Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Een muismodel te beoordelen ingeboren immuunreactie op Staphylococcus aureus -infectie

Published: February 28, 2019 doi: 10.3791/59015
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of California Davis, 2Department of Dermatology, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Een aanpak wordt beschreven voor real-time detectie van de ingeboren immune reactie op het verwonden van cutane en Staphylococcus aureus -infectie van muizen. Door vergelijking LysM-EGFP muizen (die bezitten fluorescerende neutrofielen) met een LysM-EGFP gekruist immunodeficiëntie muis stam, we vooraf ons begrip van de infectie en de ontwikkeling van benaderingen ter bestrijding van de infectie.

Abstract

Staphylococcus aureus (S. aureus) infecties, met inbegrip van methicilline resistente vlekken, zijn een enorme belasting voor de gezondheidszorg. Met de incidentiecijfers van S. aureus -infectie jaarlijks klimmen, is er een vraag voor aanvullend onderzoek in de pathogeniteit. Dierlijke modellen van een besmettelijke ziekte verder van ons begrip van de reactie van de gastheer-pathogeen en leiden tot de ontwikkeling van effectieve therapeutics. Neutrofielen spelen een primaire rol in het aangeboren immuunrespons waarop de S. aureus -infecties wordt beheerd door de vorming van een abces muur van de infectie te vergemakkelijken van bacteriële goedkeuring; het aantal neutrofielen die infiltreren van een S. aureus -huidinfectie vaak correleert met ziekte resultaat. LysM-EGFP muizen, die de verbeterde groen fluorescent proteïne (EGFP) ingevoegd in de lysozym M (LysM) promotor regio (uitgedrukt voornamelijk door neutrofiele granulocyten) bezitten, wanneer gebruikt in combinatie met in vivo hele dierlijke fluorescentie imaging (FLI) bieden een middelen voor het kwantificeren van neutrofiele emigratie noninvasively en overlangs in gewonde huid. Wanneer deze wordt gecombineerd met een bioluminescente S. aureus -stam en sequentiële in vivo hele dierlijke bioluminescente afbeeldingen (BLI), is het mogelijk lengterichting volgen zowel de neutrofiele werving dynamiek en in vivo bacteriële belasting op de site van infectie bij narcose muizen vanaf begin van infectie tot resolutie of de dood. Muizen meer resistent zijn tegen een aantal virulentiefactoren geproduceerd door S. aureus die effectieve kolonisatie en infectie bij de mens vergemakkelijken. Immunodeficiëntie muizen bieden een gevoeliger diermodel te onderzoeken persistente S. aureus infecties en de mogelijkheid van therapeutics om aangeboren immuunresponsen stimuleren. Hierin, karakteriseren wij antwoorden in LysM-EGFP muizen die aan MyD88-deficiënte muizen (LysM-EGFP × MyD88- / - muizen) hebben gefokt samen met wild-type LysM-EGFP muizen te onderzoeken van S. aureus huid wondinfectie. Multispectrale simultane detectie studie van neutrofiele werving dynamiek ingeschakeld met behulp van in vivo FLI, bacteriële belasting met behulp van in vivo BLI, en wondgenezing lengterichting en noninvasively na verloop van tijd.

Introduction

Staphylococcus aureus (S. aureus) is goed voor de meerderheid van de huid en weke delen infecties (SSTIs) in de Verenigde Staten1. De incidentie van methicilline-resistente S. aureus (MRSA) infecties gestaag gestegen de afgelopen twee decennia2, de studie van de mechanismen van de persistentie en de ontdekking van nieuwe behandelingsstrategieën motiveren. De standaard van zorg voor MRSA infecties is systemische antibiotische therapie, maar MRSA is geworden tijd3 steeds meer resistent tegen antibiotica en deze drugs kunnen verminderen van de host gunstig microbiome, waardoor negatieve gezondheidseffecten, vooral in kinderen4. Preklinische studies hebben onderzocht alternatieve strategieën voor de behandeling van MRSA infecties5, maar het vertalen van deze benaderingen naar de kliniek heeft bewezen uitdagende als gevolg van de opkomst van Virulentiefactoren die host immuunrespons6dwarsbomen. We combineren om te ontleden de dynamiek van de gastheer-pathogeen dat station S. aureus SSTIs, noninvasive en longitudinale uitlezingen van het aantal neutrofielen gerekruteerd om het bed van de wond met kinetische maatregelen van bacteriële overvloed en wond gebied.

Neutrofielen zijn het meest voorkomende circulerende leukocyten in de mens en de eerste responders om een bacteriële infectie7. Neutrofielen zijn een noodzakelijk onderdeel voor een effectieve host reactie tegen S. aureus infecties als gevolg van hun bactericide mechanismen, met inbegrip van de productie van reactieve zuurstof soorten, proteasen, antimicrobiële peptiden en functionele reacties inclusief fagocytose en neutrofiele extracellulaire val productie8,9. Menselijke patiënten met genetische defecten in neutrofiele functie, zoals Chronische granulomateuze ziekte en syndroom van Chediak-Higashi, tonen een verhoogde gevoeligheid voor S. aureus -infectie. In toevoeging, patiënten met (zoals aangeboren neutropenie) genetische en verworven (zoals neutropenie gezien bij chemotherapie patiënten) gebreken in neutrofiele nummers zijn ook zeer gevoelig voor S. aureus -infectie10. Gezien het belang van neutrofielen in het ontruimen van S. aureus -infecties, kan vergroten hun immuun capaciteit of het afstemmen van hun nummers binnen een S. aureus -laesie blijken een effectieve strategie bij het oplossen van de infectie.

In het afgelopen decennium, zijn transgene muizen met fluorescentie neutrofiele verslaggevers ontwikkeld om te bestuderen van hun handel11,12. Neutrofiele reporter muizen combineren met hele dierlijke beeldvormingstechnieken toelaat Spatio analyse van neutrofielen in weefsels en organen. Wanneer gecombineerd met de bioluminescente stammen van S. aureus, is het mogelijk om bij te houden van de accumulatie van neutrofielen naar aanleiding van S. aureus overvloed en persistentie in het kader van bacteriële virulentie factoren die direct en indirect neutrofiele getallen in aangetast weefsel13,14,15,16erover.

Muizen zijn minder gevoelig voor S. aureus virulentie en immuun belastingontduiking mechanismen dan mensen. Als zodanig, wild-type muizen niet mag zijn een ideale diermodel te onderzoeken van de effectiviteit van een therapeutisch te behandelen chronische S. aureus gegeven infectie. MyD88-deficiënte muizen (dat wil zeggen, MyD88- / - muizen), een stam van immuungecompromitteerde muis die mist functionele interleukin-1 receptor (IL-1R) en Toll-like receptor (TLR) signalering, Toon grotere vatbaarheid voor S. aureus -infectie in vergelijking met wild-type muizen17 en een bijzondere waardevermindering neutrofiele mensenhandel naar een site van S. aureus -infectie van de huid18. Ontwikkeling van de stam van een muis die beschikt over een fluorescerende neutrofiele verslaggever bij MyD88- / - muizen heeft een alternatief model voor het onderzoek naar de werkzaamheid van therapieën voor de behandeling van S. aureus -infectie in vergelijking met huidige neutrofiele reporter muizen.

In dit protocol, we karakteriseren van S. aureus -infectie in de immuungecompromitteerde LysM-EGFP × MyD88- / - muizen, en vergelijk het tijdsverloop en de resolutie van infectie met het LysM-EGFP muizen. LysM-EGFP × MyD88- / - muizen ontwikkelen een chronische infectie die niet wordt opgelost, en 75% bezwijken voor infectie na 8 dagen. Een aanzienlijk gebrek in eerste neutrofiele aanwerving gebeurt meer dan 72 h van de inflammatoire fase van infectie, en 50% minder neutrofielen werven tijdens de laatste fase van de infectie. De verhoogde gevoeligheid van de LysM-EGFP × MyD88- / - muizen maakt dit bijzondere stam een rigoureuze preklinische model te evalueren van de werkzaamheid van nieuwe therapeutische technieken, gericht op van S. aureus -infectie in vergelijking met de huidige modellen gebruik maken van wild-type muizen, met name technieken die zijn gericht op het stimuleren van de aangeboren immuunreactie tegen infectie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle muis studies werden herzien en goedgekeurd door het institutionele Animal Care en gebruik Comité bij UC Davis en werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Animal Welfare Act en de Health Act voor de uitbreiding van de onderzoek. Zorg ervoor dat gebruik van steriele handschoenen bij het werken met dieren.

1. muis bron en huisvesting

  1. Afleiden van LysM-eGFP muizen op een genetische achtergrond van C57BL/6J zoals eerder beschreven12. LysM-EGFP × MyD88- / - muizen door Overstekende LysM-EGFP muizen met MyD88- / - muizen op een achtergrond van C57BL/6J ontlenen.
  2. Huis muizen in een vivarium. Voor deze studies, werden dieren gehuisvest aan de Universiteit van Californië, Davis in groepen voorafgaand aan chirurgie en interne gehuisvest volgende chirurgie. Muizen tussen de leeftijden van 10-16 weken gebruiken.

2. bacteriële voorbereiding en kwantificering

  1. Verwijder de bioluminescente S. aureus -stam van belangstelling van-80 ° C-opslag te ontdooien op ijs. Streep op een 5% boviene bloed agarplaat. Incubeer de gestreepte plaat in een bevochtigde incubator bij 37 ° C's nachts (16u).
    Opmerking: In dit protocol, de stam van de ALC2906 SH1000 werd gebruikt. Deze soort bevat de shuttle plasmide pSK236 met de penicilline-bindend-proteïne 2 projectontwikkelaar gesmolten op de cassette luxABCDE verslaggever van Photohabdus luminescens18.
  2. Bereid al soja Bouillon (TSB) door het mengen van 0,03 g TSB poeder per mL zuiver water en autoclaaf TSB te steriliseren. Wanneer afgekoeld, voeg alle nodige antibiotica met behulp van steriele techniek. In dit protocol toevoegen u 10 µg/mL chlooramfenicol18 aan de TSB voor de expressie van het pSK236 shuttle plasmide, waarin de Bioluminescentie luxABCDE cassette selecteren.
  3. Kies 3-4 afzonderlijke kolonies van de S. aureus -plaat in TSB met 10 µg/mL chlooramfenicol om te beginnen een nachtelijke cultuur. Incubeer bacteriën op een drachtige shaker bij 37 ° C's nachts (16u).
  4. Start een nieuwe bacteriecultuur vanaf de overnachting cultuur door een monster 1:50 in TSB verdunnen met 10 µg/mL chlooramfenicol. Cultuur in een drachtige shaker op 200 rpm en 37 ° C.
  5. Twee uur na de splitsing van de S. aureus, controleren de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) op een spectrofotometer. Observeer de OD600 vs. tijd te vinden midden-logaritmische fase groei. Voor de SH1000 van de ALC2906-stam, een OD600 van 0,5 is medio-logaritmische en komt overeen met een concentratie van 1 x 108 CFU/mL (Figuur 1).
  6. Wanneer OD600 0,5 is, wassen bacteriën 1:1 met ijskoude DPBS. Centrifugeer de bacteriën voor 10 min op 3.000 x g - en 4 ° C. Zorgvuldig de bovendrijvende vloeistof decanteren en voeg extra gekoeld DPBS en vortex grondig. Centrifugeer nogmaals gedurende 10 min op 3.000 x g - en 4 ° C.
  7. Zorgvuldig decanteren het supernatant. Resuspendeer de pellet van bacteriële op een gewenste concentratie. Voor deze studies, 3 mL ALC2906 SH1000 verzamelen en resuspendeer in 1,5 mL PBS, correleren aan een concentratie van de bacteriën van ongeveer 2 x 108 CFU/mL. Houden bacteriën op ijs tot gebruik.
  8. Om te controleren of de concentratie van de bacteriën, Verdun 100 µL van de bacteriële monster 1:10,000 en 1:100,000 in PBS. Plaat 20 µL aliquots op een agarplaat. Incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde incubator voor 16 h. graaf CFUs door bruto onderzoek en bereken een bacteriële concentratie de volgende dag.

3. excisional Wounding van de huid en inoculatie met S. aureus

  1. Het toedienen van 100 µL van 0,03 mg/mL buprenorfine hydrochloride (~0.2 mg/kg) aan elke muis via intraperitoneale injectie.
  2. Twintig minuten na injectie, plaats 2-4 muizen in een kamer met 2-3 LPM zuurstof met 2-4% Isofluraan. Zodra muizen zijn volledig verdoofd, dragen de muizen een tegelijkertijd een neus kegel op 2-3 LPM zuurstof met 2-4% Isofluraan aangesloten. Controleer of muizen zijn volledig verdoofd door knijpen stevig elke achterste poot tussen een duim en wijsvinger. Ga verder met de volgende stap als het dier niet op de snuifje reageert.
  3. Scheren een 1 inch door 2 inch afdeling op de achterkant van de muis met elektrische tondeuse en schakelt u het gebied van bont knipsels met een schoon doekje of gaas. Vermijd het gebruik van ontharende lotion, omdat dit leiden overmaat ontsteking tot kan.
  4. Schoon de achterkant van de muis eerst met 10% Povidon-jodium gedrenkt gaas en vervolgens met een 70% ethanol geweekt gaas. Reinig het gebied in een spiraalpatroon, naar buiten verplaatsen van het centrum van het chirurgische gebied. Wacht ongeveer 1 minuut voor het chirurgische gebied te drogen voorafgaand aan de operatie.
  5. Houd de geschoren achterkant van de muis losjes tussen twee vingers en stevig druk op een biopsie punch steriele 6 mm in het midden van het bereid chirurgische gebied. Trek niet aan de huid strak.
    1. Draai de biopsie punch om een circulaire overzicht maken op de huid die volledig door de huid in ten minste één gedeelte van de omtrek snijdt. Wees voorzichtig niet te snijden in de onderliggende fascia of weefsel.
    2. Gebruik van steriele schaar en pincet te snijden door middel van de epidermis en dermis na de circulaire patroon bedrukt door de biopsie punch.

4. S. aureus enten

  1. Vul een 28 G insuline spuit met de gewenste bioluminescente bacteriële inoculant. In deze studie, het beheren van een concentratie van 1 x 108 CFU/mL (50 µL). Het meer dan 100 µL van volume niet beheren.
  2. Injecteren 50 µL van inoculant tussen de fascia en weefsel in het midden van de wond op de achterkant van de muis. Zorg ervoor dat de inoculant een zeepbel in het midden van de wond met minimale lekkage of dispersie vormt.
    1. De dermis naar de kant trekken, houd de injectiespuit bijna evenwijdig aan het weefsel en langzaam het duwen van de spuit in het weefsel, totdat een plotselinge afname van de weerstand wordt gevoeld, waarmee wordt aangegeven van de fascia piercing. Zorgvuldig leiden de spuit in het midden van de wond en afzien van de inoculant langzaam. Verwijder de injectiespuit langzaam van het dier.
  3. Dezelfde hoeveelheid steriele PBS te injecteren in de wonden van niet geïnfecteerde dieren zoals hierboven beschreven.
  4. Het dier terug naar haar kooi. Plaats van de kooi onder een warmte lamp of op de top van een verwarming pad en controleren van het dier tot herstel van de verdoving.

5. in Vivo BLI en FLI

  1. Initialiseer het hele dier imager via de software instrument. Anesthetize muizen in een kamer 2-3 LPM zuurstof met 2-4% Isofluraan ontvangen. Verdoving aan de nosecones binnen de imager leveren.
  2. Plaats de gewonde en besmette muis in de imager. Plaats de muis zodanig dat de wond zich zo plat mogelijk. Gebruik de volgende reeks set-up om het imago van de muizen.
    1. Selecteer luminescentie en fotograferen als de grafische modus. De belichtingstijd is 1 min op kleine weggooien en F/stop 1 (luminescentie) en F/stop 8 (foto). De emissie-filter is geopend. Klik op de knop ophaal opnemen van de afbeelding.
    2. Selecteer fluorescentie en fotograferen als de grafische modus. De belichtingstijd is 1 s bij kleine weggooien en F/stop 1 (fluorescentie) en F/stop 8 (foto) met een golflengte van de excitatie van 465/30 nm en een emissie golflengte 520/20 nm met een hoge licht-intensiteit. Klik op de knop ophaal opnemen van de afbeelding.
  3. Terug het dier naar de kooi en de monitor tot herstel van anesthesie.
  4. Afbeelding muizen dagelijks zoals beschreven hierboven.

6. de beeldanalyse

  1. Geopende afbeeldingen worden gekwantificeerd.
  2. Plaats een grote cirkelvormige regio van belang (ROI) over de gehele wond gebied inclusief omringende huid voor elke muis in de afbeelding. De neutrofiele in vivo die FLI EGFP signalen in vivo BLI S. aureus signalen verder reiken dan de rand van de wond na enkele dagen en werden opgenomen in deze studies (figuur 2A en 2B). Klik op Maatregel ROI en record waarden voor gemiddelde flux voor elke muis. De gemiddelde flux van signaal (p/s) versus telkens worden uitgezet.
  3. Als absolute aantallen van neutrofielen of S. aureus in de wond gewenst zijn, voert u de volgende experimenten.
    1. Om te correleren neutrofiele cijfers tot en met de in vivo FLI EGFP signalen, wond C57BL/6J muizen zoals hierboven beschreven, en de overdracht van een aantal beenmerg-afgeleide neutrofiele granulocyten (5 x 10,5 tot 1 x 107) van LysM-EGFP of LysM-EGFPxMyD88- / - donoren direct op de top van verschillende wonden. Afbeelding wordt uitgevoerd zoals beschreven hierboven en correlate de in vivo FLI EGFP signalen naar de bekende hoeveelheid neutrofiele granulocyten.
    2. Om te correleren S. aureus CFU de in vivo BLI signalen, wond en infecteren van muizen zoals hierboven beschreven. Op dag 1 na infectie record in vivo BLI signalen uit de muizen en onmiddellijk euthanaseren en chill karkassen. De wond accijnzen, meng het weefsel en bacteriële verdunningen op agar voor overnachting incubatie plaat. De volgende dag, telling kolonies te bepalen kve per wond.
  4. Wond genezing pasvorm een circulaire ROI meten over de rand van de wond en de maatregel het gebied van de wond (cm2) en uitzetten van de fractionele verandering van baseline vs. tijd (figuur 2C).

7. statistieken

Opmerking: Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ±SEM. p < 0.05 werden beschouwd als statistisch significant

  1. Bepalen van verschillen tussen twee groepen op een enkele dag met behulp van de methode Holm-Sidak, met Alfa = 0,05 en analyseren van elke tijdstip individueel, zonder de veronderstelling dat een consistent SD.
  2. Vergelijk verschillen tussen meerdere groepen op dezelfde dag door one-way ANOVA met de post-test Tukey meerdere-vergelijkingen. Overleving tussen experimentele groepen werd geanalyseerd door de Mantel-Cox-methode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LysM-EGFP × MyD88- / - muizen zijn meer vatbaar voor S. aureus -infectie dan LysM-EGFP muizen

De stam van S. aureus gebruikt in deze studie, ALC290618, , werd gebouwd met een plasmide waarin de lux -constructie waarbij bioluminescente signalen van live en actief metaboliseringssysteem bacteriën produceert. Wanneer geënt in muizen, kan in vivo bioluminescentie beeldvormende technieken (BLI) worden gebruikt om de lengterichting meten bacteriën lasten binnen een geïnfecteerde wond. Zowel LysM-EGFP × MyD88- / - muizen en LysM-EGFP muizen waren gewond en besmet met 1 x 107 CFU van S. aureus in de wond te vergelijken hun gevoeligheid voor S. aureus -infectie. LysM-EGFP × MyD88- / - muizen toonde een grotere gevoeligheid voor infecties dan LysM-EGFP muizen aangetoond door 80% letaliteit van LysM-EGFP × MyD88- / - muizen tijdens de eerste 8 dagen na infectie in vergelijking met 0% letaliteit van LysM-EGFP muizen tijdens de gehele duur van de 15-dagen van het experiment (figuur 3A). Beide muizenstammen verloren ~ 5% lichaamsgewicht na infectie, maar LysM-EGFP muizen teruggevonden oorspronkelijke gewicht per dag 2, terwijl LysM-EGFP × MyD88- / - muizen niet van verloren gewicht (figuur 3B herstellen deed). Sluiting van de wond in de aanwezigheid van S. aureus -infectie was niet verschillend tussen de twee soorten; sterilely gewonde LysM-EGFP × MyD88- / - had echter een significante defect in de wondgenezing in vergelijking met LysM-EGFP muizen (Figuur 3 c), als eerder gemeld19. Hele dieren imaging werd gebruikt voor het meten van bacteriële belasting dagelijks, en zo vroeg als dag 1, LysM-EGFP × MyD88- / - wonden had een hogere bacteriële belasting dan LysM-EGFP wonden. LysM-EGFP muizen gecontroleerd infectie en daalde in vivo BLI signalen in de wond, terwijl LysM-EGFP × MyD88- / - muizen tentoongesteld een toename van de bacteriële belasting die plateaued op dag 4 tot dier dood (figuur 3D,E). Deze gegevens tonen samen, de verhoogde gevoeligheid van LysM-EGFP × MyD88- / - muizen voor S. aureus -infectie in vergelijking met LysM-EGFP muizen.

Neutrofiele mensenhandel is geschaad in S. aureus geïnfecteerde LysM-EGFP × MyD88- / - muizen in vergelijking met LysM-EGFP muizen

De LysM-EGFP muis produceert groene fluorescerende neutrofielen als gevolg van een EGFP eiwit gecodeerd stroomafwaarts van de promotor lysozym M12. Deze muis is gebruikt om te bestuderen van de longitudinale in vivo neutrofiele handel in reactie op dermale S. aureus infecties13,14,20,21,22. Om te vergelijken neutrofiele kinetiek op wonden geproduceerd op LysM-EGFP en LysM-EGFP × MyD88- / - muizen, een 6 mm volledige dikte huid wond werd toegediend op het dorsum en muizen werden dagelijks beeld. Een afname van de neutrofiele mensenhandel op wonden met 40% werd waargenomen in LysM-EGFP × MyD88- / - in vergelijking met LysM-EGFP muizen (figuur 4A, C). Wanneer 1 x 107 CFU van S. aureus was geintroduceerd onmiddelijk na verwonding, in beide muizenstammen neutrofiele handel was verzwakt, maar LysM-EGFP × MyD88- / - muizen waren gevoeliger voor S. aureus -infectie met betrekking tot neutrofiele werving. Infectie veroorzaakt een 50% afname in eerste neutrofiele handel op LysM-EGFP × MyD88- / - wonden, vergeleken met een 15% daling waargenomen in LysM-EGFP wonden (figuur 4B). LysM-EGFP muizen ook aanzienlijk meer neutrofielen op de wond aangeworven tijdens de latere stadia van de infectie (figuur 4A,C) ten opzichte van LysM-EGFP × MyD88- / - muizen, die konden verhogen neutrofiele nummers zelfs in de aanwezigheid van aanhoudende bacteriële belasting. Deze gegevens tonen samen, dat LysM-EGFP × MyD88- / - muizen hebben een defect in neutrofiele aanwerving, welke is in overeenstemming met hun verhoogde gevoeligheid voor S. aureus -infectie.

Figure 1
Figuur 1: Correlatie tussen OD600 en CFU telt voor ALC2906. 3-4 ALC2906 SH1000 kolonies werden geplukt uit een agarplaat en overgedragen in TSB met 10 µg/mL chlooramfenicol voor overnachting cultuur. De volgende dag, de schorsing was 1:50 gesplitst in TSB met 10 µg/mL chlooramfenicol en gekweekt. Optische dichtheid bij 600 nm (OD600) werd gemeten in regelmatige intervallen na 2 uur gebruik van een spectrofotometer. Bij elke meting werd de bacteriën verdunde 1:100,000 in ijskoude PBS en aliquoted op een bord van de agar voor overnachting incubatie. CFUs waren de volgende dag geteld voor de berekening van de oorspronkelijke concentratie en gecorreleerd aan OD600. N = 3 met 4 verschillende OD600 metingen per experiment. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: vertegenwoordiger regio van belangen (ROI) voor gegevensanalyse. Als u wilt analyseren in vivo BLI en in vivo FLI signalen, grote, gelijkwaardig formaat ROIs waren gecentreerd over de wond en totale flux (lichtdeeltjes per seconde) werd gemeten. Voor het meten van wond sluiting, een ROI was pasvorm aan de rand van de wond en gebied (cm2) werd gemeten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: LysM-EGFP × MyD88- / - muizen zijn meer vatbaar voor S. aureus -infectie in vergelijking met LysM-EGFP muizen. LysM-EGFP en LysM-EGFP × MyD88- / - muizen werden toegediend een 6 mm wond op het dorsum en besmet met 1 x 107 CFU bioluminescente S. aureus of steriele zoutoplossing. Dieren werden dagelijks gecontroleerd en overleving van (A) en (B) gewicht werden geregistreerd. Dieren werden dagelijks beeld grootte van de wond van de maatregel (C) en (D) bacteriële luminescentie. (E) vertegenwoordiger bioluminescente beelden worden afgebeeld van besmette LysM-EGFP en LysM-EGFP × MyD88- / - muizen. Schaal bar = 3 mm. gegevens vertegenwoordigen 7-16 muizen per groep voor A, C, en D en 3 muizen per groep voor B en worden uitgedrukt als gemiddelde ±SEM. * p = 0,05, ** p = 0,01, ***p = 0,001, *p < 0,0001 tussen besmet (A, B, < / C18 > en D) of niet-geïnfecteerde (C) groepen. Statistische significantie werd bepaald met behulp van Mantel-Cox test (A) en de Holm-Sidak-methode (B-D), met Alfa = 0,05, en elke keer punt was afzonderlijk geanalyseerd zonder uitgaande van een consistente SD. gelieve Klik hier om een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: LysM-EGFP × MyD88- / - muizen moeten defecte neutrofiele werving geïnfecteerde wonden.
LysM-EGFP en LysM-EGFP × MyD88- / - muizen werden toegediend een 6 mm wond op het dorsum en besmet met 1 x 107 CFU bioluminescente S. aureus of steriele zoutoplossing. Dieren werden dagelijks beeld voor het meten van de neutrofiele inhoud (A, B). (C) vertegenwoordiger fluorescerende beelden worden afgebeeld van besmette en niet-besmette LysM-EGFP en LysM-EGFP × MyD88- / - muizen. Schaal bar = 5 mm. gegevens vertegenwoordigen 8-16 muizen per groep en worden uitgedrukt als gemiddelde ±SEM. * p < 0,05, ** p < 0,01, en *** p < 0.001 tussen besmet groepen en geïnfecteerde # p < 0.01 tussen groepen (A) of als afgebeeld op de grafiek (B). Statistische significantie werd bepaald met behulp van de methode Holm-Sidak (A), met Alfa = 0,05, en elke keer punt was afzonderlijk geanalyseerd zonder uitgaande van een consistente SD, en one-way ANOVA (B), met de Tukey meerdere-vergelijkingen na de test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

S. aureus -infectie modellen die gebruik maken van bioluminescente S. aureus -infectie in een fluorescerende neutrofiele verslaggever muis in combinatie met geavanceerde technieken van hele dieren in vivo optische beeldvorming hebben onze kennis van de aangeboren geavanceerde immune reactie op de infectie. Eerdere studies met de LysM-EGFP muis hebben aangetoond dat omhoog aan 1 x 107 neutrofielen werven op een S. aureus geïnfecteerde wond gedurende de eerste 24 h van besmetting14en wond-aangeworven neutrofielen hun halfwaardetijd van 1,5 dagen tot 5 dagen verlengen in reactie op een S. aureus-besmette wond22. Een tactiek van de overleving aangepast door muizen ter bestrijding van de infectie is mensenhandel hematopoietische stamcellen en voorlopercellen (HSPC) op een geïnfecteerde wond uit het beenmerg waar ze naar bactericide EGFP+ neutrofielen in een TLR2/MyD88/PGE2 uitbreiden afhankelijke wijze21. Extramedullary granulopoiesis biedt bovendien een essentiële bron van neutrofielen te redden van S. aureus geïnfecteerde MyD88- / - muizen van dodelijke sepsis13. Adoptief overdracht van HSPC van LysM-EGFP muizen in wild type muizen maakt het mogelijk om het proces van lokale neutrofiele productie en haar belang bij de bestrijding van S. aureus binnen een wond13,21te onderzoeken. Het is ook mogelijk om te kalibreren precies het aantal neutrofielen in de wond; neutrofiele nummer in wonden correleert lineair met EGFP signaal van 1 x 106 groter is dan 1 x 107 neutrofielen en de detectiegrens is ongeveer 1 x 106 neutrofielen in een 6 mm wond14.

In onze representatieve resultaten vergelijken we longitudinale neutrofiele en kinetiek van de S. aureus in de wonden van LysM-EGFP en LysM-EGFP × MyD88- / -. Dit is om onze kennis, deze eerste studie die vergelijkt de bacteriële belasting en neutrofiele handel tussen wild type en immuungecompromitteerde muizen overlangs door middel van resolutie van infectie. Van bijzonder belang is de mate van demping van de neutrofiele werving veroorzaakt door S. aureus -infectie in de MyD88- / - stam, die ontlokte een afname van de neutrofiele handel in wild type muizen in vergelijking met een 50% afname van de MyD88 met 15%-/ -. S. aureus vermag de immuunrespons van de gastheer te omzeilen door het produceren van een aantal virulentiefactoren bekend dat niet indirect remt neutrofiele mensenhandel (dwz, α-toxine, Panton-Valentine leukocidine en Chemotaxis remmende eiwitten23 , 24), en onze resultaten wijzen erop dat MyD88 signalering, waarschijnlijk door TLR2, TLR4 en IL-1R, cruciaal is voor het overwinnen van de strategieën die in dienst van S. aureus te onttrekken aan de immuunrespons van de gastheer. Virulentie factor-knock-out S. aureus stammen in dit model kunnen worden gebruikt voor het karakteriseren van hun effect op de mensenhandel myeloïde cel13. Verder, toen studeerde in combinatie met de LysM-EGFP × MyD88- / - muis, dit model benadrukt de rol van MyD88 bij de bestrijding van de pathogene effecten van virulentiefactoren signalering.

Er zijn verschillende kritische stappen in dit protocol dat als onjuist uitgevoerd kunt variabiliteit in studies introduceren. De verwonding en infectie procedures zijn eenvoudig in vergelijking met andere Muismodellen van de ziekte, maar het is niet zonder de fijne kneepjes. Huid punch biopsieën zijn zeer scherp en gemakkelijk kunnen snijden in de spinotrapezius spier onder de huid. Beschadiging van deze spier en haar fascia verandert neutrofiele werving en verhoogt de variabiliteit tussen de muizen en een resulteert in een meer invasieve S. aureus -infectie, die is niet gecentreerd in de wond. Muizen met aanzienlijke schade aan de spinotrapezius spier moeten van studies worden uitgesloten.

Een andere oorzaak van fout in dit model komt uit veranderingen in de bioluminescente S. aureus -stam na verloop van tijd, die in vivo BLI signalen en kinetiek van de groei veranderen kan. De ALC2906-stam bevat een shuttle-plasmide dat de gemodificeerde lux operon van de Photorhabdus luminescens -constructie die vereist is bevat voor het produceren van de bioluminescente signalen, die kunnen worden verwijderd door de S. aureus -bacteriën over tijd25. In de cultuur van een bouillon zonder selectie, 97% van de SH1000 kolonies geproduceerd bioluminescente signalen op dag 3. Deze frequentie gedaald tot 53% op dag 5 en 21% op dag 1026. Dus, op latere tijdstippen in de infectieuze loop, de in vivo BLI signalen zal waarschijnlijk beginnen te licht (< 1 log verschil) onderschatten de werkelijke in vivo bacteriële belasting. Het is belangrijk om te bevriezen van verse glycerol voorraden van S. aureus met antibiotica selectie om het plasmide bij aankomst en werkende voorraden van bacteriën vaak vervangen (dwz, om de drie maanden) kan helpen voorkomen dat verlies van de bioluminescente construct tijdens het onderhoud van de cultuur. Nieuwere stammen van bioluminescente S. aureus bevatten een stabiel geïntegreerde bioluminescente construct27,28 en zijn waarschijnlijk een verbetering over de stam van de ALC2906 in dit model gebruikt.

Dit model weliswaar nuttig zijn te onderzoeken van gelokaliseerde dermale S. aureus infecties, maar heeft beperkingen. De in vivo BLI signalen van bacteriële belasting is beperkt tot de wond en de aangrenzende huid. Het model niet voorziet in een betrouwbare uitlezing diep invasieve infecties zoals sepsis en dieren moeten worden euthanized voor het meten van de verspreiding van bacteriën in de bloedbaan of nieren13. Nieuwere en helderder gemanipuleerde bioluminescente stammen zijn gegenereerd dat de opsporing van in vivo BLI signalen kunt toestaan van2827,interne organen. Daarnaast longitudinale opsporing en controle van neutrofiele mensenhandel kunnen niet worden gemeten in andere meestal verworven van S. aureus -infecties, met inbegrip van de luchtwegen en bloed van infecties. Verminderde gevoeligheid als gevolg van weefsel autofluorescence is ook een beperking van dit model. De onlangs ontwikkelde Catchup muis maakt gebruik van een TdTomato RFP onder de promotor van de Ly6G en kan een hogere signaal / ruisverhouding dan de LysM-EGFP muis gevolg afgenomen weefsel auto fluorescentie in de RFP kanaal11.

De potentiële Overspraak tussen in vivo BLI en FLI emissie signalen in dit model is waardig van discussie, maar is te verwaarlozen. Als we het uitvoeren van experimenten zonder licht excitatie en alleen verzamelen in vivo FLI EGFP signalen met behulp van de filter van de 520/20, respecteren wij niet geen merkbare signalen van geïnfecteerde muizen, waaruit blijkt dat verzamelde signalen uit in vivo FLI EGFP signalen en niet uit overlapping van in vivo BLI signalen van de bacteriën (gegevens niet worden weergegeven). Dit is voornamelijk te wijten aan de afhaaltijd signaal, dat slechts 1 seconde in vivo FLI en 1 minuut voor in vivo BLI voor een specifieke excitatie golflengte filter van 465/30 nm en emissie filter van 520/20 is nm. Deze instellingen voldoende zijn voor optimale detectie van in vivo FLI EGFP signalen zonder bijdrage van in vivo BLI signalen. Dit wordt het best aangetoond bij het vergelijken van de orde van grootte van de y-as tussen figuur 3D en figuur 4A. De signalen van het in vivo BLI is ongeveer 100-fold minder dan de in vivo FLI van EGFP signalen, die aangeeft dat de in vivo BLI-signalen te verwaarlozen zijn en tot minder dan 1% van de signalen waargenomen van in vivo FLI bijdragen.

Wij verwachten dat toekomstige toepassingen van dit model helpt onderzoekers ontdekken en karakteriseren van virulentiefactoren van S. aureus , en dienen als een pre-klinische diermodel voor het testen van nieuwe therapieën die gericht zijn op een S. aureus -infectie duidelijk door het stimuleren van de aangeboren immuunrespons.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Lloyd S. Miller heeft financiële steun ontvangen van MedImmune, Pfizer, Regeneron, en de Chan Soon-Shiong Nanthealth Foundation en consulting kosten van Noveome Biotherapeutics en de Chan Soon-Shiong Nanthealth Foundation die geen verband met het werk die zijn gerapporteerd houden in deze paper. De andere auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de nationale instituten van gezondheid subsidies R01 AI129302 (voor S.I.S.) en het programma van de opleiding in de farmacologie: van Bench naar Bedside bij UC Davis (NIH T32 GM099608 naar L.S.A). De moleculaire en genomische Imaging (CMGI) bij de Universiteit van Californië-Davis verleend prachtig technologische steun.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Falcon 352059
6 mm Disposable Biopsy Punch Integra Miltex 33-36
Bioluminescent S. aureus Lloyd Miller, Johns Hopkins  ALC 2906 SH1000
Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics VWR 10118-938
Buprenoprhine hydrochloride injectable Western Medical Supply 7292 0.3 mg/mL
C57BL/6J Mice Jackson Labratory 000664
Chloramphenicol (crystalline powder) Fisher BioReagents BP904-100
DPBS (1x) Gibco  14190-144
Insulin Syringes Becton, Dickson and Company 329461 0.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'')
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Perkin Elmer 124262
Living Image Software – IVIS Spectrum Series Perkin Elmer 128113
LysM-eGFP Mice Thomas Graff Albert Einstein College of New York  NA
Microvolume Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-2000
MyD88 KO Mice Jackson Labratory 009088
Non-woven sponges AMD- Ritmed Inc A2101-CH 5 cm x 5 cm
Povidone Iodine 10% Solution Aplicare 697731
Prism 7.0 GraphPad Software License 
Tryptic Soy Broth Becton, Dickson and Company 211825

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moran, G. J., et al. Methicillin-Resistant S. aureus Infections among Patients in the Emergency Department. New England Journal of Medicine. 355 (7), 666-674 (2009).
  2. Suaya, J. A., et al. Incidence and cost of hospitalizations associated with Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections in the United States from 2001 through 2009. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 296 (2014).
  3. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats. P & T : a Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).
  4. Blaser, M. J. Antibiotic use and its consequences for the normal microbiome. Science. 352 (6285), 544-545 (2016).
  5. Hilliard, J. J., et al. Anti-Alpha-Toxin Monoclonal Antibody and Antibiotic Combination Therapy Improves Disease Outcome and Accelerates Healing in a Staphylococcus aureus Dermonecrosis Model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 299-309 (2015).
  6. Proctor, R. A. Recent developments for Staphylococcus aureus vaccines: clinical and basic science challenges. European Cells & Materials. 30, 315-326 (2015).
  7. Mölne, L., Verdrengh, M., Tarkowski, A. Role of Neutrophil Leukocytes in Cutaneous Infection Caused by Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 68 (11), 6162-6167 (2000).
  8. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
  9. Borregaard, N. Neutrophils, from Marrow to Microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  10. Miller, L. S., Cho, J. S. Immunity against Staphylococcus aureus cutaneous infections. Nature Reviews Immunology. 11 (8), 505-518 (2011).
  11. Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nature Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
  12. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  13. Falahee, P. C., et al. α-Toxin Regulates Local Granulocyte Expansion from Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Staphylococcus aureus-Infected Wounds. Journal of immunology. 199 (5), Baltimore, Md. 1772-1782 (2017).
  14. Kim, M. -H., et al. Dynamics of Neutrophil Infiltration during Cutaneous Wound Healing and Infection Using Fluorescence Imaging. Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1812-1820 (2008).
  15. Liese, J., Rooijakkers, S. H. M., Strijp, J. A. G., Novick, R. P., Dustin, M. L. Intravital two-photon microscopy of host-pathogen interactions in a mouse model of Staphylococcus aureus skin abscess formation. Cellular Microbiology. 15 (6), 891-909 (2013).
  16. Bogoslowski, A., Butcher, E. C., Kubes, P. Neutrophils recruited through high endothelial venules of the lymph nodes via PNAd intercept disseminating Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2449-2454 (2018).
  17. Takeuchi, O., Hoshino, K., Akira, S. Cutting Edge: TLR2-Deficient and MyD88-Deficient Mice Are Highly Susceptible to Staphylococcus aureus Infection. The Journal of Immunology. 165 (10), 5392-5396 (2000).
  18. Miller, L. S., et al. MyD88 Mediates Neutrophil Recruitment Initiated by IL-1R but Not TLR2 Activation in Immunity against Staphylococcus aureus. Immunity. 24 (1), 79-91 (2006).
  19. Macedo, L., et al. Wound healing is impaired in MyD88-deficient mice: a role for MyD88 in the regulation of wound healing by adenosine A2A receptors. The American Journal of Pathology. 171 (6), 1774-1788 (2007).
  20. Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047 (2012).
  21. Granick, J. L., et al. Staphylococcus aureus recognition by hematopoietic stem and progenitor cells via TLR2/MyD88/PGE2 stimulates granulopoiesis in wounds. Blood. 122 (10), 1770-1778 (2013).
  22. Kim, M. H., et al. Neutrophil survival and c-kit+-progenitor proliferation in Staphylococcus aureus-infected skin wounds promote resolution. Blood. 117 (12), 3343-3352 (2011).
  23. Foster, T. J. Immune evasion by staphylococci. Nature Reviews Microbiology. 3 (12), 948-958 (2005).
  24. Gordon, R. J., Lowy, F. D. Pathogenesis of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infection. Clinical Infectious Diseases. 46 (Supplement_5), S350-S359 (2008).
  25. Cho, J. S., et al. Neutrophil-derived IL-1β Is Sufficient for Abscess Formation in Immunity against Staphylococcus aureus in Mice. PLoS Pathogens. 8 (11), e1003047-e1003020 (2012).
  26. Bernthal, N. M., et al. A mouse model of post-arthroplasty Staphylococcus aureus joint infection to evaluate in vivo the efficacy of antimicrobial implant coatings. PLoS ONE. 5 (9), e12580 (2010).
  27. Plaut, R. D., Mocca, C. P., Prabhakara, R., Merkel, T. J., Stibitz, S. Stably Luminescent Staphylococcus aureus Clinical Strains for Use in Bioluminescent Imaging. PLoS ONE. 8 (3), e59232 (2013).
  28. Dillen, C. A., et al. Clonally expanded γδ T cells protect against Staphylococcus aureus skin reinfection. The Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1026-1042 (2018).

Tags

Immunologie en infecties probleem 144 Staphylococcus aureus aangeboren immuniteit neutrofielen wondgenezing ontsteking geheel-dier imaging
Een muismodel te beoordelen ingeboren immuunreactie op <em>Staphylococcus aureus</em> -infectie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Anderson, L. S., Reynolds, M. B.,… More

Anderson, L. S., Reynolds, M. B., Rivara, K. R., Miller, L. S., Simon, S. I. A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection. J. Vis. Exp. (144), e59015, doi:10.3791/59015 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter