Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Kjemisk isolasjon, kvantifisering og separasjon av huden lipider fra reptiler

Published: February 7, 2019 doi: 10.3791/59018
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biology, James Madison University, 2Department of Integrative Biology, Oregon State University

Summary

I reptiler er hud lipider fra fra Art avgjørende for seksuell signalnettverk, med potensiell bruk i behandling av invasiv art. Her beskriver vi protokoller for å trekke ut huden lipider skur huden eller hele dyr, bestemme og analysere total lipid massen og skille lipider bruker fraksjoneres via kolonnen kromatografi.

Abstract

Reptiler signal til fra Art bruke lipider i deres hud, primært for å aktivere kompis sporing og vurdering. Isolasjon av disse lipider har verktøy i forskningen fokusert på evolusjonære mønstre og mekanismer av kjemiske markedskommunikasjon vanntettingsmembraner forståelsen av lipider i utviklingen av terrestrisk liv. I en anvendt tilnærming har slike hud-baserte signaler potensiell bruk i dyreliv ledere håndtere invasiv art. De viktigste trinnene for kvantifisering reptile hud lipider i protokollen presenteres her inkluderer utvinning, totalt lipid besluttsomhet og fraksjoneres via kolonnen Ture, sistnevnte prosessen resulterer i renset eluates forbindelser som kan deretter enten være analysert for å tilordne sammensatte identifikasjoner (f.eksgass kromatografi-massespektrometri [GC-MS]) og/eller brukes direkte i mer raffinert bioassay. Huden lipider kan hentes fra levende hud, skur hud eller død hele dyr, bruke organisk upolare (f.eksHeksan benzen, toluen). Utvinning solubilizes av lipider og deretter løsemiddelet være fordampet for å gi en målbar lipid-bare pakke. Fraksjoneres omfatter utskillelsen av totalt lipid ekstrakt i bestemte eluates via tradisjonell kolonnen kromatografi. Den totale lipid ekstrakt er første bundet til en substrat-basert kolonne (f.eks, alumina), og deretter individuelle eluates ("fraksjoner") løsemiddel på spesifikke volumer sendes sekvensielt gjennom kolonnen elute sett av forbindelser fra lipid blandingen basert på felles polaritet. Brøker fremdriften i polaritet på en standardisert sekvens ved å øke relative polar løsemiddel (f.eks, diethyl Eter) i upolart løsemiddel. I dette manuskriptet vi beskriver flere metoder for å trekke ut huden lipider av reptiler og deretter gi en standardprotokoll for å isolere annerledes apparater av forbindelser basert på polaritet, bruker tradisjonelle kolonnen kromatografi. Hele lipid ekstrakter eller bestemte fraksjoner kan deretter brukes i bioassay for å finne noen biologiske aktivitet brakt frem av forbindelser der.

Introduction

Reptiler produsere lipider i overhuden, direkte fra hudceller eller diskrete kjertler som brukes i sosiale kommunikasjon, som kompis vurdering og sporing, territorialitet, og intra- og interspesifikk anerkjennelse1,2 ,3,4. Isolasjon av disse hud lipider har verktøyet i forskningen fokusert på evolusjonære mønstre og mekanismer av kjemiske markedskommunikasjon vanntettingsmembraner forståelsen av lipider i utviklingen av terrestrisk liv2,3 ,4. Videre, mange reptiler, spesielt squamates (øgler, slanger), invasiv arter av bekymring i følsomme økosystemer, og utviklingen av feromon-baserte lokker å forbedre fangst og flytting er pågående5,6. Varmeisolerende reptile hud forenkler utvinning av lipider å få ren utdrag av en potensielt robust kilde til kjemiske signaler. Prinsippet trinnene for kvantifisere reptile hud lipider i beskrevet protokollen inkludere utvinning, totalt lipid besluttsomhet og fraksjoneres via kolonnen kromatografi1,6,7. Metodene har blitt brukt rutinemessig som de gir bioaktive isolerer som forklarer mye om kompis valg og utvalg, spesielt i slanger2.

Huden lipider kan hentes fra levende hud, skur hud, eller død hele reptiler, bruker forbindelser eller polar organiske løsemidler1,7,8,9. Det bør bemerkes at plantespiser lagret i løsemidler som etanol er ikke optimal for utvinning av huden lipider, og bare friske eller ferske frosne skrotter bør betraktes som mulige kilder for utvinning. Huden lipider er inaktivt, noe som gjør dem stabile på overflaten av huden og lett å trekke7. I sine signalnettverk roller i reptil økologi, hud lipid stikkord settes ofte i værharde områder, men på grunn av sin robuste kjemiske egenskaper, slike signaler kan beholde sin informasjon verdi over lang tid10,11 , 12. utpakkingen solubilizes lipider, bruker en upolart løsemiddel (f.eksHeksan benzen, toluen) over en timer lange suge, etterfulgt av fordampning løsemiddel, å forlate en målbar mengde lipid ekstrakt7 , 8. huden lipider er svært blandbar i upolare, og en rekke hydrokarboner kan hentes fra en tilsvarende variert rekke kilder.

Fraksjoneres er mer arbeidskrevende enn utvinning men tjener til å skille den totale lipid ekstrakt i bestemte fraksjoner via kolonnen Ture, å hjelpe med rensing og mulig identifikasjon av forbindelser der1, 6 , 7 , 8. den totale lipid ekstrakt er bundet til en substrat-basert kolonne, og deretter individuelle eluates ("fraksjoner") løsemiddel på spesifikke volumer sendes sekvensielt gjennom kolonnen elute sett av forbindelser fra lipid blandingen som har en felles polaritet6,7,8. I lipid Ture, brøker fremdriften i polaritet på noen standardisert sekvensen ved å øke relative polar løsemiddel (f.eks, diethyl Eter) i upolart løsemiddel (vanligvis uttrykt prosentvis: 0%, 2%, 4% Eter, osv. )6,7,8. Om metoder som tynne lag kromatografi (TLC) kan brukes til å skille lipider i en blanding og er enklere, kolonnen kromatografi er foretrukket fordi den bruker et lukket system, er lett å kontrollere, kan separat mer konsentrert blandinger, og er kompatibel med Multiplexing for effektivitet. I dette manuskriptet vi beskriver flere metoder for å trekke ut huden lipider av reptiler og deretter gi en standardprotokoll for å isolere annerledes apparater av forbindelser basert på polaritet, bruker tradisjonelle kolonnen kromatografi. I mange prosjekter som involverer isolering av kjemiske signaler, er det ultimate målet å endre effekt i mottakere utsatt for de stikkordene. Hele lipid ekstrakter eller bestemte fraksjoner kan deretter brukes i bioassay for å finne noen biologiske aktivitet brakt frem av forbindelser der1,2,6,7. I grunnleggende biologisk forskning, for eksempel kan bioassay bruke bestemte fraksjoner åpenbare for forskere at en renset kilde av feromoner er isolert, og deretter metoder for identifikasjon av målet forbindelser kan gjennomføres. Fra et ledelsesperspektiv dyreliv, identifikasjon kan ikke være målet, og i stedet aktive brøken kan brukes i feltet til å tiltrekke seg fra Art til feller eller hemme kompis sporing i finne habitat13,14.

Protocol

Alle prosedyrer med bruk av virveldyr ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruke komiteen av James Madison University.

1. utvinning

  1. Kaste huden utvinning
    1. Samle ca 30 cm2 av skur fra en enkelt reptil, fjerne hodet og cloacal deler som kan forurense prøvene. Bruk chloroprene hansker og rengjør skur av rusk.
    2. Tara balanse med en pose eller veie båt og veie skjulet (± 0,01 g).
      Merk: Masse presisjon er avhengig av presisjon av balanse. Skur hud masse er standardisering faktor for utdraget huden lipid masse (se nedenfor) og betydelig covaries med utdraget lipid masse.
    3. Separate skur i mindre (5 cm2) stykker og legge dem til i en sealable glassbeholder med Heksan-kompatibelt lokk (f.eks, en mason glasskrukke med metall lokk eller en lab kolbe med PTFE lokk). Dekanter nok Heksan i beholderen til dukke fullt ut skur huden bitene. Sel beholderen.
      FORSIKTIG: Heksan er brannfarlig, en åndedretts irriterende, og er forbundet med flere kort - og langsiktige helsefare. Prosedyrer som involverer Heksan utføres i en avtrekksvifte (laboratory) eller utendørs (felt) mens iført riktig personlig verneutstyr (PVU) (f.ekssplash briller chloroprene hansker, lange ermer, nær toed sko).
    4. Etiketten container(s) med blyant eller væske-resistent penn. La container(s) i avtrekksvifte i romtemperatur over natten eller opptil 24 h.
    5. Fjern skur brikker med rent metall tang eller tang. Riste brikkene til å beholde eventuelle gjenværende Heksan i beholderen. La huden bitene tørke på kjøkkenpapir; deretter kaste seg. Hvis flere utdrag utføres, rengjør tang/tang mellom hvert utvalg. For å rengjøre tang/tang, skyll i ~ 50 mL Heksan i et beaker.
    6. Hvis ekstrakt ikke skal brukes umiddelbart, Dekanter eller Pipetter ekstrakt i et hetteglass riktig volum, forsegle den med en PTFE-lined cap, Merk den og lagre den på 20 ° C.
      Advarsel: Fordi ekstrakt inneholder Heksan, lagre ampullene i en eksplosjonssikre fryseren.
  2. Død helt dyr utvinning
    1. Bestemme snute-vent lengde (SVL; i centimeter) og masse (i gram) av dyret. Hvis totale lipid eller feromon produksjon per enhet av huden overflate skal fastsettes, bruke en skredder målebånd for å få maksimal kroppen omkretsen (i cm).
    2. For utvinning, velger du en beholder som har en diameter som er 1/3 av dyret. Plasser carcass sikkert på bunnen av beholderen med hodet og tidligere imot kloakk på toppen. Dekanter tilstrekkelig Heksan i beholderen å maksimere neddykket arealet av kroppen.
      Merk: Hvis hodet eller tidligere imot kloakk bli neddykket i en tidsperiode i utvinning, notere.
    3. Sikre lokket etiketten beholderen og suge den i avtrekksvifte i romtemperatur over natten eller opptil 24 h.
    4. Når du fjerner carcass, bruke rent metall tang eller tang. Beholde den gjenværende Heksan på carcass i beholderen ved at det å dryppe fra kroppen, ikke fra hodet eller halen. Sel beholderen.
    5. Hvis ekstrakt ikke skal brukes umiddelbart, Dekanter ekstrakt eller Pipetter det i et hetteglass riktig volum, forsegle den med en PTFE-lined cap, Merk den og lagre den på 20 ° C.

2. lipid masse besluttsomhet

Merk: Den utpakkede lipid masse kan fastslås på to måter: med en hetteglass eller med en runde bunn kolbe, bruker en roterende fordamperen.

  1. Bestemme den utpakkede lipid masse via metoden glass hetteglass.
    1. Bruke preweighed ampuller med tilstrekkelig størrelse (7 mL, 22 mL, 50 mL, etc.). Ta hetten og etiketten i totale massen, eller alltid veie ampullen uten cap og etiketten (merking på etiketten også legge masse). Plass etiketten på halsen av flasken for å unngå vann-kontakten.
      Merk: Fordampning i hetteglass er effektiv hvis forskeren har tilgang til en gass manifold system der flere ampuller være fordampet samtidig under en N2 strøm.
    2. Overføre utdrag til ampullen, bruker en glass pipette med en gummi pære, eller for stort volum ekstrakter, en elektronisk pipette-kontroller med en engangs 10 mL glass pipette. Skyll beholderen med ~ 3 mL Heksan og overføre til ampullen også.
    3. Fordampe prøven under en svak N2 strøm. Vipp ampullen i en vinkel å aktivere en maksimal løsemiddel areal. Kondensat vil danne på utsiden av ampullen som Heksan fordamper.
      Merk: Ringene av lipid vil danne ampullen som Heksan fordamper, så regelmessig swirl ekstrakt.
    4. Fordampe prøve å tørrhet; deretter reweigh. Registrere den totale lipid avkastningen.
      Merk: For analyse på tvers av ulike grupper, standardisere lipid masse enten å kaste masse (lipid masse [i gram] delt skur masse [i gram] x 100 gir prosent lipid masse skjulet) eller dyrets SVL (lipid masse [i milligram] delt SVL [i centimeter]; gir lipid masse per enheten lengde). Større dyrene produsere mer lipid mange arter er sterkt dekket av hvit som legger betydelig skjevhet i dataene.
  2. Bestemme den utpakkede lipid masse via roterende fordamperen.
    1. For en raskere fordamping per enkelte eksempel, overføre utdrag til en preweighed runde bunn kolbe og fordampe det bruker en roterende fordamperen.
      1. Hvis partikler merkbar i utdrag, filtrere prøven ved å plassere en kjegle filter papir i halsen av flasken; deretter overføre utdrag til flasken og la den til tyngdekraften filter. Kast filter papir etter full ekstrakt overføres.
        Merk: Overføre eksempel volumet (opptil ~ 80% kolbe volum) før roterende fordampning. Noen bobler av ekstraktet inn i kondensatoren på roterende fordamperen forårsaker forurensning og krever kondensatoren renses. En kul felle kan plasseres mellom kolbe og halsen av kondensatoren hvis bobler eller "dunk" forekommer i mest prøvene.
    2. Slå på strømmen til roterende fordamperen og vann bad (50 ° C, lavere enn løsemiddel kokepunktet). Slå på kaldt vann strømmen til kondensatoren.
      Merk: Kondensatoren på roterende fordamperen er koblet til enten en sirkulerende chiller eller en kaldt vann stuss ventilering å renne. Infusjonshastigheten kan være treg hvis vannet er kaldere enn ambient, å kondensere løsemiddel damp lar kolbe og skriver inn kondensatoren.
    3. Slå på vakuum kilden (vann vakuum eller pumpe). Sikre det tomrommet trykket er tilstrekkelig til å holde flasken av kondensatoren. Åpne ventilen på slutten av kondensatoren kobler kolbe. Skyv kolbe på halsen av kondensatoren, lukke ventilen for å forsegle og sikre kolbe ikke kan koble fra kondensatoren når flasken er utgitt.
    4. Senk kolbe til ~ 50% er neddykket i badekaret. Start rotasjon av kolbe på medium hastighet. Hvis vakuum, hastigheten, kondensator flyt og badevann optimale, vil løsemiddel damp forlate kolbe kondensere på spolen og dryppe ned utvinning kolbe.
      1. Hvis prøven koker (f.eks, store bobler, rask gassing), umiddelbart redusere vakuum og/eller hastighet av roterende fordamperen. Hvis koking fortsetter, deaktivere kolbe rotasjon, slå av vakuum, heve kolbe fra bad og slipp vakuum segl. Gjenta trinn 2.2.3 og 2.2.4.
        Merk: Hvis ingen løsemiddel samles i utvinning flasken men ekstraktet er åpenbart fordamper, vakuum er sannsynligvis nonoptimal og må justeres.
    5. Fordampe prøven under vakuum før ~ 2 mL løsemiddel forblir i flasken (stort volum utdrag), eller, hvis det brukes en preweighed kolbe, fordampe til en perle av væske med en < 1 cm diameter vises i bunnen av flasken. Slå av rotasjon og vakuum; så, heve kolbe ut av badet.
    6. Hold kolbe halsen som vakuum segl slippes; deretter vri nakken for å skyve den fra kondensatoren. Hvis det brukes et stort volum kolbe, swirl kondensert ekstrakt i flasken å oppløse synlig lipider; deretter overføre løsning via Pipetter til en mindre volum, preweighed kolbe. Legge 3 mL Heksan skyll store kolbe, virvle det, Pipetter det til mindre kolbe og fordampe igjen (trinn 2.2.3 - 2.2.5).
    7. Perlen av væske i ekstraktet stivner som Heksan fordamper. Når tørr, la den når romtemperatur. Lipider vil danne en gjennomsiktig, hvit til gul voks i flasken (~ 5 min). Veie flasken for å få siste massen.
      Merk: Avhengig av lipider utdraget, de vil ha solid (f.eks, voks) eller semisolid (f.eks, råolje) egenskaper, særlig når fraksjonert lipider er fordampet (se nedenfor).
  3. Solubilize lipider i innspilte volumet av Heksan å gi ≥1 mg av lipid per 1 mL av Heksan. Den arbeider for videre til kromatografi er ~ 5 mL. Hvis overføring fra kolbe medisinglass, beholde 2 mL totalvolumet skylle kolbe etter overføre fleste av ekstraktet til ampullen.
  4. Etiketten hetteglass, forsegle dem med PTFE-lined caps og lagre dem på 20 ° C.

3. kolonnen kromatografi

Merk: for å skille ukjent forbindelser basert på polariteten til bestemte fraksjoner, utdraget lipid masse kan være lagt til forberedt flytende kromatografi kolonner og fraksjonert bruker standard elueringsrør.

  1. Utarbeidelse av kolonnen
    1. Avhengig av lipid masse i utdrag, bruke en stor- eller en små volumer glass kromatografi kolonne med en Teflon stopcock. Kolonnen er utstyrt med eller smeltet til et fast volum reservoar (500 mL for en stor kolonne, 250 mL for en liten kolonne). Heretter kan refererer denne protokollen bare til et stort volum kromatografi kolonne smeltet til et reservoar. Rengjør alle nye glass og deler som skal brukes i kromatografi som beskrevet i del 4; deretter skyll med Heksan eller en annen upolart løsemiddel.
    2. Kaste et stykke glassfiber ull (~ 14 cm i lengde [L] x 4 cm bredde [W]) gjentatte ganger til en firkant ~ 4 cm x 4 cm er dannet. Bruk en tre dowel stang lengre enn kolonnen for å plassere glassfiber nederst i kolonnen.
    3. Sikre kolonnen i hette til en standard ring stå med to klemmer (f.eks, sving eller modulære), over stopcock og én under halsen av reservoaret. Nivå kolonnen. Plasser kolonnen i en høyde å tillate tilstrekkelig arbeidsavstand for 500 mL kanne lett passer i kolonnen. Åpne stopcock.
    4. Hell vasket og tørket sand i kolonnen til en ~ 3 cm sand hviler over glassfiber. Plasser svart eller papir under kolonnen og trykke forsiktig. Hvis sand faller fra kolonnen med hvert trykk, er glassfiber barrieren utilstrekkelig. Gjenta trinn 3.1.2 - 3.1.4.
      Merk: Bruk en utbrettet binders tapet til slutten av en dowel stang å hente glassfiber fra bunnen.
    5. Plass 500 mL begeret kolonnen. Sakte Dekanter ~ 25 mL Heksan fra 100 mL kanne eller uteksaminert sylinder i kolonnen reservoaret våt sand. Lukk stopcock når det er ~0.5 cm Heksan over sand.
    6. Veie ut nøytral alumina. For hver liten kolonne, kan du bruke ~ 50 g; ~ 175 g for hver store kolonne. Hell alumina i en 1 L Erlenmeyer kolbe. Begrense 400 g aluminiumoksid per 1 L kolbe.
    7. Å aktivere alumina (aktivitet III), Pipetter deionisert vann et volum lik 6% av aluminiumoksid masse (dvs.for 100 g alumina, legge til 6 mL vann). Legge til vannet så drops gjennom alumina.
    8. Dekk flasken aluminiumsfolie eller en kork. Kraftig swirl (ikke riste) å spre jevnt tillegget. Fortsatt gjenstår ingen synlige klumper.
      Merk: Kolbe vil varme som vannet reagerer med alumina, som må forventes.
    9. Legge til Heksan inntil alumina er helt dekket, ~0.5 cm Heksan over alumina. Swirl flasken for å danne en slurry.
    10. Plass en ventilerte trakt i reservoaret og et 500 mL glass beaker under kolonnen. Åpne stopcock. Virvel av alumina og stadig hell den i kolonnen. Sikre alumina er settling jevnt i kolonnen og ingen store bobler eller sprekker er forming i kolonnen alumina. Forsiktig Tapp siden av kolonnen jevnt utifra alumina.
      Merk: Ekstra Heksan legges for ekstra heller, å opprettholde slurry. Heksan å samle i begeret kolonnen kan gjenbrukes hvis glass begeret var i starten.
    11. Kolonnen blir dannet når toppen av aluminiumoksid er stabil og ~ 4 cm under halsen av kolonnen på bunnen av reservoaret. Bruke en pipette skylle innsiden av reservoaret med Heksan for gjenværende alumina. Bruke en trakt, forsiktig legge til et ekstra lag av sand på alumina, ~ 1 cm under reservoaret.
      Merk: Heksan vil flyte fra kolonnen som stopcock er åpen. Ikke la kolonnen tørke ut. Hvis kolonnen tørker ut, må prosessen begynne igjen, fra og med trinn 3.1.2. Protokollen kan stoppes her hvis kolonnene er forberedt en dag før fraksjoneres. Fast en kork i toppen av reservoaret eller dekkes med folie. Fyll tanken med ~ 100 mL Heksan. Skru av stopcock.
  2. Fraksjoneres av lipid ekstraktet
    Merk: Uansett kolonnestørrelse fraksjoner av lipid ekstrakt kan samles individuelt og samlet basert på deres brøkdel polaritet eller forkastet fullstendig hvis de ikke inneholder noen kjente/identifisert målet forbindelser. Runder av Repliker elueringsrør (n = 3 bind) er gått gjennom kolonnen for å sikre tilstrekkelig tilsettes av lipider. Følg tabell 1 for store kolonner elueringsrør (med et utdrag masse > 30 mg) eller små-kolonne elueringsrør (med et utdrag masse < 30 mg). En skreddersydd elueringsrør protokoll for å isolere bare methyl ketoner er i tabell 2.
    1. Fjerne de gjenværende Heksan øverst i kolonnen bruker en stort volum pipette, eller tillate Heksan å dryppe ut i et rent beger. La ~ 3 mL Heksan over sanden på toppen av kolonnen.
      Merk: Den innsamlede Heksan er ren hvis det bare kontaktet rent glass og kan gjenvinnes i første fraksjonen.
    2. Overføre lipid pakke til kolonnen bruker en lang glass pipette. Sakte Pipetter ekstraktet for å unngå å forstyrre sand laget. Skyll den ekstra ampullen eller flasken ~ 5 mL Heksan og overføre den til kolonnen.
      Merk: Hvis ekstrakt ble lagret på 20 ° C, lipider vil bli utløst. Varm ampullen til mer utløse er synlig.
    3. Åpne stopcock og kan prøve å laste inn i kolonnen. Hvis ekstrakt har en stor masse (> 30 mg), en gulaktig band kan være synlige i alumina, rett under sanden på toppen. Samle er flyten gjennom i et avfall beaker som denne Heksan ikke lenger ren. Lukk stopcock når ~ 3 mL står på toppen av sanden.
      FORSIKTIG: Lipid i utdrag, bundet til alumina og kolonnen tørke ikke ut eller prøven vil gå tapt.
    4. Plass en preweighed og merket runde bunn kolbe (100 mL 250 mL og 500 mL) under kolonnen før helle den første fraksjon. Brøker forkastes kan samles i en felles glassbeholder.
    5. Forberede den første fraksjon (100% Heksan: 0% diethyl Eter [hittil, "Eter"]) i en uteksaminert sylinder. Hvis forbereder fraksjoner på forhånd, dekk med aluminiumsfolie eller stopper med kork.
      Merk: Fraksjoner fremgang i polaritet; sylinderen trenger derfor ikke å være skylles mellom fraksjoner.
    6. Legg første brøkene reservoaret av helle via ventilerte glass trakt rettet mot en side av reservoaret å unngå å forstyrre sand laget. Åpne stopcock for å starte tilsettes. Lukk stopcock når ~ 3 mL Heksan holder seg over sanden på toppen av kolonnen.
      Merk: Aldri slutte en elueringsrør innenfor en enkelt brøkdel ved å lukke stopcock før fleste av eluate har samlet. Mellom fraksjoner, ikke la stopcock stengt lenger enn ~ 1 h fordi forsinkelser kan forandre kvalitet og repeatability av tilsettes.
    7. Gjenta trinn 3.2.4 - 3.2.6 for brøker 2 og 3. Samle fraksjoner i riktig størrelse kolber at headspace for roterende fordampning, spesielt hvis fraksjoner er blir samlet.
    8. Forberede en fjerde fraksjon (2% Eter) og legge den til reservoaret. Plasserer neste kolbe kolonnen, åpne stopcock og samle den fjerde fraksjon. Forberede en femte brøkdel; Fortsett etter behov.
      Merk: Det er mulig å fordampe første fraction(s) via roterende fordampning mens samle påfølgende fraksjoner.
    9. For å forberede brøker i GC-MS analyser, kan du få en brøkdel masse bruker en 0,01 eller 0,1 mg presisjon balanse. Solubilize lipid fraksjoner å gi 1 mg av lipid per 1 mL av Heksan.

4. rengjøring

  1. La stopcock åpne og invertere kolonnen i avfall begeret. Alumina og sand vil gå tom for kolonnen. eventuelt riste for å påskynde prosessen. Bruke en dowel stang for å hente glassfiber ull hvis det er fast (unngå riper glass) eller blås med en N2 strøm.
  2. Dissemble og rengjør alle glass, bruke laboratorium-grade vaskemiddel i varmt vann i en plast badekar med glass pensel (med hår eller plastikk Bristol). Vask 3 x. Skyll godt med rikelig med varmt vann til glasset er ikke lenger sleip å landingen.
  3. Skyll glass og verktøy 3 x med deionisert vann. Plass dem i en reol til air-dry. For å akselerere tørking, legge små aceton (3 mL) til glass, virvel, og la den air-dry eller kjøre den under en N2 strøm.

Representative Results

Følgende utvinning, den totale lipid er den første typen data som kan skaffes via protokollen presenteres her. Men skal totalt lipid masse verdier aldri bli analysert uten noen forsøk på å standardisere innhentet verdiene. Flere tilnærminger kan brukes, men vi anbefaler enten standardisere utdraget lipid massen dyrets SVL (i cm) eller masse skur huden som er trukket ut. Tidligere resultatene i en lipid-masse-per-lengde verdi og sistnevnte vil være en del av kilde masse. Årsaken til standardisering er at større dyrene naturlig produsere mer hud lipider fordi de har et større total huden overflate område. Figur 1A eksemplifiserer denne tilknytningen, hvor utdraget huden lipid masse skalaer lineært med masse kaste huden utdraget. Når standardisert til totalt skur huden massen, denne lineær sammenheng er helt fjernet (figur 1B).

Etter fraksjoneres, samme standardisering tilnærming kan brukes med massene av personlige fraksjoner (figur 2). I denne eksempel datasett, hver fraksjon ikke bidrar like til den totale utdraget lipid masse: nøytral lipider (brøkdeler 1-3) er det dominerende settet av forbindelser av masse andel sammenlignet med hvert sett av flere polar lipider (brøkdeler 4-6, 7-9 og 10-12).

Figure 1
Figur 1: relasjoner mellom utdraget lipid masse og innspill materiale. (A) i reptiler, forholdet mellom totalt skjulet hud masse og utdraget huden lipid masse er positivt korrelert (P < 0,001). (B) når utdraget huden lipid masse er standardisert til totalt kaste masse (lipid masse delt kaste masse), denne relasjonen finnes ikke lenger (P = 0.46). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: standardisert brøkdel massene etter elueringsrør. Bruke kolonnen Ture, kan hud lipid ekstrakter være elut i fraksjoner, basert på Sammensatt polaritet. Brøken masse, deretter uttrykkes som en prosentandel av den totale lipid ekstrakt (brøkdel massen [i milligram] delt på totalt lipid ekstrakt masse [i milligram) til å fastslå forskjellene mellom brøker eller eksperimentelle grupper8. Bars forestiller midler. Topp feilen er SEM; bunnen feilen er 95% CI. Individuelle datapunkter gis for klarhet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: representant gass chromatographs av metyl ketoner fraksjoner. (A) med riktig tilsettes, metyl ketoner de rikeste forbindelsene i brøkdel 7 fra tabell 2 og sees couplets topper (tiden = 24-34 min). (B) brøkdel 6 fra tabell 2, men gir bare nontarget forbindelser. Denne samme resultat kan oppstå når polar løsemiddelet brukes i mobile fase er utløpt eller hvis kolonnen stoppes for lange perioder (> 1 h) mellom fraksjoner. Merk forskjellen i molekylær overflod mellom to spor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Brøk Heksan (mL) Diethyl Eter (mL)
1,2,3 100 [30] 0 [0]
4,5,6 98 [29,4] 2 [0,6]
7,8,9 96 [28.8] 4 [1.2]
knappene for 10,11,12 92 [27.6] 8 [2,4]
13,14,15 84 [25.2] 16 [4.8]

Tabell 1: Standard elueringsrør volumer huden lipid fraksjoneres. Løsemiddel volumer og prosenter gis for både stort volum (f.eks, 250 mL) og [små-volum] (f.eks, 100 mL) kromatografi kolonner ved hjelp av alumina (aktivitet III). Heksan er bærer løsemiddelet; diethyl Eter er mobile fase.

Brøk Heksan (mL) Diethyl Eter (mL) Notater
1, 2, 3 30 0 elute; samle ikke
4, 5 28.8 1.2 elute; samle ikke
6, 7, 8 28.8 1.2 samle individuelt. flertall av methyl ketoner massen vil bli i brøkdel 7; GC-MS kvalitetskontroller bør kjøres på 6 og 8 for å sikre riktig elueringsrør av ketoner

Tabell 2: endret elueringsrør ordning for riller slange methyl ketoner. Disse volumene er Bruk små volumer kromatografi kolonnen og med merket aluminiumoksid tilgjengelig. Eluted brøken positivt for metyl ketoner har en sterk bioactivity i feltet analyser med vill, frieri mannlige strømpebånd slanger1,7. For å bekrefte tilstedeværelse av metyl ketoner i målet fraksjoner, prøver kan bli fortynnet til 1 mg/mL og analyseres via GC-MS. gir Figur 3 representant chromatograms for både positive og negative resultater etter elueringsrør.

Discussion

Utvinning av huden lipider i reptiler kan brukes på levende eller døde huden, i tillegg til skur hud, som tilbyr allsidighet i eksperimentell bruk av denne teknikken. Videre kan utdrag av huden lipider gjøres i feltet for å aktivere et dynamisk program for metoden til et bredt spekter av biologer2,13. Utvinning av huden lipider er enkel; Derfor er det enkelt å skalere opp utdrag behov per eksperiment eller design, og utøvere trenger ikke har betydelig kompetanse til å utføre metodene. Bare Begrensende faktorer for skalering er tilgjengeligheten av fume hette plass, en overflod av rent, sealable glass, og løsemiddel lagringsplass.

Huden lipid ekstra fraksjoneres kan skreddersys til forskerens behov, og derfor har lignende fleksibilitet til lipid ekstraksjon. For eksempel kan nøytral lipider, elut og deretter forkastet, for å føre mål brøker som kan rense forbindelser av interesse eller forenkle bioassay. Fraksjoneres kan utføres på flere skalaer innen og over lipid prøver. For eksempel kan flere kolonner kjøres samtidig for å gjøre prosessen mer effektiv. Eller bare en del av en total lipid-pakke kan være fraksjonert på en liten kolonne, dermed spare reagenser og tid. Fraksjoneres er hovedsakelig begrenset av massen av den totale lipid ekstrakt og presisjonen for utstyret tilgjengelig for forskeren. For eksempel hvis forskeren har en balanse med en 10,0 mg presisjon, bestemmelse av brøken masse og, derfor, er nøyaktigheten av prøven forberedelse for GC-MS analyse betydelig, om ikke helt, forhindret. Det samme gjelder for glass. Hvis forskeren har en stort volum kolonne fraksjoneres, men har en liten totale lipid masse å skille elueringsrør eller separasjon av forbindelser vil fremgang, men vil kreve en betydelig sløsing av løsemidler, reagenser, tid og muligens målet forbindelser seg.

Det anbefales å utføre en kvalitetskontroll sjekk før fastsettelse elueringsrør ordningen, som vist i tabell 2og bestemme hva fraksjoner forkastes. For å bekrefte tilsettes av de ønskede lipider, en kolonne kan kjøre der hver fraksjon, 1-15, samles individuelt og deretter analysert bruke GC-MS. I Figur 3viser representant gasskromatograf spor at methyl ketoner fra strømpebånd slanger bare elute fra kolonnen i en bestemt del. Dette grepet kvalitetskontroll, kan en modifisert elueringsrør ordningen utvikles for artene å sikre maksimal avkastningen av forbindelser av interesse. Endringer i materialer, for eksempel leverandør eller mye av alumina eller en alder av diethyl eteren, vil absolutt føre forskjeller i elueringsrørets som skal kontrolleres ved å utføre en kvalitetskontroll test.

Teknikkene er begrenset av kjemisk natur signaler som kan oppnås. Primært tillate disse metodene bare forskere å isolere og skille langkjedede lipider fra huden av reptiler. Mange arter av reptiler bruke luftbårne og/eller proteinaceous signaler som kjemiske signaler metodene beskrevet er inkompatibel med isolere sa signaler. Videre, upolart løsemidler vil ikke trekke vandig signaler fra overflater av reptiler eller kilder stikkordet program (f.eksbur vann avføring, akvatiske substrat) som faktisk kan inneholde rikelig kjemiske signaler. Aktuelle metoder for å fange opp slike signaler er tilgjengelige for forskere (f.ekssolid-fase microextraction [SPME] for flyktige signaler og høy ytelse flytende kromatografi [HPLC] for vandige bunker), men liker metodene beskrevet ovenfor, er det en teknisk læringskurve.

Viktigst, bør nytten av den endelige kjemisk blandingen til forskeren lede metodene som brukes. For eksempel hvis en forsker ønsker å vite om en mannlig kontaktpunktene dyret kan skille mellom signaler produsert av mannlige g. du vil fra kvinnelige Art i en målrettet bioassay, er utvinning den eneste metoden for2,3. Hvis identifikasjon av dekket av hvit forbindelser er målet, men bør ekstrakt renses, slik at større tillit i tilordner IDer til bestemte molekyler eller grupper av molekyler via kjemisk analyse1, 6,9,11. Men for å dirigere kromatografi med lipid kilde, er betydelig masse starter ekstrakt nødvendig for at målbare brøkdel massene kan fås; ellers av prøver kan gjennomføres, men er ikke optimal14.

Fremtidig utvikling av denne protokollen inkludere tiltak for å bruke og tilpasse prosedyren for mer reptilian arter. Utvikles også ekstra noninvasive metoder for å trekke ut huden lipider.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Utvikling av disse metodene, spesielt skur huden lipid utvinning, oppstod under samarbeidende avtaler (14-7412-1061-CA 15-7412-1155-CA og 16-7412-1269-CA) mellom James Madison University (JMU) og det amerikanske Department of agricultures dyr og plante helse inspeksjon Service (APHIS). M.R.P. anerkjenner bidragene fra følgende studentene til utviklingen av metodene skur hud: S. Patel (Washington and Lee University [WLU]), J. Zachry (WLU), R. Flores (JMU), J. Noll (JMU) og S. Ashton (JMU).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Powder-free Chloroprene Gloves Microflex NEC-288 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves")
Ohaus Adventurer Precision Balance Ohaus AX622 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance")
Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid Ball NC9661590 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar")
Hexane, Mixtures of Isomers Sigma-Aldrich 650544 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane")
Hi/Lo Write-On Temperature Tape Electron Microscopy Sciences 5029927 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL Sigma-Aldrich Z414514 See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL Sigma-Aldrich Z414492 See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL")
Cork Flask Support Ring Sigma-Aldrich Z512419 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring")
Accu-jet Pro Pipette Controller Sigma-Aldrich Z671533 See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller")
Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL Pyrex 13-666-7E See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette")
Rotavapor R II Buchi 2422A0 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator")
Elliptical Bump Trap Chemglass Life Science 501215241 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap")
7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass Supelco 27151 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial")
7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner Supelco 27152 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap")
22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass Supelco 27173 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial")
22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner Supelco 27174-U See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap")
Excellence XS Analytical Balance Mettler-Toledo XS205DU See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance")
5 3/4" Disposable Glass Pipette Fisherbrand NC0418555 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette")
Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly Kimble-Chase 17810-19300 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column")
Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands Fischerbrand 11474207 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand")
3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp Troemner 2300203 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps")
Clamp Regular Holder Fischerbrand 05754Q See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder")
Sand,Washed and Dried Macron Fine Chemical MK-7062-212 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand")
Alumina, Neutral Sorbtech 15740-5 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US
Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL Pyrex 4980-1L See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL Sigma-Aldrich Z100684 See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask")
Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir Sigma-Aldrich Z560553 See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column")
Ethyl Ether Anhydrous Fisher Chemical E138500 See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether")
Alconox Detergnet Sigma-Aldrich 242985 See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox")
Acetone (Certified ACS) Fisher Chemical A18P-4 See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone")

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mason, R. T., et al. Sex pheromones in snakes. Science. 245 (4915), 290-292 (1989).
  2. Mason, R. T., Parker, M. R. Social behavior and pheromonal communication in reptiles. Journal of Comparative Physiology A. 196 (10), 729-749 (2010).
  3. Martín, J., López, P. Pheromones and chemical communication in lizards. Reproductive Biology and Phylogeny of Lizards and Tuatara. Rheubert, J. L., Siegel, D. S., Trauth, S. E. , CRC Press. Enfield, NJ. 43-77 (2014).
  4. Mayerl, C., Baeckens, S., Van Damme, R. Evolution and role of the follicular epidermal gland system in non-ophidian squamates. Amphibia-Reptilia. 36 (3), 185-206 (2015).
  5. Mathies, T., Levine, B., Engeman, R., Savidge, J. A. Pheromonal control of the invasive brown treesnake: potency of female sexual attractiveness pheromone varies with ovarian state. International Journal of Pest Management. 59 (2), 141-149 (2013).
  6. Parker, M. R., Patel, S. M., Zachry, J. E., Kimball, B. A. Feminization of male brown treesnake methyl ketone expression via steroid hormone manipulation. Journal of Chemical Ecology. 44 (2), 189-197 (2018).
  7. Parker, M. R., Mason, R. T. Pheromones in snakes: history, patterns, and future research directions. Reproductive Biology and Phylogeny of Snakes. Sever, D., Aldridge, R. , CRC Press. Enfield, NJ. 551-572 (2011).
  8. Parker, M. R., Mason, R. T. Low temperature dormancy affects the quantity and quality of the female sexual attractiveness pheromone in red-sided garter snakes. Journal of Chemical Ecology. 35 (10), 1234-1241 (2009).
  9. Parker, M. R., Mason, R. T. How to make a sexy snake: estrogen activation of female sex pheromone in male red-sided garter snakes. Journal of Experimental Biology. 215 (5), 723-730 (2012).
  10. Alberts, A. C. Constraints on the design of chemical communication systems in terrestrial vertebrates. American Naturalist. 139, S62-S89 (1992).
  11. Martín, J., Ortega, J., López, P. Interpopulational variations in sexual chemical signals of Iberian wall lizards may allow maximizing signal efficiency under different climatic conditions. PLoS ONE. 10 (6), e0131492 (2015).
  12. Baeckens, S., et al. Environmental conditions shape the chemical signal design of lizards. Functional Ecology. 32 (2), 566-580 (2018).
  13. Greene, M. J., Mason, R. T. Chemically mediated sexual behavior of the brown tree snake, Boiga irregularis. Ecoscience. 5 (3), 405-409 (1998).
  14. Mason, R. T. Integrated pest management: The case for pheromonal control of habu and brown tree snakes. Snakes and Man: Controlling Pest Species for Conservation and Human Health. Rodda, G., Chiszar, D., Sawai, Y., Tanaka, H. , Cornell University Press. Ithaca, NY. 196-205 (1998).
  15. Pruett, J. A., et al. Evolutionary interactions between visual and chemical signals: chemosignals compensate for the loss of a visual signal in male Sceloporus lizards. Journal of Chemical Ecology. 42 (11), 1164-1174 (2016).

Tags

Miljøfag problemet 144 Pheromone analytisk kjemi GC-MS Ture reptile slange utvinning kjemiske økologi alumina
Kjemisk isolasjon, kvantifisering og separasjon av huden lipider fra reptiler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baedke, P. E., Rucker, H. R., Mason, … More

Baedke, P. E., Rucker, H. R., Mason, R. T., Parker, M. R. Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles. J. Vis. Exp. (144), e59018, doi:10.3791/59018 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter