Summary
In reptielen zijn huid lipiden van soortgenoten cruciaal voor seksuele signalering, met potentiële gebruik in beheer van invasieve soorten. Hier beschrijven we protocollen voor het extraheren van huid lipiden uit schuur huid of hele dieren, bepalen en analyseren van de totale lipide-massa en de lipiden met behulp van fractionering via kolom-chromatografie te scheiden.
Abstract
Reptielen signaal naar soortgenoten gebruik van lipiden in hun huid, vooral voor het inschakelen van stuurman bijhouden en beoordeling. De isolatie van deze lipiden heeft nut in onderzoek gericht op evolutionaire patronen en mechanismen van chemische communicatie, naast het begrip van de dakbedekking rol van lipiden in de evolutie van het aardse leven. In een toegepaste aanpak hebben dergelijke signalen huid gebaseerde potentiële gebruik voor wildlife managers omgaan met invasieve soorten. De belangrijkste stappen voor het kwantificeren van de reptile huid lipiden in het protocol hier gepresenteerd omvatten extractie, bepaling van de totale lipide en fractionering via kolom-chromatografie, het laatste proces resulteert in gezuiverde eluaten van verbindingen die dan kunnen ofwel worden geanalyseerd om het toewijzen van samengestelde identificaties (bijvoorbeeldgaschromatografie-massaspectrometrie [GC-MS]) en/of rechtstreeks in de meer verfijnde bioassays gebruikt. Huid lipiden kunnen worden geëxtraheerd uit levende huid, huid, of dood hele dieren, waarbij apolaire organische oplosmiddelen worden gebruikt (bijvoorbeeldhexaan, benzeen, tolueen) werpen. Extractie lost de lipiden en, vervolgens, het oplosmiddel verdampt kan worden zodanig dat deze een meetbare alleen-lipide-extract. Fractionering betreft de scheiding van het extract van de totale lipide in specifieke eluaten via traditionele kolom-chromatografie. Het totale lipide-extract is eerst gebonden aan een substraat-gebaseerde kolom (bijvoorbeeld, aluminiumoxide) en, vervolgens, individuele eluaten ("fracties") van oplosmiddel bij specifieke volumes sequentieel worden doorgegeven via de kolom Elueer sets van stoffen uit het lipide-mengsel op basis van gemeenschappelijke polariteit. De voortgang van de breuken in polariteit op een gestandaardiseerde reeks doordat de relatieve hoeveelheid polair oplosmiddel (b.v., diethylether) in apolaire oplosmiddelen. In dit manuscript, we beschrijven van verschillende methoden voor het extraheren van de huid van reptielen lipiden en, geef een standaardprotocol voor het isoleren van verschillende sets van verbindingen op basis van polariteit, met behulp van traditionele kolom-chromatografie. Hele lipide extracten of specifieke breuken kunnen vervolgens worden gebruikt in bioassays elke biologische activiteit ontlokte daarin door de verbindingen te bepalen.
Introduction
Reptielen produceren lipiden in de epidermis, hetzij rechtstreeks van huidcellen discrete klieren die worden gebruikt in de sociale communicatie, zoals de beoordeling van de mate en bijhouden, territorialiteitsbeginsel, intra- en interspecifieke erkenning1,2 ,3,4. De isolatie van deze huid lipiden heeft nut in onderzoek gericht op evolutionaire patronen en mechanismen van chemische communicatie, naast het begrip van de dakbedekking rol van lipiden in de evolutie van de aardse leven2,3 ,4. Verder, veel reptielen, vooral squamates (hagedissen, slangen), zijn invasieve soorten van zorg in gevoelige ecosystemen, en de ontwikkeling van feromoon gebaseerde kunstaas overlapping en verwijdering te verbeteren is lopende5,6. De ondoordringbaarheid van reptile huid vergemakkelijkt de extractie van de lipiden aanwezig om relatief pure extracties uit te voeren van een potentieel krachtige bron van chemische signalen. Het beginsel stappen voor het kwantificeren van reptile huid lipiden in het protocol beschreven omvatten extractie, bepaling van de totale lipide en fractionering via kolom-chromatografie1,6,7. De methoden zijn routinematig gebruikt zoals zij opleveren bioactieve isolaten die veel over partner keuze en selectie, met name in slangen2 verklaren.
Huid lipiden kunnen worden geëxtraheerd uit levende huid, schuur de huid, of dood hele reptielen, met behulp van apolaire of polaire organische oplosmiddelen1,,7,,8,9. Opgemerkt moet worden dat museum specimens opgeslagen in oplosmiddelen zoals ethanol, niet optimaal voor de winning van huid lipiden zijn en alleen vers of vers bevroren karkassen moeten worden beschouwd als mogelijke bronnen voor extractie. Huid lipiden zijn inert, waardoor ze stabiel op de oppervlakte van de huid en makkelijk te uittreksel van7. In hun signalering rollen in reptiel ecologie, huid lipide signalen zijn vaak gedeponeerd in ruwe omgevingen, maar vanwege hun robuuste chemische eigenschappen, dergelijke signalen kunnen behouden hun waarde informatie gedurende lange perioden van tijd10,11 , 12. het extractieproces lost de lipiden, met behulp van een apolaire oplosmiddelen (bijvoorbeeldhexaan, benzeen, tolueen) over een uur-lange weken, gevolgd door de verdamping van het oplosmiddel, te vertrekken van een meetbare hoeveelheid lipide uittreksel7 , 8. huid lipiden zijn zeer mengbaar in apolaire oplosmiddelen, en een breed scala van koolwaterstoffen kan worden geëxtraheerd uit een evenzo divers scala van bronnen.
Fractionering meer moeizaam dan extractie is maar dient om te scheiden van het extract van de totale lipide in specifieke breuken via kolom-chromatografie, om te helpen bij de zuivering en mogelijke identificatie van de stoffen daarin1, 6 , 7 , 8. het totale lipide-extract is gebonden aan een substraat-gebaseerde kolom, en vervolgens afzonderlijke eluaten ("fracties") van oplosmiddel bij specifieke volumes sequentieel worden doorgegeven via de kolom Elueer sets van verbindingen van het lipide-mengsel die een gemeenschappelijke polariteit6,7,8. In lipide chromatografie, de voortgang van de breuken in de polariteit bij enkele reeks gestandaardiseerd door verhoging van de relatieve hoeveelheid polair oplosmiddel (b.v., diethylether) in apolaire oplosmiddelen (meestal uitgedrukt als een percentage: 0%, 2%, 4% ether, enz. )6,7,8. Hoewel methoden als dunne-laag chromatografie (TLC) kan worden gebruikt om te scheiden van lipiden in een mengsel en zijn eenvoudiger, kolom-chromatografie voorkeur omdat het gebruik maakt van een gesloten systeem, makkelijk is te besturen, kunt afzonderlijke meer geconcentreerd mengsels, en is compatibel met multiplex voor efficiëntie. In dit manuscript, we beschrijven van verschillende methoden voor het extraheren van de huid van reptielen lipiden en, geef een standaardprotocol voor het isoleren van verschillende sets van verbindingen op basis van polariteit, met behulp van traditionele kolom-chromatografie. In vele onderzoeksprojecten waarbij het isolement van chemische signalen, is het uiteindelijke doel om veranderingen te bewerkstelligen in de ontvangers blootgesteld aan deze signalen. Hele lipide extracten of specifieke breuken kunnen, vervolgens in bioassays worden gebruikt om te bepalen dat welke biologische activiteit ontlokte door de verbindingen daarin1,2,6,7. In fundamenteel biologisch onderzoek, bijvoorbeeld kunnen bioassays met behulp van specifieke breuken en openbaren aan onderzoekers dat een zuivere bron van feromonen is geïsoleerd, vervolgens methoden voor de identificatie van de doel-verbindingen kunnen worden nagestreefd. Vanuit een wildlife management perspectief, kan identificatie niet het doel, en in plaats daarvan, de actieve breuk kan worden gebruikt in het veld om trekken soortgenoten te vallen of remmen stuurman bijhouden in de native habitat13,14.
Protocol
Alle procedures waarbij het gebruik van gewervelde dieren werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruiken Comité van James Madison University.
1. extractie
-
Schuur huid extractie
- Ongeveer 30 cm2 van schuur ophalen in een enkele reptiel, verwijderen van de hoofd- en cloaca secties die de monsters kunnen besmetten. Draag chloropreen handschoenen en reinig de schuur van puin.
- Tarra van het evenwicht met een tas of boot wegen en wegen de schuur (± 0,01 g).
Opmerking: De massale precisie wordt bepaald door de nauwkeurigheid van het saldo. Schuur huid massa is de factor van de normalisatie voor de uitgepakte huid lipide massa (zie hieronder) en aanzienlijk covaries met uitgepakte lipide massa. - Scheiden van de schuur in kleinere stukken (5 cm2) en voeg ze toe aan een afsluitbare glazen container met een deksel van hexaan-compatibel (bijvoorbeeld, een glas mason jar met een metalen deksel of een lab-kolf met een PTFE-deksel). Decanteren genoeg hexaan in de container te volledig dompelen de schuur huid stukken. Het verzegelen van de container.
Let op: Hexaan is brandbaar, een ademhalings irriterende, en wordt geassocieerd met verschillende korte - en lange - termijn gezondheidsrisico's. Procedures waarbij hexaan worden uitgevoerd in een zuurkast (laboratorium) of buiten (veld) terwijl het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) (bijvoorbeeldsplash bril, chloropreen handschoenen, lange mouwen, sluiten-toed schoenen). - Label de verpakking(en) met een potlood of pen oplosmiddel-resistente. Laat de verpakking(en) in de zuurkast bij kamertemperatuur overnachting of tot 24 h.
- Verwijder de stukken van de schuur met behulp van schone metalen pincet of Tang. Schud de stukken te behouden de resterende hexaan in de container. Toestaan dat de stukken van de huid te drogen op keukenpapier; vervolgens gooi hen. Als meerdere extracties worden uitgevoerd, reinigt u de Tang/verlostang tussen elk monster. Voor de reiniging van de Tang/Tang, spoel ze in ~ 50 mL hexaan in een bekerglas.
- Als het extract niet onmiddellijk worden gebruikt wordt, decanteren of het extract in een glazen ampul van passende omvang Pipetteer, zegel met een PTFE-lined cap, label en opslaan bij-20 ° C.
Let op: Omdat het extract hexaan bevat, bewaar de flesjes in een explosieveilige vriezer.
-
Dood de hele dierlijke extractie
- De snuit-vent opnamelengte (SVL; in centimeters) en massa (in gram) van het dier. Als de totale lipide of feromoon productie per eenheid van oppervlakte van de huid vastgesteld wordt, gebruiken een kleermaker het meetlint om de omtrek van de maximale lichaam (in centimeters).
- Voor de extractie, kiest u een container met een diameter die is 1/3 van de lengte van het dier. Positie het karkas veilig aan de onderkant van de container met de kop en de cloaca bovenop. Decanteren voldoende hexaan in de container te maximaliseren van de ondergedompelde oppervlakte van het lichaam.
Opmerking: Als het kopbeen of de cloaca worden ondergedompeld gedurende enige tijd in extractie, let. - Beveiligen van het deksel, label van de container, en weken in een zuurkast bij kamertemperatuur overnachting of tot 24 h.
- Bij het verwijderen van het karkas, schoon metalen pincet of Tang gebruiken. Behouden de resterende hexaan op het karkas in de container doordat het te druppelen uit het lichaam, niet uit het hoofd of de staart. Het verzegelen van de container.
- Als het extract niet onmiddellijk worden gebruikt wordt, decanteren van het extract of Pipetteer het in een glazen ampul van passende omvang, zegel met een PTFE-lined cap, label en opslaan bij-20 ° C.
2. bepaling van de massa van het lipide
Opmerking: De uitgepakte lipide massa kan op twee manieren worden bepaald: met een glazen ampul of met een rondbodemkolf, met behulp van een rotatieverdamper.
- Bepaal de uitgepakte lipide massa via de glazen ampul methode.
- Gebruik een preweighed flesje van voldoende grootte (7 mL 22 mL, 50 mL, enz.). Het GLB en het label van de totale massa of altijd wegen de flacon zonder dop en label (markeringen op het etiket ook toevoegen massa). Plaats het label op de hals van de kolf water contact te vermijden.
Opmerking: Verdamping in glazen flesjes werkt efficiënt als de onderzoeker toegang heeft tot een spruitstuk gassysteem waar meerdere flesjes kunnen gelijktijdig worden verdampt onder een N2 stroom. - De flacon overbrengen in het extract, met behulp van een glazen pipet met een rubber lamp of, voor groot volume extracten, een elektronische pipet controller met een disposable 10 mL glazen pipet. Spoel de container met ~ 3 mL hexaan en overdracht aan de flacon ook.
- Het verdampen van het monster onder een zachte N2 stroom. Kantel de ampul in een hoek om een maximale oplosmiddel oppervlakte. Condensaat zal vormen aan de buitenkant van de flacon als de hexaan verdampt.
Opmerking: Ringen van lipide zal vormen in de flacon zoals de hexaan verdampt, dus periodiek swirl van het extract. - Verdampen van het monster aan droogte; vervolgens, weeg. Record opbrengst van het totale lipide.
Opmerking: Voor de analyse van verschillende fracties, standaardiseren het lipide massa ofwel te werpen massa (lipide massa [gram] gedeeld door schuur massa [gram] x 100 levert de percentage lipide massa van de schuur) of van het dier SVL (lipide massa [in milligram] gedeeld door SVL [in centimeter]; opbrengsten van het lipide massa per eenheid lengte). Grotere dieren produceren meer lipide, en veel soorten zijn sterk seksueel dimorphic, die legt belangrijke bias in de gegevens.
- Gebruik een preweighed flesje van voldoende grootte (7 mL 22 mL, 50 mL, enz.). Het GLB en het label van de totale massa of altijd wegen de flacon zonder dop en label (markeringen op het etiket ook toevoegen massa). Plaats het label op de hals van de kolf water contact te vermijden.
- Bepaal de uitgepakte lipide massa via de rotatievacuümverdamper.
- Voor een snellere verdamping per individuele monster, het extract overbrengen in een preweighed Rondbodemkolf en damp met behulp van een rotatieverdamper.
- Als deeltjes zijn merkbaar in het extract, filteren het monster door het plaatsen van een kegel filtreerpapier in de hals van de kolf; vervolgens het extract overbrengen in de kolf en laat het aan de zwaartekracht filter. Beschikken over het koffiefilter nadat het volledige extract is overgebracht.
Opmerking: Het monstervolume Transfer (tot ~ 80% kolf volume) voor roterende verdamping. Elke borrelen van het extract in de condensor van de rotatievacuümverdamper veroorzaakt verontreiniging en vereist de condensor te worden gereinigd. Een bult val kan worden geplaatst tussen de kolf en de hals van de condensor als de blaasjes of "stoten" in de meeste monsters optreden.
- Als deeltjes zijn merkbaar in het extract, filteren het monster door het plaatsen van een kegel filtreerpapier in de hals van de kolf; vervolgens het extract overbrengen in de kolf en laat het aan de zwaartekracht filter. Beschikken over het koffiefilter nadat het volledige extract is overgebracht.
- Zet de stroom naar het roterende verdamper en water bad (50 ° C; lager is dan het oplosmiddel kookpunt). Zet de koudwater stroom de condensor.
Opmerking: De condensor van de rotatievacuümverdamper is verbonden met een circulerende chiller of een koudwater kraan ontluchting tot de drain. Het debiet kan worden vertraagd als het water koeler dan ambient is, te condenseren het oplosmiddel damp verlaten van de kolf en het invoeren van de condensor. - Inschakelen van de vacuüm bron (water vacuüm of pomp). Zorg ervoor dat de vacuüm druk is voldoende om te houden van de kolf aan de hals van de condensor. Open de vent aan het einde van de condensor voordat u de kolf. Schuif de kolf op de hals van de condensor, sluit de vent te verzegelen, zorgen dat de kolf een verbinding met de condensor niet verbreken wanneer de kolf wordt vrijgegeven.
- De erlenmeyer lager tot ~ 50% wordt ondergedompeld in het bad. Start de rotatie van de kolf op middellange snelheid. Als het vacuüm, snelheid, condensor stroom en bad temperatuur optimaal zijn, zal de oplosmiddelen damp verlaten de kolf condenseren op de spoel en druppelen in de maatkolf van herstel.
- Als het monster kookt (b.v., grote bubbels, snelle vergassing), direct verminderen van de vacuüm en/of de snelheid van de rotatievacuümverdamper. Als het koken blijft, uitschakelen van de kolf rotatie, uitschakelen van het vacuüm, de kolf uit het bad te verhogen en laat het vacuüm zegel. Herhaal stap 2.2.3 en 2.2.4.
Opmerking: Als geen oplosmiddel is het verzamelen in de kolf herstel maar het extract is uiteraard verdampen, het vacuüm is waarschijnlijk nonoptimal en moet worden aangepast.
- Als het monster kookt (b.v., grote bubbels, snelle vergassing), direct verminderen van de vacuüm en/of de snelheid van de rotatievacuümverdamper. Als het koken blijft, uitschakelen van de kolf rotatie, uitschakelen van het vacuüm, de kolf uit het bad te verhogen en laat het vacuüm zegel. Herhaal stap 2.2.3 en 2.2.4.
- Verdampen van het monster onder het vacuüm tot ~ 2 mL oplosmiddel blijft in de kolf (groot volume extracten), of, als een preweighed kolf wordt gebruikt, verdampen tot een kraal van vloeistof met een < 1 cm diameter is zichtbaar in de bodem van de kolf. Uitschakelen van de rotatie en vacuüm; Breng de kolf uit het bad.
- De hals van de kolf houden als het vacuüm zegel wordt vrijgegeven; Draai vervolgens de nek om het glijden van de condensor. Als een groot volume kolf wordt gebruikt, swirl het verkorte extract in de kolf te ontbinden zichtbaar lipiden; Breng de oplossing via pipet over in een maatkolf van kleinere volumes, preweighed. Voeg 3 mL hexaan te spoelen van de grote erlenmeyer, het swirl Pipetteer het aan de kleinere maatkolf en verdampen opnieuw (stappen 2.2.3 - 2.2.5).
- De parel van vloeistof in het extract zal stollen zoals de hexaan verdampt. Eenmaal droog, laat het bereiken van de kamertemperatuur. Lipiden vormen een doorschijnende, witte tot gele wax in de kolf (~ 5 min). Weeg de kolf met het oog op de definitieve massa.
Opmerking: Afhankelijk van de aard van de lipiden uitgepakt, ze zal hebben solid (b.v., wax) of halfvaste (b.v., ruwe olie) eigenschappen, vooral wanneer de gefractioneerde lipiden zijn verdampt (zie hieronder).
- Voor een snellere verdamping per individuele monster, het extract overbrengen in een preweighed Rondbodemkolf en damp met behulp van een rotatieverdamper.
- Solubilize de lipiden in de opgenomen hoeveelheid hexaan opleveren ≥1 mg van lipide per 1 mL hexaan. Het volume van de werken voor het vorderen aan chromatografie is ~ 5 mL. Als van de kolf ampul, behouden van 2 mL van het totale volume te spoelen van de kolf na het overbrengen van de meerderheid van het extract om de flacon overbrengen.
- Label de flesjes, zegel ze met PTFE-lined caps en bewaar ze bij-20 ° C.
3. in kolom-chromatografie
Opmerking: Om te scheiden van onbekende verbindingen op basis van polariteit in bepaalde fracties, uitgepakte lipide massa kan kolommen toegevoegd aan bereid vloeistofchromatografie en gespreide met behulp van standaard elutie.
- Voorbereiding van de kolom
- Afhankelijk van de massa van de lipide in het extract, een grote- of een kleine-volume glazen chromatografie kolom met een Teflon-afsluiter te gebruiken. De kolom is voorzien of gesmolten tot een vast volume reservoir (500 mL voor een grote kolom; 250 mL voor een kleine kolom). Voortaan, verwijst dit protocol alleen naar een kolom van de chromatografie groot volume gesmolten naar een reservoir. Grondig schoon elke nieuwe glaswerk en onderdelen te worden gebruikt in de chromatografie, zoals beschreven in sectie 4; spoel ze vervolgens af met hexaan of een andere apolaire oplosmiddelen.
- Vouw een stukje glasvezel wol (~ 14 cm in lengte [L] x 4 cm in breedte [W]) herhaaldelijk tot een vierkant van ~ 4 cm x 4 cm ontstaat. Gebruik een houten deuvel staaf langer is dan de kolom om de positie van de glasvezel aan de onderkant van de kolom.
- Beveilig de kolom in een kap naar een standaard ring stand met twee klemmen (b.v., draaibare of modulair), een boven de afsluiter en een onder de nek van het reservoir. Het niveau van de kolom. Positie van de kolom op een hoogte op voldoende afstand van de werken voor het bekerglas van 500 mL te passen gemakkelijk onder de kolom toestaan. Open de afsluiter.
- Pour gewassen en gedroogd zand in de kolom totdat een ~ 3 cm zand boven de glasvezel rust. Zwart of donker papier onder de kolom plaats en tik het zachtjes. Als zand uit de kolom met elke tik valt, is de glasvezel-barrière onvoldoende. Herhaal stap 3.1.2 - 3.1.4.
Opmerking: Gebruik een uitgevouwen paperclip geplakt is aan het einde van een vattenproducenten staaf te halen van de glasvezel van de bodem. - Plaats het bekerglas van 500 mL onder de kolom. Langzaam decanteren ~ 25 mL hexaan uit een bekerglas van 100 mL of gegradueerde cilinder in het reservoir van de kolom te nat van het zand. Sluit de afsluiter wanneer er ~0.5 cm van hexaan boven het zand is.
- Weeg neutrale aluminiumoxide. Gebruik voor elke kleine kolom, ~ 50 g; ~ 175 g voor elke grote kolom. Giet de aluminiumoxide in een erlenmeyer van 1 L. 400 g aluminiumoxide per maatkolf van 1 L beperken.
- Om te activeren het aluminiumoxide (activiteit III), Pipetteer gedeïoniseerd water van een volume gelijk is aan 6% van de aluminiumoxide massa (dat wil zeggen, voor 100 g aluminiumoxide, 6 mL water toevoegen). Voeg het water als druppels gedurende de aluminiumoxide.
- Dekking van de kolf met aluminiumfolie of een kurk. Krachtig swirl (niet schudden) de lading gelijkmatig te verspreiden. Totdat geen klontjes zichtbaar blijven.
Opmerking: De kolf zal als het water reageert met de aluminiumoxide, die naar verwachting opwarmen. - Voeg hexaan totdat de aluminiumoxide volledig van, ~0.5 cm van hexaan boven de aluminiumoxide voorzien is. Swirl de kolf vormen een drijfmest.
- Plaats een geventileerde trechter in het reservoir van de kolom en een bekerglas van 500 mL glas onder de kolom. Open de afsluiter. Swirl de aluminiumoxide en giet het gestaag in de kolom. Zorgen de aluminiumoxide is gelijkmatig zich vestigen in de kolom en geen grote luchtbellen of scheuren in de kolom aluminiumoxide uitmaken. Tik zachtjes op de kant van de kolom te gelijkmatig regelen de aluminiumoxide.
Opmerking: Extra hexaan moet worden toegevoegd voor extra giet, om de drijfmest. De hexaan verzamelen in het bekerglas onder de kolom kan worden hergebruikt als het glas bekerglas schoon aan het begin was. - De kolom wordt gevormd wanneer de top van de aluminiumoxide stabiel en ~ 4 cm onder de hals van de kolom aan de voet van het reservoir is. Gebruik een pipet te spoelen van de binnenkant van het reservoir met hexaan voor residuele aluminiumoxide. Met behulp van een trechter, zachtjes een tweede laag toe te voegen met zand op de top van de aluminiumoxide, ~ 1 cm onder het reservoir.
Opmerking: Hexaan zal vloeien voort uit de kolom als de afsluiter open blijft. Laat niet de kolom uitdrogen. Als de kolom uitdroogt, is het moet dat het proces opnieuw, beginnen vanaf stap 3.1.2. Het protocol kan hier worden gestopt als de kolommen een dag voor fractionering bereid zijn. Stevig plaatsen van een kurk in de top van het reservoir of het strak te dekken met folie. Vul het reservoir met ~ 100 mL hexaan. Draai de afsluiter.
- Versplintering van het lipide-extract
Opmerking: Ongeacht de kolomgrootte van de, breuken van lipide extract kunnen worden individueel verzameld en gebundeld op basis van hun fractie polariteit of verwijderde volledig als ze niet alle bekende/geïdentificeerd doel-verbindingen bevatten. Rondes van repliceren elutie (n = 3 volumes) worden doorgegeven via de kolom om de voldoende elutie van de lipiden. Tabel 1 voor grote-kolom-elutie volgen (met een extract massa > 30 mg) of kleine-kolom-elutie (met een extract massa < 30 mg). Een op maat gemaakte elutie-protocol voor het isoleren van alleen methyl ketonen is in tabel 2.- Verwijder de resterende hexaan boven aan de kolom, met behulp van een precisiepipet groot volume, of toestaan dat de hexaan te druppelen uit in een bekerglas van schoon. Laat ~ 3 mL hexaan boven het zand boven aan de kolom.
Opmerking: De verzamelde hexaan is zuiver, als het alleen schoon glaswerk gecontacteerd en in de eerste breuk kan worden gerecycleerd. - Overdracht van het lipide-uittreksel naar de kolom, met behulp van een lange glazen pipet. Pipetteer langzaam het extract voorkom verstoring van de zand laag. Spoel de extract ampul of kolf met ~ 5 mL hexaan en het overbrengen van de kolom.
Opmerking: Als het extract werd opgeslagen bij-20 ° C, zal er de lipiden worden neergeslagen. Warm de flacon totdat niet meer neerslag zichtbaar is. - Open de afsluiter en het monster te laden in de kolom toestaan. Als het extract een grote massa heeft (> 30 mg), een gelige band mogelijk zichtbaar in de aluminiumoxide, net onder het zand aan de bovenkant. De stroom door in een bekerglas van afval verzamelen zoals deze hexaan niet langer schoon is. Sluit de afsluiter wanneer ~ 3 mL op de top van het zand blijft.
Let op: De lipide in het extract, nu gebonden aan de aluminiumoxide en kolom kan niet uitdrogen of het monster zullen verloren gaan. - Plaats een preweighed en gelabelde Rondbodemkolf (100 mL, 250 mL of 500 mL) onder de kolom voor het gieten van de eerste breuk. Breuken moeten worden afgevoerd kunnen worden verzameld in een gemeenschappelijk glas-container.
- Voorbereiding van de eerste breuk (100% hexaan: 0% diethylether [voorheen, "ether"]) in een gegradueerde cilinder. Als fracties van tevoren, cover met folie of stop met kurk te bereiden.
Opmerking: Breuken vooruitgang in de polariteit; de cilinder hoeft daarom niet te worden gespoeld tussen breuken. - Voeg de eerste breuk naar het reservoir door gieten via een geventileerde glazen trechter met gericht aan een kant van het reservoir om te voorkomen dat de verstoring van de zand laag. Open de afsluiter om te beginnen de elutie. Sluit de afsluiter wanneer ~ 3 mL hexaan boven het zand boven aan de kolom blijft.
Opmerking: Nooit een elutie binnen een afzonderlijke fractie stoppen door de afsluiter af te sluiten voordat de meerderheid van het eluaat is verzameld. Tussen de fracties, niet verlaten de afsluiter gesloten langer dan ~ 1 h omdat vertragingen kunnen het veranderen van de kwaliteit en de herhaalbaarheid van de elutie. - Herhaal stap 3.2.4 - 3.2.6 voor breuken 2 en 3. Verzamel de breuken in gepaste afmetingen kolven waarmee headspace voor roterende verdamping, vooral als de breuken zijn wordt gebundeld.
- Bereid een designerprijs (2% ether) en toe te voegen aan het reservoir. Plaats de volgende kolf onder de kolom, opent u de afsluiter en de designerprijs te verzamelen. Bereiden van een vijfde fractie; Volg zo nodig.
Opmerking: Het is mogelijk om te verdampen van de eerste fraction(s) via de roterende verdamping terwijl het verzamelen van opeenvolgende breuken. - Voor het voorbereiden van breuken worden gebruikt in de GC-MS analyses, verkrijgen een massa van de breuk met behulp van een evenwicht precisie van 0,01 of 0.1 mg. Solubilize de lipide-fracties om de opbrengst van 1 mg van lipide per 1 mL hexaan.
- Verwijder de resterende hexaan boven aan de kolom, met behulp van een precisiepipet groot volume, of toestaan dat de hexaan te druppelen uit in een bekerglas van schoon. Laat ~ 3 mL hexaan boven het zand boven aan de kolom.
4. reiniging
- Laat de afsluiter open en omkeren van de kolom in het bekerglas van afval. De aluminiumoxide en zand zal opraken van de kolom; Als alternatief, schud om te versnellen het proces. Gebruik van een vattenproducenten staaf te halen van de glasvezel-wol als het vastzit (vermijd krassen op glas) of het blazen met een N2 stroom.
- Zijzak en reinig alle glaswerk, met behulp van laboratorium-grade afwasmiddel in warm water in een plastic bak met een borstel glaswerk (met haar of kunststof borstels). 3 x wassen. Goed met veel warm water spoelen totdat het glas niet langer glad aanvoelt is.
- Spoel het glaswerk en tools 3 x met gedeïoniseerd water. Plaats ze op een rek om te drogen. Om te versnellen het drogen, het toevoegen van een klein volume van aceton (3 mL) aan het glaswerk, swirl, en laat ze drogen of uit te voeren onder een N2 stroom.
Representative Results
Volgende extractie, de totale lipide massa is de eerste soort gegevens die kan worden verkregen via het protocol hier gepresenteerd. Totale lipide massa moeten echter nooit worden geanalyseerd zonder een poging om het standaardiseren van de verkregen waarden. Verschillende benaderingen kunnen worden gebruikt, maar we raden ofwel het standaardiseren van de uitgepakte lipide-massa van het dier SVL (in centimeters) of de massa van de schuur huid dat is uitgepakt. De voormalige resultaten in een lipide-massa-per-length-waarde en de laatste zal zijn een deel van de bron massa. De reden voor de normalisatie is dat grotere dieren natuurlijk meer huid lipiden produceren, omdat ze een grotere totale huid oppervlakte hebben. Figuur 1A is een voorbeeld van deze vereniging, waar de uitgepakte huid lipide massa schalen lineair met de massa van huid geëxtraheerd afwerpen. Zodra gestandaardiseerd aan de totale schuur huid massa, deze lineaire relatie volledig is verwijderd (figuur 1B).
Na fractionering, dezelfde normalisatie aanpak kan worden gebruikt met de massa's van de individuele fracties (Figuur 2). In deze verzameling voorbeeldgegevens, elke fractie niet draagt evenzeer aan de totale uitgepakte lipide massa: neutrale lipiden (breuken 1-3) zijn de dominante set van verbindingen door massa verhouding ten opzichte van elke set van meer polar lipiden (breuken 4-6, 7-9 en 10-12).
Figuur 1: relaties tussen geëxtraheerd lipide massa en invoertekst materiaal. (A) In reptielen, de relatie tussen de totale schuur huid massa en de uitgepakte huid lipide massa is positief gecorreleerd (P < 0,001). (B) wanneer de uitgepakte huid lipide massa is gestandaardiseerd aan de totale massa werpen (de massa gedeeld door de schuur lipide massa), deze relatie is niet langer aanwezig (P = 0,46). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: gestandaardiseerd opgebrachte hoeveelheid na elutie. Met behulp van kolom-chromatografie, kunnen huid lipide extracten worden geëlueerd in breuken, op basis van samengestelde polariteit. De breuk massa is, vervolgens, uitgedrukt als een percentage van het totale lipide-extract (breuk massa [in milligram] gedeeld door totale lipide extract massa [in milligram) om te bepalen van de verschillen tussen de fracties of experimentele groepen8. De staven aan het middel. De bovenste fout is SEM; de fout van de bodem is 95% CI. Afzonderlijke gegevenspunten worden geleverd voor de duidelijkheid. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: vertegenwoordiger gaschromatografen van methyl ketonen breuken. (A) met de juiste elutie, methyl ketonen zijn de meest voorkomende verbindingen in deel 7 uit tabel 2 en kan worden gezien als coupletten van pieken (retentietijd = 24-34 min). (B) breuk 6 van tabel 2, levert echter alleen nontarget verbindingen. Dit hetzelfde resultaat kan optreden wanneer de polair oplosmiddel gebruikt in de mobiele fase is verlopen of als de kolom wordt gestopt voor langere tijd (> 1 h) tussen de fracties. Let op het verschil in moleculaire overvloed tussen de twee sporen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Breuk | Hexaan (mL) | Diethylether (mL) |
| 1,2,3 | 100 [30] | 0 [0] |
| 4,5,6 | 98 [29,4] | 2 [0.6] |
| 7,8,9 | 96 [28.8] | 4 [1,2] |
| 10,11,12 | 92 [27.6] | 8 [2.4] |
| 13,14,15 | 84 [25.2] | 16 [4.8] |
Tabel 1: standaard elutie volumes voor huid lipide fractionering. Oplosmiddel volumes en percentages worden gegeven voor zowel groot-volume (bijvoorbeeld, 250 mL) en [kleine-volume] (bijvoorbeeld, 100 mL) Chromatografiekolommen met behulp van aluminiumoxide (activiteit III). Hexaan is het oplosmiddel van de vervoerder; diethylether is de mobiele fase.
| Breuk | Hexaan (mL) | Diethylether (mL) | Notities |
| 1, 2, 3 | 30 | 0 | Elueer; verzamelen geen |
| 4, 5 | 28.8 | 1.2 | Elueer; verzamelen geen |
| 6, 7, 8 | 28.8 | 1.2 | verzamelen individueel; meerderheid van methyl ketonen massa zullen in deel 7; GC-MS kwaliteitscontroles moeten worden uitgevoerd op 6 en 8 om de juiste elutie van de ketonen |
Tabel 2: gewijzigde elutie regeling voor kousenbandslang methyl ketonen. Deze volumes zijn voor gebruik met een kleine-volume chromatografie kolom en het merk van aluminiumoxide momenteel beschikbaar. De eluted fractie positief voor methyl ketonen heeft een sterke topicale in veld testen met wild, hofmakerij mannelijke Kousenband slangen1,7. Controleer de aanwezigheid van methyl ketonen in de target-breuken, monsters kunnen worden verdund tot 1 mg/mL en geanalyseerd via GC-MS. voorziet Figuur 3 representatieve chromatogrammen zowel positieve als negatieve resultaten na elutie.
Discussion
De winning van huid lipiden in reptielen kan worden toegepast op levende of dode huid, naast de schuur huid, die veelzijdigheid in de experimentele toepassing van deze techniek biedt. Verder, extracties van huid lipiden kunnen gebeuren in het veld om een dynamische toepassing van de methode op een breed scala aan biologen2,13. Extractie van huid lipiden is eenvoudig; Daarom, het is gemakkelijk omhoog aan schaal extracties zo nodig per experiment of ontwerp en beoefenaars hoeft niet aanzienlijke deskundigheid uit te voeren van de methoden. De enige beperkende factoren voor schaalvergroting zijn de beschikbaarheid van fume hood ruimte, een overvloed aan schone, hersluitbaar glaswerk en oplosmiddel opslagruimte.
Huid lipide extract fractionering kan worden afgestemd op de behoeften van een onderzoeker en heeft dus dezelfde flexibiliteit met lipide aardgaswinning. Neutrale lipiden kunnen bijvoorbeeld worden geëlueerd en vervolgens verwijderd, om te resulteren in doel breuken die kunnen verbindingen van belang te zuiveren of te vereenvoudigen van bioassays. Fractionering kan worden uitgevoerd op meerdere schalen binnen en tussen lipide monsters. Bijvoorbeeld, kunnen meerdere kolommen tegelijk worden uitgevoerd om het proces efficiënter te maken. Of slechts een gedeelte van een totale lipide-extract kan worden fractionated op een kleine kolom aan, dus sparen reagentia en tijd. Fractionering wordt vooral beperkt door de massa van het totale lipide-extract en de precisie van de apparatuur beschikbaar aan de onderzoeker. Bijvoorbeeld, als de onderzoeker een balans met een nauwkeurigheid van 10.0 mg, de bepaling van de breuk massa en dus ook heeft wordt de nauwkeurigheid van de bereiding van de monsters voor de GC-MS-analyse aanzienlijk, zo niet volledig, belemmerd. Hetzelfde geldt voor het glaswerk. Als de onderzoeker heeft een groot volume kolom voor fractionering, maar heeft een kleine totale lipide massa te scheiden, de elutie of de scheiding van de stoffen zal vooruitgang maar vergt een aanzienlijke verspilling van oplosmiddelen, reagentia, tijd en potentieel, het doel verbindingen zelf.
Het is aangeraden om het uitvoeren van een controle van de kwaliteitscontrole voor het bepalen van de elutie regeling, zoals te zien in tabel 2, en beslissen welke fracties mag worden weggegooid. Te bevestigen de elutie van de gewenste lipiden, een kolom kan worden run waar elke fractie, 1-15, individueel verzameld en vervolgens geanalyseerd via GC-MS. In Figuur 3tonen representatieve gaschromatograaf sporen dat methyl ketonen van Kousenband slangen alleen Elueer uit de kolom in een bepaalde fractie. Door het uitvoeren van deze stap kwaliteitscontrole, kan een gemodificeerde elutie-regeling worden ontwikkeld voor een bepaalde soort om de maximale opbrengst van de verbindingen van belang. Wijzigingen in de materialen, zoals de leverancier of de partij van de aluminiumoxide of de leeftijd van de diethylether, zullen absoluut leiden tot verschillen in elutie die moeten worden gecontroleerd voor door het uitvoeren van een test van de kwaliteitscontrole.
De beschreven technieken zijn beperkt door de chemische aard van de signalen die kunnen worden verkregen. Vooral toestaan deze methoden alleen onderzoekers te isoleren en lange-keten lipiden te scheiden van de huid van reptielen. Veel soorten reptielen lucht en/of eiwithoudende signalen gebruiken als chemische signalen, en de beschreven methoden zijn niet compatibel met het isoleren van de genoemde signalen. Verdere, apolaire oplosmiddelen zal niet uitgepakt waterige signalen uit de oppervlakken van reptielen of bronnen van cue afzetting (bijvoorbeeldkooi water, fecale materie, aquatische substraat) die inderdaad overvloedige chemische signalen kunnen bevatten. Passende methoden voor het vastleggen van dit soort signalen zijn beschikbaar voor onderzoekers (bvsolid-phase microextraction [SPME] voor vluchtige signalen en krachtige vloeibare chromatografie [HPLC] voor waterige signalen), hoewel, zoals de methoden hierboven beschreven, is er een technische leercurve.
Belangrijker, moet het nut van het definitieve chemische mengsel aan de onderzoeker begeleiden de gebruikte methoden. Bijvoorbeeld, als een onderzoeker wil weten als een mannelijke focal dier onderscheid tussen de signalen geproduceerd door mannelijke vs. vrouwelijke soortgenoten in een gerichte bioassay maken kan, is extractie dat de enige methode nodig2,3. Als de identificatie van seksueel dimorphic verbindingen het doel is, echter moet het extract gezuiverd worden, zodat een groter vertrouwen in de identificaties toe te wijzen aan specifieke moleculen en groepen moleculen via chemische analyse1, 6,9,11. Om uit te voeren zelfs chromatografie met een lipide-bron, is een belangrijke massa van het starten van extract echter vereist zodat meetbare opgebrachte hoeveelheid kunnen worden verkregen; anders, de bundeling van monsters kan worden nagestreefd maar niet optimale14.
Toekomstige ontwikkelingen van dit protocol omvat maatregelen om te gebruiken en aanpassen van de procedure voor meer reptiel soorten. Extra noninvasive methoden voor de winning van huid lipiden zijn ook ontwikkeld.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De ontwikkeling van deze methoden, met name schuur huid lipide extractie, voorgedaan samenwerkingsovereenkomsten (14-7412-1061-CA 15-7412-1155-CA en 16-7412-1269-CA) tussen James Madison Universiteit (JMU) en het Amerikaanse ministerie van landbouw dier en Plant Health Inspection Service (APHIS). M.R.P. erkent de bijdragen voor de volgende studenten aan de ontwikkeling van de schuur huid methoden: S. Patel (Washington and Lee University [WLU]), J. Zachry (WLU), R. Flores (JMU), J. Noll (JMU) en S. Ashton (JMU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powder-free Chloroprene Gloves | Microflex | NEC-288 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves") |
| Ohaus Adventurer Precision Balance | Ohaus | AX622 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance") |
| Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid | Ball | NC9661590 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar") |
| Hexane, Mixtures of Isomers | Sigma-Aldrich | 650544 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane") |
| Hi/Lo Write-On Temperature Tape | Electron Microscopy Sciences | 5029927 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape") |
| Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL | Sigma-Aldrich | Z414514 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL") |
| Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL | Sigma-Aldrich | Z414492 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL") |
| Cork Flask Support Ring | Sigma-Aldrich | Z512419 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring") |
| Accu-jet Pro Pipette Controller | Sigma-Aldrich | Z671533 | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller") |
| Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL | Pyrex | 13-666-7E | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette") |
| Rotavapor R II | Buchi | 2422A0 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator") |
| Elliptical Bump Trap | Chemglass Life Science | 501215241 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap") |
| 7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27151 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial") |
| 7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27152 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
| 22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27173 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial") |
| 22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27174-U | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
| Excellence XS Analytical Balance | Mettler-Toledo | XS205DU | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance") |
| 5 3/4" Disposable Glass Pipette | Fisherbrand | NC0418555 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette") |
| Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly | Kimble-Chase | 17810-19300 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column") |
| Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands | Fischerbrand | 11474207 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand") |
| 3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp | Troemner | 2300203 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps") |
| Clamp Regular Holder | Fischerbrand | 05754Q | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder") |
| Sand,Washed and Dried | Macron Fine Chemical | MK-7062-212 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand") |
| Alumina, Neutral | Sorbtech | 15740-5 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US |
| Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL | Pyrex | 4980-1L | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask") |
| Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL | Sigma-Aldrich | Z100684 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask") |
| Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir | Sigma-Aldrich | Z560553 | See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column") |
| Ethyl Ether Anhydrous | Fisher Chemical | E138500 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether") |
| Alconox Detergnet | Sigma-Aldrich | 242985 | See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox") |
| Acetone (Certified ACS) | Fisher Chemical | A18P-4 | See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone") |
References
- Mason, R. T., et al. Sex pheromones in snakes. Science. 245 (4915), 290-292 (1989).
- Mason, R. T., Parker, M. R. Social behavior and pheromonal communication in reptiles. Journal of Comparative Physiology A. 196 (10), 729-749 (2010).
- Martín, J., López, P. Pheromones and chemical communication in lizards. Reproductive Biology and Phylogeny of Lizards and Tuatara. Rheubert, J. L., Siegel, D. S., Trauth, S. E. , CRC Press. Enfield, NJ. 43-77 (2014).
- Mayerl, C., Baeckens, S., Van Damme, R. Evolution and role of the follicular epidermal gland system in non-ophidian squamates. Amphibia-Reptilia. 36 (3), 185-206 (2015).
- Mathies, T., Levine, B., Engeman, R., Savidge, J. A. Pheromonal control of the invasive brown treesnake: potency of female sexual attractiveness pheromone varies with ovarian state. International Journal of Pest Management. 59 (2), 141-149 (2013).
- Parker, M. R., Patel, S. M., Zachry, J. E., Kimball, B. A. Feminization of male brown treesnake methyl ketone expression via steroid hormone manipulation. Journal of Chemical Ecology. 44 (2), 189-197 (2018).
- Parker, M. R., Mason, R. T. Pheromones in snakes: history, patterns, and future research directions. Reproductive Biology and Phylogeny of Snakes. Sever, D., Aldridge, R. , CRC Press. Enfield, NJ. 551-572 (2011).
- Parker, M. R., Mason, R. T. Low temperature dormancy affects the quantity and quality of the female sexual attractiveness pheromone in red-sided garter snakes. Journal of Chemical Ecology. 35 (10), 1234-1241 (2009).
- Parker, M. R., Mason, R. T. How to make a sexy snake: estrogen activation of female sex pheromone in male red-sided garter snakes. Journal of Experimental Biology. 215 (5), 723-730 (2012).
- Alberts, A. C. Constraints on the design of chemical communication systems in terrestrial vertebrates. American Naturalist. 139, S62-S89 (1992).
- Martín, J., Ortega, J., López, P. Interpopulational variations in sexual chemical signals of Iberian wall lizards may allow maximizing signal efficiency under different climatic conditions. PLoS ONE. 10 (6), e0131492 (2015).
- Baeckens, S., et al. Environmental conditions shape the chemical signal design of lizards. Functional Ecology. 32 (2), 566-580 (2018).
- Greene, M. J., Mason, R. T. Chemically mediated sexual behavior of the brown tree snake, Boiga irregularis. Ecoscience. 5 (3), 405-409 (1998).
- Mason, R. T. Integrated pest management: The case for pheromonal control of habu and brown tree snakes. Snakes and Man: Controlling Pest Species for Conservation and Human Health. Rodda, G., Chiszar, D., Sawai, Y., Tanaka, H. , Cornell University Press. Ithaca, NY. 196-205 (1998).
- Pruett, J. A., et al. Evolutionary interactions between visual and chemical signals: chemosignals compensate for the loss of a visual signal in male Sceloporus lizards. Journal of Chemical Ecology. 42 (11), 1164-1174 (2016).
