Summary
I reptiler är hudens lipider från artfränder avgörande för sexuella signaler, med potentiella användning i hantering av invasiva arter. Här, vi beskriver protokoll för att extrahera hudens lipider från skjul hud eller hela djur, att fastställa och analysera den totala lipid massan och separera de lipider som använder fraktionering via kolonnkromatografi.
Abstract
Reptiler signal till artfränder med lipider i sin hud, främst för att aktivera mate spårning och bedömning. Isolering av dessa lipider har verktyget i forskning inriktad på evolutionära mönster och mekanismer av kemisk kommunikation, förutom förstå rollen tätskikt av lipider i utvecklingen av terrestrial liv. I en tillämpad metod har sådan hud-baserade ledtrådar potentiella användning för wildlife chefer behandlar invasiva arter. De viktigaste stegen för att kvantifiera reptil hudens lipider i protokollet presenteras här inkluderar utvinning, totala lipid beslutsamhet och fraktionering via kolonnkromatografi, senare processen resulterar i renat eluat av föreningar som sedan kan antingen vara analyseras för att tilldela förening identifieringar (t.ex., gaskromatografi-masspektrometri [GC-MS]) eller användas direkt i mer raffinerad bioassays. Hudens lipider kan extraheras från levande hud, skjul hud, eller döda hela djur, använder nonpolar organiska lösningsmedel (t exhexan, bensen, toluen). Utvinning solubilizes lipider, och sedan kan lösningsmedlet förångas för att ge en mätbar endast lipid-extrakt. Fraktionering omfattar separation av totala lipid extraktet till specifika eluat via traditionella kolonnkromatografi. Totala lipid extraktet binds först till ett substrat-baserade kolumn (t.ex., aluminiumoxid) och, sedan, enskilda eluat (”bråk”) av lösningsmedel vid specifika volymer skickas sekventiellt genom kolumnen till eluera uppsättningar av föreningar från lipid blandningen baserat på gemensamma polaritet. De fraktioner framsteg i polaritet vid en standardiserad sekvens genom att öka den relativa mängden polära lösningsmedel (t.ex., dietyleter) i opolära lösningsmedel. I detta manuskript, vi beskriva flera metoder för att utvinna hudens lipider av reptiler och sedan ge ett standardprotokoll för att isolera olika uppsättningar av föreningar baserat på polaritet, med traditionella kolonnkromatografi. Hela lipid extrakt eller särskilda fraktioner kan sedan användas i bioassays för att avgöra någon biologisk aktivitet som framkallas av föreningarna som däri.
Introduction
Reptiler producerar lipider i epidermis, antingen direkt från hudceller eller diskret körtlar som används i social kommunikation, såsom mate bedömning och spårning, territorialitetsprincipen, och intra- och mellanartskonkurrens erkännande1,2 ,3,4. Isolering av dessa hudens lipider har verktyget i forskning inriktad på evolutionära mönster och mekanismer av kemisk kommunikation, förutom förstå rollen tätskikt av lipider i utvecklingen av terrestrial liv2,3 ,4. Vidare, många reptiler, särskilt squamates (ödlor, ormar), är invasiva arter av oro i känsliga ekosystem, och utvecklingen av feromon-baserat beten att förbättra fångstmetoder och avlägsnande är pågående5,6. Ogenomtränglighet av reptil hud underlättar utvinning av lipider närvarande att få relativt ren extraktioner av en potentiellt robust källa kemiska signaler. Principen stegen för att kvantifiera reptil hudens lipider i protokollet beskrivs omfattar utvinning, totala lipid beslutsamhet och fraktionering via kolumnen kromatografi1,6,7. Metoderna har använts rutinmässigt som ger de bioaktiva isolat som förklarar mycket om mate val och urval, särskilt i ormar2.
Hudens lipider kan extraheras från antingen levande hud, skjul hud, eller döda hela reptiler, använder nonpolar eller polära organiska lösningsmedel1,7,8,9. Det bör noteras att museiexemplar lagras i lösningsmedel som etanol är inte optimala för utvinning av hudens lipider, och endast färska eller färska frysta slaktkroppar bör betraktas som möjliga källor för utvinning. Hudens lipider är inerta, vilket gör dem stabila på ytan av huden och lätt att extrahera7. I sin signalering roller i reptil ekologi, hudens lipid cues sätts ofta i tuffa miljöer, men på grund av sin robusta kemiska egenskaper, sådana signaler kan behålla sin information värde över lång tid10,11 , 12. extraheringen solubilizes de lipider, med ett icke-polära lösningsmedel (t.ex.hexan, bensen, toluen) över en timmar långa blöt, följt av avdunstning av lösningsmedlet, lämna en mätbar massa lipid extrakt7 , 8. hudens lipider är mycket blandbar i nonpolar vätskor, och ett brett utbud av kolväten kan utvinnas från ett likaså varierande utbud av källor.
Fraktionering är mer arbetskrävande än utvinning men tjänar till att separera totala lipid extraktet till särskilda fraktioner via kolonnkromatografi, till stöd i rening och möjliga identifiering av föreningarna som däri1, 6 , 7 , 8. totalt lipid extraktet är bunden till ett substrat-baserade kolumn och sedan individuella eluat (”bråk”) av lösningsmedel vid specifika volymer skickas sekventiellt genom kolonnen till eluera uppsättningar av föreningar från lipid blandningen som har en gemensam polaritet6,7,8. I lipid kromatografi, fraktioner framsteg i polaritet på några standardiserade sekvens genom att öka den relativa mängden polära lösningsmedel (t.ex., dietyleter) i opolära lösningsmedel (vanligen uttryckt i procent: 0%, 2%, 4% eter, etc. )6,7,8. Men metoder som tunnskiktskromatografi (TK) kan användas för att separera lipider i en blandning och är enklare, kolonnkromatografi är program eftersom den använder ett slutet system, är lätt att kontrollera, kan separat mer koncentrerad blandningar, och är kompatibel med Multiplexing för effektivitet. I detta manuskript, vi beskriva flera metoder för att utvinna hudens lipider av reptiler och sedan ge ett standardprotokoll för att isolera olika uppsättningar av föreningar baserat på polaritet, med traditionella kolonnkromatografi. I många forskningsprojekt som innebär isolering av kemiska signaler, är slutmålet att åstadkomma förändring i de mottagare som utsätts för dessa signaler. Hela lipid extrakt eller särskilda fraktioner kan sedan användas i bioassays för att avgöra någon biologisk aktivitet framkallas av föreningarna som däri1,2,6,7. I grundläggande biologisk forskning, exempelvis kan bioassays med särskilda fraktioner avslöja att forskare att en renad källa av feromoner har isolerats, och sedan, metoder för identifiering av föreningarna som mål kan eftersträvas. Från en wildlife managementperspektiv, identifiering kanske inte målet, och i stället den aktiva fraktionen kunde användas i fältet att locka artfränder till fällor eller hämma mate spårning nonnative livsmiljö13,och14.
Protocol
Alla förfaranden som inbegriper användning av ryggradsdjur godkändes av institutionella djur vård och använda kommittén av James Madison University.
1. utvinning
-
Skjul hud utvinning
- Samla cirka 30 cm2 av skjul från en enda reptil, ta bort huvud och Svabbprover sektioner som kan kontaminera proverna. Använd kloropren handskar och rengör skjulet av skräp.
- Taravikt balansen med en väska eller väger båten och väger skjulet (± 0,01 g).
Obs: Massa precision bestäms av precisionen i balansen. Skjul hud massa är den standardisering faktorn för extraherade hudens lipid massa (se nedan) och betydligt samvarierar med extraherade lipid massa. - Separata skjulet i mindre (5 cm2) bitar och lägga till dem i en förslutningsbar glasflaska med hexan-kompatibel lock (t.ex., en mason glasburk med metall lock eller en lab kolv med PTFE lock). Häll upp tillräckligt hexan i behållaren att helt dränka skjul hud bitar. Täta behållaren.
FÖRSIKTIGHET: Hexan är brandfarligt, en respiratoriska irriterande, och associeras med flera kort - och långsiktiga hälsorisker. Förfaranden som inbegriper hexan utförs i dragskåp (laboratorium) eller utomhus (fält) samtidigt bära lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) (t.ex., splash skyddsglasögon, kloropren handskar, långa ärmar, Stäng-toed skor). - Etikett på respektive förpackning med en penna eller lösningsmedel-vattenresistent penna. Lämna på respektive förpackning i dragskåp vid rumstemperatur över natten eller upp till 24 h.
- Ta bort skjul bitar med ren metal pincett eller tång. Skaka bitar att behålla eventuella återstående hexan i behållaren. Låt huden bitarna torka på hushållspapper; sedan, kasta dem. Om flera extraktioner utförs, ren tång/tången mellan varje prov. För att rengöra tång/tången, skölj dem i ~ 50 mL hexan i en bägare.
- Om extraktet är inte skall användas omedelbart, Dekantera eller Pipettera extraktet i en injektionsflaska av glas lämplig volym, försegla det med en PTFE-fodrad mössa, etikett och lagra den på-20 ° C.
Varning: Eftersom extraktet innehåller hexan, förvara injektionsflaskorna i en explosionssäker frys.
-
Döda hela djur utvinning
- Spela in nosen-vent längd (SVL; i centimeter) och vikt (i gram) av djuret. Om totala lipid eller pheromone produktion per enhet av hud yta skall fastställas, använda en skräddare måttband för att erhålla maximal kropp omkrets (i centimeter).
- För utvinning, välja en behållare som har en diameter som är 1/3 av längden på djuret. Placera kadavret säkert längst ned i behållaren med huvud och kloak på toppen. Häll upp tillräcklig hexan i behållaren för att maximera nedsänkt yta av kroppen.
Obs: Om huvudet eller kloak bli nedsänkt för någon tid i utvinning, notera. - Secure locket, märk behållaren och dränk den i ett dragskåp vid rumstemperatur över natten eller upp till 24 h.
- När du tar bort stommen, Använd ren metal pincett eller tång. Behålla kvarvarande hexan på slaktkroppen i behållaren genom att låta det droppa från kroppen, inte från huvudet eller svansen. Täta behållaren.
- Om extraktet är inte skall användas omedelbart, Dekantera extraktet eller Pipettera det i en injektionsflaska av glas lämplig volym, försegla det med en PTFE-fodrad mössa, etikett och lagra den på-20 ° C.
2. lipid massa Bestämning
Obs: Den extraherade lipid massan kan bestämmas på ett av två sätt: med en injektionsflaska av glas eller med en runda-botten kolv, med en roterande indunstare.
- Bestämma den extraherade lipid massa via metoden glas injektionsflaska.
- Använd en preweighed flaska med tillräcklig storlek (7 mL, 22 mL, 50 mL, etc.). Inkludera den gemensamma jordbrukspolitiken och etiketten i den totala massan, eller alltid väga flaskan utan mössa och etikett (markeringar på etiketten också lägga massa). Placera etiketten på halsen på kolven att undvika vatten kontakt.
Obs: Avdunstning i injektionsflaskor av glas är effektivt om forskaren har tillgång till en gas grenrör system där flera injektionsflaskor kan vara avdunstat samtidigt under en N2 stream. - Överför extraktet till injektionsflaskan, med glas pipett med en gummi lampa eller, för stor volym utdrag, en elektronisk pipett-handkontroll med en disponibel 10 mL glas pipett. Skölj behållaren med ~ 3 mL hexan och överföring till injektionsflaskan samt.
- Avdunsta provet under en mild N2 ström. Luta flaskan i en vinkel att aktivera en maximal lösningsmedel yta. Kondensat kommer bildas på utsidan av flaskan som hexan avdunstar.
Obs: Ringar av lipid bildar i injektionsflaskan som hexan avdunstar, så regelbundet snurra extraktet. - Avdunsta provet till torrhet; då kontroll. Spela in den totala lipid avkastningen.
Obs: För analys i olika grupper, standardisera lipid samlas antingen att kasta massa (lipid massan [i gram] dividerat med skjul massan [i gram] x 100 ger procent lipid massa skjulet) eller till djurets SVL (lipid massa [i milligram] dividerat med SVL [i centimeter]; ger lipid massan per längdenhet). Större djur producerar mer lipid, och många arter är starkt könsdimorfism, som medför betydande bias i data.
- Använd en preweighed flaska med tillräcklig storlek (7 mL, 22 mL, 50 mL, etc.). Inkludera den gemensamma jordbrukspolitiken och etiketten i den totala massan, eller alltid väga flaskan utan mössa och etikett (markeringar på etiketten också lägga massa). Placera etiketten på halsen på kolven att undvika vatten kontakt.
- Bestämma den extraherade lipid massa via rotationsindunstaren.
- För en snabbare avdunstning per enskilda prov, överföra extraktet till en preweighed runda-botten-kolv och Indunsta den med en roterande indunstare.
- Om partiklar är märkbar i extraktet, filtrera provet genom att placera en filterpapper kon i halsen på kolven; sedan överföra extraktet till kolven och låt det gravitation filter. Kassera pappersfiltret efter full extraktet överförs.
Obs: Överföra provvolymen (upp till ~ 80% mätkolv volym) innan roterande avdunstning. Alla bubblande av extraktet till kondensorn av rotationsindunstaren orsakar kontaminering och kräver kondensorn rengörs. En bula fälla kan placeras mellan kolven och halsen på kondensorn om bubblor eller ”stöta” förekommer i de flesta prover.
- Om partiklar är märkbar i extraktet, filtrera provet genom att placera en filterpapper kon i halsen på kolven; sedan överföra extraktet till kolven och låt det gravitation filter. Kassera pappersfiltret efter full extraktet överförs.
- Slå på strömmen till roterande förångare och vatten badet (50 ° C; lägre än lösningsmedel kokpunkten). Slå på kallt vatten flödet till kondensorn.
Obs: Kondensorn av rotationsindunstaren är ansluten till antingen ett cirkulerande kylmaskin eller ett kallt vatten tapp avluftning till avloppet. Flödet kan vara långsam om vattnet är kallare än omgivande, kondensera lösningsmedel dunsten lämnar kolven och ange kondensorn. - Slå på vakuumkällan (vatten vakuum eller pumpen). Kontrollera vakuum trycket är tillräckligt för att hålla kolven till halsen på kondensorn. Öppna ventilen i slutet av kondensorn innan kolven ansluts. Skjut kolven på halsen på kondensorn, stänga ventilen för att täta och se till att kolven inte går att koppla från kondensorn när kolven är släppt.
- Lägre kolven tills ~ 50% är nedsänkt i badet. Starta rotationen av kolven på medellång hastighet. Om vakuum, hastighet, kondensorn flöde och badtemperaturen är optimal, kommer att lösningsmedel dunsten lämnar kolven kondensera på spolen och droppa i återhämtning kolven.
- Om provet kokar (t.ex., stora bubblor, snabb gasning), omedelbart minska det vakuum och/eller hastighet rotationsindunstaren. Om den kokande fortsätter, inaktivera kolv rotation, stänga av dammsugaren, höja kolven från badet och släppa vakuum tätning. Upprepa steg 2.2.3 och 2.2.4.
Obs: Om inget lösningsmedel är att samla in i recovery kolven men extraktet är uppenbarligen indunstning, vakuum är troligen nonoptimal och måste justeras.
- Om provet kokar (t.ex., stora bubblor, snabb gasning), omedelbart minska det vakuum och/eller hastighet rotationsindunstaren. Om den kokande fortsätter, inaktivera kolv rotation, stänga av dammsugaren, höja kolven från badet och släppa vakuum tätning. Upprepa steg 2.2.3 och 2.2.4.
- Avdunsta provet under vakuum tills ~ 2 mL vätska kvar i kolven (stor volym utdrag), eller, om en preweighed kolv används, låt dunsta tills en pärla av vätska med ett < 1 cm diameter syns i botten av kolven. Stäng av rotationen och vakuum; sedan, höja kolven ur badkaret.
- Håll kolven halsen som vakuum tätning släpps; sedan vrida nacken för att dra det från kondensorn. Om en stor volym kolv används, snurra kondenserade extraktet i kolven att upplösa synliga lipider; överför sedan lösning via pipetten till en mindre volym, preweighed kolv. Tillsätt 3 mL hexan skölj stora kolven, snurra det, tillsätt det till mindre kolven och avdunsta igen (steg 2.2.3 - 2.2.5).
- Pärla av vätska i extraktet kommer stelna när hexan dunstar. När torr, låt den anta rumstemperatur. Lipider bildar ett genomskinligt, vitt till gult vax i kolven (~ 5 min). Väga in kolven för att få den slutliga massan.
Obs: Beroende på de lipider som utvinns, de har antingen solid (t.ex., vax) eller halvhårda (t.ex., råolja) egenskaper, särskilt när fraktionerade lipider har avdunstat (se nedan).
- För en snabbare avdunstning per enskilda prov, överföra extraktet till en preweighed runda-botten-kolv och Indunsta den med en roterande indunstare.
- Solubilize av lipider i inspelade volymen hexan avkastning ≥1 mg lipid per 1 mL hexan. De arbetar för att utvecklas till kromatografi är ~ 5 mL. Om överföring från kolven till injektionsflaska, behålla 2 mL av den totala volymen att skölja kolven efter överföra flesta av extraktet till injektionsflaskan.
- Märk rören, täta dem med PTFE-fodrade mössor och lagra dem vid-20 ° C.
3. kolonnkromatografi
Obs: för att separera okänd föreningar baserat på polaritet till särskilda fraktioner, extraherade lipid massa kan vara har lagts till beredda vätskekromatografi kolumner och fractionated använder standard eluering.
- Beredning av kolumnen
- Beroende på lipid massan i extraktet, använda antingen en stor- eller en små volymer kromatografi glaskolonn med en Teflon Avstängningskranen. Kolumnen är monterat med eller smält till en fast volym reservoar (500 mL för en stor kolumn, 250 mL för en liten kolumn). Detta protokoll avser hädanefter endast en stor volym kromatografi kolumn smält till en reservoar. Ren eventuella nya glas och delar som ska användas i kromatografi som beskrivs i avsnitt 4. skölj dem sedan, med hexan eller en annan icke-polära lösningsmedel.
- Vik en bit glasfiber ull (~ 14 cm i längd [L] x 4 cm i bredd [W]) upprepade gånger tills en kvadrat med ~ 4 x 4 cm bildas. Använd en träpinne stång längre än kolumnen för att placera glasfiber längst ned i kolumnen.
- Säkra kolumnen i en huva till en standard ringen stå med två klämmor(t exswivel eller modular), en ovan Avstängningskranen och en under halsen på reservoaren. Nivå i kolumnen. Placera kolumnen på en höjd så att tillräcklig arbetsavstånd för 500 mL bägaren att passa enkelt under kolumnen. Öppna Avstängningskranen.
- Häll tvättas och torkas sand i kolumnen tills en ~ 3 cm sand vilar ovan glasfiber. Placera svart eller mörkt papper under kolumnen och tryck den försiktigt. Om sand faller från kolumnen med varje tryck, är glasfiber barriären otillräcklig. Upprepa steg 3.1.2 - 3.1.4.
Obs: Använd en ovikt gem tejpade till slutet av en dowel spö för att hämta glasfiber från botten. - Placera den 500 mL-glasbägaren under kolumnen. Häll långsamt upp ~ 25 mL hexan från en 100 mL-glasbägare eller graderad cylinder i kolumnen reservoaren till våt sand. Stäng Avstängningskranen när det är ~0.5 cm hexan ovanför sanden.
- Väga sig neutrala aluminiumoxid. För varje liten kolumn, använda ~ 50 g; ~ 175 g för varje stor kolumn. Häll aluminiumoxid i en 1 L Erlenmeyer-kolv. Begränsa 400 g aluminiumoxid per 1 L mätkolv.
- Till aktivera aluminiumoxid (verksamhet III), Pipettera avjoniserat vatten av en volym motsvarande 6% av aluminiumoxid massa (dvs.100 g av aluminiumoxid, tillsätt 6 mL vatten). Tillsätt vatten som droppar i hela aluminiumoxid.
- Täcka mätkolven i aluminiumfolie eller kork. Kraftfullt snurra (skaka inte) att jämnt skingra anklagelsen. Fortsätt tills inga synliga klumpar kvar.
Obs: Kolven kommer värma som vattnet reagerar med den aluminiumoxid, som kan förväntas. - Lägg till hexan tills aluminiumoxid är helt täckt, med ~0.5 cm hexan ovanför aluminiumoxid. Snurra kolven för att bilda en slurry.
- Placera en ventilerad tratt i reservoaren av kolumnen och en 500 mL-glasbägare under kolumnen. Öppna Avstängningskranen. Snurra aluminiumoxid och stadigt Häll det i kolumnen. Säkerställa aluminiumoxid lösa jämnt i kolumnen och inga stora bubblor eller sprickor bildas i kolumnen aluminiumoxid. Knacka försiktigt på sidan av kolumnen sedimentera jämnt av aluminiumoxid.
Obs: Ytterligare hexan måste läggas för ytterligare häller, att upprätthålla suspensionen. Hexan samlande i bägaren under kolumnen kan återanvändas om glasbägaren var ren i början. - Kolumnen bildas när toppen av aluminiumoxid är stabil och ~ 4 cm under halsen på kolumnen vid basen av reservoaren. Använd en pipett för att skölja insidan av behållaren med hexan för resterande aluminiumoxid. Hjälp av en tratt, försiktigt att lägga till ett andra lager av sand ovanpå aluminiumoxid, att ~ 1 cm under behållaren.
Obs: Hexan kommer flöda från kolumnen som Avstängningskranen förblir öppen. Låt inte kolumnen torka ut. Om kolumnen torkar ut, måste processen börja igen, början med steg 3.1.2. Protokollet kan stoppas här om kolumnerna är beredda dygnet innan fraktionering. Fast placera en kork i toppen av behållaren eller Täck det tätt med folie. Fyll behållaren med ~ 100 mL hexan. Dra åt Avstängningskranen.
- Fraktionering av lipid extraktet
Obs: Oavsett kolumnen storlek, fraktioner av lipid extrakt kan samlas individuellt och poolade utifrån deras bråkdel polaritet eller ignorerade helt om de inte innehåller några kända/identifierade målet föreningar. Omgångar av replikera eluering (n = 3 volymer) överförs genom kolumnen att säkerställa den tillräckligt elueringen av lipider. Följ tabell 1 för stor-kolumn eluering (med extrakt massa > 30 mg) eller små-kolumn eluering (med extrakt massa < 30 mg). En skräddarsydd eluering-protokollet för att isolera endast metyl ketoner är i tabell 2.- Ta bort återstående hexan överst i kolumnen med stor volym pipett eller tillåta hexan att rinna ut till en ren bägare. Lämna ~ 3 mL hexan ovanför sanden överst i kolumnen.
Obs: Insamlade hexan är rena om det bara kontaktade rent glas och kan återvinnas i det första bråket. - Överföra lipid extraktet till kolumnen, med långa glas pipett. Långsamt Pipettera extraktet för att undvika att störa sandlagret. Skölj extrakt flaskan eller kolven med ~ 5 mL hexan och överföra den till kolumnen.
Obs: Om extraktet var förvaras vid-20 ° C, kommer lipider kommer att utlösas. Varma injektionsflaskan tills inga fler fällningen är synliga. - Öppna Avstängningskranen och låta provet att läsa in i kolumnen. Om extraktet har en stor massa (> 30 mg), ett gulaktigt band kan vara synlig i aluminiumoxid, strax under sanden på toppen. Samla in flödet genom i en bägare på avfall som denna hexan är inte längre rena. Stäng Avstängningskranen när ~ 3 mL kvar ovanpå sanden.
Varning: Lipid extraktet, nu är bundet till den aluminiumoxid och kolumnen, inte kan torka ut eller provet kommer att gå förlorade. - Placera en preweighed och märkta runda-botten mätkolv (100 mL, 250 mL eller 500 mL) under kolumnen innan du häller den första fraktionen. Fraktioner som skall kasseras kan samlas i en gemensam glasbehållare.
- Förbereda den första fraktionen (100% hexan: 0% dietyleter [hittils, ”eter”]) i en graderad cylinder. Om förbereder fraktioner i förväg, täck med folie eller propp med kork.
Obs: Fraktioner framsteg i polaritet; Därför behöver cylindern inte sköljas mellan fraktioner. - Lägg den första fraktionen av reservoaren av hälla via en ventilerad glastratt hänvisas till en sida av reservoaren för att undvika att störa sandlagret. Öppna avstängningskranen för att starta elueringen. Stäng Avstängningskranen när ~ 3 mL hexan kvar ovanför sanden överst i kolumnen.
Obs: Sluta aldrig en eluering inom en enskild fraktion genom att stänga Avstängningskranen innan majoriteten av eluatet har samlats. Mellan fraktioner, lämna inte Avstängningskranen stängd längre än ~ 1 h eftersom förseningar kan förändra kvalitet och repeterbarhet av elueringen. - Upprepa steg 3.2.4 - 3.2.6 för fraktioner 2 och 3. Samla fraktionerna i lämplig storlek kolvar som tillåter headspace för rotary avdunstning, särskilt om fraktionerna som sammanförs.
- Förbereda en fjärde del (2% eter) och lägga till den i behållaren. Placera nästa kolven under kolumnen, öppna Avstängningskranen och samla den fjärde fraktionen. Förbereda en femte bråkdel; Fortsätt sedan som behövs.
Obs: Det är möjligt att avdunsta första fraction(s) via roterande avdunstningen samtidigt samla successiva fraktioner. - För att förbereda fraktioner ska användas i GC-MS analyser, få en bråkdel massa med 0,01 eller 0,1 mg noggrannhet våg. Solubilize lipid bråk för att ge 1 mg av lipid per 1 mL hexan.
- Ta bort återstående hexan överst i kolumnen med stor volym pipett eller tillåta hexan att rinna ut till en ren bägare. Lämna ~ 3 mL hexan ovanför sanden överst i kolumnen.
4. rengöring
- Lämna Avstängningskranen öppen och Invertera kolumnen i avfall bägaren. De aluminiumoxid och sand kommer slut på kolumnen. Alternativt skaka för att påskynda processen. Använda en dowel spö för att hämta glasfiber ull om det fastnat (undvika repor glas) eller blåsa ut med en N2 ström.
- Hyckla och rengör allt glas, med laboratoriet-grade rengöringsmedel i varmt vatten i en plastbalja med en glas borste (med hår eller plast borst). Tvätta 3 x. Skölj noga med varmt vatten tills glaset är inte längre slick vid beröring.
- Skölj glas och verktyg 3 x med avjoniserat vatten. Placera dem på ett galler lufttorka. För att påskynda torkning, lägga till en liten volym av aceton (3 mL) till glas, snurra, och låta det lufttorka eller köra det under en N2 stream.
Representative Results
Följande utvinning, den totala lipid massa är den första typen av data som kan förvärvas genom det protokoll som presenteras här. Totalt fett Massavärden bör dock aldrig analyseras utan några försök att standardisera de erhållna värdena. Flera metoder kan användas, men vi rekommenderar antingen standardisera extraherade lipid massan till djurets SVL (i centimeter) eller till massan av skjul huden som extraherades. Tidigare resultat i ett lipid-massa-per-längd värde och den senare blir en del av källkod massa. Anledningen till standardiseringen är att större djur naturligt producera mer hud lipider eftersom de har en större total hud yta. Figur 1A exemplifierar denna förening, där de extraherade hudens lipid massa skalorna linjärt med massa skjul hud extraheras. När standardiserade till totala skjul hud samlas, detta linjärt förhållande är helt bort (figur 1B).
Efter fraktionering, samma standardisering tillvägagångssätt kan användas med den stora massan av de enskilda fraktionerna (figur 2). I detta prov data set, respektive fraktion inte bidrar lika till den totala extraherade lipid massa: neutrala lipider (bråk 1-3) är den dominerande uppsättningen föreningar av massa andel jämfört med varje uppsättning mer polära lipider (bråk 4-6, 7-9 och 10-12).
Figur 1: relationer mellan extraherade lipid massa och ingående material. (A) i reptiler, förhållandet mellan det totala skjulet hud massan och extraherade hudens lipid massa är positivt korrelerade (P < 0,001). (B) när extraherade hudens lipid massa är standardiserat till den totala kasta massa (den lipid massa dividerat med skjulet massa), detta förhållande är inte längre närvarande (P = 0,46). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: standardiserade bråkdel massorna efter eluering. Använda kolonnkromatografi, kan hudens lipid extrakt vara elueras i fraktioner, baserat på sammansatta polaritet. Fraktionen massa är, sedan, uttryckt som en andel av det totala lipid extraktet (bråkdel massa [i milligram] dividerat med totala lipid extrakt massa [i milligram) att avgöra skillnader mellan fraktioner eller experimentella för8. Staplarna representerar medel. Översta felet är SEM; botten felet är 95% CI. För tydlighet finns enskilda datapunkter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa gas Kromatografer av metyl keton fraktioner. (A) med de korrekta elueringen, metyl ketoner är de vanligast förekommande föreningarna i fraktionen 7 från tabell 2 och kan ses som kupletter toppar (retentionstiden = 24-34 min). (B) fraktionen 6 från tabell 2, räntor dock endast ickemålorganismer föreningar. Detta samma resultat kan inträffa när den polära lösningsmedel som används i den mobila fasen har upphört att gälla eller om kolumnen stoppas under lång tid (> 1 h) mellan fraktioner. Observera skillnaden i molekylär överflöd mellan de två spåren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Fraktion | Hexan (mL) | Dietyleter (mL) |
| 1,2,3 | 100 [30] | 0 [0] |
| 4,5,6 | 98 [29,4] | 2 [0,6] |
| 7,8,9 | 96 [28,8] | 4 [1.2] |
| 10,11,12 | 92 [27,6] | 8 [2,4] |
| 13,14,15 | 84 [25,2] | 16 [4,8] |
Tabell 1: Standard eluering volymer för hudens lipid fraktionering. Lösningsmedel volymer och procentsatser ges för både stor volym (t.ex., 250 mL) och [små volymer] (t.ex., 100 mL) kromatografi kolonner med aluminiumoxid (verksamhet III). Hexan är bärare vätskan; dietyleter är den mobila fasen.
| Fraktion | Hexan (mL) | Dietyleter (mL) | Anteckningar |
| 1, 2, 3 | 30 | 0 | eluera; samla inte |
| 4, 5 | 28,8 | 1.2 | eluera; samla inte |
| 6, 7, 8 | 28,8 | 1.2 | samla in individuellt. majoriteten av metyl keton massan kommer att vara i bråkdel 7; GC-MS kvalitetskontroller ska köras på 6 och 8 att säkerställa korrekt eluering av ketoner |
Tabell 2: modifierade eluering system för strumpeband orm metyl ketoner. Dessa volymer är för användning med en små volymer kromatografi kolumn och med varumärket av aluminiumoxid för närvarande tillgängliga. Den eluerade fraktionen som är positiva för metyl ketoner har en stark bioaktivitet i fältet analyser med wild, uppvakta manliga strumpeband ormar1,7. För att bekräfta närvaron av metyl ketoner i målet fraktioner, prover kan spädas 1 mg/ml och analyseras via GC-MS. ger figur 3 representativa kromatogram för både positiva och negativa resultat efter eluering.
Discussion
Utvinning av hudens lipider i reptiler kan tillämpas på levande eller döda hud, förutom skjul hud, som erbjuder mångsidighet i experimentell tillämpningen av denna teknik. Extraktioner av hudens lipider kan dessutom göras i fältet, för att möjliggöra en dynamisk tillämpning av metoden till ett brett utbud av biologer2,13. Utvinning av hudens lipider är enkel; Därför är det lätt att skala upp extraktioner som behövs per experiment eller design och utövare behöver inte har betydande expertis för att köra metoderna. De enda begränsande faktorerna för uppskalning är tillgängligheten av rök hood utrymme, ett överflöd av ren, sealable glasvaror och lösningsmedel lagringsutrymme.
Hudens lipid extrakt fraktionering kan anpassas till en forskares behov och har därför liknande flexibilitet till utvinning av lipider. Exempelvis kan neutrala lipider elueras och därefter kasseras, för att resultera i mål fraktioner som kan rena föreningar av intresse eller förenkla bioassays. Fraktionering kan utföras på flera skalor inom och över lipid prover. Till exempel kan flera kolumner köras samtidigt för att göra processen effektivare. Eller bara en del av en total lipid extrakt kan vara fractionated på en liten kolumn till, således bespara reagenser och tid. Fraktionering begränsas främst av massan av de totala lipid-extraktet och precisionen av utrustningen som är tillgängliga för forskaren. Till exempel om forskaren har en balans med en 10,0 mg precision, bestämning av fraktionen nettomassa och, därför, är riktigheten av provberedningen för GC-MS analys väsentligt, om inte helt, hindras. Samma sak gäller för glas. Om forskaren har en stor volym kolumn för fraktionering, men har en liten totala lipid massa att separera den eluering eller separation av föreningarna som kommer att göra framsteg men kommer att kräva en betydande slöseri med lösningsmedel, reagenser, tid och potentiellt, målet föreningar själva.
Det rekommenderas att utföra en kvalitetskontroll kontroll innan fastställande eluering systemet, som kan ses i tabell 2, och bestämma vilka fraktioner kan kasseras. Till bekräfta elueringen av de önskade lipider, en kolumn kan vara kör där varje fraktion, 1-15, samlas in separat och sedan analyseras med GC-MS. I figur 3visar representativa gaskromatograf spår att metyl ketoner från strumpeband ormar bara eluera från kolumnen i en viss fraktion. Genom att utföra denna kvalitetskontroll steg, kan en modifierad eluering system utvecklas för en viss art att säkerställa maximal avkastning av föreningarna som av intresse. Ändringar i material, såsom den leverantör eller massa av aluminiumoxid eller ålder dietyletern, kommer absolut leda till skillnader i eluering som bör kontrolleras för genom att utföra en kvalitetskontroll test.
De tekniker som beskrivs begränsas främst av kemiska beskaffenhet ledtrådar som kan erhållas. Primärt, tillåta dessa metoder endast forskare att isolera och separera långkedjiga lipider från huden på reptiler. Många arter av reptiler använda luftburna eller proteinhaltiga ledtrådar som kemiska signaler och metoderna som beskrivs är oförenliga med isolera nämnda ledtrådar. Ytterligare, nonpolar lösningsmedel kommer inte extrahera aqueous cues från ytbehandlar av reptiler eller källor av cue nedfall (t.ex., Bur vatten, avföring, vattenlevande substrat) som faktiskt kan innehålla rikliga kemiska signaler. Lämpliga metoder för att fånga dessa typer av ledtrådar är tillgängliga för forskare (t.ex., fasta fasen microextraction [SPME] för flyktiga cues och högpresterande vätskekromatografi [HPLC] för vattenhaltiga signaler), även om, gillar metoderna beskrivs ovan, finns det en teknisk inlärningskurva.
Viktigast av allt, bör nyttan av den slutliga kemiska blandningen som forskaren vägleda de metoder som används. Exempelvis om en forskare vill veta om en fokal handjur kan skilja mellan de ledtrådar som produceras av manliga vs kvinnliga artfränder i en riktad bioassay, är utvinning den enda metoden behövs2,3. Om identifiering av könsdimorfisk föreningar är målet, borde extraktet dock renas, för att möjliggöra större förtroende för tilldela specifika molekyler eller grupper av molekyler via kemisk analys1, identifieringar 6,9,11. Dock att även bedriva kromatografi med en lipid källa, krävs en betydande massa börjar utdrag så att mätbar bråkdel massorna kan erhållas; annars en sammanslagning av prover kan eftersträvas men är inte optimala14.
Framtida utveckling av detta protokoll omfatta åtgärder för att utnyttja och anpassa förfarandet för mer reptils arter. Ytterligare noninvasiva metoder för extraktion av hudens lipider utvecklas också.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Utvecklingen av dessa metoder, särskilt skjul hud lipid utvinning, uppstod under samarbetsavtal (14-7412-1061-CA 15-7412-1155-CA och 16-7412-1269-CA) mellan James Madison University (JMU) och US Department of agricultures djur och Plant Health Inspection Service (APHIS). M.R.P. erkänner bidrag från följande studenterna till utvecklingen av skjul hud metoder: S. Patel (Washington och Lee University [WLU]), J. Zachry (WLU), R. Flores (JMU), J. Noll (JMU) och S. Ashton (JMU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Powder-free Chloroprene Gloves | Microflex | NEC-288 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves") |
| Ohaus Adventurer Precision Balance | Ohaus | AX622 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance") |
| Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid | Ball | NC9661590 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar") |
| Hexane, Mixtures of Isomers | Sigma-Aldrich | 650544 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane") |
| Hi/Lo Write-On Temperature Tape | Electron Microscopy Sciences | 5029927 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape") |
| Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL | Sigma-Aldrich | Z414514 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL") |
| Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL | Sigma-Aldrich | Z414492 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL") |
| Cork Flask Support Ring | Sigma-Aldrich | Z512419 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring") |
| Accu-jet Pro Pipette Controller | Sigma-Aldrich | Z671533 | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller") |
| Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL | Pyrex | 13-666-7E | See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette") |
| Rotavapor R II | Buchi | 2422A0 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator") |
| Elliptical Bump Trap | Chemglass Life Science | 501215241 | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap") |
| 7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27151 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial") |
| 7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27152 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
| 22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass | Supelco | 27173 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial") |
| 22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner | Supelco | 27174-U | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap") |
| Excellence XS Analytical Balance | Mettler-Toledo | XS205DU | See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance") |
| 5 3/4" Disposable Glass Pipette | Fisherbrand | NC0418555 | See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette") |
| Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly | Kimble-Chase | 17810-19300 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column") |
| Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands | Fischerbrand | 11474207 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand") |
| 3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp | Troemner | 2300203 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps") |
| Clamp Regular Holder | Fischerbrand | 05754Q | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder") |
| Sand,Washed and Dried | Macron Fine Chemical | MK-7062-212 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand") |
| Alumina, Neutral | Sorbtech | 15740-5 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US |
| Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL | Pyrex | 4980-1L | See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask") |
| Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL | Sigma-Aldrich | Z100684 | See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask") |
| Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir | Sigma-Aldrich | Z560553 | See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column") |
| Ethyl Ether Anhydrous | Fisher Chemical | E138500 | See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether") |
| Alconox Detergnet | Sigma-Aldrich | 242985 | See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox") |
| Acetone (Certified ACS) | Fisher Chemical | A18P-4 | See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone") |
References
- Mason, R. T., et al. Sex pheromones in snakes. Science. 245 (4915), 290-292 (1989).
- Mason, R. T., Parker, M. R. Social behavior and pheromonal communication in reptiles. Journal of Comparative Physiology A. 196 (10), 729-749 (2010).
- Martín, J., López, P. Pheromones and chemical communication in lizards. Reproductive Biology and Phylogeny of Lizards and Tuatara. Rheubert, J. L., Siegel, D. S., Trauth, S. E. , CRC Press. Enfield, NJ. 43-77 (2014).
- Mayerl, C., Baeckens, S., Van Damme, R. Evolution and role of the follicular epidermal gland system in non-ophidian squamates. Amphibia-Reptilia. 36 (3), 185-206 (2015).
- Mathies, T., Levine, B., Engeman, R., Savidge, J. A. Pheromonal control of the invasive brown treesnake: potency of female sexual attractiveness pheromone varies with ovarian state. International Journal of Pest Management. 59 (2), 141-149 (2013).
- Parker, M. R., Patel, S. M., Zachry, J. E., Kimball, B. A. Feminization of male brown treesnake methyl ketone expression via steroid hormone manipulation. Journal of Chemical Ecology. 44 (2), 189-197 (2018).
- Parker, M. R., Mason, R. T. Pheromones in snakes: history, patterns, and future research directions. Reproductive Biology and Phylogeny of Snakes. Sever, D., Aldridge, R. , CRC Press. Enfield, NJ. 551-572 (2011).
- Parker, M. R., Mason, R. T. Low temperature dormancy affects the quantity and quality of the female sexual attractiveness pheromone in red-sided garter snakes. Journal of Chemical Ecology. 35 (10), 1234-1241 (2009).
- Parker, M. R., Mason, R. T. How to make a sexy snake: estrogen activation of female sex pheromone in male red-sided garter snakes. Journal of Experimental Biology. 215 (5), 723-730 (2012).
- Alberts, A. C. Constraints on the design of chemical communication systems in terrestrial vertebrates. American Naturalist. 139, S62-S89 (1992).
- Martín, J., Ortega, J., López, P. Interpopulational variations in sexual chemical signals of Iberian wall lizards may allow maximizing signal efficiency under different climatic conditions. PLoS ONE. 10 (6), e0131492 (2015).
- Baeckens, S., et al. Environmental conditions shape the chemical signal design of lizards. Functional Ecology. 32 (2), 566-580 (2018).
- Greene, M. J., Mason, R. T. Chemically mediated sexual behavior of the brown tree snake, Boiga irregularis. Ecoscience. 5 (3), 405-409 (1998).
- Mason, R. T. Integrated pest management: The case for pheromonal control of habu and brown tree snakes. Snakes and Man: Controlling Pest Species for Conservation and Human Health. Rodda, G., Chiszar, D., Sawai, Y., Tanaka, H. , Cornell University Press. Ithaca, NY. 196-205 (1998).
- Pruett, J. A., et al. Evolutionary interactions between visual and chemical signals: chemosignals compensate for the loss of a visual signal in male Sceloporus lizards. Journal of Chemical Ecology. 42 (11), 1164-1174 (2016).
