactericidas en TLR2/MyD88/PGE2 manera dependiente21. Además, extramedular granulocitopoyesis proporciona una fuente esencial de los neutrófilos a S. aureus infectados MyD88- / - ratones de sepsis letal13. Transferencia adoptiva de la HSPC de ratones LysM-EGFP en ratones de tipo salvaje hace posible examinar el proceso de la producción local del neutrófilo y su importancia en la lucha contra el S. aureus dentro de una herida de13,21. También es posible calibrar exactamente el número de neutrófilos en la herida; número de neutrófilo en las heridas se correlaciona linealmente con señal de EGFP de 1 x 106 a mayor que 1 x 107 neutrófilos, y el límite de detección es aproximadamente 1 x 106 neutrófilos en una herida de 6 mm14.
En nuestros resultados representativos comparamos longitudinal neutrófilo y la cinética de S. aureus en las heridas de EGFP LysM y LysM-EGFP × MyD88- / -. A nuestro conocimiento, éste es este primer estudio que compara la carga bacteriana y neutrófilo tráfico entre el tipo salvaje y immunocompromised ratones longitudinalmente a través de la resolución de la infección. De particular interés es el grado de reclutamiento neutrófilo atenuación causada por la infección de S. aureus en la cepa- / - MyD88, que produce una disminución de 15% en el tráfico de neutrófilos en los ratones de tipo salvaje en comparación con una disminución del 50% en MyD88-/ -. S. aureus es capaz de evadir la inmunorespuesta del anfitrión por producir un número de factores de virulencia conocidos indirectamente inhibir tráfico de neutrófilos (es decir,, α-toxina, leukocidin de Panton-Valentine y Chemotaxis inhibitorio de la proteína23 , 24), y los resultados obtenidos indican que MyD88 señalización, probablemente a través de TLR2, TLR4 y IL-1R, es fundamental para superar las estrategias empleadas por S. aureus para eludir inmunorespuestas del anfitrión. Factor de virulencia-nocaut S. aureus cepas pueden utilizarse en este modelo para caracterizar su efecto sobre el tráfico de células mieloides13. Además, cuando se estudió conjuntamente con el EGFP LysM × MyD88- / - ratón, este modelo destaca el papel de MyD88 en la lucha contra los efectos patógenos de virulencia factores de señalización.
Hay varios pasos críticos en este protocolo que si se realiza inadecuadamente puede introducir variabilidad en los estudios. Los procedimientos de heridas y la infección son sencillos en comparación con otros modelos de ratón de la enfermedad, pero no es sin su intríngulis. Las biopsias del sacador de piel están muy afiladas y pueden cortar fácilmente en el músculo spinotrapezius debajo de la piel. Este músculo y su fascia altera el reclutamiento de neutrófilo y aumenta la variabilidad entre ratones y los resultados en una infección por S. aureus más invasiva que no está centrada dentro de la herida. Ratones con daño significativo a los músculos spinotrapezius deben ser excluidos de los estudios.
Otra fuente de error en este modelo viene de los cambios en el bioluminiscente cepa de S. aureus con el tiempo, que puede alterar las señales en vivo de BLI y cinética de crecimiento. La cepa de ALC2906 contiene un plásmido de lanzadera que contiene el operon modificados lux de Photorhabdus luminescens construcción que es necesaria para producir las señales bioluminiscentes, que pueden ser descartadas por la bacteria S. aureus sobre tiempo de25. En un caldo de cultivo sin la selección, el 97% de las colonias SH1000 había producido señales bioluminiscentes en día 3. Esta frecuencia se redujo a 53% el día 5 y 21% en día 1026. Así, en más puntos del tiempo durante el curso infeccioso, las señales en vivo de BLI probablemente comenzará a ligeramente (< diferencia de 1 registro) subestiman la real en vivo la carga bacteriana. Es importante que la congelación de acciones de glicerol fresca de S. aureus con selección de antibiótico para mantener el plásmido a la llegada y reemplazar las reservas de trabajo de las bacterias con frecuencia (es decir,, cada tres meses) puede ayudar a prevenir la pérdida de la construcción bioluminiscente durante el mantenimiento de la cultura. Nuevas cepas de bioluminiscente S. aureus contienen un constructo bioluminiscente estable integrado27,28 y están probable una mejora sobre la cepa de ALC2906 utilizada en este modelo.
Mientras que este modelo es útil para el estudio localizado cutáneo S. aureus las infecciones, tiene limitaciones. Las señales en vivo del BLI de la carga bacteriana se limita a la herida y piel adyacente. El modelo no ofrece una lectura fiable para profundo las infecciones como sepsis y animales deben ser sacrificados para medir la difusión de las bacterias en el torrente sanguíneo o riñones13. Se han generado más nuevas y más brillante ingeniería cepas bioluminiscentes que puede permitir la detección de señales en vivo de BLI de órganos internos27,28. Además, no se puede medir longitudinal detección y monitorización de tráfico de neutrófilos en otros comúnmente adquirido infecciones de S. aureus , incluyendo la respiratoria y las infecciones de la sangre. Disminución de la sensibilidad debido a la autofluorescencia de los tejidos es también una limitación de este modelo. El ratón de Catchup reciente utiliza un RFP TdTomato bajo el promotor de Ly6G y puede haber una mayor relación señal a ruido que el ratón LysM-EGFP debido a reducido fluorescencia automático de tejido en la RFP canal11.
La posible interferencia entre la señal de emisión en vivo de la BLI y FLI en este modelo es digno de debate pero es insignificante. Si realizar experimentos sin excitación luz y sólo recoge las señales de FLI EGFP en vivo utilizando el filtro de 520/20, no observamos ninguna señal apreciable de ratones infectados, demostrar que recogen las señales de las señales en vivo de FLI EGFP y no de superposición de señales en vivo de BLI de las bacterias (datos no mostrados). Esto es principalmente debido al tiempo de colección de señal, que es sólo 1 segundo para FLI en vivo y 1 minuto de BLI en vivo y un filtro de longitud de onda de excitación específica de 465/30 nm y emisión filtro de 520/20 nm. Estos ajustes permiten una óptima detección de señales en vivo de FLI EGFP sin contribución de señales en vivo de BLI. Esto se demuestra mejor al comparar la magnitud del eje y entre Figura 4Ay figura 3D . Las señales de la BLI en vivo es unos 100-fold menos que las señales en vivo de FLI de EGFP, indicando que las señales en vivo de BLI son insignificantes y que contribuyen a menos del 1% de las señales observadas de FLI en vivo.
Esperamos que futuras aplicaciones de este modelo ayudará a los investigadores descubrir y caracterizar factores de virulencia de S. aureus y servir como un modelo animal preclínico para probar nuevas terapias que tienen como objetivo claro de infección por S. aureus , aumentando la respuesta inmune innata.
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Disclosures
Lloyd S. Miller ha recibido apoyo de beca de MedImmune, Pfizer, Regeneron y Chan Soon-Shiong Nanthealth Fundación y consultoría honorarios de Noveome Biotherapeutics y la Fundación de Chan Soon-Shiong Nanthealth que no están relacionados con el trabajo divulgado en este trabajo. Otros autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el nacional institutos de salud becas R01 AI129302 (a SIS) y el programa de capacitación en farmacología: de banco a cabecera en UC Davis (NIH T32 GM099608 a L.S.A). Molecular y genómica Imaging (CMGI) en la Universidad de California en Davis proporcionan excelente soporte tecnológico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352059 | |
| 6 mm Disposable Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-36 | |
| Bioluminescent S. aureus | Lloyd Miller, Johns Hopkins | ALC 2906 SH1000 | |
| Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics | VWR | 10118-938 | |
| Buprenoprhine hydrochloride injectable | Western Medical Supply | 7292 | 0.3 mg/mL |
| C57BL/6J Mice | Jackson Labratory | 000664 | |
| Chloramphenicol (crystalline powder) | Fisher BioReagents | BP904-100 | |
| DPBS (1x) | Gibco | 14190-144 | |
| Insulin Syringes | Becton, Dickson and Company | 329461 | 0.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'') |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Living Image Software – IVIS Spectrum Series | Perkin Elmer | 128113 | |
| LysM-eGFP Mice | Thomas Graff Albert Einstein College of New York | NA | |
| Microvolume Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| MyD88 KO Mice | Jackson Labratory | 009088 | |
| Non-woven sponges | AMD- Ritmed Inc | A2101-CH | 5 cm x 5 cm |
| Povidone Iodine 10% Solution | Aplicare | 697731 | |
| Prism 7.0 | GraphPad Software | License | |
| Tryptic Soy Broth | Becton, Dickson and Company | 211825 |
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