Summary
在爬行动物中, 来自中性的皮肤脂质对于性信号至关重要, 有可能用于入侵物种管理。在这里, 我们描述了从脱落的皮肤或整个动物中提取皮肤脂质, 确定和分析总脂质, 并通过柱层析分离脂质的方案。
Abstract
爬行动物使用皮肤中的脂质向配偶发出信号, 主要是为了实现配偶的跟踪和评估。除了了解脂质在陆地生命进化中的防水作用外, 这些脂类的分离还有助于研究化学通信的进化模式和机制。在一种应用的方法中, 这种基于皮肤的线索对于处理入侵物种的野生动物管理者有潜在的用途。在这里介绍的协议中, 对爬行动物皮肤脂质进行定量的主要步骤包括提取、总脂质测定和通过柱层析进行分馏, 后者过程中的化合物可以纯化, 然后可以或者进行分析以分配化合物鉴定 (例如, 气相色谱-质谱联用) 和/或直接用于更精细的生物鉴定。皮肤脂类可以从活着的皮肤、脱落的皮肤或死亡的整个动物中提取, 使用非极性有机溶剂 (例如, 已烷、苯、甲苯)。萃取溶解脂质, 然后, 溶剂可以蒸发, 产生可测量的纯脂提取物。分馏包括通过传统柱层析将总脂质提取物分离成特定的脱液物。总脂质提取物首先与一个基于层的柱 (如氧化铝) 结合, 然后, 在特定体积上, 溶剂的单个提取物 ("分数") 依次通过该柱传递到脂质混合物中的化合物集合基于共同的极性。通过增加极性溶剂 (如乙醚) 在非极性溶剂中的相对数量, 在极性序列中的极性过程中, 分数在极性中取得了进展。在本稿中, 我们描述了几种提取爬行动物皮肤脂质的方法, 然后, 利用传统的柱层析法, 提供了一种基于极性的不同化合物集的标准分离协议。因此, 全脂提取物或特定组分可用于生物检测, 以确定其中的化合物所产生的任何生物活性。
Introduction
爬行动物直接从皮肤细胞或用于社会交流的离散腺体, 如配偶评估和跟踪、地域性以及种内和种间识别 1, 2,在表皮产生脂质 ,3,4。这些皮肤脂类的分离除了了解脂质在陆地生命进化中的防水作用外, 还有助于研究化学通信的进化模式和机制. ,4。此外, 许多爬行动物, 特别是鳞状动物 (蜥蜴、蛇), 是敏感生态系统中关注的入侵物种, 目前正在开发基于信息素的诱饵, 以改善诱捕和清除.爬行动物皮肤的不透性有利于提取存在的脂质, 以获得相对纯净的化学信号来源的提取。该方案中对爬行动物皮肤脂质进行定量的主要步骤包括提取、总脂质测定和通过柱层析 1、6、7进行分馏. 这些方法被例行使用, 因为它们产生的生物活性分离物解释了很多关于配偶的选择和选择, 特别是在蛇2中。
皮肤脂质可以从活着的皮肤, 脱落的皮肤, 或死亡的整个爬行动物,使用非极性或极性有机溶剂1,7,8,9。应当指出, 储存在乙醇等溶剂中的博物馆标本并不适合提取皮肤脂质, 只有新鲜或新鲜冷冻的尸体才应被视为可能的提取来源。皮肤脂质是惰性的, 这使得它们在皮肤表面很稳定, 容易提取7。在爬行动物生态学中, 皮肤脂质提示通常沉积在恶劣的环境中, 但由于其强大的化学特性, 这些线索可以在很长一段时间内保留其信息价值10,11,12. 提取过程中使用非极性溶剂 (例如已烷、苯、甲苯) 浸泡一小时, 然后将溶剂蒸发, 使脂质溶解, 从而留下可测量的脂质萃取物7,8. 皮肤脂质在非极性溶剂中具有很高的混溶性, 可以从类似的各种来源中提取各种碳氢化合物。
分馏比提取更费力, 但有助于通过柱层析将总脂质提取物分离到特定的组分中, 以帮助纯化和可能识别其中的化合物 1,6,7.,8. 总脂质提取物与一个基于子层的柱结合, 然后, 在特定体积的溶剂的单个提取物 ("分数") 依次通过该柱, 从具有共同的脂质混合物中提取化合物集。极性6,7,8。在脂质色谱中, 通过增加极性溶剂 (如乙醚) 在非极性溶剂中的相对含量 (通常以百分比表示: 0%、2%、4% 乙醚等), 在极性中的极性过程中呈一定的标准化序列。)6,7,8。虽然薄层色谱 (tlc) 等方法可用于分离混合物中的脂类, 而且更简单, 但柱层析是首选, 因为它使用的是一个封闭的系统, 易于控制, 可以分离更浓缩的混合物, 并且与多路复用的效率。在本稿中, 我们描述了几种提取爬行动物皮肤脂质的方法, 然后, 利用传统的柱层析法, 提供了一种基于极性的不同化合物集的标准分离协议。在许多涉及化学线索隔离的研究项目中, 最终目标是改变暴露在这些线索下的接收机。因此, 全脂提取物或特定组分可用于生物检测, 以确定其中的化合物 1、2、6、7所产生的任何生物活性。例如, 在基础生物研究中, 使用特定分数的生物检测可以向研究人员揭示信息素的纯化源已经被分离, 然后, 可以采用目标化合物的鉴定方法。从野生动物管理的角度来看, 识别可能不是目标, 相反, 活性分数可以在野外使用, 以吸引物种到陷阱或抑制在非本地栖息地 13,14的配偶跟踪。
Protocol
所有涉及脊椎动物使用的程序都得到了詹姆斯·麦迪逊大学动物护理和使用机构委员会的批准。
1. 提取
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切皮提取
- 从一只爬行动物中收集大约30厘米2的脱落, 去除头部和覆盖层, 可能会污染样品。戴上氯丁橡胶手套, 清理棚子里的杂物。
- 用袋子或称重船调整天平并称重棚子 (±0.01 g)。
注: 质量精度由天平的精度决定。乳皮质量是提取皮肤脂质质量的标准化因子 (见下文), 并与提取脂质质量显著共清。 - 将棚子分成较小的 (5 厘米2) 块, 并将其添加到具有六烷兼容盖的密封玻璃容器中 (例如, 带有金属盖的玻璃石匠罐或带有 ptfe 盖子的实验室烧瓶)。将足够的已烷放入容器中, 使脱落的皮肤碎片完全浸入。密封容器。
注意: 六烷是易燃的, 是一种呼吸道刺激物, 并与几个短期和长期的健康危害有关。涉及已烷的程序是在烟罩 (实验室) 或室外 (野外), 同时佩戴适当的个人防护设备 (如飞溅护目镜、氯丁橡胶手套、长袖、紧身鞋)。 - 用铅笔或耐溶剂笔在容器上贴上标签。将容器放在烟罩内, 在室温下过夜或长达24小时。
- 用干净的金属钳子或钳子取下棚子碎片。摇一摇碎片, 以保留容器中剩余的已烷。让皮肤碎片在纸巾上干燥;然后, 丢弃它们。如果正在执行多个提取, 请清洁每个样品之间的通 \ 钳。要清洁钳子, 请在烧杯中用约50毫升的已烷冲洗。
- 如果未立即使用该提取物, 请将提取物装饰或移液器放入适当体积的玻璃瓶中, 用聚四氟乙烯内衬的盖子将其密封, 并将其贴上标签, 并将其存放在-20°c。
注意: 由于提取物中含有已烷, 因此将小瓶存放在防爆冰柜中。
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整个动物的提取死亡
- 记录动物的鼻孔长度 (svl; 厘米) 和质量 (以克为单位)。如果要确定每单位皮肤表面积的总脂质或信息素的产生, 请使用裁缝的卷尺来获得最大身体周长 (以厘米为单位)。
- 对于提取, 请选择直径为动物长度的1.一定的容器。将尸体安全地放置在容器的底部, 头部和皮卡顶部。将足够的已烷放入容器中, 以最大限度地增加车身的淹没表面积。
注: 如果头部或皮卡在提取过程中被淹没了任何时间, 请注意。 - 固定盖子, 给容器贴上标签, 并在室温下浸泡在室内通风柜中过夜或浸泡至24小时。
- 取出尸体时, 请使用干净的金属钳或钳子。通过允许容器中的尸体从体内滴入, 而不是从头部或尾部滴下, 保留容器中尸体上的残留已烷。密封容器。
- 如果不立即使用提取物, 将提取物或移液器装饰成适当体积的玻璃瓶, 用聚四氟乙烯内衬的盖子将其密封, 贴上标签, 并将其存放在-20°c。
2. 脂质质量测定
注: 提取的脂质质量可以通过以下两种方式之一来确定: 使用玻璃瓶或圆底烧瓶, 使用旋转蒸发器。
- 通过玻璃瓶法确定提取的脂质质量。
- 使用足够大小的预称小瓶 (7 毫升、22毫升、50毫升等). 将瓶盖和标签包括在总质量中, 或始终称重没有瓶盖的小瓶和标签 (标签上的标记也会增加质量)。将标签放在烧瓶的颈部, 以避免水接触。
注: 如果研究人员能够进入气体歧管系统, 在 n2 流下可以同时蒸发多个小瓶, 那么玻璃瓶中的蒸发是有效的. - 将提取物转移到小瓶中, 使用带有橡胶灯泡的玻璃移液器, 或者对于大容量提取物, 使用带有一次性10毫升玻璃移液器的电子移液器控制器。用约3毫升的已烷冲洗容器, 并转移到小瓶中。
- 在温和的 n2流下蒸发样品。将小瓶倾斜到一定角度, 以实现最大溶剂表面积。当已烷蒸发时, 小瓶的外部会形成冷凝水。
注: 当已烷蒸发时, 小瓶中会形成脂圈, 因此会定期对提取物进行旋涡。 - 将样品蒸发到干燥;然后, 重新称重。记录总脂质产量。
注: 为了对不同群体进行分析, 将脂质质量标准化, 使其产生质量 (脂质质量 (克) 除以流质 [克] x 100, 产生所流的脂质百分比), 或将动物的 svl (脂质质量 (以毫克为单位) 除以 svl [厘米];单位长度的脂质质量)。较大的动物产生更多的脂质, 许多物种是强烈的性二态, 这在数据中造成了显著的偏差。
- 使用足够大小的预称小瓶 (7 毫升、22毫升、50毫升等). 将瓶盖和标签包括在总质量中, 或始终称重没有瓶盖的小瓶和标签 (标签上的标记也会增加质量)。将标签放在烧瓶的颈部, 以避免水接触。
- 通过旋转蒸发器确定提取的脂质质量。
- 为了加快每个样品的蒸发速度, 将提取物转移到预压的圆底烧瓶中, 并使用旋转蒸发器将其蒸发。
- 如果提取物中的颗粒物明显, 请在烧瓶的颈部放置滤纸锥, 对样品进行过滤;然后, 将提取物转移到烧瓶中, 并允许其进入重力过滤器。在转移完整的提取后处理滤纸。
注: 在旋转蒸发前转移样品体积 (最大约80% 烧瓶量)。提取物在旋转蒸发器的冷凝器中的任何冒泡都会造成污染, 并需要清洗冷凝器。如果大多数样品中出现气泡或 "碰撞", 则可在烧瓶和冷凝器颈部之间放置凹凸疏水阀。
- 如果提取物中的颗粒物明显, 请在烧瓶的颈部放置滤纸锥, 对样品进行过滤;然后, 将提取物转移到烧瓶中, 并允许其进入重力过滤器。在转移完整的提取后处理滤纸。
- 打开旋转蒸发器和水浴的电源 (50°c; 低于溶剂沸点)。打开冷水流向冷凝器的流量。
注: 旋转蒸发器的冷凝器连接到循环冷水机组或向排水沟排放的冷水喷头。如果水比环境温度更低, 则流速可能会变慢, 从而使溶剂蒸气冷凝离开烧瓶并进入冷凝器。 - 打开真空源 (水真空或泵)。确保真空压力足以将烧瓶固定在冷凝器的颈部。在连接烧瓶之前, 先打开冷凝器末端的通风口。将烧瓶滑到冷凝器的颈部, 关闭通风口密封, 并确保烧瓶在释放烧瓶时不能与冷凝器断开。
- 将烧瓶降低至约50% 淹没在浴缸中。以中等速度开始烧瓶的旋转。如果真空、速度、冷凝器流量和沐浴温度最佳, 离开烧瓶的溶剂蒸汽将凝结在线圈上, 滴入回收瓶中。
- 如果样品沸腾 (例如, 大气泡, 快速气体), 立即降低旋转蒸发器的真空和/或速度。如果沸腾继续, 关闭烧瓶旋转, 关闭真空, 从浴缸中提高烧瓶, 并释放真空密封。重复步骤2.2.3 和2.2.4。
注: 如果回收瓶中没有溶剂收集, 但萃取物明显蒸发, 真空很可能不是最佳的, 必须重新调整。
- 如果样品沸腾 (例如, 大气泡, 快速气体), 立即降低旋转蒸发器的真空和/或速度。如果沸腾继续, 关闭烧瓶旋转, 关闭真空, 从浴缸中提高烧瓶, 并释放真空密封。重复步骤2.2.3 和2.2.4。
- 将样品蒸发到真空下, 直到溶剂保持在烧瓶 (大容量提取物) 中, 或者, 如果使用预称的烧瓶, 则蒸发, 直到烧瓶底部可以看到直径为 & lt;1 厘米的液体珠。关闭旋转和真空;然后, 把烧瓶从浴室里拿出来。
- 释放真空密封时, 按住烧瓶颈;然后, 扭动颈部, 将其从冷凝器中滑落。如果使用大容量烧瓶, 将烧瓶中的浓缩提取物旋转, 以溶解可见的脂类;然后,通过移液器将溶液转移到体积较小、预压烧瓶的地方。加入3毫升的已烷, 冲洗大烧瓶, 旋回, 将其移液到较小的烧瓶, 然后再次蒸发 (步骤 2.2.3-2.2.5)。
- 萃取物中的液体珠将随着已烷的蒸发而凝固。干燥后, 让其达到室温。脂质会在烧瓶中形成半透明的白色至黄色蜡 (~ 5分钟)。称量烧瓶以获得最后的质量。
注: 根据提取的脂类的性质, 它们将具有固体 (如蜡) 或半固态 (如原油) 特性, 特别是当分馏脂蒸发时 (见下文)。
- 为了加快每个样品的蒸发速度, 将提取物转移到预压的圆底烧瓶中, 并使用旋转蒸发器将其蒸发。
- 将已烷记录体积中的脂质溶解, 使其产生≥1毫克脂质/1 毫升的已烷。测定到色谱仪的工作量约为5毫升。如果从烧瓶转移到小瓶, 在将大部分提取物转移到小瓶后, 保留2毫升的总体积冲洗烧瓶。
- 给小瓶贴上标签, 用聚四氟乙烯内衬的瓶盖封, 并将其存放在-20°c。
3. 柱层析
注: 为了将基于极性的未知化合物分离到特定的分数中, 可以在制备的液相色谱柱中添加提取的脂质质量, 并使用标准洗脱法进行分馏。
- 列的准备工作
- 根据提取物中的脂质质量, 使用带有特氟龙旋塞的大体积或小体积玻璃色谱柱。该柱要么安装在固定体积的储集层上, 要么与固定体积的储层融合在一起 (大柱为500毫升; 小柱为250毫升)。从今以后, 该方案只指与储层融合的大容量色谱柱。如第4节所述, 彻底清洁色谱中使用的任何新玻璃器皿和部件;然后, 用已烷或其他非极性溶剂冲洗它们。
- 反复折叠一块玻璃纤维羊毛 (长度约14厘米, 宽 [宽] 约14厘米, 宽 [宽]), 直到形成一个约4厘米 x 4 厘米的正方形。使用比柱长的木制销钉将玻璃纤维放置在柱的底部。
- 用两个夹具 (例如旋转或模块化) 将引擎盖中的柱固定在标准的环形支架上, 一个夹在旋塞上方, 一个在水库的颈部下方。对列进行级别设置。将列放置在高度, 以允许500毫升烧杯有足够的工作距离, 使其易于安装在柱下。打开塞子。
- 将洗过的干砂倒进柱子上, 直到约3厘米的沙子停留在玻璃纤维上方。将黑色或深色纸张放在柱子下, 然后轻轻地点击。如果沙子从柱上掉落, 每一个水龙头, 玻璃纤维屏障是不够的。重复步骤 3.1.2-3.1.4。
注: 使用贴在销钉末端的展开的回形针, 从底部取玻璃纤维。 - 将500毫升烧杯放在立柱下。慢慢地从100毫升烧杯或刻度缸中放入柱式储罐中, 将约25毫升的已烷弄湿。当沙子上方有约0.5 厘米的已烷时, 请关闭塞子。
- 称量中性氧化铝。对于每个小柱, 使用 ~ 50 克;每个大柱约175克。把氧化铝倒进1升的埃伦迈耶烧瓶里。每1升瓶限制400克氧化铝。
- 要激活氧化铝 (活性三), 移液器去离子水的体积等于氧化铝质量的 6% (即100 克氧化铝, 加入6毫升的水)。在整个氧化铝中加入水滴。
- 用铝箔或软木塞覆盖烧瓶。强烈旋转 (不晃动), 均匀地分散电荷。继续, 直到没有可见的团块保留为止。
注: 当水与氧化铝反应时, 烧瓶会变暖, 这是意料之中的。 - 加入已烷, 直到氧化铝完全覆盖, 氧化铝上方约0.5 厘米的已烷。旋转烧瓶形成浆料。
- 在柱的储层中放置一个通风漏斗, 并在柱子下面放置一个500毫升的玻璃烧杯。打开塞子。旋转氧化铝, 并稳步将其倒入色谱柱中。确保氧化铝在柱中均匀沉降, 氧化铝柱内没有出现大气泡或裂纹。轻轻点击色谱柱的侧面, 均匀地固定氧化铝。
注: 必须添加额外的已烷作为额外的浇注, 以保持浆料。如果玻璃烧杯一开始就干净, 则可以重复使用在柱下烧杯中收集的已烷。 - 当氧化铝顶部稳定且在储层底部柱颈部下方 ~ 4 厘米处形成柱。使用移液器用已烷冲洗储液罐内部以获取残余氧化铝。使用漏斗, 轻轻地在氧化铝顶部添加第二层沙子, 在水库下方约1厘米处。
注: 当塞子保持打开状态时, 六烷将从列中流出。不要让柱子干了。如果列干涸, 则必须重新开始该过程, 从步骤3.1.2 开始。如果列在分馏前一天准备好, 则可以在此处停止该协议。牢固地将软木塞放在水库的顶部, 或用铝箔紧紧地覆盖它。用约100毫升的已烷填充储层。拧紧塞子。
- 脂质提取物的分馏
注: 无论色谱柱大小, 脂质提取物的分数都可以根据其分数极性单独收集和汇总, 如果它们不包含任何已知/已识别的目标化合物, 则可以完全丢弃。复制洗脱数 (n = 3 卷) 的圆圆通过列, 以确保脂质的充分洗脱。在大柱洗脱 (萃取质量和 gt;30 毫克) 或小柱洗脱 (含萃取物质量和 lt;30 毫克) 的情况下, 按照表1进行操作。表 2列出了一种仅用于分离甲基酮的定制洗脱协议。- 要么使用大体积移液器取出柱顶部剩余的已烷, 要么让已烷滴入干净的烧杯中。将约3毫升的已烷留在柱顶部的沙子上方。
注: 收集到的已烷是纯的, 如果它只接触干净的玻璃器皿, 并可以回收在第一部分。 - 使用长玻璃移液器将脂质提取物输送到色谱柱。慢慢移液器的提取物, 以避免干扰砂层。用约5毫升的已烷冲洗提取瓶或烧瓶, 并将其转移到色谱柱上。
注: 如果提取物储存在-20°c, 脂质将沉淀。温暖小瓶, 直到没有更多的沉淀是可见的。 - 打开塞子, 并允许样品加载到列。如果提取物有一个大质量 (和 gt;30 毫克), 一个黄色带可能是可见的氧化铝, 就在下面的沙子在顶部。收集通过废物烧杯的流量, 因为这个已烷不再干净。当大约3毫升仍停留在沙滩上时, 请关闭旋塞。
注意: 提取物中的脂质, 现在绑定到氧化铝和色谱柱, 不能干涸, 或者样品会丢失。 - 在浇注第一部分之前, 在柱下面放置一个预称和标记的圆底烧瓶 (100 毫升、250毫升或500毫升)。要丢弃的分数可以收集在一个普通的玻璃容器中。
- 准备第一部分 (100% 六元: 0% 二乙醚 [之前, "乙醚"]) 在一个刻度缸。如果事先准备分数, 用铝箔或软木塞用软木塞覆盖。
注: 分数在极性上的进展;因此, 气缸不需要在分数之间冲洗。 - 通过定向到储层一侧的通风玻璃漏斗将第一部分添加到储层中, 以避免干扰砂层。打开塞子开始洗脱。当大约3毫升的已烷保持在柱顶部的沙子上方时, 请关闭旋塞。
注意: 在收集大部分洗脱液之前, 不要通过关闭塞子来停止单个分数内的洗脱。在分数之间, 不要让塞子关闭超过 ~ 1小时, 因为延迟会改变洗脱的质量和可重复性。 - 重复步骤 3.2.4-3.2.6 分数2和3。将分数收集在适当大小的烧瓶中, 以允许旋转蒸发的头部空间, 特别是在分数被汇集的情况下。
- 准备第四部分 (2% 乙醚), 并将其添加到储罐中。将下一个烧瓶放在柱子下, 打开塞子, 并收集第四个部分。准备第五部分;然后, 根据需要继续。
注: 在收集连续分数的同时,可以通过旋转蒸发将第一部分蒸发。 - 对于准备用于 gc-ms 分析的分数, 请使用0.01 或0.1 毫克的精确平衡获得分数质量。溶解脂质分数, 每1毫升已烷产生1毫克脂质。
- 要么使用大体积移液器取出柱顶部剩余的已烷, 要么让已烷滴入干净的烧杯中。将约3毫升的已烷留在柱顶部的沙子上方。
4. 清洁
- 保持塞子打开, 并反转废物烧杯中的柱。氧化铝和沙子将耗尽柱;或者, 摇一摇, 以加快进程。如果玻璃纤维羊毛卡住 (避免划伤玻璃), 或用 n2 流将其吹掉, 请使用销钉棒将其取出。
- 在热水中使用实验室级的洗涤剂, 用玻璃器皿刷 (带头发或塑料刷), 将所有玻璃器皿共用和清洁。洗3倍。用大量的温水冲洗干净, 直到玻璃不再光滑。
- 用去离子水冲洗玻璃器皿和工具3倍。将它们放在机架上, 以风干。为了加速干燥, 在玻璃器皿中加入少量丙酮 (3 毫升), 旋转, 并允许它风干或在n2流下运行。
Representative Results
在提取之后, 总脂质是可以通过这里介绍的协议获得的第一种数据类型。然而, 如果不尝试使获得的脂质质量值标准化, 就永远不应该分析总脂质值。可以使用几种方法, 但我们建议要么将提取的脂质质量标准化到动物的 svl (厘米) 或被提取的脱落皮肤的质量。前者产生每长度的利脂质量值, 后者将是源质量的比例。标准化的原因是, 较大的动物自然会产生更多的皮肤脂质, 因为它们的总皮肤表面积较大。图 1a说明了这一关联, 提取的皮肤脂质质量与脱落的皮肤质量呈线性量。一旦标准化到总脱落的皮肤质量, 这种线性关系被完全删除 (图 1b)。
在分馏之后, 同样的标准化方法也可以用于单个分数的质量 (图 2)。在此样本数据集中, 每个分数对提取的总脂质的贡献并不平等: 中性脂质 (分数 1-3) 是按质量比例计算的主要化合物集, 而与每一组更极性脂质 (分数4-6、7-9 和 10-12) 相比。
图 1: 提取的脂质质量与输入材料之间的关系.(a) 在爬行动物中, 总脱落皮肤质量与提取的皮肤脂质质量呈正相关 (p < 0.001)。(b) 当提取的皮肤脂质被标准化为总脱落质量 (脂质被棚子质量除以) 时, 这种关系不再存在 (p = 0.46)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 洗脱后的标准化分数质量.利用柱层析法, 可以在复合极性的基础上, 将皮肤脂质提取物洗脱成分数。分数质量, 然后, 表示总脂质提取物的比例 (分数质量 (毫克) 除以总脂质提取物质量 [毫克), 以确定分数或实验组8之间的差异。条形图表示手段。最大的误差是 sem;底部误差为 95% ci。为清楚起见, 提供了各个数据点。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 甲基酮组分的代表性气相色谱仪.(a) 在适当的洗脱后, 甲基酮是表 2第7分片中最丰富的化合物, 可被视为峰对联 (保留时间 = 24-34 分钟)。(b) 然而,表 2中的分数6只产生非目标化合物。当移动相中使用的极性溶剂过期或柱在分数之间长时间停止 (gt;1 h) 时, 也会出现同样的结果。注意这两种痕迹在分子丰度上的差异。请点击这里查看此图的较大版本.
| 分数 | 六烷 (毫升) | 二乙醚 (ml) |
| 1, 2, 3 | 100 [30] | 0 [0] |
| 4, 5, 6 | 98 [29.4] | 2 [0.6] |
| 7, 8, 9 | 96 [28.8] | 4 [1.2] |
| 10、11、12 | 92 [27.6] | 8 [2.4] |
| 13, 14, 15 | 84 [25.2] | 16 [4.8] |
表 1: 皮肤脂质分馏的标准洗脱量.给出了大容量 (例如250毫升) 和 [小体积] (例如, 使用氧化铝的100毫升) 色谱柱 (活性三) 的溶剂量和百分比。六烷是载体溶剂;二乙醚是流动相。
| 分数 | 六烷 (毫升) | 二乙醚 (ml) | 笔记 |
| 1, 2, 3 | 30 | 0 | 埃卢特;不收集 |
| 4, 5 | 28。8 | 1。2 | 埃卢特;不收集 |
| 6、7、8 | 28。8 | 1。2 | 单独收集;大部分甲基酮质量将在第7部分;gc-ms 质量控制检查应在6号和8号上进行, 以确保酮的正确洗脱 |
表 2: 加特蛇甲基酮的改良洗脱方案.这些卷用于小体积色谱柱和目前可用的氧化铝品牌。甲基酮的洗脱分数阳性在野外检测中具有很强的生物活性, 野生的, 求爱的雄性吊带蛇1,7。为了确认目标分数中是否存在甲基酮, 可以将样品稀释到 1 mgml, 并通过gc-ms 进行分析. 图3提供了洗脱后的阳性和阴性结果的代表性色谱图.
Discussion
爬行动物中皮肤脂质的提取可应用于活皮或死皮, 此外还可用于脱落的皮肤, 这在这一技术的实验应用中提供了多功能性。此外, 皮肤脂质的提取可以在现场进行, 以便能够动态地将该方法应用于广泛的生物学家2,13。皮肤脂质提取简单;因此, 根据每个实验或设计的需要, 可以很容易地扩展提取, 并且从业者不需要有大量的专业知识来执行这些方法。扩大规模的唯一限制因素是烟罩空间的可用性、丰富的清洁、可密封的玻璃器皿和溶剂存储空间。
皮肤脂质提取物分馏可以根据研究人员的需要进行定制, 因此具有与脂质提取相似的灵活性。例如, 中性脂类可以洗脱, 然后丢弃, 从而产生目标分数, 从而净化感兴趣的化合物或简化生物检测。分馏可以在脂质样品内和脂质样本之间的多个尺度上进行。例如, 可以同时运行多个列, 以提高过程的效率。或者, 只有一部分的总脂质提取物可以分馏在一个小的列, 从而, 备用试剂和时间。分馏主要受到总脂质提取物质量和研究人员可用设备精度的限制。例如, 如果研究人员的天平为10.0 毫克, 则确定分数质量, 从而显著 (如果不是完全) 阻碍 gc-ms 分析样品制备的准确性。玻璃器皿也是如此。如果研究人员有一个大体积的分馏柱, 但有一个小的总脂质用于分离, 则化合物的洗脱或分离将会进行, 但需要大量浪费溶剂、试剂、时间, 以及潜在的目标复合自己。
建议在确定洗脱方案之前进行质量控制检查, 如表 2所示, 并决定可以丢弃哪些分数。为了确认所需脂质的洗脱, 可以运行一个柱, 其中每个分数, 1-15, 单独收集, 然后使用 gc-ms 进行分析。在图 3中, 具有代表性的气相色谱图痕迹显示, 加尔蛇的甲基酮只在特定的分数中从色谱柱中提取。通过执行这一质量控制步骤, 可以为特定物种制定改进的洗脱方案, 以确保感兴趣的化合物的最大产量。材料的变化, 如氧化铝的供应商或大量的制造商或乙醚的年龄, 将绝对导致洗脱的差异, 应通过进行质量控制测试来控制。
所描述的技术主要受到可以获得的线索的化学性质的限制。首先, 这些方法只能让研究人员从爬行动物的皮肤中分离出长链脂质。许多种类的爬行动物使用空气中的和/或蛋白质的线索作为化学信号, 并且所描述的方法与隔离表示的线索是不相容的。此外, 非极性溶剂不会从爬行动物表面或线索沉积来源 (例如, 网箱水、粪便物质、水生基质) 中提取可能确实含有丰富化学信号的水线索。研究人员可以使用适当的方法来捕获这些类型的线索 (例如, 用于挥发性线索的固相微萃取 [spme] 和用于水线索的高效液相色谱 [hplc]), 尽管与这些方法一样上面描述的, 有一个技术学习曲线。
最重要的是, 最终化学混合物对研究人员的效用应指导所使用的方法。例如, 如果研究人员想知道雄性焦点动物是否能区分有针对性的生物测定中雄性与雌性动物产生的线索, 那么提取是唯一需要的方法是 2,3.如果以性二态化合物的鉴定为目标, 则应将提取物纯化, 以便能够更有信心通过化学分析1将鉴定权分配给特定分子或分子群, 6,9,11。然而, 即使是以脂源进行色谱, 也需要大量的起始提取物, 才能获得可测量的分数质量;否则, 可以进行样本的汇集, 但不是最佳的 14。
该议定书的未来发展包括采取措施, 利用和调整该程序, 以更多的爬行动物物种。另外, 提取皮肤脂质的无创方法也在开发中。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这些方法的发展, 特别是脱落皮肤脂质提取, 发生在合作协议 (14-7412-1061-ca, 15-7412-11155-ca, 和 16-7412-1269-ca) 之间的詹姆斯麦迪逊大学 (jmu) 和美国农业部动物和植物卫生检查服务 (aphis)。m. r. p. 感谢下列学生对脱落皮肤方法的发展所作的贡献: s. patel (华盛顿和李大学 [wlu])、j. zachry (wlu)、r. flores (jmu)、j. noll (jmu) 和 s. ashton (ju)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powder-free Chloroprene Gloves | Microflex | NEC-288 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves") |
| Ohaus Adventurer Precision Balance | Ohaus | AX622 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance") |
| Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid | Ball | NC9661590 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar") |
| Hexane, Mixtures of Isomers | Sigma-Aldrich | 650544 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane") |
| Hi/Lo Write-On Temperature Tape | Electron Microscopy Sciences | 5029927 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape") |
| Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL | Sigma-Aldrich | Z414514 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL") |
| Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL | Sigma-Aldrich | Z414492 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL") |
| Cork Flask Support Ring | Sigma-Aldrich | Z512419 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring") |
| Accu-jet Pro Pipette Controller | Sigma-Aldrich | Z671533 | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller") |
| Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL | Pyrex | 13-666-7E | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette") |
| Rotavapor R II | Buchi | 2422A0 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator") |
| Elliptical Bump Trap | Chemglass Life Science | 501215241 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap") |
| 7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27151 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial") |
| 7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27152 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
| 22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27173 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial") |
| 22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27174-U | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
| Excellence XS Analytical Balance | Mettler-Toledo | XS205DU | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance") |
| 5 3/4" Disposable Glass Pipette | Fisherbrand | NC0418555 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette") |
| Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly | Kimble-Chase | 17810-19300 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column") |
| Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands | Fischerbrand | 11474207 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand") |
| 3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp | Troemner | 2300203 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps") |
| Clamp Regular Holder | Fischerbrand | 05754Q | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder") |
| Sand,Washed and Dried | Macron Fine Chemical | MK-7062-212 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand") |
| Alumina, Neutral | Sorbtech | 15740-5 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US |
| Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL | Pyrex | 4980-1L | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask") |
| Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL | Sigma-Aldrich | Z100684 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask") |
| Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir | Sigma-Aldrich | Z560553 | See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column") |
| Ethyl Ether Anhydrous | Fisher Chemical | E138500 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether") |
| Alconox Detergnet | Sigma-Aldrich | 242985 | See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox") |
| Acetone (Certified ACS) | Fisher Chemical | A18P-4 | See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone") |
References
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