Summary
В пресмыкающихся липиды кожи с сородичами имеют решающее значение для сексуальной сигнализации, с потенциального использования в управлении инвазивных видов. Здесь мы описываем протоколы для извлечения липиды кожи от кожи сарай или всей животных, определение и анализ всего липидной массы и отделяя липиды, используя фракционирование через колоночной хроматографии.
Abstract
Рептилий сигнал сородичами, используя липидов в их коже, главным образом, с тем чтобы мате отслеживания и оценки. Изоляции эти липиды имеет программа исследований, посвященных эволюции моделей и механизмов химической связи, в дополнение к пониманию гидроизоляции роли липидов в эволюции земной жизни. В прикладной подход такие сигналы, основанные на кожу у потенциального использования для дикой природы менеджеров, занимающихся инвазивных видов. Основные шаги для количественной оценки липиды кожи рептилий в протоколе, представленные здесь включают извлечение, решимость всего липидов и фракционирование через колоночной хроматографии, последний процесс, в результате чего очищенная элюаты соединений, которые можно затем либо быть проанализированы, чтобы назначить составные идентификаторы (например, газовая хроматография масс-спектрометрии [GC-MS]) или используется непосредственно в более изысканной bioassays. Липиды кожи могут быть извлечены из жизни кожи, пролил кожи, или мертвый весь животных, с использованием неполярных органических растворителях (например, гексан, бензола, толуола). Добыча solubilizes липиды и, затем, можно испаряется растворитель поддаваться измерению липидов только экстракт. Фракционирование предполагает разделение всего липидов экстракт в конкретных элюаты через традиционные колоночной хроматографии. Экстракт всего липидов сначала привязан к субстрат на основе столбца (например, алюминия) и, затем, отдельные элюаты («дроби») растворителя на определенных томов передаются последовательно через колонку для элюировать наборы соединений из смеси липидов на основе общих полярности. Прогресс фракций в полярности в стандартной последовательности путем увеличения относительного количества полярных растворителей (например, диэтиловый эфир) в неполярных растворителей. В этой рукописи мы описывают несколько методов для извлечения липиды кожи рептилий и, затем, предоставляют стандартный протокол для изоляции различных наборов соединений, основанный на полярности, с использованием традиционных колоночной хроматографии. Извлекает весь липидов или определенных фракций затем использоваться в bioassays для определения любой биологической активности, вызвал соединениями в нем.
Introduction
Рептилий производят липидов эпидермиса, непосредственно из клеток кожи или из дискретных желез, которые используются в социальной коммуникации, таких как мат оценки и отслеживания, территориальности, интра - и межвидовых признание1,2 ,3,4. Изоляции эти липиды кожи имеет программа исследований, посвященных эволюции моделей и механизмов химической связи, в дополнение к пониманию роли гидроизоляции липидов в эволюции земной жизни2,3 ,4. Кроме того, много пресмыкающихся, особенно окостенение (ящерицы, змеи), инвазивных видов, вызывающих озабоченность в чувствительных экосистем, и разработка на основе феромонов приманки для улучшения улавливания и удаления текущих5,6. Герметичность кожи рептилий облегчает извлечение липидов, для получения относительно чистой добычи потенциально надежным источником химических сигналов. Принцип действия для количественной оценки липиды кожи рептилий в протоколе описаны включают добычу, решимость всего липидов и фракционирование через столбец хроматографии1,6,7. Методы были использованы регулярно как они дают биоактивные изолятов, которые объяснить многое о Мате выбор и выбор, особенно в змей2.
Липиды кожи могут быть извлечены из жизни кожи, кожи сарай, или мертвый весь рептилий, используя неполярных или полярных органических растворителях1,,78,9. Следует отметить, что музейных образцов хранятся в растворителях, таких как этанол не являются оптимальными для извлечения липиды кожи, и только свежие или свежий замороженные туши должны рассматриваться в качестве возможных источников для извлечения. Липиды кожи являются инертными, который делает их устойчивыми на поверхности кожи и легко извлечь7. В их сигнальный ролей в экологии рептилий коже липидов сигналы часто залегают в суровых условиях, но из-за их надежный химические свойства, такие сигналы могут сохранять их информативность длительное время10,11 , 12. процесс извлечения solubilizes липиды, используя неполярных растворителей (например, гексан, бензола, толуола) над многочасовым замочить, следуют испарения растворителя, чтобы оставить измерению массы липидов экстракт7 , 8. липиды кожи являются весьма смешивается в неполярных растворителей, и широкий спектр углеводороды могут быть извлечены из аналогично разнообразных источников.
Фракционирование является более трудоемким, чем добыча, но служит для разделения всего липидов экстракт в определенных фракций через колоночной хроматографии, чтобы помочь очистки и возможности идентификации соединений нем1, 6 , 7 , 8. всего липидов экстракт привязан к столбцу, на основе субстрата, а затем отдельные элюаты («дроби») растворителя на определенных томов передаются последовательно через колонку для элюировать наборы соединений из смеси липидов, которые имеют общие полярности6,,78. В хроматографии липидов, фракций прогресс в полярности на некоторых стандартизированная последовательность путем увеличения относительного количества полярных растворителей (например, диэтиловый эфир) в неполярных растворителей (обычно выражается в процентах: 0%, 2%, 4% эфира, и т.д. )6,,78. Хотя методы как тонкослойной хроматографии (ТСХ) могут быть использованы для разделения липидов в смеси и проще, колоночной хроматографии предпочитают потому что он использует закрытые системы, является легко контролировать, можно отдельно больше сосредоточены смеси и совместим с мультиплексирование для повышения эффективности. В этой рукописи мы описывают несколько методов для извлечения липиды кожи рептилий и, затем, предоставляют стандартный протокол для изоляции различных наборов соединений, основанный на полярности, с использованием традиционных колоночной хроматографии. Во многих исследовательских проектах с участием изоляции химические сигналы конечной целью является для осуществления изменений в приемники, подвержены эти сигналы. Извлекает весь липидов или определенных фракций затем использоваться в bioassays для определения любой биологической активностью вызвал соединениями нем1,2,6,7. В основных биологических исследований например, bioassays, с использованием конкретных фракций можно выявить исследователей что очищенный источник феромоны был изолирован, и затем, могут осуществляться методы для определения целевых соединений. С точки зрения управления дикой природы идентификации не может быть целью, и вместо этого, активная фракция могут использоваться в области привлечения сородичами ловушки или подавляют Мате, отслеживание в неродном Хабитат13,14.
Protocol
Все процедуры, связанные с использованием позвоночных были утверждены институциональный уход животных и использовать Комитет в Университете Джеймса Мэдисона.
1. Добыча
-
Пролил кожи добыча
- Соберите около 30 см2 сарая из одного рептилий, удаление головы и клоаки разделы, которые могут загрязнять образцы. Надевайте перчатки хлоропрен и чистой сарай мусора.
- Масса тары баланс с мешком или весят лодка и весят сарай (± 0,01 г).
Примечание: Массовые точность определяется точность баланса. Пролил кожи массы стандартизации фактор для извлечения кожи липидной массы (см. ниже) и значительно covaries с извлечения липидов массы. - Отдельные сарай на более мелкие куски (25 см) и добавить их в герметичные стеклянные контейнер с крышкой гексан совместимый (например, Мейсон стеклянную банку с металлической крышкой или лаборатории флакон с крышкой, PTFE). Декант достаточно гексан в контейнер для полностью погрузить кусочки кожи пролить. Уплотнение контейнера.
Предупреждение: Гексан легковоспламеняющиеся, Респираторные раздражитель и связан с несколькими кратко - и долгосрочной перспективе опасности для здоровья. Процедуры с участием гексан выполняются в Зонта (Лаборатория) или на открытом воздухе (поле) при ношении соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) (например, всплеск очки, хлоропреновый перчатки, длинные рукава, закрыть носком туфли). - Ярлык контейнера(ов) с карандашом или ручкой растворителя устойчивостью. Оставьте контейнера(ов) в вытяжной шкаф при комнатной температуре на ночь или до 24 ч.
- Удаление части сарай, с использованием чистого металла щипцами или щипцы. Встряхните куски сохранить любые оставшиеся гексан в контейнере. Разрешить кусочки кожи для просушки на бумажные полотенца; затем отменить их. Если выполняются несколько зубов, очистите клещи/корнцанг между выборками. Чтобы очистить клещи/щипцы, промойте их в ~ 50 мл гексана в стакан.
- Если экстракт не должны использоваться сразу же, сцеживаться или Пипетка экстракт в стеклянный флакон соответствующие тома, запечатать его с ПТФЭ выстроились шапку, его и хранить его при-20 ° C.
Предупреждение: Поскольку экстракт содержит гексан, храните флаконов в морозильник взрывозащищенные.
-
Мертвый весь животных добыча
- Запись длина морды vent (СВЛ; в сантиметрах) и массы (в граммах) животного. Если всего липидов или феромоны производства на единицу площади поверхности кожи должна быть определена, используйте портной ленты мера для получения максимальной тела окружности (в сантиметрах).
- Для извлечения выберите контейнер, который имеет диаметр 1/3 длины животного. Позиция каркаса надежно в нижней части контейнера с головы и Клоака на вершине. Декант достаточно гексан в контейнер для максимизации погруженной площади поверхности тела.
Примечание: Если руководитель или Клоака стать погружения на любое количество времени в добыче, принять к сведению. - Обеспечить крышки, этикетке контейнера и вымочить в вытяжной шкаф при комнатной температуре на ночь или до 24 ч.
- При удалении каркаса, используйте чистые металлические щипцы или щипцами. Сохраняют остаточного гексан на туши в контейнере, позволяя его капать из организма, не из головы или хвоста. Уплотнение контейнера.
- Если экстракт не должны использоваться сразу же, сцеживаться экстракт или Пипетка в стеклянный флакон соответствующие тома, запечатать его с ПТФЭ выстроились шапку, его и хранить его при-20 ° C.
2. липидной массы определение
Примечание: Извлеченные липидной массы может определяться одним из двух способов: с стеклянный флакон или с круглым дном колбу, используя роторный испаритель.
- Определите извлечения липидов массового через стеклянный флакон метод.
- Используйте preweighed флаконе достаточного размера (7 мл, 22 мл, 50 мл, и т.д.). Включать крышку и метка в общей массе, или всегда весят флакон без крышки и метка (маркировка на этикетке также добавить массы). Поместите метку на шее Колб, чтобы избежать контакта воды.
Примечание: Испарения в стеклянный флакон эффективен, если исследователь имеет доступ к системе газового коллектора где несколько флаконов может быть одновременно испаряется под N2 поток. - Передать флакона экстракт, с помощью стеклянной пипетки с резиновую грушу, или для большого объема экстракты, контроллер электронный дозатор с одноразовые 10 мл стеклянной пипетки. Промойте контейнер с ~ 3 мл гексана и передачи для флакона также.
- Испарится образец под нежный поток N2 . Наклоните флакона под углом, чтобы дать максимальную площадь поверхности растворитель. Конденсат лягут на внешней стороне флакона как гексан испаряется.
Примечание: Кольца липидов сформирует в флакон как гексан испаряется, поэтому периодически вихрем экстракт. - Испарится образца досуха; затем reweigh. Запись всего липидов доходность.
Примечание: Для анализа между различными группами, стандартизировать липидов массы либо пролить массы (липидной массы [в граммах] делится пролил массу [в граммах] x 100 дает процент липидной массы сарай) или животного SVL (липидной массы [в миллиграммах] разделены SVL [в сантиметров]; урожайность липидной массы на единицу длины). Крупные животные производят больше липидов, и многие виды сильно сексуально какаду, который налагает значительное Смещение в данных.
- Используйте preweighed флаконе достаточного размера (7 мл, 22 мл, 50 мл, и т.д.). Включать крышку и метка в общей массе, или всегда весят флакон без крышки и метка (маркировка на этикетке также добавить массы). Поместите метку на шее Колб, чтобы избежать контакта воды.
- Определите извлеченные липидной массы через роторный испаритель.
- Для быстрее испарения на отдельных сэмпл передать preweighed раунд нижней колбе экстракт и испаряются с помощью роторный испаритель.
- Если частицы заметны в экстракте, фильтр образца, поместив фильтр бумажный конус в шею колбу; Затем экстракт передать колбу и позволяют гравитации фильтра. Утилизируйте фильтр-бумаги после передачи полного извлечения.
Примечание: Перенести объем образца (вплоть до ~ 80% колбу объем) до поворотного испарения. Любые восходящей экстракта в конденсатор роторный испаритель вызывает загрязнение и требует конденсатора быть очищены. Шишка ловушки могут быть размещены между колбу и шеи конденсатора, если пузыри или «натыкаясь» происходят в большинстве проб.
- Если частицы заметны в экстракте, фильтр образца, поместив фильтр бумажный конус в шею колбу; Затем экстракт передать колбу и позволяют гравитации фильтра. Утилизируйте фильтр-бумаги после передачи полного извлечения.
- Включите питание роторный испаритель и воды Бата (50 ° C; ниже точки кипения растворителя). Включите холодноводных потока к конденсатору.
Примечание: Конденсатор роторный испаритель подключен к циркуляционный охладитель или холодной воды кран, вентиляция в канализацию. Скорость потока может быть медленным, если вода прохладнее, чем окружения, для конденсации растворителя пара оставляя колбу и введя конденсатора. - Включите источник вакуума (воды вакуум или насоса). Убедитесь, что достаточно, чтобы держать колбу на шее конденсатора вакуумного давления. Откройте вентиляционное отверстие на конце конденсатора перед подключением колбу. Слайд колбу на шейку конденсатора, закройте вентиляционные уплотнения, и убедиться, что настой не может отключиться от конденсатора при отпускании колбу.
- Опустите колбу до ~ 50% погружен в бани. Начало вращения колбу на средней скорости. Если вакуум, скорость, конденсатор потока и температуры оптимальны, растворителей паров, оставляя колбу будет конденсироваться на катушки и закапать в колбу восстановления.
- Если кипит образца (например, большие пузыри, быстрое газом), немедленно сократить вакуум и/или скорость роторный испаритель. Если Кипячение продолжается, выключите колбу вращение, выключите пылесос, поднять колба из ванны и отпустите вакуумное уплотнение. Повторите шаги 2.2.3 и 2.2.4.
Примечание: Если не растворителя сбор в колбу восстановления, но экстракт очевидно испарения, вакуум скорее неоптимальный и должны быть скорректированы.
- Если кипит образца (например, большие пузыри, быстрое газом), немедленно сократить вакуум и/или скорость роторный испаритель. Если Кипячение продолжается, выключите колбу вращение, выключите пылесос, поднять колба из ванны и отпустите вакуумное уплотнение. Повторите шаги 2.2.3 и 2.2.4.
- Испарится образец в вакууме до ~ 2 мл растворителя остается в колбу (большой объем экстракты), или, если используется preweighed колбу, выпарить до бисера жидкости с < 1 см диаметр отображается в нижней части колбы. Выключить вращения и вакуума; затем поднимите настой из ванны.
- Держать колбу шеи как вакуум, выпуска печать; Затем поверните шею, чтобы скользить от конденсатора. Если используется большой объём колбы, вихрем конденсированных экстракт в колбу распустить видимых липидов; Затем перенесите решения через пипетку в колбу меньшего объема, preweighed. Добавить 3 мл гексана для полоскания большой флакон, вихрем его, Пипетка для небольших колбу и снова испаряется (шаги 2.2.3 - 2.2.5).
- Шарик жидкости в экстракте укрепит как гексан испаряется. После высыхания, позволяют ему достичь комнатной температуры. Липиды станут полупрозрачными, от белого до желтого воска в колбу (~ 5 мин). Весят Фляга для получения окончательного массы.
Примечание: В зависимости от характера липиды извлечено, они будут иметь твердые (например, воск) или полутвердая (например, нефть) свойства, особенно когда фракционированный липиды испаряются (см. ниже).
- Для быстрее испарения на отдельных сэмпл передать preweighed раунд нижней колбе экстракт и испаряются с помощью роторный испаритель.
- Солюбилизировать последнего липидов в записанный объем гексан приносить ≥1 мг липидов на 1 мл гексана. Рабочий объем для прогрессирует в хроматографии-~ 5 мл. Если передача от флакон флакон, удерживать общего объема для полоскания колбу после передачи большинства экстракта флакон 2 мл.
- Ярлык флаконы, запечатать их с ПТФЭ выстроились шапки и хранить их при-20 ° C.
3. колоночной хроматографии
Примечание: Отделить неизвестных соединений, основанный на полярности в определенных фракций, извлеченные липидов массы может быть добавлен к готовым жидкостной хроматографии столбцы и фракционированный с использованием стандартных элюции.
- Подготовка столбца
- В зависимости от массы липидов в экстракте используйте большой - или столбец малообъемной стеклянной хроматографии с тефлоновым краном. Столбец является либо оснащены или сливается с фиксированной объем водохранилища (500 мл для столбца большого; 250 мл для столбца небольших). Отныне этот Протокол относится только к столбцу большого объема хроматографии, сливается в водоем. Тщательно очистите любые новые стекла и частей, которые будут использоваться в хроматографии, как описано в разделе 4; затем промойте их гексаном или другой неполярных растворителей.
- Сложите кусок ваты из стекловолокна (~ 14 см в длину [L] x 4 см в ширину [W]) до тех пор, пока квадрат ~ 4 см х 4 см образуется. Используйте деревянный дюбель стержня, дольше, чем столбец для расположения стекловолокна в нижней части столбца.
- Закрепите столбца в верх к стандартным кольцом стенд с двумя зажимами (например, поворотный или модульный), один выше краном и один под шею водохранилища. Уровень столбца. Позиция столбца на высоте достаточное рабочее расстояние для 500 мл стакан соответствовать легко в столбце Разрешить. Откройте кран.
- Налейте промывают и сушат песок в столбце, до тех пор, пока ~ 3 см песка лежит выше стекловолокна. Место черный или темный документ в столбце и коснитесь его нежно. Если песок падает из столбца с каждого крана, стекловолокна барьер является недостаточным. Повторите шаги 3.1.2 - 3.1.4.
Примечание: Используйте развернутой скрепки, приклеенный к конец стержня Дюбель для выборки из стекловолокна со дна. - Поместите стакан 500 мл в столбце. Медленно сцеживаться ~ 25 мл гексана из 100 мл стакан или мерного цилиндра в столбце водохранилище на мокрый песок. Закройте кран, когда есть ~0.5 см гексана выше песка.
- Весят из нейтральных глинозема. Для каждого столбца, небольшой используйте ~ 50 г; ~ 175 g для каждого большого столбца. Залейте глинозема в колбу Эрленмейера 1 Л. Предел 400 g глинозема за флакон 1 Л.
- Активировать глинозема (деятельность III), Пипетка деионизированной воды объемом, равным 6% глинозема массы (т.е., для 100 g глинозема, добавить 6 мл воды). Добавьте воду как капли во всем глинозема.
- Обложка колбу с алюминиевой фольгой или пробки. Энергично вихрем (не трясите) равномерно разогнать заряд. Продолжайте, пока остаются без видимых сгустки.
Примечание: Фляга согреет как вода реагирует с глинозема, который быть предположенным. - Добавление гексан, до тех пор, пока полностью покрыта глинозема, с ~0.5 сантиметра гексана выше глинозема. Вихрем Фляга для получения суспензии.
- Поместите воронку вентилируемые в водохранилище столбца и стекла 500 мл стакан под столбцом. Откройте кран. Вихрем глинозема и неуклонно налить его в столбце. Обеспечить глинозема равномерно разрешения в столбце и никаких больших пузырей или трещины образуются в столбце глинозема. Аккуратно нажмите стороне колонки равномерно урегулировать глинозема.
Примечание: Дополнительные гексан необходимо добавить дополнительные льет, поддерживать навозной жижи. Гексан, собирая в стакане в столбце могут быть использованы, если стеклянный стакан чистой в начале. - Столбце образуется, когда в верхней части глинозема является стабильным и ~ 4 см под шею столбце на базе водохранилища. Использование пипетки для полоскания внутри резервуара с гексан для остаточного алюминия. Используя воронку, осторожно добавьте второй слой песка поверх глинозема, ~ 1 см под водохранилища.
Примечание: Гексан будет вытекать из столбца как запорный остается открытым. Не позволяйте столбце высохнуть. Если столбец высыхает, процесс должен начаться снова, начиная с шага 3.1.2. Протокол может быть остановлено здесь, если столбцы подготавливаются в день до фракционирования. Прочно Установите пробку в верхней части резервуара или плотно накрыть фольгой. Заполните резервуар с ~ 100 мл гексана. Затяните кран.
- Фракционировании экстракта липидов
Примечание: Независимо от размера столбца, может быть собраны индивидуально и пуле основанный на их долю полярности или отказаться полностью, если они не содержат каких-либо известных/определенных целевых соединений фракций липидов экстракта. Раундов реплицировать элюции (n = 3 тома) передаются через колонку для обеспечения достаточной элюции липиды. Следовать в таблице 1 для больших столбцов элюции (с экстрактом массы > 30 мг) или Элюирующий малых колонки (с экстрактом массового < 30 мг). С учетом элюции протокол для изоляции только метил кетонов находится в таблице 2.- Удалите оставшиеся гексан в верхней части столбца, используя большой объем пипетки, или позволить гексан капать из в чистый стакан. Оставьте ~ 3 мл гексана выше песка в верхней части столбца.
Примечание: Собранные гексан чисто, если он только связался с чистой посуды и могут быть переработаны в первой фракции. - Передача экстракт липидов в столбце, используя длинные стеклянные пипетки. Медленно Пипетка экстракт, чтобы не мешать слой песка. Промойте флаконе экстракт или настой с ~ 5 мл гексана и передача его в столбце.
Примечание: Если экстракт хранился при температуре-20 ° C, будет ускорили липиды. Теплый флакона до тех пор, пока не более осадок является видимым. - Откройте кран и позволяют образца для загрузки в столбце. Если экстракт обладает большой массы (> 30 мг), желтоватая полоса может быть видна в глинозем, чуть ниже песок на вершине. Сбор через поток в отходов стакан, как этот гексан больше не является чистым. Закройте кран, когда ~ 3 мл остается поверх песка.
Предупреждение: Липидов в экстракте, теперь обязаны глинозема и столбец, не могут высохнуть или образца будут потеряны. - Место preweighed и помечены раунд нижней колбе (100 мл, 250 мл или 500 мл) под столбцом перед заливкой первой фракцией. Дроби к удалению могут быть собраны в общей стеклянной посуде.
- Подготовка первой фракции (100% гексана: 0% диэтиловый эфир [до сих пор, «эфира»]) в мерный цилиндр. Если подготовка фракций заранее, накрыть фольгой или пробку с Корк.
Примечание: Дроби прогресс в полярности; Таким образом цилиндр не нужно промыть между фракциями. - Добавьте, первая фракция в водохранилище, поливая через воронку вентилируемые стекло направлена в сторону водохранилища чтобы не мешать слой песка. Откройте запорный начать элюции. Закройте кран, когда ~ 3 мл гексана остается выше песка в верхней части столбца.
Примечание: Никогда не остановить элюции в рамках отдельных дроби, закрыв кран, прежде чем было собрано большинство элюата. Между фракциями не оставляйте кран закрыт дольше, чем ~ 1 h, потому, что задержки могут изменить качество и повторяемость элюции. - Повторите шаги 3.2.4 - 3.2.6 для дробей, 2 и 3. Сбор фракций в размера колбы, которые позволяют headspace Ротари испарения, особенно если фракций объединяются.
- Подготовка четвертой фракции (2% эфира) и добавить его в водохранилище. Поместите следующий настой в столбце, открыть кран и собирать четвертой фракции. Подготовить пятая часть; Далее при необходимости.
Примечание: Это возможно для испарения первые fraction(s) через Ротари испарения во время сбора последовательных фракций. - Для подготовки фракций, которые будут использоваться в анализы GC-MS, получите массу дроби с помощью прецизионные 0,01 или 0,1 мг. Солюбилизировать последнего фракций липидов приносить 1 мг липидов на 1 мл гексана.
- Удалите оставшиеся гексан в верхней части столбца, используя большой объем пипетки, или позволить гексан капать из в чистый стакан. Оставьте ~ 3 мл гексана выше песка в верхней части столбца.
4. Очистка
- Оставьте открытым краном и инвертировать столбце отходов стакан. Глинозема и песок будет выполняться из колонны; Кроме того встряхните, чтобы ускорить этот процесс. Использовать стержень дюбеля для выборки ваты из стекловолокна, если он застрял (не поцарапать стекло) или взорвать его с потоком N2 .
- Лицемерить и очистки всех посуды, используя лабораторные класс моющего средства в горячей воде в ушате пластиковая посуда щеткой (с волос или пластиковой щетины). Вымойте 3 x. Хорошо промойте обильным количеством теплой воды до тех пор, пока стекло уже не пятно на ощупь.
- Промойте посуда и инструменты 3 x деионизированной водой. Разместите их на стойку высохнуть. Для ускорения сушки, добавить небольшой объем ацетона (3 мл) для посуды, вихрем и позволить ему воздушно-сухой или запустить его под N2 потока.
Representative Results
Следующие извлечения, всего липидов массы является первый тип данных, которые могут быть приобретены через протокол, представленные здесь. Однако общая липидной массы значения никогда не должны быть проанализированы без некоторых попыток стандартизировать полученные значения. Можно использовать несколько подходов, но мы рекомендуем либо стандартизации извлеченные липидной массы животного SVL (в сантиметрах) или массы кожи сарай, который был извлечен. Бывший результаты в липидной массы за-значением длины и последний будет часть исходного массы. Причина для стандартизации крупных животных естественно производят больше липиды кожи, потому что они имеют большую площадь поверхности всего кожи. Рисунок 1A является примером этой ассоциации, где извлеченные кожи липидной массы весы линейно с массой пролил кожи извлечены. После стандартизованного массы кожи всего сарай, это линейная связь является полностью удалены (рис. 1B).
После фракционирования тот же подход стандартизации может использоваться с массами отдельных фракций (рис. 2). В этом наборе данных образца, каждая фракция не способствует одинаково всего извлечения липидов масса: нейтральные липиды (фракции 1-3) являются доминирующей набор соединений, массовая доля по сравнению с каждого набора более полярных липидов (фракции 4-6, 7-9 и 10-12).
Рисунок 1: отношения между извлечено липидной массы и ввода материала. (A) в пресмыкающихся, отношения между общий сарай кожи массы и извлеченные кожи Липидный массы положительно коррелирует (P < 0,001). (B) когда извлеченные кожи Липидный массы является стандартным для общей массы пролить (липидной массы разделены сарай массы), эта связь больше не присутствует (P = 0,46). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: стандартизированная часть массы после элюции. С помощью колоночной хроматографии, кожи Липидный выдержки может быть этого eluted на фракции, основанный на составные полярности. Фракция массы затем, выражается в виде доли экстракта всего липидов (фракция масса [в миллиграммах] делится всего липидов экстракт массу [в миллиграммах) для определения различий между фракций или экспериментальной группы8. Столбцы представляют собой средства. Топ ошибки является SEM; Ошибка нижней — 95% CI. Отдельные точки данных предоставляются для ясности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: представитель газовых хроматографов метил кетон фракций. (A) с надлежащей элюции, метил кетонов являются наиболее распространенными соединениями в часть 7 из таблицы 2 и может рассматриваться как куплеты пиков (время хранения = мин 24-34). Часть 6 (B) из таблицы 2, однако, только дает nontarget соединений. Это же может произойти по истечении Полярный растворитель используется в мобильных фазе или если столбец остановлена для длительных периодов времени (> 1 h) между фракциями. Обратите внимание на разницу в молекулярных изобилии между двумя трассировками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Фракция | Гексан (мл) | Диэтиловый эфир (мл) |
| 1,2,3 | 100 [30] | 0 [0] |
| 4,5,6 | 98 [29,4] | 2 [0,6] |
| 7,8,9 | 96 [28,8] | 4 [1.2] |
| 10,11,12 | 92 [27,6] | 8 [2,4] |
| 13,14,15 | 84 [25,2] | 16 [4,8] |
Таблица 1: стандартные элюции томов для кожи Липидный фракционирования. Растворителя томов и процентные показатели даны для большого объема (например, 250 мл) и [малообъемной] (например, 100 мл) столбцы хроматографии с использованием глинозема (деятельность III). Гексан является перевозчиком растворителя; Диэтиловый эфир является подвижная фаза.
| Фракция | Гексан (мл) | Диэтиловый эфир (мл) | Примечания |
| 1, 2, 3 | 30 | 0 | элюировать; не собираем |
| 4, 5 | 28,8 | 1.2 | элюировать; не собираем |
| 6, 7, 8 | 28,8 | 1.2 | собирают отдельно; Большинство из метил кетонов масса будет в часть 7; GC-MS контроля качества проверки должно быть запущено на 6 и 8 для обеспечения надлежащего элюции кетоны |
Таблица 2: изменение элюции схема для подвязки змея метил кетонов. Эти тома предназначены для использования со столбцом малообъемной хроматографии и с маркой глинозема в настоящее время. Eluted фракция позитивные для метил кетонов имеет сильный отпорности в поле анализов с дикой, ухаживания мужской подвязки змей1,7. Чтобы подтвердить присутствие метил кетонов в целевых фракций, образцов может быть разбавлен до 1 мг/мл и проанализированы через GC-г-жа Рисунок 3 предусматривает как положительные, так и отрицательные результаты, после элюции представитель хроматограммы.
Discussion
Экстракции липидов кожи рептилий может применяться для живых или мертвых кожу, помимо пролил кожи, который обеспечивает универсальность в экспериментальное применение этой техники. Кроме того экстракции липидов кожи может быть сделано в поле, чтобы включить динамическое применение метода к широкому спектру биологи2,13. Извлечение липидов кожи очень проста; Таким образом это легко масштабировать извлечения при необходимости за эксперимент или дизайн, и практиков не нужно иметь значительный опыт для выполнения методов. Только ограничивающих факторов для расширения масштабов являются наличие дыма капот пространства, обилие чистой, герметичные посуды и растворителей дискового пространства.
Коже липидов экстракт фракционирования могут быть приспособлены к потребностям исследователь и, таким образом, имеет аналогичную гибкость для экстракции липидов. Например можно этого eluted и затем отбрасывается, чтобы привести целевых фракций, которые могут очищать соединений интерес или упростить bioassays нейтральные липиды. Фракционирование может выполняться на нескольких уровнях в рамках образцы липидов и. Например несколько столбцов можно запустить одновременно, чтобы сделать этот процесс более эффективным. Или только часть всего липидов экстракт можно фракционированный на небольшую колонку жалеть, таким образом, реактивы и время. Фракционирование ограничивается главным образом масса всего липидов экстракта и точность оборудования для исследователя. Например если исследователь имеет баланс с точностью 10,0 мг, определение доли массы и, следовательно, точность пробоподготовки для анализа ГХ-МС значительно, если не полностью, затруднена. То же самое верно для посуды. Если исследователь имеет столбец большого объема для фракционирования, но имеет небольшой всего липидной массы отделить, элюирование или разделение соединений будет прогрессировать, но потребует значительных потерь растворителей, реактивов, время, и потенциально, целевой соединения сами.
Рекомендуется выполнить проверку контроля качества перед определением элюции схеме, как показано в таблице 2, и решить, какие фракции могут игнорироваться. Для подтверждения элюции желаемого липиды, столбец может быть запуск где собираются отдельно и затем анализируется каждой фракции, 1-15, с использованием GC-MS. На рисунке 3представитель газовый хроматограф следы показывают, что метил кетонов от подвязки змей только элюировать из столбца в конкретной фракции. Выполняя этот шаг контроля качества, изменение элюции схемы могут быть разработаны для данного вида обеспечить максимальный выход соединений интерес. Изменения в материалах, таких как поставщик или много глинозема или возраст диэтиловом эфире, будет абсолютно привести к различиям в элюции, которые должны контролироваться для выполнения контроля качества тестирования.
Методы, описанные ограничены главным образом по химической природе сигналы, которые могут быть получены. Прежде всего эти методы позволяют только исследователям изолировать и отдельные длинноцепочечных липиды из кожи рептилий. Много видов пресмыкающихся использование бортовых и/или белковых сигналы как химические сигналы, и описанные методы несовместимы с изоляции сказал подсказки. Кроме того, неполярных растворителей не будет извлекать водный сигналы от поверхности рептилий или источников кий осаждения (например, Кейдж воды, фекалии, водной субстрата), который может действительно содержать многочисленные химические сигналы. Соответствующие методы для захвата этих видов подсказок доступны исследователям (например, твердофазный микроэкстракция [SPME] для летучих подсказки и жидкостной хроматографии [ВЭЖХ] высокой производительности для водной подсказки), хотя, как методы описано выше, существует технический кривой обучения.
Самое главное утилита окончательный химическая смесь для исследователя должны руководствоваться используемых методов. Например если исследователь хочет знать, если мужчины фокуса животного может различать сигналы, производимые мужчины против женщин горбачей в целенаправленной помощи биопроб, добыча является единственным методом необходимо2,3. Если целью является выявление сексуально диморфных соединений, однако, экстракт должны быть очищены, чтобы включить большее доверие назначение идентификации конкретных молекул или групп молекул через химический анализ1, 6,9,11. Однако даже проводить хроматографии с источником липидов, значительной массы начиная экстракт является обязательным, так что измеримые долю массы может быть получен; в противном случае объединение образцов может осуществляться, но не является оптимальным14.
Будущее этого протокола включают меры использовать и адаптировать процедуры более рептилий видов. Разрабатываются также дополнительные неинвазивные методы извлечения липиды кожи.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Разработка этих методов, особенно сарай кожи экстракции липидов, произошло во время совместных соглашений (14-7412-1061-CA, 15-7412-1155-CA и 16-7412-1269-CA) между Джеймс Madison университет (JMU) и министерства сельского хозяйства США животных и растений инспекционной службы здравоохранения (APHIS). М.Р.П признает вклад следующих студентов к разработке методов кожи пролить: S. Пател (Университет Вашингтона и ли [ГССПСО]), J. Zachry (ГССПСО), р. Флорес (JMU), J. Noll (JMU) и S. Эштон (JMU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powder-free Chloroprene Gloves | Microflex | NEC-288 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves") |
| Ohaus Adventurer Precision Balance | Ohaus | AX622 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance") |
| Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid | Ball | NC9661590 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar") |
| Hexane, Mixtures of Isomers | Sigma-Aldrich | 650544 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane") |
| Hi/Lo Write-On Temperature Tape | Electron Microscopy Sciences | 5029927 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape") |
| Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL | Sigma-Aldrich | Z414514 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL") |
| Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL | Sigma-Aldrich | Z414492 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL") |
| Cork Flask Support Ring | Sigma-Aldrich | Z512419 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring") |
| Accu-jet Pro Pipette Controller | Sigma-Aldrich | Z671533 | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller") |
| Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL | Pyrex | 13-666-7E | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette") |
| Rotavapor R II | Buchi | 2422A0 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator") |
| Elliptical Bump Trap | Chemglass Life Science | 501215241 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap") |
| 7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27151 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial") |
| 7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27152 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
| 22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27173 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial") |
| 22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27174-U | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
| Excellence XS Analytical Balance | Mettler-Toledo | XS205DU | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance") |
| 5 3/4" Disposable Glass Pipette | Fisherbrand | NC0418555 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette") |
| Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly | Kimble-Chase | 17810-19300 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column") |
| Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands | Fischerbrand | 11474207 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand") |
| 3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp | Troemner | 2300203 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps") |
| Clamp Regular Holder | Fischerbrand | 05754Q | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder") |
| Sand,Washed and Dried | Macron Fine Chemical | MK-7062-212 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand") |
| Alumina, Neutral | Sorbtech | 15740-5 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US |
| Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL | Pyrex | 4980-1L | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask") |
| Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL | Sigma-Aldrich | Z100684 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask") |
| Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir | Sigma-Aldrich | Z560553 | See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column") |
| Ethyl Ether Anhydrous | Fisher Chemical | E138500 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether") |
| Alconox Detergnet | Sigma-Aldrich | 242985 | See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox") |
| Acetone (Certified ACS) | Fisher Chemical | A18P-4 | See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone") |
References
- Mason, R. T., et al. Sex pheromones in snakes. Science. 245 (4915), 290-292 (1989).
- Mason, R. T., Parker, M. R. Social behavior and pheromonal communication in reptiles. Journal of Comparative Physiology A. 196 (10), 729-749 (2010).
- Martín, J., López, P. Pheromones and chemical communication in lizards. Reproductive Biology and Phylogeny of Lizards and Tuatara. Rheubert, J. L., Siegel, D. S., Trauth, S. E. , CRC Press. Enfield, NJ. 43-77 (2014).
- Mayerl, C., Baeckens, S., Van Damme, R. Evolution and role of the follicular epidermal gland system in non-ophidian squamates. Amphibia-Reptilia. 36 (3), 185-206 (2015).
- Mathies, T., Levine, B., Engeman, R., Savidge, J. A. Pheromonal control of the invasive brown treesnake: potency of female sexual attractiveness pheromone varies with ovarian state. International Journal of Pest Management. 59 (2), 141-149 (2013).
- Parker, M. R., Patel, S. M., Zachry, J. E., Kimball, B. A. Feminization of male brown treesnake methyl ketone expression via steroid hormone manipulation. Journal of Chemical Ecology. 44 (2), 189-197 (2018).
- Parker, M. R., Mason, R. T. Pheromones in snakes: history, patterns, and future research directions. Reproductive Biology and Phylogeny of Snakes. Sever, D., Aldridge, R. , CRC Press. Enfield, NJ. 551-572 (2011).
- Parker, M. R., Mason, R. T. Low temperature dormancy affects the quantity and quality of the female sexual attractiveness pheromone in red-sided garter snakes. Journal of Chemical Ecology. 35 (10), 1234-1241 (2009).
- Parker, M. R., Mason, R. T. How to make a sexy snake: estrogen activation of female sex pheromone in male red-sided garter snakes. Journal of Experimental Biology. 215 (5), 723-730 (2012).
- Alberts, A. C. Constraints on the design of chemical communication systems in terrestrial vertebrates. American Naturalist. 139, S62-S89 (1992).
- Martín, J., Ortega, J., López, P. Interpopulational variations in sexual chemical signals of Iberian wall lizards may allow maximizing signal efficiency under different climatic conditions. PLoS ONE. 10 (6), e0131492 (2015).
- Baeckens, S., et al. Environmental conditions shape the chemical signal design of lizards. Functional Ecology. 32 (2), 566-580 (2018).
- Greene, M. J., Mason, R. T. Chemically mediated sexual behavior of the brown tree snake, Boiga irregularis. Ecoscience. 5 (3), 405-409 (1998).
- Mason, R. T. Integrated pest management: The case for pheromonal control of habu and brown tree snakes. Snakes and Man: Controlling Pest Species for Conservation and Human Health. Rodda, G., Chiszar, D., Sawai, Y., Tanaka, H. , Cornell University Press. Ithaca, NY. 196-205 (1998).
- Pruett, J. A., et al. Evolutionary interactions between visual and chemical signals: chemosignals compensate for the loss of a visual signal in male Sceloporus lizards. Journal of Chemical Ecology. 42 (11), 1164-1174 (2016).
