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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Un modèle de souris pour évaluer réponse immunitaire innée à l’infection par Staphylococcus aureus

Published: February 28, 2019 doi: 10.3791/59015
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of California Davis, 2Department of Dermatology, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Il est décrit une approche pour la détection en temps réel de la réponse immunitaire innée de blessures cutanées et Staphylococcus aureus infection des souris. Par comparaison LysM-EGFP souris (qui possèdent des neutrophiles fluorescents) avec un LysM-EGFP croisés souche de souris immunodéficientes, nous faire avancer notre compréhension de l’infection et l’élaboration d’approches pour lutter contre l’infection.

Abstract

Staphylococcus aureus Les infections (Staphylococcus aureus), y compris les taches résistantes à la méthicilline, sont un énorme fardeau sur le système de santé. Taux d’incidence de l’infection à Staphylococcus aureus grimper chaque année, il y a une demande de recherche supplémentaire dans son pouvoir pathogène. Modèles animaux de maladies infectieuses progresser notre compréhension de la réponse de l’hôte-pathogène et conduisent au développement d’agents thérapeutiques efficaces. Neutrophiles jouent un rôle primordial dans la réponse immunitaire innée qui contrôle les infections à S. aureus en formant un abcès pour mur au large de l’infection et faciliter la clairance bactérienne ; le nombre de neutrophiles qui infiltrent une infection de la peau de S. aureus souvent est corrélée avec le résultat de la maladie. Souris LysM-EGFP, qui possèdent la protéine fluorescente verte (EGFP) renforcée insérée dans la région promotrice de Lysozyme M (LysM) (exprimée principalement par les neutrophiles), lorsqu’il est utilisé en conjonction avec imagerie de fluorescence animaux in vivo (FLI) fournissent une moyens de quantifier émigration neutrophile non invasive et longitudinalement dans la peau blessée. Lorsqu’il est combiné avec un bioluminescentes S. aureus souche et séquentielle imagerie in vivo d’animaux bioluminescent (BLI), il est possible de surveiller longitudinalement la dynamique du recrutement neutrophiles et une charge bactérienne in vivo sur le site de infection chez la souris anesthésiés depuis le début de l’infection à la résolution ou la mort. Les souris sont plus résistants à un certain nombre de facteurs de virulence produites par Staphylococcus aureus qui facilitent la colonisation efficace et infection chez l’homme. Des souris immunodéficientes fournissent un modèle animal plus sensible afin d’examiner les persistants de S. aureus infections et la capacité d’agents thérapeutiques pour stimuler les réponses immunitaires innées. Dans les présentes, nous caractérisons les réponses chez les souris LysM-EGFP ont été élevées à des souris déficientes MyD88 (LysM-EGFP × MyD88-- souris/ ) ainsi que des souris de type sauvage LysM-EGFP pour enquêter sur S. aureus infection de plaie cutanée. Détection simultanée multispectrale activé étude de neutrophiles recrutement dynamique à l’aide de FLI in vivo, charge bactérienne à l’aide de BLI in vivo et la cicatrisation longitudinalement et non invasive au fil du temps.

Introduction

Staphylococcus aureus (S. aureus) représente la majorité des infections cutanées et des tissus mous (SSTIs) dans les États-Unis1. L’incidence méthicilline-résistant Staphylococcus aureus (MRSA), les infections a augmenté régulièrement pendant les dernières deux décennies2, motiver l’étude des mécanismes de persistance et de la découverte de nouvelles stratégies de traitement. La norme de soins pour les infections à SARM est une antibiothérapie systémique, mais SARM est devenu plus en plus résistante aux antibiotiques au fil du temps3 et ces médicaments peuvent diminuer le microbiome bénéfique de l’hôte, causant des effets négatifs sur la santé, surtout dans enfants4. Les études précliniques ont examiné des stratégies alternatives pour le traitement d’infections SARM5, mais traduire ces approches à la clinique s’est avérée difficile en raison de l’émergence de facteurs de virulence qui contrecarrent l’hôte des réponses immunitaires6. Pour disséquer la dynamique de l’hôte-pathogène qui animent SSTIs de S. aureus , nous combinons non invasive et afficheurs longitudinales du nombre de neutrophiles recrutement pour le lit de la plaie avec des mesures cinétiques d’abondance bactérienne et plaie zone.

Les neutrophiles sont les leucocytes circulant plus abondant chez les humains et les premiers intervenants à une infection bactérienne7. Les neutrophiles sont une composante nécessaire pour une réponse de l’hôte efficace contre le Staphylococcus aureus infections en raison de leurs mécanismes bactéricides, y compris la production d’espèces réactives de l’oxygène, des protéases, des peptides antimicrobiens et des réponses fonctionnelles y compris la phagocytose et neutrophiles piège extracellulaire production8,9. Les patients humains avec des défauts génétiques en fonction de neutrophile, comme maladie granulomateuse chronique et le syndrome de Chediak-Higashi, montrent une sensibilité accrue aux infections de S. aureus . En outre, les patients avec génétiques (par exemple, neutropénie congénitale) et acquises (par exemple de neutropénie chez les patients de chimiothérapie) défauts en nombre de neutrophiles sont également très sensibles à S. aureus infection10. Compte tenu de l’importance des neutrophiles dans la guérison d’infections à S. aureus , renforçant leurs capacités immunitaires ou réglage leur nombre au sein d’une lésion de S. aureus peut s’avérer une stratégie efficace dans la résolution de l’infection.

Au cours de la dernière décennie, les souris transgéniques avec des journalistes de neutrophiles fluorescence ont été développés pour étudier leur trafic de11,12. Combinant souris journaliste neutrophiles animaux techniques d’imagerie permet l’analyse spatio-temporelle des neutrophiles dans les tissus et organes. Lorsqu’il est combiné avec des souches bioluminescentes de S. aureus, il est possible de suivre l’accumulation de polynucléaires neutrophiles en réponse à l’abondance de S. aureus et de persistance dans le contexte de la virulence bactérienne des facteurs qui directement et indirectement perturber le nombre de neutrophil dans tissu atteint13,14,15,16.

Les souris sont moins sensibles aux mécanismes de S. aureus virulence et immunitaire d’évasion que les humains. Ainsi, souris de type sauvage peuvent ne pas être un modèle animal idéal pour étudier l’efficacité d’une donnée thérapeutique pour traiter les chroniques de S. aureus infection. MyD88-deficient mice (c.-à-d. MyD88- / - souris), une souche de souris immunodéprimées qui n’a pas de récepteurs fonctionnels interleukine 1 (IL-1R) et récepteur Toll-like (TLR) de signalisation, voir la plus grande susceptibilité à l’infection par Staphylococcus aureus , par rapport à souris de type sauvage17 et une altération dans le trafic de neutrophiles vers un site d’infection à S. aureus dans la peau de18. Développement d’une souche de souris qui possède un journaliste neutrophil fluorescent MyD88- / - souris a fourni un modèle alternatif pour enquêter sur l’efficacité des thérapies pour traiter l’infection de S. aureus par rapport à l’actuel neutrophile souris de journaliste.

Dans ce protocole, nous caractériser infection à Staphylococcus aureus dans les LysM-EGFP × MyD88- / - des souris immunodéprimées et comparer l’évolution temporelle et la résolution de l’infection par les souris LysM-EGFP. LysM-EGFP × MyD88- / - souris développent une infection chronique qui ne se résout pas, et 75 % succombent à une infection après 8 jours. Un défaut important de recrutement initial de neutrophil produit sur une période de 72 h de la phase inflammatoire de l’infection, et moins de 50 % de polynucléaires neutrophiles recruter au cours de la dernière étape de l’infection. La sensibilité accrue du × LysM-EGFP MyD88 souris- / - cela rend notamment la souche un modèle préclinique rigoureux pour évaluer l’efficacité des nouvelles techniques thérapeutiques ciblant les S. aureus infection par rapport à l’actualité des modèles utiliser la souris de type sauvage, en particulier les techniques visant à stimuler la réponse immunitaire innée contre l’infection.

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Protocol

Toutes les études sur les souris ont été examinés et approuvés par le Comité de l’urbanisme à UC Davis et d’institutionnels animalier et ont été effectuées conformément aux directives de la loi sur la protection des animaux et de la santé recherche Extension Act. N’oubliez pas d’utiliser des gants stériles lorsque vous travaillez avec des animaux.

1. la souris Source et logement

  1. LysM-eGFP souris sur un fond génétique C57BL/6J de dériver comme décrit plus haut12. Dériver de LysM-EGFP × MyD88- / - souris en traversant des souris LysM-EGFP MyD88- / - souris sur un fond de C57BL/6J.
  2. Souris domestiques dans un vivarium. Pour ces études, les animaux était logés à l’Université de Californie, Davis dans les groupes avant la chirurgie et unique logée après une chirurgie. Utilisez la souris âgés de 10 à 16 semaines.

2. quantification et préparation bactérienne

  1. Supprimer la bioluminescence souche de Staphylococcus aureus d’intérêt de stockage de-80 ° C à fondre sur la glace. Rayure sur une plaque de gélose au sang bovin de 5 %. Incuber la plaque striée dans un incubateur humidifié à 37 ° C pendant la nuit (16 h).
    Remarque : Dans le présent protocole, la souche ALC2906 SH1000 a été utilisée. Cette souche contient le pSK236 de plasmide de navette avec le promoteur de la protéine se liant à la pénicilline 2 fusionné à la cassette de journaliste luxABCDE de luminescens Photohabdus18.
  2. Préparer bouillon trypticase soja (TSB) en mélangeant 0,03 g de poudre de BST par mL d’eau pure et autoclave BST pour stériliser. Lorsque refroidi, ajouter des antibiotiques nécessaires en utilisant une technique stérile. Dans ce protocole, ajouter 10 µg/mL de chloramphénicol18 au BST pour sélectionner pour l’expression du plasmide pSK236 navette, qui contient la cassette de luxABCDE de bioluminescence.
  3. Choisir 3-4 colonies distinctes de la plaque de S. aureus dans BST avec du chloramphenicol 10 µg/mL pour commencer une culture au jour le jour. Incuber les bactéries dans un agitateur en incubation à 37 ° C pendant la nuit (16 h).
  4. Démarrez une nouvelle culture bactérienne de la culture au jour le jour par dilution d’un échantillon 01:50 dans BST avec du chloramphenicol 10 µg/mL. Culture dans un shaker en incubation à 200 tr/min et 37 ° C.
  5. Deux heures après le fractionnement du S. aureus, surveiller la densité optique à 600 nm (OD600) sur un spectrophotomètre. Observer l' OD600 vs temps de trouver le milieu-logarithmique phase de croissance. Pour la souche ALC2906 SH1000, une OD600 de 0,5 est mi-logarithmique et correspond à une concentration de 1 x 108 UFC/mL (Figure 1).
  6. Quand OD600 est de 0,5, laver les bactéries 1:1 avec SPD glacée. Centrifuger les bactéries pendant 10 min à 3 000 x g et 4 ° C. Soigneusement, éliminer le surnageant et ajouter supplémentaires SPD réfrigérés et vortex soigneusement. Centrifuger à nouveau pour 10 min à 3 000 x g et 4 ° C.
  7. Éliminer délicatement le surnageant. Resuspendre le culot bactérien à la concentration désirée. Pour ces études, recueillir 3 mL de ALC2906 SH1000 et resuspendre dans 1,5 mL de PBS, corrélées à une concentration de bactéries d’environ 2 x 108 UFC/mL. Conservez les bactéries sur la glace jusqu'à utilisation.
  8. Pour vérifier la concentration de bactéries, diluer 100 µL de l’échantillon bactérienne 1/10 000 et 1/100 000 dans du PBS. Plaque de 20 µL d’extraits sur une gélose. Incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié pendant 16 h. comte UFC par examen brut et calculer une concentration bactérienne le lendemain.

3. Wounding excision de peau et de l’Inoculation par S. aureus

  1. Administrer 100 µL de chlorhydrate de buprénorphine 0,03 mg/mL (~0.2 mg/kg) pour chaque souris par injection intrapéritonéale.
  2. Vingt minutes après l’injection, place 2-4 souris dans une chambre avec l’oxygène de 2 à 3 l/min à l’isoflurane 2 à 4 %. Une fois que les souris sont complètement anesthésiés, transférer les souris un à la fois à un cône de nez relié à l’oxygène de 2 à 3 l/min à l’isoflurane 2 à 4 %. Vérifiez la souris sont complètement anesthésiés en pinçant fermement chaque patte arrière entre un pouce et l’index. Passez à l’étape suivante si l’animal ne répond pas à la pincée.
  3. Raser un 1 pouce par section de 2 pouces à l’arrière de la souris avec une tondeuse électrique et nettoyer la zone des coupures de fourrure à l’aide d’un chiffon propre ou une gaze. Évitez d’utiliser la lotion dépilatoire car il peut provoquer une inflammation excessive.
  4. Nettoyer l’arrière de la souris tout d’abord avec de la gaze 10 % povidone-iode imbibé, puis avec un éthanol à 70 % trempé gaze. Nettoyez la zone en forme de spirale, se déplaçant vers l’extérieur du centre de la zone chirurgicale. Attendre environ 1 minute pour la zone chirurgicale à sécher avant la chirurgie.
  5. Tenez le rasé l’arrière de la souris sans serrer entre deux doigts et presser fermement une biopsie à l’emporte-pièce stérile 6 mm au centre de la zone chirurgicale préparée. Ne pas tirer la peau tendue.
    1. Tordre la biopsie à l’emporte-pièce pour créer un contour circulaire sur la peau qui traverse entièrement la peau au moins une section de l’esquisse. Veillez à ne pas découper le carénage ou le tissu sous-jacent.
    2. Utilisez des ciseaux stériles et pinces pour couper à travers l’épiderme et du derme, suivant le modèle circulaire apposé par la biopsie à l’emporte-pièce.

4. S. aureus Inoculation

  1. Remplissez une seringue à insuline 28 G avec l’inoculant bactérie bioluminescente désirée. Dans cette étude, administrer une concentration de 1 x 108 UFC/mL (50 µL). Ne pas administrer plus de 100 µL de volume.
  2. Injecter 50 µL d’inoculant entre le fascia et les tissus dans le centre de la plaie à l’arrière de la souris. Veiller à ce que l’inoculant forme une bulle au centre de la plaie avec minimiser les fuites ou dispersion.
    1. Tirer le derme vers le côté, tenez la seringue presque parallèle au tissu et pousser lentement la seringue dans le tissu jusqu'à ce qu’une diminution brusque de résistance se fait sentir, ce qui indique le piercing du fascia. Attentivement conduire la seringue dans le centre de la plaie et distribuer l’inoculant lentement. Retirer la seringue lentement de l’animal.
  3. Injecter le même volume de PBS stérile dans la plaie des animaux infectés, comme décrit ci-dessus.
  4. Retourner l’animal de sa cage. Placez la cage sous une lampe de chaleur ou sur un coussin chauffant et surveiller l’animal jusqu'à la guérison de l’anesthésie.

5. en Vivo BLI et FLI

  1. Initialiser l’imageur animaux via le logiciel de l’instrument. Anesthésier la souris dans une chambre, réception d’oxygène de 2 à 3 l/min à l’isoflurane 2 à 4 %. Livrer l’anesthésie à le nosecones à l’intérieur de l’imageur.
  2. Placez la souris blessée et infectée dans l’imageur. Positionnez la souris tels que la plaie est aussi plate que possible. Utiliser les réglages de séquence suivant à l’image des souris.
    1. Sélectionnez la Luminescence et photographier comme mode d’imagerie. Le temps d’exposition est de 1 min à petite binning et F/stop 1 (luminescence) et arrêt de F/8 (photo). Le filtre d’émission est ouvert. Cliquez sur le bouton acquérir pour enregistrer l’image.
    2. Sélectionnez la Fluorescence et la photographie comme mode d’imagerie. Le temps d’exposition est de 1 s à petit binning et F/stop 1 (Fluorescence) et arrêt de F/8 (photo) avec une longueur d’onde d’excitation de 465/30 nm et une émission de longueur d’onde 520/20 nm avec une intensité haute lampe. Cliquez sur le bouton acquérir pour enregistrer l’image.
  3. Retour l’animal dans sa cage et le moniteur jusqu'à de l’anesthésie.
  4. Image des souris tous les jours tel que décrit ci-dessus.

6. image Analysis

  1. Ouvrir les images à quantifier.
  2. Placer une grande région circulaire d’intérêt (ROI) sur la zone de toute plaie, y compris la peau de chaque souris dans l’image environnante. Les signaux BLI S. aureus in vivo et des neutrophiles in vivo que FLI EGFP signaux dépassent le bord de la plaie après plusieurs jours et ont été inclus dans ces études (Figure 2 a et 2 b). Cliquez sur le ROI de la mesure et des valeurs Records pour un flux moyen pour chaque souris. Tracer le flux moyen de chaque signal (p/s) par rapport à la durée.
  3. Si vous désirez un nombre absolu de neutrophiles ou S. aureus dans la plaie, réaliser les expériences suivantes.
    1. Pour établir une corrélation entre le nombre de neutrophiles aux signaux FLI EGFP in vivo, plaie de souris C57BL/6J comme décrit ci-dessus et transférer une gamme des dérivés de la moelle osseuse des neutrophiles (5 x 105 à 1 x 10-7) de LysM-EGFP ou LysM-EGFPxMyD88- / - donateurs directement sur le dessus de différentes blessures. Image telle que décrite ci-dessus et de corréler l’EGFP FLI in vivo des signaux à la quantité connue des neutrophiles.
    2. Pour mettre en corrélation s.doré UFC pour les signaux BLI in vivo, enroulé et infecter des souris comme décrit ci-dessus. Le 1er jour après l’infection record in vivo BLI signaux provenant des souris et immédiatement euthanasier et refroidir les carcasses. La plaie de l’accise, homogénéiser le tissu et plaque bactériennes dilutions sur gélose pour l’incubation durant la nuit. Le lendemain, compter les colonies afin de déterminer l’UFC par blessure.
  4. Pour mesurer la plaie guérison fit un retour sur investissement circulaire sur le bord de la plaie et mesure la zone de la plaie (cm2) et tracer le changement fractionnaire de base en fonction du temps (Figure 2).

7. les statistiques

Remarque : Toutes les données sont présentées en moyenne ±ét. p < 0,05 étaient considérés comme statistiquement significatifs

  1. Déterminer les différences entre les deux groupes en un seul jour à l’aide de la méthode Holm-Sidak, avec alpha = 0,05 et analyser chaque instant individuellement, sans pour autant assumer une SD compatible
  2. Comparer les différences entre plusieurs groupes le même jour par ANOVA à avec le post-test de comparaisons multiples Tukey. La survie entre les groupes expérimentaux a été analysée par la méthode de Mantel-Cox.

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Representative Results

LysM-EGFP × MyD88- / - souris sont plus sensibles à l’infection par Staphylococcus aureus que souris LysM-EGFP

La souche Staphylococcus aureus utilisée dans cette étude, ALC290618, a été construit avec un plasmide contenant la construction lux qui produit des signaux bioluminescentes de bactéries vivantes et activement métabolisants. Lorsqu’il est inoculé à des souris, bioluminescence in vivo (BLI) techniques d’imagerie peut être utilisé pour mesurer la charge de bactéries au sein d’une plaie infectée longitudinalement. LysM-EGFP × MyD88- / - souris et souris LysM-EGFP ont été blessés et infectées avec 1 x 107 UFC S. aureus dans la plaie pour comparer leur susceptibilité à l’infection par Staphylococcus aureus . LysM-EGFP × MyD88- / - souris ont montré une plus grande susceptibilité à l’infection que les souris LysM-EGFP démontrent par 80 % de létalité × LysM-EGFP MyD88- / - souris pendant les 8 premiers jours d’infection par rapport à 0 % de létalité des souris LysM-EGFP pendant la ensemble de 15 jours la durée de l’expérience (Figure 3 a). Les deux souches de souris perdent environ 5 % du poids corporel suite à une infection, mais souris LysM-EGFP récupéré poids original par jour 2, tandis que LysM-EGFP MyD88- / - les souris × n’a pas récupéré perdu du poids (Figure 3 b). Fermeture de la plaie en présence de l’infection à Staphylococcus aureus ne différait pas entre les deux souches ; Cependant, sterilely blessés × LysM-EGFP MyD88- / - avait un défaut important dans la cicatrisation des plaies par rapport aux souris LysM-EGFP (Figure 3), comme indiqué précédemment19. Tout animal d’imagerie utilisée pour mesurer la charge bactérienne tous les jours, et dès le jour 1, MyD88- / - plaies de le × LysM-EGFP avaient une charge bactérienne supérieure que LysM-EGFP blesse. LysM-EGFP souris sous contrôle de l’infection et une diminution des signaux BLI in vivo dans la plaie, alors que LysM-EGFP MyD88- / - les souris × montrent une augmentation de la charge bactérienne qui atteint un plateau au jour 4 jusqu'à la mort animale (Figure 3D,E). Ensemble, ces résultats démontrent la sensibilité accrue des LysM-EGFP MyD88- / - les souris × à S. aureus infection par rapport à des souris LysM-EGFP.

Traite des neutrophiles est altérée chez S. aureus infectés LysM-EGFP MyD88- / - souris × par rapport aux souris LysM-EGFP

La souris LysM-EGFP produit verts fluorescents neutrophiles due à une protéine EGFP codée en aval du promoteur Lysozyme M12. Cette souris a été utilisée pour étudier le trafic in vivo longitudinale neutrophiles en réponse à cutanée S. aureus infection13,14,20,21,22. Pour comparer les neutrophil cinétique aux blessures produites sur LysM-EGFP et LysM-EGFP × MyD88- / - souris, une blessure de la peau de pleine épaisseur 6 mm a été administrée sur la face dorsale, et souris ont été imagées par jour. A observé une diminution de 40 % dans le trafic de neutrophiles aux plaies × LysM-EGFP MyD88- / - par rapport à des souris LysM-EGFP (Figure 4 a, C). Lorsque 1 x 107 UFC de S. aureus a été introduit immédiatement après la blessure, traite des neutrophiles a été atténuée chez les deux souches de souris, mais LysM-EGFP × MyD88- / - souris étaient plus sensibles à l’infection par Staphylococcus aureus l’égard de recrutement neutrophil. Infection due à un 50 % diminution initiale neutrophile traite à LysM-EGFP × MyD88- / - plaies comparés à une diminution de 15 % observée dans les plaies LysM-EGFP (Figure 4 b). Souris LysM-EGFP a également recrutement des neutrophiles beaucoup plus sur la plaie durant les derniers stades de l’infection (Figure 4 a,C) par rapport aux LysM-EGFP × MyD88- / - souris, qui n’ont pas pas augmenter le nombre de neutrophiles même dans la présence de la charge bactérienne soutenue. Ensemble, ces résultats démontrent que LysM-EGFP × MyD88- / - souris présentent un défaut dans le recrutement de neutrophil, qui correspond à leur sensibilité accrue aux infections de S. aureus .

Figure 1
Figure 1 : Corrélation entre OD600 et UFC compte pour ALC2906. 3-4 ALC2906 SH1000 colonies ont été cueillies sur une gélose et virés au BST avec du chloramphenicol 10 µg/mL pour une culture. Le lendemain, la suspension a été divisée 01:50 BST avec du chloramphenicol 10 µg/mL et cultivées. Densité optique à 600 nm (OD600) a été mesurée à intervalles réguliers pendant 2 heures à l’aide d’un spectrophotomètre. À chaque mesure, la bactérie a été dilué 1/100 000 dans du PBS glacée et aliquotés sur une gélose à l’incubation durant la nuit. UFC ont été comptés le jour suivant pour calculer la concentration initiale et corrélée à l’OD600. N = 3 à 4 tailles différentes de600 OD par expérience. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : région représentative des intérêts (ROIs) pour l’analyse des données. Pour analyser les BLI in vivo et in vivo des signaux FLI, grand, ROIs de tailles équivalentes ont été centrées sur la plaie et le flux total (photons par seconde) a été mesuré. Pour mesurer la fermeture de la plaie, un retour sur investissement était apte au bord de la plaie et zone (cm2) a été mesurée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : LysM-EGFP × MyD88- / - souris sont plus sensibles aux infections de S. aureus par rapport aux souris LysM-EGFP. LysM-EGFP × MyD88- / - souris et les LysM-EGFP ont été administrés une 6 mm enroulée sur le dos et infectées avec 1 x 107 UFC de bioluminescent S. aureus ou du sérum physiologique stérile. Animaux ont été surveillés tous les jours et la survie de (A) et (B) poids ont été enregistrées. Animaux ont été projetés quotidiennement à mesure (C) taille de la blessure et la luminescence bactérienne (D). Images de bioluminescent représentant (E) sont représentés de LysM-EGFP infecté et les LysM-EGFP × MyD88- / - souris. Echelle = 3 mm. données représentent 7-16 souris par groupe pour A, C, et D et 3 souris par groupe pour B et sont exprimés en moyenne ±ét. * p = 0,05, ** p = 0,01, ***p = 0,001, *p < 0,0001 entre infecté (A, B, < / C18 > et D) ou non infecté (C) groupes. Signification statistique a été déterminée à l’aide du test de Mantel-Cox (A) et la méthode Holm-Sidak (B-D), avec alpha = 0,05 et chaque temps de point a été analysé individuellement, sans pour autant assumer une SD compatible. s’il vous plaît cliquez ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : LysM-EGFP × MyD88- / - souris ont recrutement neutrophil défectueux pour les plaies infectées.
LysM-EGFP × MyD88- / - souris et les LysM-EGFP ont été administrés une 6 mm enroulée sur le dos et infectées avec 1 x 107 UFC de bioluminescent S. aureus ou du sérum physiologique stérile. Animaux ont été projetés quotidiennement afin de mesurer la teneur en neutrophiles (A, B). (C) les images fluorescentes représentatives sont dépeints de LysM-EGFP × MyD88- / - souris et les LysM-EGFP infecté et non infectés. Echelle = données représentent de 5 mm. 8-16 souris par groupe et sont exprimés en moyenne ±ét. * p < 0,05, ** p < 0,01, et *** p < 0,001 entre infectés par groupes et # p < 0,01 entre non infectés groupes (A) ou en tant que représentée sur le graphique (B). Signification statistique a été déterminée à l’aide de la méthode Holm-Sidak (A), avec alpha = 0,05 et chaque temps de point a été analysé individuellement, sans pour autant assumer une compatible SD et ANOVA à (B), avec les multiples Tukey-comparaisons après le test. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Modèles d’infection de S. aureus qui utilisent la bioluminescence S. aureus infection chez une souris journaliste neutrophiles fluorescent en conjonction avec des techniques avancées d’imagerie optique in vivo animaux ont fait progresser notre connaissance de l’inné réponse immunitaire à l’infection. Des études antérieures à l’aide de la souris LysM-EGFP ont montré que vers le haut à 1 x 107 neutrophiles recrue d’une plaie infectée de Staphylococcus aureus dans les premières 24 heures de l’infection à14et les neutrophiles recrutés plaie visent à étendre leur demi-vie de 1,5 à 5 jours en réponse à un S. aureus-infection de plaie22. Une tactique de survie adaptée par souris pour lutter contre l’infection est traite des souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices (CSPH) d’une plaie infectée de la moelle osseuse où ils élargissent en bactéricides neutrophiles EGFP+ dans un TLR2/MyD88/PGE2 21de façon dépendante. En outre, la granulopoïèse extramédullaire fournit une source essentielle des neutrophiles à la rescousse de S. aureus infecté MyD88- / - souris de septicémie mortelle13. Transfert adoptif de HSPC de souris LysM-EGFP dans des souris de type sauvage rend possible d’examiner le processus de production locale de neutrophil et de son importance dans la lutte contre le Staphylococcus aureus dans une plaie13,21. Il est également possible de calibrer avec précision le nombre de neutrophiles dans la plaie ; nombre de neutrophil dans les plaies corrélation linéaire avec signal EGFP de 1 x 106 à plus de 1 x 107 neutrophiles et la limite de détection est d’environ 1 x 106 neutrophiles dans une plaie de 6 mm14.

Dans nos résultats représentatifs, nous comparons neutrophile longitudinal et la cinétique de Staphylococcus aureus dans les blessures du LysM-EGFP et × LysM-EGFP MyD88- / -. Il s’agit à notre connaissance, cette première étude qui compare la charge bactérienne et les neutrophiles traite entre le type sauvage et souris immunodéprimées longitudinalement dans la résolution de l’infection. D’intérêt particulier est le degré d’atténuation de neutrophiles recrutement causée par Staphylococcus aureus infection chez la souche MyD88- / - , qui a provoqué une diminution de 15 % dans le trafic de neutrophiles chez les souris de type sauvage comparées à une diminution de 50 % dans MyD88-/ -. S. aureus est capable d’échapper à la réponse immunitaire de l’hôte en produisant un certain nombre de facteurs de virulence connus pour inhiber indirectement traite des neutrophiles (c'est-à-dire, α-toxine leucocidine de Panton-Valentine et chimiotactisme protéine inhibitrice23 , ( 24), et nos résultats indiquent que la signalisation MyD88, probablement par le biais de TLR2 et TLR4 IL-1R, est essentielle pour surmonter les stratégies employées par S. aureus d’éluder les réponses immunitaires de l’hôte. Facteur de virulence-knockout Staphylococcus aureus souches peuvent être utilisés dans ce modèle pour caractériser leur effet sur le trafic des cellules myéloïdes13. En outre, quand étudié conjointement avec la LysM-EGFP × MyD88- / - souris, ce modèle souligne le rôle des MyD88 signalisation dans la lutte contre les effets pathogènes des facteurs de virulence.

Il y a plusieurs étapes cruciales dans le présent protocole qui si effectuée incorrectement peut introduire une variabilité dans les études. Les procédures de blessant et l’infection sont simples par rapport aux autres modèles de la maladie de la souris, mais il n’est pas sans ses subtilités. Coup de poing biopsies de la peau sont très coupantes et peuvent facilement couper dans le muscle spinotrapezius au-dessous de la peau. Endommager ce muscle et son aponévrose modifie recrutement neutrophile et augmente la variabilité entre les souris et une se traduisent par une infection de S. aureus plus invasive qui n’est pas centrée dans la plaie. Souris avec des dommages importants au muscle spinotrapezius devraient être exclus des études.

Une autre source d’erreur dans ce modèle provient de changements dans la bioluminescence souche de Staphylococcus aureus au fil du temps, ce qui peut modifier les signaux BLI in vivo et la cinétique de croissance. La souche ALC2906 contient un plasmide de navette qui contient l’opéron mis à jour le lux de construction de Photorhabdus luminescens qui est tenue de produire les signaux bioluminescentes, qui peuvent être mis au rebut par la bactérie Staphylococcus aureus plus de temps25. Dans un bouillon de culture sans sélection, 97 % des colonies SH1000 produit bioluminescentes signaux au jour 3. Cette fréquence est tombée à 53 % le jour 5 et 21 % le jour 1026. Ainsi, en points dans le temps plus tard au cours de l’infectieux, les signaux BLI in vivo probablement commence à légèrement (< différence 1 log) sous-estimer la charge bactérienne réelles in vivo . Il est important de geler dans les stocks de glycérol fraîches de S. aureus avec sélection antibiotique pour maintenir le plasmide à l’arrivée et le remplacement des stocks de travail des bactéries fréquemment (p. ex., tous les trois mois) peut aider à prévenir la perte de la bioluminescent construct pendant l’entretien de la culture. Les souches récentes de bioluminescent S. aureus contiennent un construct bioluminescentes stablement intégrée27,28 et sont probablement une amélioration sur la souche de ALC2906 utilisée dans ce modèle.

Bien que ce modèle est utile pour étudier voie cutanée localisée S. aureus infections, il a des limites. Les signaux BLI in vivo de la charge bactérienne est limitée à la plaie et la peau adjacente. Le modèle ne prévoit pas une lecture fiable des infections profondes invasives comme la septicémie, et les animaux doit être euthanasiés pour mesurer la diffusion de bactéries dans la circulation sanguine ou les reins13. Souches bioluminescentes plus récents et plus lumineux artificiels ont été générés qui peut permettre la détection des signaux BLI in vivo des organes internes27,28. En outre, longitudinale détection et surveillance du trafic neutrophiles ne peuvent être mesurés dans d’autres communément acquis de S. aureus infections, y compris respiratoires et les infections du sang. Sensibilité réduite en raison de l’autofluorescence des tissus est également une limitation de ce modèle. La souris de rattrapage récemment développée utilise un RFP TdTomato par un promoteur de la Ly6G et peut avoir un signal / bruit plus élevé que la souris LysM-EGFP due à réduit fluorescence auto tissu dans le DP canal11.

La diaphonie potentielle entre les signaux d’émission des BLI et FLI in vivo dans ce modèle est digne de la discussion mais est négligeable. Si nous effectuons des expériences sans excitation lumineuse et ne recueillir que des signaux de FLI EGFP in vivo à l’aide du filtre 520/20, nous n’observons pas les signaux appréciables de souris infectées, démontrant qu’il existe des signaux collectés in vivo FLI EGFP signaux et non chevauchement des signaux BLI in vivo de la bactérie (données non présentées). Ceci est principalement dû au temps de collection de signal, qui est seulement 1 seconde pour un filtre de longueur d’onde d’excitation spécifique de 465/30 nm et émission de filtre de 520/20 et 1 minute pour BLI in vivo et in vivo FLI nm. Ces paramètres permettent une détection optimale des signaux de FLI EGFP in vivo sans contribution de signaux BLI in vivo. C’est le mieux démontré lors de la comparaison de l’ordre de grandeur de l’axe des ordonnées entre Figure 3D et de la Figure 4 a. Les signaux émis par le BLI in vivo est environ 100 fois moins que les signaux de FLI de EGFP in vivo, indiquant que les signaux BLI in vivo sont négligeables et contribuent à moins de 1 % des signaux observés de FLI in vivo.

Nous attendons de futures applications de ce modèle aidera les chercheurs découvrir et caractériser les facteurs de virulence de S. aureus et servir de modèle animal préclinique pour tester de nouvelles thérapies visant à effacer l’infection à Staphylococcus aureus en stimulant la croissance des réponse immunitaire innée.

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Disclosures

Lloyd S. Miller bénéficie du soutien de la subvention de MedImmune, Pfizer, Regeneron et le Chan Soon-Gilles Nanthealth Foundation et frais de consultation de Noveome Biotherapeutics et la fondation de Nanthealth Chan Soon-Gilles qui ne sont pas liés aux travaux déclaré dans cet article. Les autres auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la National instituts de santé subventions R01 AI129302 (à S.I.S.) et le programme de formation en pharmacologie : du laboratoire au patient à UC Davis (NIH T32 GM099608 à la plaque). Le moléculaire et imagerie génomique (CMGI) à l’Université de Californie à Davis fourni un appui technologique superbe.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Falcon 352059
6 mm Disposable Biopsy Punch Integra Miltex 33-36
Bioluminescent S. aureus Lloyd Miller, Johns Hopkins  ALC 2906 SH1000
Bovine Blood Agar, 5%, Hardy Diagnostics VWR 10118-938
Buprenoprhine hydrochloride injectable Western Medical Supply 7292 0.3 mg/mL
C57BL/6J Mice Jackson Labratory 000664
Chloramphenicol (crystalline powder) Fisher BioReagents BP904-100
DPBS (1x) Gibco  14190-144
Insulin Syringes Becton, Dickson and Company 329461 0.35 mm (28 G) x 12.7 mm (1/2'')
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System Perkin Elmer 124262
Living Image Software – IVIS Spectrum Series Perkin Elmer 128113
LysM-eGFP Mice Thomas Graff Albert Einstein College of New York  NA
Microvolume Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-2000
MyD88 KO Mice Jackson Labratory 009088
Non-woven sponges AMD- Ritmed Inc A2101-CH 5 cm x 5 cm
Povidone Iodine 10% Solution Aplicare 697731
Prism 7.0 GraphPad Software License 
Tryptic Soy Broth Becton, Dickson and Company 211825

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Un modèle de souris pour évaluer réponse immunitaire innée à l’infection par <em>Staphylococcus aureus</em>
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Anderson, L. S., Reynolds, M. B., Rivara, K. R., Miller, L. S., Simon, S. I. A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection. J. Vis. Exp. (144), e59015, doi:10.3791/59015 (2019).

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