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रासायनिक अलगाव, ठहराव, और त्वचा लिपिड की जुदाई सरीसृप से

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/59018
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biology, James Madison University, 2Department of Integrative Biology, Oregon State University

Summary

सरीसृप में, विशिष्टताओं से त्वचा लिपिड यौन संकेतन के लिए महत्वपूर्ण हैं, इनवेसिव प्रजातियों के प्रबंधन में संभावित उपयोग के साथ । यहाँ, हम शेड त्वचा या पूरे जानवरों से त्वचा लिपिड निकालने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन, कुल लिपिड द्रव्यमान का निर्धारण और विश्लेषण, और स्तंभ क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से भिन्नीकरण का उपयोग कर लिपिड को अलग.

Abstract

सरीसृप उनकी त्वचा में लिपिड का उपयोग कर विशिष्ट करने के लिए संकेत, मुख्य रूप से मेट ट्रैकिंग और मूल्यांकन सक्षम करने के लिए । इन लिपिड के अलगाव विकासवादी पैटर्न और रासायनिक संचार के तंत्र पर ध्यान केंद्रित अनुसंधान में उपयोगिता है, स्थलीय जीवन के विकास में लिपिड की पनरोक भूमिका को समझने के अलावा । एक लागू दृष्टिकोण में, ऐसी त्वचा आधारित cues इनवेसिव प्रजातियों के साथ निपटने के वंयजीव प्रबंधकों के लिए संभावित उपयोग किया है । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में साँप त्वचा लिपिड को बढ़ाता है के लिए मुख्य कदम निष्कर्षण, कुल लिपिड दृढ़ संकल्प, और कॉलम क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से भिन्नीकरण, उत्तरार्द्ध प्रक्रिया यौगिकों जो तब कर सकते हैं की शुद्ध eluates में जिसके परिणामस्वरूप के लिए शामिल या तो यौगिक पहचान (जैसे, गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री [जीसी-MS]) और/या और अधिक परिष्कृत परख में सीधे इस्तेमाल किया आवंटित करने के लिए विश्लेषण किया जा । त्वचा लिपिड रहने वाले त्वचा से निकाला जा सकता है, त्वचा, या मृत पूरे जानवरों शेड, ध्रुवीय कार्बनिक सॉल्वैंट्स (जैसे, hexane, बेंजीन, टोल्यूनि) का उपयोग कर । निष्कर्षण लिपिड solubilizes और, तो, विलायक एक औसत दर्जे का लिपिड ही निकालने उपज के लिए सुखाया जा सकता है । आंशिक पारंपरिक कॉलम क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से विशिष्ट eluates में कुल लिपिड निकालने की जुदाई शामिल है । कुल लिपिड निकालने पहले एक सब्सट्रेट आधारित स्तंभ के लिए बाध्य है (जैसे, एल्यूमिना) और, फिर, व्यक्तिगत eluates ("भिन्न") विलायक के विशिष्ट खंडों पर क्रमिक रूप से पारित कर रहे हैं स्तंभ के माध्यम से लिपिड मिश्रण से यौगिकों के elute सेट करने के लिए आम ध्रुवीयता के आधार पर । ध्रुवीय विलायक में ध्रुवीय विलायक (जैसे, diethyl ईथर) के सापेक्ष राशि को बढ़ाने के द्वारा एक मानकीकृत अनुक्रम में अंश प्रगति । इस पांडुलिपि में, हम सरीसृप के त्वचा लिपिड निकालने के लिए कई तरीकों का वर्णन और, फिर, ध्रुवीयता के आधार पर यौगिकों के विभिन्न सेट अलग करने के लिए एक मानक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, पारंपरिक स्तंभ क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर. पूरे लिपिड निष्कर्षों या विशिष्ट भागों, तो, परख में इस्तेमाल किया जा सकता है किसी भी जैविक यौगिकों उसमें से जुटाया गतिविधि निर्धारित करते हैं ।

Introduction

सरीसृप एपिडर्मिस में लिपिड का उत्पादन, या तो सीधे त्वचा कोशिकाओं से या असतत ग्रंथियों कि सामाजिक संचार में उपयोग किया जाता है से, जैसे मेट मूल्यांकन और ट्रैकिंग, territoriality, और अंतर और विशिष्ट पहचान1,2 ,3,4. इन त्वचा लिपिड के अलगाव विकासवादी पैटर्न और रासायनिक संचार के तंत्र पर ध्यान केंद्रित अनुसंधान में उपयोगिता है, स्थलीय जीवन के विकास में लिपिड की पनरोक भूमिका को समझने के अलावा2,3 ,4. इसके अलावा, कई सरीसृप, विशेष रूप से squamates (छिपकली, सांप), संवेदनशील पारिस्थितिकी प्रणालियों में चिंता की इनवेसिव प्रजातियों हैं, और फेरोमोन के विकास आधारित lures को फँसाने में सुधार और हटाने चल रही है5,6। साँप त्वचा की पारगम्यता रासायनिक संकेतों का एक संभावित मजबूत स्रोत के अपेक्षाकृत शुद्ध निकालने प्राप्त करने के लिए वर्तमान लिपिड के निष्कर्षण की सुविधा । वर्णित प्रोटोकॉल में साँप त्वचा लिपिड को बढ़ाता है के लिए सिद्धांत कदम निष्कर्षण, कुल लिपिड दृढ़ संकल्प, और कॉलम क्रोमैटोग्राफी1,6,7 के माध्यम से अंश शामिल हैं । तरीकों नियमित रूप से इस्तेमाल किया गया है के रूप में वे सक्रिय उपज अलग है कि दोस्त पसंद और चयन के बारे में ज्यादा समझाने की, विशेष रूप से सांप2में ।

त्वचा लिपिड या तो रहने वाले त्वचा से निकाला जा सकता है, शेड त्वचा, या मृत पूरे सरीसृप, का उपयोग कर ध्रुवीय या ध्रुवीय कार्बनिक सॉल्वैंट्स1,7,8,9। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि संग्रहालय ऐसे इथेनॉल के रूप में सॉल्वैंट्स में संग्रहित नमूनों त्वचा लिपिड की निकासी के लिए इष्टतम नहीं हैं, और केवल ताजा या हौसले से जमे हुए लावे निष्कर्षण के लिए संभव स्रोतों के रूप में माना जाना चाहिए । त्वचा लिपिड निष्क्रिय है, जो उंहें त्वचा की सतह और7निकालने के लिए आसान पर स्थिर बनाता है । साँप पारिस्थितिकी में उनके संकेत भूमिकाओं में, त्वचा लिपिड cues अक्सर कठोर वातावरण में जमा कर रहे हैं, लेकिन उनके मजबूत रासायनिक गुणों की वजह से, ऐसे cues समय की लंबी अवधि में अपनी जानकारी के मूल्य को बनाए रखने कर सकते हैं10,11 , 12. निष्कर्षण प्रक्रिया लिपिड solubilizes, एक घंटे से अधिक लंबे समय सोख, विलायक के वाष्पीकरण के द्वारा पीछा किया एक गैर-ध्रुवीय विलायक (जैसे, hexane, बेंजीन, टोल्यूनि) का उपयोग कर, लिपिड निकालने के एक औसत दर्जे का मास छोड़ने के लिए7 , 8. त्वचा लिपिड में अत्यधिक मिश्रणीय है, और हाइड्रोकार्बन की एक विस्तृत श्रृंखला के सूत्रों के एक इसी तरह विविध सरणी से निकाला जा सकता है ।

भिन्नीकरण निष्कर्षण से अधिक श्रमसाध्य है, लेकिन स्तंभ क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से विशिष्ट भागों में कुल लिपिड निकालने के लिए अलग करने के लिए कार्य करता है, शुद्धीकरण और यौगिकों के संभावित पहचान में सहायता करने के लिए उसमें1, 6 , 7 , 8. कुल लिपिड निकालने एक सब्सट्रेट आधारित स्तंभ के लिए बाध्य है, और फिर, व्यक्तिगत eluates ("भिन्न") विलायक के विशिष्ट खंडों पर क्रमिक रूप से पारित कर रहे हैं स्तंभ के माध्यम से लिपिड मिश्रण से यौगिकों का elute सेट है कि एक आम ध्रुवीयता6,7,8. लिपिड क्रोमैटोग्राफी में, ध्रुवीय विलायक (आमतौर पर एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया: 0%, 2%, 4%ईथर, आदि के सापेक्ष राशि में वृद्धि के द्वारा कुछ मानकीकृत अनुक्रम में भिन्नता में ध्रुवीकरण की प्रगति . )6,7,8. हालांकि पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) जैसे तरीकों को एक मिश्रण में लिपिड अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और सरल कर रहे हैं, कॉलम क्रोमैटोग्राफी क्योंकि यह एक बंद प्रणाली का उपयोग करता है पसंद है, को नियंत्रित करने के लिए आसान है, और अधिक केंद्रित मिश्रण अलग कर सकते हैं, और के साथ संगत है division for कार्यकुशलता. इस पांडुलिपि में, हम सरीसृप के त्वचा लिपिड निकालने के लिए कई तरीकों का वर्णन और, फिर, ध्रुवीयता के आधार पर यौगिकों के विभिन्न सेट अलग करने के लिए एक मानक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, पारंपरिक स्तंभ क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर. कई अनुसंधान रासायनिक cues के अलगाव को शामिल परियोजनाओं में, अंतिम लक्ष्य के लिए उन cues को उजागर रिसीवर में परिवर्तन प्रभाव है । पूरे लिपिड निष्कर्षों या विशिष्ट भिन्न कर सकते हैं, तो, परख में इस्तेमाल किया जा करने के लिए किसी भी जैविक यौगिकों में यह1,2,6,7से संनिहित गतिविधि का निर्धारण । बुनियादी जैविक अनुसंधान में, उदाहरण के लिए, विशिष्ट भागों का उपयोग कर परख शोधकर्ताओं को पता चलता है कि pheromones के एक शुद्ध स्रोत अलग किया गया है सकते हैं, और फिर, लक्ष्य यौगिकों की पहचान के लिए तरीकों को आगे बढ़ाया जा सकता है । एक वंयजीव प्रबंधन के नजरिए से, पहचान लक्ष्य नहीं हो सकता है, और इसके बजाय, सक्रिय अंश क्षेत्र में इस्तेमाल किया जा सकता है करने के लिए जाल या देशी निवास स्थान13,14में ट्रैकिंग दोस्त को बाधित करने के लिए विशिष्टताओं को आकर्षित ।

Protocol

रीढ़ के उपयोग को शामिल करने वाली सभी प्रक्रियाओं को जेंस मेडिसन विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. निष्कर्षण

  1. शेड त्वचा निष्कर्षण
    1. लगभग 30 सेमी2 इकट्ठा एक साँप से शेड, सिर और cloacal वर्गों है कि नमूनों को दूषित कर सकते हैं को हटाने. chloroprene दस्ताने पहनें और मलबे के शैड को साफ करें ।
    2. एक बैग या वजन नाव के साथ संतुलन धड़ा और शेड (± ०.०१ g) तौलना ।
      नोट: जन परिशुद्धता संतुलन की परिशुद्धता द्वारा निर्धारित किया जाता है । शेड त्वचा द्रव्यमान निकाले त्वचा लिपिड द्रव्यमान के लिए मानकीकरण कारक है (नीचे देखें) और काफी covaries के साथ निकाले लिपिड मास.
    3. छोटे (5 सेमी2) टुकड़ों में अलग शेड और उंहें एक hexane के साथ एक सील कांच कंटेनर को जोड़ने के संगत ढक्कन (उदाहरणके लिए, एक धातु ढक्कन या एक PTFE ढक्कन के साथ एक प्रयोगशाला कुप्पी के साथ एक गिलास मेसन जार) । कंटेनर में खिचड़ी भाषा पर्याप्त hexane पूरी तरह से शेड त्वचा टुकड़े जलमग्न । कंटेनर सील ।
      चेतावनी: Hexane ज्वलनशील, एक श्वसन अड़चन है, और कई छोटे और दीर्घकालिक स्वास्थ्य खतरों के साथ जुड़ा हुआ है । hexane शामिल प्रक्रियाओं एक धुएं डाकू (प्रयोगशाला) या बाहर (क्षेत्र) में प्रदर्शन कर रहे है जबकि उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहने (जैसे, छप चश्में, chloroprene दस्ताने, लंबी आस्तीन, बंद पंजे जूते) ।
    4. एक पेंसिल या विलायक प्रतिरोधी कलम के साथ कंटेनर (ओं) लेबल । कमरे के तापमान पर धुएं डाकू में कंटेनर (ओं) को छोड़ रात भर या 24 घंटे तक ।
    5. साफ धातु संदंश या चिमटे का उपयोग करके शेड टुकड़े निकालें । कंटेनर में किसी भी बचे हुए hexane को बनाए रखने के लिए टुकड़ों को हिलाएं । त्वचा के टुकड़ों को कागज तौलिए पर सूखने दें; फिर, उंहें त्यागें । एकाधिक निकालने प्रदर्शन किया जा रहा है, तो प्रत्येक नमूने के बीच चिमटे/संदंश साफ़ करें । संदंश को साफ करने के लिए, उंहें एक चोंच में hexane के ~ ५० मिलीलीटर में कुल्ला ।
    6. अगर निकालने के लिए तुरंत इस्तेमाल किया जा नहीं है, खिचड़ी भाषा या उचित मात्रा के एक गिलास शीशी में निकालने पिपेट, यह एक PTFE के साथ सील, टोपी लाइन, यह लेबल, और यह दुकान पर-20 ° c.
      चेतावनी: क्योंकि निकालने hexane शामिल हैं, एक धमाका प्रूफ फ्रीजर में शीशियों की दुकान ।
  2. मृत पूरे पशु निष्कर्षण
    1. थूथन-वेंट लंबाई (SVL; सेंटीमीटर में) और द्रव्यमान (ग्राम में) पशु का रिकॉर्ड करें । त्वचा की सतह क्षेत्र के प्रति इकाई कुल लिपिड या फेरोमोन उत्पादन निर्धारित किया जा करने के लिए है, तो अधिकतम शरीर परिधि (सेंटीमीटर में) प्राप्त करने के लिए एक दर्जी टेप उपाय का उपयोग करें ।
    2. निष्कर्षण के लिए, एक कंटेनर है कि एक व्यास है कि पशु की लंबाई के 1/3 है चुनें । शीर्ष पर सिर और क्लोअका के साथ कंटेनर के तल पर सुरक्षित रूप से लोथ की स्थिति । शरीर के जलमग्न सतह क्षेत्र को अधिकतम करने के लिए कंटेनर में पर्याप्त hexane नहीं कर सकते ।
      नोट: यदि सिर या क्लोअका निष्कर्षण में समय की किसी भी राशि के लिए जलमग्न हो जाते हैं, ध्यान रखना ।
    3. ढक्कन सुरक्षित, कंटेनर लेबल, और यह एक धुएं डाकू में कमरे के तापमान पर रात भर या 24 घंटे में भिगोना ।
    4. लोथ को हटाते समय साफ मेटल संदंश या चिमटे का इस्तेमाल करें । कंटेनर में लोथ पर अवशिष्ट hexane को शरीर से ड्रिप की अनुमति देकर, सिर या पूंछ से न रखें । कंटेनर सील ।
    5. अगर निकालने के लिए तुरंत इस्तेमाल किया जा नहीं है, निकालने या उचित मात्रा के एक गिलास शीशी में यह पिपेट, यह एक PTFE-लाइन टोपी के साथ सील, यह लेबल, और यह दुकान पर-20 ° c.

2. लिपिड सामूहिक संकल्प

नोट: निकाले लिपिड जन दो तरीकों में से एक में निर्धारित किया जा सकता है: एक गिलास शीशी या एक गोल नीचे कुप्पी के साथ, एक रोटरी वाष्पीकरण का उपयोग कर ।

  1. कांच की शीशी विधि के द्वारा निकाली लिपिड मास का निर्धारण ।
    1. पर्याप्त आकार (7 मिलीलीटर, 22 मिलीलीटर, ५० मिलीलीटर, आदि) की एक तौला शीशी का प्रयोग करें । कैप और लेबल को कुल द्रव्यमान में शामिल करें, या हमेशा शीशी को बिना कैप और लेबल के तौलना (लेबल पर चिह्नों को भी द्रव्यमान जोड़ें). पानी के संपर्क से बचने के लिए कुप्पी की गर्दन पर लेबल लगाएं ।
      नोट: कांच शीशियों में वाष्पीकरण कुशल है अगर शोधकर्ता एक गैस कई गुना प्रणाली के लिए उपयोग किया है, जहां एकाधिक शीशियों एक साथ एक एन2 धारा के तहत सुखाया जा सकता है ।
    2. शीशी को निकालने के लिए स्थानांतरण, एक रबर बल्ब के साथ एक गिलास पिपेट का उपयोग कर या, बड़ी मात्रा के अर्क के लिए, एक डिस्पोजेबल 10 मिलीलीटर कांच पिपेट के साथ एक इलेक्ट्रॉनिक पिपेट नियंत्रक । hexane के ~ 3 मिलीलीटर के साथ कंटेनर कुल्ला और शीशी को हस्तांतरण के रूप में अच्छी तरह से ।
    3. एक सज्जन N2 धारा के तहत नमूना लुप्त हो जाना । एक कोण पर शीशी झुकाव एक अधिकतम विलायक सतह क्षेत्र को सक्षम करने के लिए । घनीभूत के बाहर शीशी के रूप में hexane वाष्पीकरण पर फार्म होगा ।
      नोट: लिपिड के छल्ले के रूप में शीशी में hexane वाष्पीकरण के रूप में होगा, तो समय से निकालने घूमता है ।
    4. सूखापन के लिए नमूना लुप्त हो जाना; फिर, फिर से तौलना । कुल लिपिड उपज रिकॉर्ड ।
      नोट: विभिंन समूहों में विश्लेषण के लिए, लिपिड द्रव्यमान का मानकीकरण या तो बड़े पैमाने पर बहाने के लिए (लिपिड जन [ग्राम में] द्वारा विभाजित जन [ग्राम में) शेड का प्रतिशत लिपिड द्रव्यमान के लिए या पशु के SVL (लिपिड में जन [मिलीग्राम] SVL द्वारा विभाजित [में सेंटीमीटर]; प्रति इकाई लंबाई लिपिड द्रव्यमान पैदावार) । बड़े पशुओं अधिक लिपिड उत्पादन, और कई प्रजातियों दृढ़ता से यौन dimorphic, जो डेटा में महत्वपूर्ण पूर्वाग्रह लगाता है ।
  2. रोटरी वाष्पीकरण के माध्यम से निकाली लिपिड मास का निर्धारण ।
    1. व्यक्तिगत नमूना प्रति तेजी से वाष्पीकरण के लिए, एक तौला दौर नीचे कुप्पी के लिए निकालने के हस्तांतरण और यह एक रोटरी वाष्पन का उपयोग कर लुप्त हो जाना.
      1. अगर कण निकालने में नजर आ रहे हैं, तो कुप्पी के गले में एक फिल्टर पेपर कोन रखकर नमूना फ़िल्टर करें; फिर, कुप्पी को निकालने के लिए स्थानांतरण और यह गुरुत्वाकर्षण फिल्टर करने के लिए अनुमति देते हैं । पूरा निकालने के बाद फिल्टर पेपर का निपटारा हस्तांतरित किया जाता है ।
        नोट: रोटरी वाष्पीकरण से पहले नमूना मात्रा (अप करने के लिए ~ ८०% कुप्पी मात्रा) स्थानांतरण. रोटरी वाष्पीकरण के संघनित्र में निकालने के किसी भी bubbling दूषण का कारण बनता है और संघनित्र साफ किया जा करने की आवश्यकता है । एक टक्कर जाल कुप्पी और संघनित्र की गर्दन के बीच रखा जा सकता है अगर बुलबुले या "bumping" ज्यादातर नमूनों में होते हैं ।
    2. रोटरी वाष्पीकरण और पानी स्नान (५० ° c; विलायक उबलते बिंदु से कम) के लिए बिजली चालू करें । ठंडा पानी के प्रवाह संघनित्र को चालू करें ।
      नोट: रोटरी वाष्पन के संघनित्र या तो एक परिचालित मिर्च या एक ठंडा पानी नाली को वेंट पानी से जुड़ा है । प्रवाह की दर धीमी हो सकती है अगर पानी परिवेश की तुलना में कूलर है, विलायक वाष्प कुप्पी छोड़ने और संघनित्र में प्रवेश करने के लिए ।
    3. निर्वात स्रोत (पानी निर्वात या पंप) पर बारी. सुनिश्चित करें कि वैक्यूम दबाव संघनित्र की गर्दन को कुप्पी पकड़ करने के लिए पर्याप्त है । कुप्पी को जोड़ने से पहले संघनित्र के अंत में वेंट खोलो । कुप्पी की गर्दन पर बोतल स्लाइड, सील करने के लिए वेंट बंद करो, और कुप्पी जब कुप्पी जारी की है से डिस्कनेक्ट नहीं कर सकते यह सुनिश्चित करें ।
    4. ~ ५०% तक कुप्पी कम स्नान में जलमग्न है । मध्यम गति से कुप्पी के रोटेशन को प्रारंभ करें । यदि वैक्यूम, गति, संघनित्र प्रवाह, और स्नान के तापमान इष्टतम हैं, विलायक वाष्प जा कुप्पी के कुंडल पर गाढ़ा होगा और वसूली कुप्पी में ड्रिप ।
      1. यदि नमूना फोड़े (जैसे, बड़े बुलबुले, रैपिड बक), तुरंत निर्वात और/या रोटरी वाष्पीकरण की गति को कम । यदि उबलते जारी है, कुप्पी रोटेशन बंद करें, वैक्यूम बंद करें, नहाने से कुप्पी बढ़ाएं, और वैक्यूम सील छोड़ें । चरण 2.2.3 और 2.2.4 दोहराएं ।
        नोट: कोई विलायक वसूली कुप्पी में इकट्ठा कर रहा है, लेकिन निकालने स्पष्ट रूप से वाष्पीकरण है, निर्वात सबसे अधिक संभावना है और फिर से समायोजित किया जाना चाहिए ।
    5. वैक्यूम के तहत नमूना लुप्त हो जाना ~ विलायक के 2 मिलीलीटर कुप्पी (बड़ी मात्रा में अर्क) में रहता है, या, यदि एक तौला कुप्पी इस्तेमाल किया जा रहा है, एक < 1 सेमी व्यास के साथ तरल की एक मनका जब तक लुप्त हो जाना कुप्पी के तल में दिखाई देता है । रोटेशन और निर्वात को बंद कर दें; फिर, स्नान के बाहर कुप्पी बढ़ा ।
    6. वैक्यूम सील जारी है के रूप में कुप्पी गर्दन पकड़ो; फिर, गर्दन को मोड़ संघनित्र से स्लाइड । यदि एक बड़ी मात्रा में कुप्पी का प्रयोग किया जा रहा है, तो दिखाई देने वाले लिपिड को भंग करने के लिए कुप्पी में गाढ़ा निकालने घूमता है; फिर, पिपेट के माध्यम से एक छोटी मात्रा, तौला कुप्पी के लिए समाधान हस्तांतरण । बड़ी कुप्पी से कुल्ला करने के लिए hexane के 3 मिलीलीटर जोड़ें, यह भंवर, यह छोटे कुप्पी के लिए पिपेट, और फिर से लुप्त हो जाना (कदम 2.2.3-2.2.5) ।
    7. निकालने में तरल के मनका के रूप में hexane वाष्पों जमना होगा । सूखी एक बार, यह कमरे के तापमान तक पहुंचने के लिए अनुमति देते हैं । लिपिड एक पारदर्शी, कुप्पी (~ 5 मिनट) में पीले मोम के लिए सफेद फार्म का होगा । कुप्पी के अंतिम मास प्राप्त करने के लिए वजन ।
      नोट: निकाले लिपिड की प्रकृति पर निर्भर करता है, वे या तो ठोस होगा (जैसे, मोम) या semisolid (जैसे, कच्चे तेल) गुण, विशेष रूप से जब fractionated लिपिड काफूर हो (नीचे देखें).
  3. Solubilize के दर्ज की गई मात्रा में लिपिड्स को hexane के ≥ 1 मिलीग्राम लिपिड के hexane के प्रति 1 मिलीलीटर उपज है । क्रोमैटोग्राफी को प्रगति के लिए कार्य मात्रा ~ 5 मिलीलीटर है । यदि कुप्पी से शीशी में स्थानांतरित, कुल मात्रा के 2 मिलीलीटर को बनाए रखने के लिए शीशी को निकालने के बहुमत स्थानांतरित करने के बाद कुप्पी कुल्ला ।
  4. शीशियों लेबल, उन्हें PTFE-लाइन में टोपियां के साथ सील, और उन्हें-20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.

3. कॉलम क्रोमैटोग्राफी

नोट: विशिष्ट भागों में ध्रुवीयता के आधार पर अज्ञात यौगिकों को अलग करने के लिए, निकाले लिपिड जन को तैयार तरल क्रोमैटोग्राफी कॉलम और fractionated मानक रेफरेंस का उपयोग करने के लिए जोड़ा जा सकता है ।

  1. स्तंभ की तैयारी
    1. निकालने में लिपिड द्रव्यमान पर निर्भर करता है, या तो एक बड़े-या एक छोटे मात्रा में एक Teflon टोंटी के साथ ग्लास क्रोमैटोग्राफी स्तंभ का उपयोग करें । स्तंभ या तो के साथ सज्जित या एक निश्चित मात्रा वाले जलाशय से जुड़े हुए है (एक बड़े स्तंभ के लिए ५०० मिलीलीटर; एक छोटे स्तंभ के लिए २५० मिलीलीटर) । इसके बाद, इस प्रोटोकॉल केवल एक बड़ी मात्रा क्रोमैटोग्राफी स्तंभ एक जलाशय से जुड़े करने के लिए संदर्भित करता है । अच्छी तरह से किसी भी नए कांच के और भागों को साफ क्रोमैटोग्राफी में इस्तेमाल किया जा के रूप में धारा 4 में वर्णित; फिर, उंहें hexane या एक अंय ध्रुवीय विलायक के साथ कुल्ला ।
    2. शीसे रेशा ऊन का एक टुकड़ा गुना (~ लंबाई में 14 सेमी [एल] x चौड़ाई में 4 सेमी [डब्ल्यू]) बार जब तक ~ 4 cm x 4 cm का एक वर्ग का गठन किया है । स्तंभ के तल पर शीसे रेशा की स्थिति के लिए कॉलम की तुलना में अब एक लकड़ी के dowel रॉड का प्रयोग करें ।
    3. एक हुड में एक मानक अंगूठी के लिए कॉलम सुरक्षित दो clamps के साथ खड़े हो जाओ (जैसे, कुंडा या मॉड्यूलर), एक टोंटी के ऊपर और जलाशय की गर्दन के नीचे एक । स्तंभ स्तर । स्तंभ के अंतर्गत आसानी से फ़िट करने के लिए ५०० मिलीलीटर यूरिन के लिए पर्याप्त कार्यशील दूरी की अनुमति देने के लिए स्तंभ को ऊंचाई पर रखें. टोंटी खोलें ।
    4. डाल धोया और कॉलम में रेत सूख, जब तक एक ~ रेत के 3 सेमी शीसे रेशा के ऊपर टिकी हुई है । कॉलम के नीचे काले या गहरे कागज रखें और इसे धीरे से टैप करें । रेत हर नल के साथ कॉलम से गिर जाता है, शीसे रेशा बाधा अपर्याप्त है । दोहराएं कदम 3.1.2-3.1.4 ।
      नोट: नीचे से शीसे रेशा लाने के लिए एक dowel रॉड के अंत करने के लिए एक खुलासा क्लिप टेप का प्रयोग करें ।
    5. कॉलम के तहत ५०० एमएल यूरिन रखें । धीरे से एक १०० मिलीलीटर चोंच या स्तंभ जलाशय में एेसे सिलेंडर से रेत गीला करने के लिए hexane के ~ 25 मिलीलीटर खिचड़ी भाषा । बंद टोंटी जब वहां है ~ ०.५ रेत के ऊपर hexane के cm ।
    6. तटस्थ एल्यूमिना का वजन । प्रत्येक छोटे स्तंभ के लिए, का उपयोग करें ~ ५० g; प्रत्येक बड़े कॉलम के लिए ~ १७५ जी । एक 1 L Erlenmeyer कुप्पी में एल्यूमिना डालो । 1 L कुप्पी प्रति एल्यूमिना के ४०० g को सीमित करे ।
    7. एल्यूमिना (गतिविधि III) को सक्रिय करने के लिए, एल्यूमिना द्रव्यमान के 6% के बराबर मात्रा का पिपेट जल (अर्थात, एल्यूमिना के १०० ग्राम के लिए, 6 मिलीलीटर पानी डालें) । एल्यूमिना भर में बूंदों के रूप में पानी जोड़ें ।
    8. एल्यूमीनियम पंनी या एक काग के साथ कुप्पी कवर । जोरदार भंवर (हिला नहीं) को समान रूप से आरोप फैलाने के लिए । जारी रखें जब तक कोई दिखाई नहीं झुरमुट रहते हैं ।
      नोट: कुप्पी के रूप में पानी गर्म होगा जो एल्यूमिना के साथ प्रतिक्रिया करता है, जिसकी अपेक्षा की जानी है ।
    9. एल्यूमिना के ऊपर hexane के ~ ०.५ cm के साथ, पूर्ण रूप से कवर होने तक hexane जोड़ें । एक घोल बनाने के लिए कुप्पी को घूमता है ।
    10. कॉलम के जलाशय में एक वेंट कीप प्लेस और कॉलम के नीचे एक ५०० मिलीलीटर ग्लास चोंच । टोंटी खोलें । एल्यूमिना घूमता है और लगातार उसे कॉलम में डाल दिया जाता है । सुनिश्चित करें कि एल्यूमिना स्तंभ में समान रूप से बसने वाला है और एल्यूमिना स्तंभ में कोई बड़े बुलबुले या दरारें नहीं हैं । धीरे से स्तंभ के पक्ष को समान रूप से एल्यूमिना को व्यवस्थित करने के लिए टैप करें ।
      नोट: अतिरिक्त hexane के लिए अतिरिक्त डाला, घोल को बनाए रखने के लिए जोड़ा जाना चाहिए । कॉलम के तहत यूरिन में इकट्ठा होने वाले hexane को अगर ग्लास यूरिन स्टार्ट पर साफ किया गया तो इसका दोबारा इस्तेमाल किया जा सकता है.
    11. स्तंभ का गठन जब एल्यूमिना के ऊपर स्थिर होता है और जलाशय के आधार पर स्तंभ की गर्दन के नीचे ~ 4 सेमी होता है । जलाशय के अंदर अवशिष्ट एल्यूमिना के लिए hexane के साथ कुल्ला करने के लिए एक पिपेट का प्रयोग करें । एक कीप का प्रयोग, धीरे जलाशय के नीचे ~ 1 सेमी करने के लिए एल्यूमिना के शीर्ष पर रेत की एक दूसरी परत जोड़ने के लिए ।
      नोट: Hexane स्तंभ से प्रवाहित होगा क्योंकि टोंटी खुला रहता है । कॉलम को सूखने न दें । यदि स्तंभ बाहर सूख जाता है, प्रक्रिया फिर से शुरू होगा, 3.1.2 कदम से शुरू । यदि स्तंभ अंशों से एक दिन पहले तैयार किए जाते हैं तो प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है. मजबूती से जलाशय के शीर्ष में एक कॉर्क जगह या पंनी के साथ कसकर कवर । hexane के ~ १०० मिलीलीटर के साथ जलाशय भरें । कस टोंटी ।
  2. लिपिड निकालने के अंश
    नोट: स्तंभ आकार की परवाह किए बिना, लिपिड निकालने के अंशों को व्यक्तिगत रूप से एकत्र किया जा सकता है और उनके अंश ध्रुवीकरण के आधार पर परित या पूरी तरह से खारिज कर दिया अगर वे किसी भी ज्ञात/पहचान लक्ष्य यौगिकों शामिल नहीं है । लिपिड्स के पर्याप्त रेफरेंस को सुनिश्चित करने के लिए दोहराने वाले रेफरेंस के फेरे (एन = 3 वॉल्यूम्स) कॉलम के जरिए पास किए जाते हैं । बड़े कॉलम रेफरेंस के लिए टेबल 1 का पालन करें (एक उद्धरण मास > 30 मिलीग्राम के साथ) या छोटे कॉलम रेफरेंस (एक निकालने मास < 30 मिलीग्राम के साथ) । केवल मिथाइल ketones को अलग करने के लिए एक सिलवाया रेफरेंस प्रोटोकॉल तालिका 2में है ।
    1. या तो स्तंभ के शीर्ष पर बचे हुए hexane को निकालें, बड़ी मात्रा में पिपेट का उपयोग करके, या hexane को साफ चोंच में ड्रिप लगाने की अनुमति दें । छोड़ ~ 3 कॉलम के शीर्ष पर रेत के ऊपर hexane की मिलीलीटर ।
      नोट: एकत्र hexane शुद्ध अगर यह केवल साफ कांच के बीच संपर्क किया है और पहले अंश में पुनर्नवीनीकरण जा सकता है ।
    2. एक लंबे गिलास पिपेट का उपयोग कर, स्तंभ के लिए लिपिड निकालने हस्तांतरण. धीरे से रेत की परत को परेशान करने से बचने के लिए निकालने पिपेट । hexane के ~ 5 मिलीलीटर के साथ निकालने की शीशी या कुप्पी कुल्ला और यह कॉलम में स्थानांतरण ।
      नोट: यदि निकालने-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था, लिपिड उपजी हो जाएगा । तब तक शीशी को गर्म करे जब तक कि कोई और हाला न दिखाई दे ।
    3. टोंटी खोलें और नमूना स्तंभ में लोड करने के लिए अनुमति दें । यदि निकालने के एक बड़े द्रव्यमान है (> 30 मिलीग्राम), एक पीले रंग के बैंड एल्यूमिना में दिखाई जा सकती है, बस ऊपर रेत के नीचे । एक बेकार चोंच में के माध्यम से प्रवाह इकट्ठा के रूप में यह hexane अब साफ है । बंद टोंटी जब ~ 3 मिलीलीटर रेत के शीर्ष पर रहता है ।
      सावधानी: निकालने में लिपिड, अब एल्यूमिना और स्तंभ के लिए बाध्य, बाहर सूखी नहीं कर सकते या नमूना खो जाएगा ।
    4. पहले अंश को डालने से पहले स्तंभ के नीचे एक तौला और लेबल वाले गोल-नीचे कुप्पी (१०० मिलीलीटर, २५० मिलीलीटर या ५०० मिलीलीटर) रखें. भागों को छोड़ दिया जाना एक आम गिलास कंटेनर में एकत्र किया जा सकता है ।
    5. एेसे सिलेंडर में पहला अंश (१००% hexane: 0% diethyl ईथर [heretofore, "ईथर"]) तैयार करें । यदि अग्रिम में भागों की तैयारी, पन्नी या काग के साथ डाट के साथ कवर ।
      नोट: भिन्नताओं में प्रगति; इसलिए, सिलेंडर भागों के बीच कुल्ला करने की जरूरत नहीं है ।
    6. एक निकाल कांच के माध्यम से डालने के लिए जलाशय के लिए पहले अंश जोड़ने के लिए एक ओर निर्देशित कीप जलाशय के रेत परत परेशान से बचने के लिए । टोंटी को रेफरेंस शुरू करने के लिए खोलें । बंद टोंटी जब ~ hexane के 3 मिलीलीटर कॉलम के शीर्ष पर रेत के ऊपर रहता है ।
      नोट: eluate के बहुमत एकत्र किया गया है पहले टोंटी बंद करके एक व्यक्तिगत अंश के भीतर एक रेफरेंस कभी नहीं रोक. अंतर के बीच, नहीं छोड़ टोंटी से अधिक के लिए बंद कर दिया ~ 1 h क्योंकि देरी गुणवत्ता और रेफरेंस की पुनरावृत्ति को बदल सकते हैं ।
    7. दोहराएं चरण 3.2.4-3.2.6 भागों 2 और 3 के लिए । उचित आकार की कुप्पी में अंशों को एकत्र करें जो रोटरी वाष्पीकरण के लिए headspace की अनुमति दें, विशेषकर यदि अंशों को परित किया जा रहा हो ।
    8. एक चौथा अंश (2% ईथर) तैयार है और यह जलाशय में जोड़ें । कॉलम के नीचे अगली कुप्पी रखें, टोंटी खोलें और चौथा अंश एकत्र करें । पांचवां अंश तैयार करें; फिर, आवश्यकतानुसार जारी रखें ।
      नोट: यह रोटरी वाष्पीकरण के माध्यम से पहली अंश (ओं) लुप्त हो जाना संभव है, जबकि लगातार भिन्न इकट्ठा.
    9. भागों की तैयारी के लिए GC-एमएस विश्लेषण में इस्तेमाल किया जा करने के लिए, एक अंश एक ०.०१ या ०.१ मिलीग्राम परिशुद्धता संतुलन का उपयोग कर जन प्राप्त । Solubilize लिपिड अंशों की उपज 1 मिलीग्राम लिपिड के प्रति 1 मिलीलीटर hexane ।

4. सफाई

  1. टोंटी को खुला छोड़ दें और कचरे के यूरिन में कॉलम को उलटा करें । एल्यूमिना और रेत का कॉलम बाहर चला जाएगा; वैकल्पिक रूप से, प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए हिला । एक dowel रॉड का प्रयोग करें शीसे रेशा ऊन लाने के लिए अगर यह अटक गया है (कांच खरोंच से बचने के) या यह एक N2 धारा के साथ बाहर उड़ा ।
  2. Dissemble और सभी कांच के ऊपर साफ, प्रयोगशाला ग्रेड डिटर्जेंट का उपयोग कर एक प्लास्टिक के टब में गर्म पानी में एक कांच के नीचे के (बाल या प्लास्टिक bristles के साथ) । 3x धो लें । जब तक गिलास को छूने के लिए चालाक नहीं है गर्म पानी के बहुत से अच्छी तरह कुल्ला ।
  3. पानी के नीचे के कांच के और उपकरण 3x जल के साथ कुल्ला । उंहें हवा सूखी एक रैक पर रखें । सुखाने में तेजी लाने के लिए, कांच के बनने की एसीटोन (3 मिलीलीटर) की एक छोटी सी मात्रा में जोड़ें, भंवर, और यह हवा सूखी या एक N2 धारा के तहत इसे चलाने के लिए अनुमति देते हैं ।

Representative Results

निष्कर्षण के बाद, कुल लिपिड मास डेटा है कि यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है की पहली प्रकार है । हालांकि, कुल लिपिड व्यापक मूल्यों को कुछ करने के लिए प्राप्त मूल्यों का मानकीकरण प्रयास के बिना विश्लेषण नहीं किया जाना चाहिए । कई दृष्टिकोण इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन हम या तो मानकीकरण की सिफारिश की है पशु SVL को निकाले लिपिड (सेंटीमीटर में) या शेड त्वचा है कि निकाला गया था के द्रव्यमान के लिए । एक लिपिड में पूर्व परिणाम-मास-लंबाई मूल्य और बाद के स्रोत द्रव्यमान का अनुपात होगा । मानकीकरण के लिए कारण है कि बड़े पशुओं को स्वाभाविक रूप से अधिक त्वचा लिपिड उत्पादन क्योंकि वे एक अधिक से अधिक कुल त्वचा की सतह क्षेत्र है । चित्रा 1a मिसाल इस संघ, जहां निकाली त्वचा लिपिड बड़े पैमाने पर शेड त्वचा निकाले के साथ बड़े पैमाने पर तराजू । एक बार कुल बहाने त्वचा द्रव्यमान के लिए मानकीकृत, इस रैखिक संबंध पूरी तरह से हटा दिया है (आंकड़ा 1b) ।

निंनलिखित अंश, एक ही मानकीकरण दृष्टिकोण व्यक्ति भिंन (चित्रा 2) की जनता के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । इस नमूना डेटा सेट में, प्रत्येक अंश समान रूप से कुल निकाले गए लिपिड के लिए योगदान नहीं है: तटस्थ लिपिड (भिन्न 1-3) अधिक ध्रुवीय लिपिड के प्रत्येक सेट की तुलना में बड़े पैमाने पर अनुपात द्वारा यौगिकों के प्रमुख सेट कर रहे हैं (भिन्न 4-6, 7-9, और 10-12).

Figure 1
चित्रा 1: निकाले लिपिड जन और इनपुट सामग्री के बीच संबंध । (क) सरीसृप में, कुल के बीच संबंध त्वचा द्रव्यमान और निकाली त्वचा लिपिड द्रव्यमान सकारात्मक (पी < ०.००१) से संबंधित है । (ख) जब निकाली गई त्वचा लिपिड द्रव्यमान के लिए मानकीकृत किया जाता है कुल शेड द्रव्यमान (लिपिड जन शेड जन द्वारा विभाजित), इस संबंध अब मौजूद नहीं है (P = ०.४६). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: मानकीकृत भिंन जनता के रेफरेंस के बाद । स्तंभ क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करना, त्वचा लिपिड निष्कर्षों भागों में eluted जा सकता है, यौगिक ध्रुवीयता के आधार पर. अंश द्रव्यमान है, तो, कुल लिपिड निकालने के अनुपात के रूप में व्यक्त (अंश द्रव्यमान [मिलीग्राम में] कुल लिपिड निकालने द्रव्यमान द्वारा विभाजित [मिलीग्राम में) अंशों या प्रायोगिक8समूहों के बीच मतभेद निर्धारित करने के लिए. सलाखों के साधन का प्रतिनिधित्व करते हैं । शीर्ष त्रुटि SEM है; नीचे त्रुटि ९५% CI है । व्यक्तिगत डेटा बिंदुओं स्पष्टता के लिए प्रदान की जाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: मिथाइल कीटोंन अंशों के प्रतिनिधि गैस chromatographs । (क) उचित रेफरेंस के साथ, मिथाइल ketones की तालिका २ से भिन्ना ७ में सबसे प्रचुर यौगिक हैं और चोटियों के दोहे (अवधारण समय = 24-34 मिनट) के रूप में देखे जा सकते हैं. (ख) तालिका 2से भिंन 6, तथापि, केवल पैदावार लक्ष्य यौगिकों । यह वही परिणाम हो सकता है जब ध्रुवीय विलायक मोबाइल चरण में उपयोग की समयसीमा समाप्त हो गई है या यदि स्तंभ समय की लंबी अवधि के लिए बंद कर दिया है (> 1 ज) भागों के बीच । दो निशान के बीच आणविक बहुतायत में अंतर नोट करें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अंश Hexane (एमएल) Diethyl ईथर (एमएल)
1, 2, 3 १०० [30] 0 [0]
4, 5, 6 ९८ [२९.४] 2 [०.६]
7, 8, 9 ९६ [२८.८] 4 [१.२]
10, 11, 12 ९२ [२७.६] 8 [२.४]
13, 14, 15 ८४ [२५.२] 16 [४.८]

तालिका 1: त्वचा लिपिड भिन्नीकरण के लिए मानक रेफरेंस वॉल्यूम. विलायक मात्रा और प्रतिशत दोनों बड़े खंड (जैसे, २५० मिलीलीटर) और [छोटे खंड] (जैसे, १०० एमएल) क्रोमैटोग्राफी स्तंभ एल्यूमिना (गतिविधि III) का उपयोग कर के लिए दिए जाते हैं । Hexane वाहक विलायक है; diethyl ईथर मोबाइल चरण है ।

अंश Hexane (एमएल) Diethyl ईथर (एमएल) नोट्स
1, 2, 3 30 0 elute; जमा नहीं करते
4, 5 २८.८ १.२ elute; जमा नहीं करते
6, 7, 8 २८.८ १.२ व्यक्तिगत रूप से इकट्ठा; अधिकांश मिथाइल कीटोंन द्रव्यमान का अंश 7 में होगा; जीसी-MS की ketones का उचित रेफरेंस सुनिश्चित करने के लिए 6 व 8 पर क्वालिटी कंट्रोल चेक चलाया जाना चाहिए

टेबल 2: गेटिस स्नेक मिथाइल ketones के लिए संशोधित रेफरेंस स्कीम । ये वॉल्यूम एक छोटे वॉल्यूम वाले क्रोमैटोग्राफी कॉलम के साथ और वर्तमान में उपलब्ध एल्यूमिना के ब्रांड के साथ उपयोग के लिए हैं । eluted मिथाइल ketones के लिए सकारात्मक अंश जंगली, पुरुष गेटिस सांप1,7के साथ क्षेत्र परख में एक मजबूत है । लक्ष्य अंशों में मिथाइल ketones की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए, नमूनों को 1 मिलीग्राम/एमएल को पतला किया जा सकता है और GC-MS के माध्यम से विश्लेषण कर सकते हैं 3 रेफरेंस के बाद सकारात्मक और नकारात्मक दोनों परिणामों के लिए प्रतिनिधि chromatograms प्रदान करता है ।

Discussion

सरीसृप में त्वचा लिपिड के निष्कर्षण रहने या मृत त्वचा के लिए लागू किया जा सकता है, त्वचा शेड के अलावा, जो इस तकनीक के प्रायोगिक आवेदन में बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करता है । इसके अलावा, त्वचा लिपिड के निष्कर्षण क्षेत्र में किया जा सकता है, जीव2,13की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए विधि के एक गतिशील आवेदन को सक्षम करने के लिए । त्वचा लिपिड निष्कर्षण सरल है; इसलिए, यह आसान है के रूप में प्रयोग या डिजाइन प्रति जरूरत के लिए निकालने के लिए, और चिकित्सकों महत्वपूर्ण विशेषज्ञता के तरीकों को क्रियांवित नहीं की जरूरत है । ऊपर स्केलिंग के लिए ही सीमित कारक धुएं हूड अंतरिक्ष की उपलब्धता, स्वच्छ, सील कांच के बाहर का एक बहुतायत के, और विलायक भंडारण अंतरिक्ष के लिए कर रहे हैं ।

त्वचा लिपिड निकालें भिन्नीकरण एक शोधकर्ता की जरूरत के अनुरूप किया जा सकता है और, इसलिए, लिपिड निष्कर्षण करने के लिए समान लचीलापन है । उदाहरण के लिए, तटस्थ लिपिड eluted और फिर खारिज कर दिया जा सकता है, लक्ष्य भागों में परिणाम है कि ब्याज की यौगिकों शुद्ध या परख सरल हो सकता है । भिन्नीकरण के भीतर और लिपिड नमूनों के पार कई तराजू पर किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, प्रक्रिया को अधिक कुशल बनाने के लिए एकाधिक स्तंभों को एक साथ चलाया जा सकता है । या, केवल एक कुल लिपिड निकालने के एक हिस्से के लिए एक छोटे से स्तंभ पर fractionated जा सकता है, इस प्रकार, स्पेयर रिएजेंट और समय. आंशिक रूप से कुल लिपिड निकालने के द्रव्यमान और शोधकर्ता के लिए उपलब्ध उपकरणों की परिशुद्धता द्वारा सीमित है । उदाहरण के लिए, यदि शोधकर्ता एक १०.० मिलीग्राम परिशुद्धता के साथ एक संतुलन है, अंश द्रव्यमान का निर्धारण और, इसलिए, जीसी-एमएस विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी की सटीकता काफी है, नहीं तो पूरी तरह से, बाधा । एक ही कांच के नीचे के लिए सच है । यदि शोधकर्ता अंश के लिए एक बड़ी मात्रा स्तंभ है, लेकिन एक छोटे से कुल लिपिड अलग करने के लिए जन है, इस रेफरेंस या जुदाई यौगिकों की प्रगति होगी, लेकिन सॉल्वैंट्स, रिएजेंट, समय की एक महत्वपूर्ण अपव्यय की आवश्यकता होगी, और संभावित, लक्ष्य यौगिकों स्वयं ।

यह सलाह दी जाती है कि रेफरेंस स्कीम का निर्धारण करने से पहले गुणवत्ता नियंत्रण जांच कर लें, जैसा कि तालिका 2में देखा गया है, और तय करें कि किन अंशों को छोड़ा जा सकता है । वांछित लिपिड के रेफरेंस की पुष्टि करने के लिए, एक कॉलम चलाया जा सकता है, जहां प्रत्येक अंश, 1-15, व्यक्तिगत रूप से एकत्र किया जाता है और फिर GC-MS का उपयोग कर विश्लेषण । चित्रा ३में प्रतिनिधि गैस chromatograph निशान दिखाते हैं कि गेटिस साँपों से मिथाइल ketones एक विशिष्ट अंश में स्तम्भन से ही elute. इस गुणवत्ता नियंत्रण कदम प्रदर्शन करके, एक संशोधित रेफरेंस स्कीम ब्याज की यौगिकों की अधिकतम उपज सुनिश्चित करने के लिए एक दी गई प्रजातियों के लिए विकसित किया जा सकता है । सामग्री में परिवर्तन, इस तरह के आपूर्तिकर्ता या बहुत एल्यूमिना या diethyl ईथर की आयु के रूप में, बिल्कुल रेफरेंस में अंतर है कि एक गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षण प्रदर्शन के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए में परिणाम होगा ।

वर्णित तकनीकों संकेतों कि प्राप्त किया जा सकता है की रासायनिक प्रकृति द्वारा मुख्य रूप से सीमित कर रहे हैं । मुख्य रूप से, इन पद्धतियों केवल शोधकर्ताओं को अलग करने और सरीसृप की त्वचा से लंबी श्रृंखला लिपिड अलग करने के लिए अनुमति देते हैं । सरीसृप के कई प्रजातियों के रासायनिक संकेतों के रूप में हवाई और/या proteinaceous cues का उपयोग करें, और वर्णित तरीके अलग के साथ असंगत कहा cues हैं । इसके अलावा, ध्रुवीय सॉल्वैंट्स सरीसृप या क्यू जमाव के सूत्रों (जैसे, पिंजरे का पानी, मल बात, जलीय सब्सट्रेट) है कि वास्तव में प्रचुर मात्रा में रासायनिक संकेतों को शामिल कर सकते है की सतहों से जलीय cues निकालने नहीं होगा । संकेतों के इन प्रकार के कैप्चरिंग के लिए उपयुक्त तरीके शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध हैं (जैसे, ठोस चरण microextraction [SPME] अस्थिर cues और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी के लिए [HPLC] जलीय cues के लिए), हालांकि, तरीकों की तरह ऊपर वर्णित है, वहां एक तकनीकी सीखने की अवस्था है ।

सबसे महत्वपूर्ण बात, शोधकर्ता को अंतिम रासायनिक मिश्रण की उपयोगिता का इस्तेमाल किया तरीकों का मार्गदर्शन करना चाहिए । उदाहरण के लिए, यदि एक शोधकर्ता को पता है अगर एक पुरुष फोकल पशु एक लक्षित परख में पुरुष बनाम महिला विशिष्ट द्वारा उत्पादित cues के बीच अंतर कर सकते है चाहता है, निष्कर्षण ही विधि2,3की जरूरत है । यदि यौन dimorphic यौगिकों की पहचान लक्ष्य है, तथापि, निकालने के लिए शुद्ध होना चाहिए, विशिष्ट अणुओं या रासायनिक विश्लेषण के माध्यम से अणुओं के समूहों के लिए पहचान निर्दिष्ट करने में अधिक से अधिक विश्वास को सक्षम करने के लिए1, 6,9,11. हालांकि, यहां तक कि एक लिपिड स्रोत के साथ क्रोमैटोग्राफी आचरण करने के लिए, निकालने शुरू करने का एक महत्वपूर्ण बड़े पैमाने पर आवश्यक है ताकि औसत दर्जे का अंश जनता प्राप्त किया जा सकता है; अंयथा, नमूनों की पूलिंग पीछा किया जा सकता है, लेकिन14इष्टतम नहीं है ।

इस प्रोटोकॉल के भविष्य के घटनाक्रम का उपयोग और अधिक सांप प्रजातियों के लिए प्रक्रिया को अनुकूलित करने के उपाय शामिल हैं । त्वचा लिपिड निकालने के अतिरिक्त इनवेसिव तरीकों को भी विकसित किया जा रहा है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इन तरीकों के विकास, विशेष रूप से त्वचा लिपिड निष्कर्षण के बहाने, सहकारी समझौतों के दौरान हुई (14-7412-1061-ca, 15-7412-1155-ca, और 16-7412-1269-सीए) जेंस मैडिसन विश्वविद्यालय (JMU) और अमेरिका के कृषि विभाग के बीच पशु और पादप स्वास्थ्य निरीक्षण सेवा (APHIS). M.R.P. शेड त्वचा तरीकों के विकास के लिए निंनलिखित छात्रों के योगदान को स्वीकार करता है: एस पटेल (वाशिंगटन और ली विश्वविद्यालय [WLU]), जे Zachry (WLU), आर Flores (JMU), जे नॉल (JMU), और एस एस्टन (JMU) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Powder-free Chloroprene Gloves Microflex NEC-288 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves")
Ohaus Adventurer Precision Balance Ohaus AX622 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance")
Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid Ball NC9661590 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar")
Hexane, Mixtures of Isomers Sigma-Aldrich 650544 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane")
Hi/Lo Write-On Temperature Tape Electron Microscopy Sciences 5029927 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL Sigma-Aldrich Z414514 See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL Sigma-Aldrich Z414492 See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL")
Cork Flask Support Ring Sigma-Aldrich Z512419 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring")
Accu-jet Pro Pipette Controller Sigma-Aldrich Z671533 See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller")
Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL Pyrex 13-666-7E See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette")
Rotavapor R II Buchi 2422A0 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator")
Elliptical Bump Trap Chemglass Life Science 501215241 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap")
7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass Supelco 27151 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial")
7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner Supelco 27152 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap")
22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass Supelco 27173 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial")
22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner Supelco 27174-U See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap")
Excellence XS Analytical Balance Mettler-Toledo XS205DU See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance")
5 3/4" Disposable Glass Pipette Fisherbrand NC0418555 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette")
Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly Kimble-Chase 17810-19300 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column")
Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands Fischerbrand 11474207 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand")
3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp Troemner 2300203 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps")
Clamp Regular Holder Fischerbrand 05754Q See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder")
Sand,Washed and Dried Macron Fine Chemical MK-7062-212 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand")
Alumina, Neutral Sorbtech 15740-5 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US
Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL Pyrex 4980-1L See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL Sigma-Aldrich Z100684 See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask")
Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir Sigma-Aldrich Z560553 See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column")
Ethyl Ether Anhydrous Fisher Chemical E138500 See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether")
Alconox Detergnet Sigma-Aldrich 242985 See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox")
Acetone (Certified ACS) Fisher Chemical A18P-4 See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone")

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References

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Baedke, P. E., Rucker, H. R., Mason, R. T., Parker, M. R. Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles. J. Vis. Exp. (144), e59018, doi:10.3791/59018 (2019).

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