Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Kemiske Isolation, kvantificering og adskillelse af huden lipider fra krybdyr

doi: 10.3791/59018 Published: February 7, 2019

Summary

I krybdyr er hud lipider fra artsfæller afgørende for seksuel signalering, med potentielle anvendelse i forvaltning af invasive arter. Her beskriver vi protokoller til at udtrække hud lipider fra stald hud eller hele dyr, bestemme og analysere den samlede lipid masse og adskille lipider ved hjælp af fraktionering via kolonne kromatografi.

Abstract

Krybdyr signal til artsfæller ved hjælp af lipider i deres hud, primært til at muliggøre mate tracking og vurdering. Isolationen af disse lipider har nytte i forskning fokuseret på evolutionære mønstre og mekanismer for kemisk kommunikation, ud over oplysninger om vandtætning betydningen af lipider i udviklingen af jordiske liv. I en anvendt metode har sådanne hud-baserede stikord potentielle anvendelse for dyreliv ledere beskæftiger sig med invasive arter. De vigtigste skridt for kvantificering krybdyr hud lipider i den protokol, der præsenteres her omfatter udvinding, samlede lipid bestemmelse og fraktionering via kolonne kromatografi, sidstnævnte processen resulterer i renset eluater af forbindelser, som kan derefter enten blive analyseret for at tildele sammensatte identifikationer (fxgaskromatografi-massespektrometri [GC-MS]) og/eller bruges direkte i mere raffineret bioassays. Huden lipider kan udvindes fra levende hud, kaste huden, eller døde hele dyr, ved hjælp af upolære organiske opløsningsmidler (f.eks., hexan, benzen, toluen). Udvinding solubilizes af lipider, og derefter, opløsningsmidlet kan være fordampet for at give en målbar kun lipid-ekstrakt. Fraktionering indebærer adskillelse af den samlede lipid ekstrakt i specifikke eluater via traditionelle kolonne kromatografi. Den samlede lipid ekstrakt først er bundet til et substrat-baseret kolonne (fx, aluminiumoxid) og så individuelle eluater ("fraktioner") af opløsningsmiddel ved bestemte mængder overført sekventielt gennem kolonnen at eluere sæt af forbindelser fra lipid blanding baseret på fælles polaritet. Brøker fremskridt i polaritet på en standardiseret sekvens ved at øge den relative mængde af polært opløsningsmiddel (fx, diethylether) i upolære opløsningsmidler. I dette manuskript, vi beskriver flere metoder til at udtrække hud lipider krybdyr og derefter give en standardprotokol til isolering af forskellige sæt af forbindelser baseret på polaritet, ved hjælp af traditionelle kolonne kromatografi. Hele lipid ekstrakter eller særlige fraktioner kan, derefter bruges i bioassays til at afgøre enhver biologisk aktivitet fremkaldes ved forbindelser deri.

Introduction

Krybdyr producere lipider i epidermis, enten direkte fra hudens celler eller diskrete kirtler, der er brugt i social kommunikation, såsom mate vurdering og sporing, territorialprincippet, og intra- og artskrydsede anerkendelse1,2 ,3,4. Isolationen af disse hud lipider har nytte i forskning fokuseret på evolutionære mønstre og mekanismer for kemisk kommunikation, ud over oplysninger om vandtætning betydningen af lipider i udviklingen af jordiske liv2,3 ,4. Yderligere, mange krybdyr, især squamates (firben, slanger), invasive arter af bekymring i følsomme økosystemer, og udviklingen af feromon-baserede lokker at forbedre diffusering og fjernelse er igangværende5,6. Krybdyr hud uigennemtrængelighed letter udvinding af lipider stede at opnå relativt rene udtræk af en potentielt stærk kilde til kemiske signaler. Princippet om skridt for kvantificering krybdyr hud lipider i den beskrevne protokol omfatter udvinding, samlede lipid bestemmelse og fraktionering via kolonne kromatografi1,6,7. Metoder har været anvendt rutinemæssigt som de udbytte bioaktive isolater, der forklarer meget om mate valg og udvælgelse, især i slanger2.

Huden lipider kan udvindes fra enten levende hud, stald hud, eller døde hele krybdyr, ved hjælp af upolære eller polære organiske opløsningsmidler1,7,8,9. Det skal bemærkes, at museet prøver opbevares i opløsningsmidler som ethanol er ikke optimale til udvinding af huden lipider, og kun friske eller frisk frosne slagtekroppe bør betragtes som mulige kilder til udvinding. Huden lipider er inert, hvilket gør dem stabile på overfladen af huden og nemt at udtrække7. I deres signaling roller i krybdyr økologi, hud lipid stikord er ofte deponeret i barske miljøer, men på grund af deres robuste kemiske egenskaber, disse stikord kan bevare deres oplysninger værdi over lang tid10,11 , 12. udpakningen solubilizes lipider, ved hjælp af en upolære opløsningsmidler (f.eks., hexan, benzen, toluen) over en timer lange blød, efterfulgt af fordampning af opløsningsmidlet, til at forlade en målbar massen af lipid ekstrakt7 , 8. hud lipider er meget blandbart i upolære opløsningsmidler, og en lang række kulbrinter kan udvindes fra en tilsvarende bred vifte af kilder.

Fraktionering er mere besværligt end udvinding men tjener til at adskille den samlede lipid ekstrakt i specifikke fraktioner via kolonne kromatografi, at støtte i rensning og eventuel identificering af forbindelser deri1, 6 , 7 , 8. den samlede lipid ekstrakt er bundet til et substrat-baseret kolonne, og derefter, individuelle eluater ("fraktioner") af opløsningsmiddel ved bestemte mængder er bestået sekventielt gennem kolonnen at eluere sæt af forbindelser fra lipid blanding, der har en fælles polaritet6,7,8. I lipid kromatografi, brøker fremskridt i polaritet på nogle standardiserede sekvens ved at øge den relative mængde af polært opløsningsmiddel (fx, diethylether) i upolære opløsningsmidler (typisk udtrykt i procent: 0%, 2%, 4% Æter, osv. )6,7,8. Selvom metoder som tyndtlagskromatografi (TLC) kan bruges til at adskille lipider i en blanding og er enklere, kolonne kromatografi er foretrukket, fordi det bruger et lukket system, er nem at styre, kan særskilt mere koncentreret blandinger, og er kompatibel med multiplexing for effektivitet. I dette manuskript, vi beskriver flere metoder til at udtrække hud lipider krybdyr og derefter give en standardprotokol til isolering af forskellige sæt af forbindelser baseret på polaritet, ved hjælp af traditionelle kolonne kromatografi. I mange forskningsprojekter der involverer isolering af kemiske signaler, er det ultimative mål at gennemføre ændringer i modtagere udsat for disse stikord. Hele lipid ekstrakter eller særlige fraktioner kan, derefter bruges i bioassays til at afgøre enhver biologisk aktivitet fremkaldes ved forbindelser deri1,2,6,7. I biologisk grundforskning, f.eks kan bioassays ved hjælp af særlige fraktioner afsløre at forskerne at en renset kilde af feromoner er blevet isoleret, og derefter, metoder til identifikation af target forbindelser kan forfølges. Fra en management perspektiv, identifikation kan ikke være målet, og i stedet, den aktive fraktion kan bruges i feltet til at tiltrække artsfæller fælder eller hæmme mate sporing i nonnative habitat13,14.

Protocol

Alle procedurer, der involverer brugen af hvirveldyr blev godkendt af institutionelle Animal Care og bruge Udvalget af James Madison University.

1. udvinding

  1. Stald hud udvinding
    1. Samle ca 30 cm2 skur fra et enkelt krybdyr, fjernelse af hoved og cloacal sektioner, der kan forurene prøverne. Chloroprene handsker og ren skur af vragrester.
    2. Tara-balance med en pose eller vejer båden og vejer skur (± 0,01 g).
      Bemærk: Den masse præcision bestemmes af præcision af balance. Stald hud masse er standardisering faktoren for udpakkede hud lipid masse (se nedenfor) og betydeligt covaries med udpakkede lipid masse.
    3. Adskille skuret i mindre stykker, (5 cm2) og tilføje dem til en genlukkelig glasbeholder med hexan-kompatible låg (fx, et glas mason krukke med en metal låg eller en lab kolbe med PTFE låg). Dekanteres nok hexan i beholder til fuldt dykke skur hud stykker. Forsegle beholderen.
      Forsigtig: Hexan er brandfarligt, en respiratoriske irriterende, og er forbundet med flere kort - og langsigtede sundhedsmæssige farer. Procedurer, der involverer hexan er udført i et stinkskab (laboratorium) eller udendørs (felt) mens iført passende personlige værnemidler (PPE) (fx, splash beskyttelsesbriller, chloropren handsker, lange ærmer, Luk-tåede sko).
    4. Label emballage med en blyant eller solvens-resistente pen. Forlade emballage i stinkskab ved rumtemperatur natten eller op til 24 h.
    5. Fjern stald stykker ved hjælp af ren metal pincet eller tænger. Ryst stykker for at bevare eventuelle resterende hexan i beholderen. Give skin stykker til tørre på papirservietter; derefter, kassere dem. Hvis flere ekstraktioner udføres, skal du rense Tang/pincet mellem hver prøve. For at rengøre Tang/pincet, skylle dem i ~ 50 mL af hexan i et bægerglas.
    6. Hvis ekstraktet er ikke skal bruges straks, dekanteres eller afpipetteres ekstrakt i et hætteglas af passende volumen, forsegle det med en PTFE-foret hætte, mærke det, og opbevar den ved-20 ° C.
      Forsigtig: Fordi ekstraktet indeholder hexan, gemme hætteglassene i en eksplosion-bevis fryser.
  2. Døde hele dyr udvinding
    1. Notere den snude-vent (SVL; i centimeter), og massen af dyr (i gram). Hvis den samlede lipid eller pheromone produktion pr. enhed af huden overflade område skal bestemmes, skal du bruge en skrædder målebånd til at opnå maksimal krop omkredsen (i centimeter).
    2. Til udvinding, vælge en beholder, der har en diameter, der er 1/3 af længden af dyret. Placer slagtekroppen sikkert i bunden af beholderen med hoved og kloak på toppen. Dekanteres tilstrækkelig hexan i beholder til at maksimere den undersøiske areal af kroppen.
      Bemærk: Hvis hoved eller kloak blive nedsænket i nogen tid i udvinding, tage til efterretning.
    3. Sikre låget, etiketten på beholderen og suge det i et stinkskab ved rumtemperatur natten eller op til 24 h.
    4. Når du fjerner slagtekroppen, bruge ren metal pincet eller tænger. Bevare de resterende hexan på slagtekroppen i beholderen ved at tillade det at dryppe fra kroppen, ikke fra hoved eller hale. Forsegle beholderen.
    5. Hvis ekstraktet er ikke skal bruges straks, dekanteres ekstrakten eller afpipetteres i et hætteglas af passende volumen, forsegle det med en PTFE-foret hætte, mærke det, og opbevar den ved-20 ° C.

2. lipid masse bestemmelse

Bemærk: Den udpakkede lipid massen kan beregnes på to måder: med et hætteglas eller en runde-bunden kolbe, ved hjælp af en rotationsfordamper.

  1. Bestemme den udpakkede lipid masse via metoden glas hætteglas.
    1. Bruge en preweighed hætteglas af tilstrækkelig størrelse (7 mL, 22 mL, 50 mL, osv.). Omfatter fælles landbrugspolitik og etiketten i den samlede masse, eller altid vejer hætteglas uden hætte og etiket (markeringer på etiketten også tilføje masse). Placer etiketten på halsen af kolben at undgå vand kontakt.
      Bemærk: Fordampning i hætteglas er effektiv, hvis forskeren har adgang til en manifold gassystem hvor flere hætteglas kan være fordampet samtidig under en N2 stream.
    2. Overføre ekstrakt til hætteglas, ved hjælp af et glas pipette med en gummi pære eller for store mængder ekstrakter, en elektronisk pipette controller med en engangs 10 mL glas pipette. Skyl beholderen med ~ 3 mL af hexan og overførsel til hætteglasset.
    3. Fordampe prøve under en blid N2 stream. Vippe hætteglas i en vinkel til at aktivere en maksimal opløsningsmiddel areal. Kondensat vil danne på ydersiden af hætteglasset som hexan fordamper.
      Bemærk: Ringe af lipid vil danne i hætteglasset, som hexan fordamper, så med jævne mellemrum swirl ekstraktet.
    4. Fordampe prøven til tørhed; derefter tilbagevejes. Optage det samlede lipid udbytte.
      Bemærk: For analyse på tværs af forskellige grupper, standardisere lipid masse enten at kaste masse (lipid vægt [i gram] divideret med stald masse [i gram] x 100 udbytter procent lipid massen af skuret) eller til dyrets SVL (lipid masse [i milligram] divideret med SVL [i centimeter]; udbytter lipid massen pr. enhed længde). Større dyr producerer flere lipid, og mange arter er stærkt seksuelt dimorfe, som pålægger betydelige skævhed i data.
  2. Bestemme den udpakkede lipid masse via en rotationsfordamper.
    1. For en hurtigere fordampning pr. individuel prøve, overføre ekstrakt til en preweighed runde-bunden kolbe og fordampe det ved hjælp af en rotationsfordamper.
      1. Hvis partikler er mærkbar i uddrag, filtrere prøven ved at placere et filtrerpapir kegle i halsen af kolben; derefter, overføre ekstraktet kolben og lad det tyngdekraften filter. Bortskaf filtrerpapir efter den fulde ekstrakt er overført.
        Bemærk: Overføre sample volumen (op til ~ 80% kolbe volumen) før roterende fordampning. Enhver boblende ekstrakt til kondensator af rotationsinddamperen forårsager forurening og kræver kondensatoren til at blive renset. En bule fælde kan placeres mellem kolben og halsen af kondensatoren, hvis bobler eller "bumpe" forekommer i de fleste prøver.
    2. Tænder for strømmen til roterende fordamper og vand bad (50 ° C, lavere end den opløsningsmiddel kogepunkt). Slå koldt vand strømmen til svaleren.
      Bemærk: Kondensator af rotationsinddamperen er forbundet med enten en cirkulerende chiller eller en koldtvands spidsende udluftning til afløbet. Flowet kan være langsom, hvis vandet er køligere end ambient, at kondensere det opløsningsmiddel vapor forlader kolben og ind i kondensatoren.
    3. Tænde vakuumkilde (vand vakuum eller pumpe). Sikre det vakuum pres er tilstrækkelig til at holde kolben til kondensatoren hals. Åbn udluftning i slutningen af kondensatoren før forbinder kolben. Skub i kolben på halsen af kondensatoren, lukke udluftning for at forsegle og sikre kolben ikke kan fjerne forbindelsen kondensatoren, når kolben er frigivet.
    4. Lavere kolben, indtil ~ 50% er neddykket i badet. Start rotation af kolben på medium hastighed. Hvis vakuum, hastighed, kondensatorens flow og bad temperatur er optimal, vil den opløsningsmidlets dampe forlader kolben kondensere på spolen og dryppe i recovery kolben.
      1. Hvis prøven koges (fx, store bobler, hurtig gasning), straks reducere vakuum og/eller hastighed af en rotationsfordamper. Hvis den kogende fortsætter, slukke kolbe rotation, slå vakuum, hæve kolben fra badet og frigive det vakuum segl. Gentag trin 2.2.3 og 2.2.4.
        Bemærk: Hvis nogen opløsningsmiddel indsamling i recovery kolben men ekstraktet naturligvis fordamper, vakuum er sandsynligvis nonoptimal og skal justeres.
    5. Fordampe prøve under vakuum indtil ~ 2 mL af opløsningsmidlet forbliver i kolben (stort volumen uddrag), eller hvis der bruges en preweighed kolben fordampe indtil en perle af væske med en < 1 cm i diameter er synlig i bunden af kolben. Sluk for rotation og vakuum; derefter, hæve kolben ud af badet.
    6. Hold kolbens hals som vakuum segl er udgivet; derefter, dreje halsen for at skubbe det fra kondensatoren. Hvis der bruges en stor mængde kolbe slyng den kondenserede ekstrakt i kolben til at opløse synlige lipider; derefter, overføre løsning via pipette til en mindre volumen, preweighed kolbe. Tilføj 3 mL af hexan at skylle den store kolbe, slyng det, afpipetteres det mindre kolben og fordampe igen (trin 2.2.3 - 2.2.5).
    7. Perlen af væske i uddrag vil størkne som hexan fordamper. Når tør, lad det nå stuetemperatur. Lipider vil danne en gennemsigtig, hvid til gul voks i kolben (~ 5 min). Veje kolben for at opnå den endelige masse.
      Bemærk: Afhængigt af lipider udvundet art vil de enten fast (fx, voks) eller halvfaste (fx, råolie) egenskaber, især når fraktionerede lipider er fordampet (se nedenfor).
  3. Solubilize lipider i den registrerede volumen hexan at give ≥ 1 mg af lipid per 1 mL af hexan. Den arbejdende volumen for udvikler sig til kromatografi er ~ 5 mL. Hvis overførsel fra kolben til hætteglasset, beholde 2 mL af den samlede mængde at skylle kolben efter overføre fleste af ekstraktet til hætteglasset.
  4. Etiket til hætteglas, forsegle dem med PTFE-foret hætte og gemme dem på-20 ° C.

3. kolonne kromatografi

Bemærk: for at adskille ukendte forbindelser baseret på polaritet i specifikke fraktioner, uddraget lipid masse kan være tilføjet til rede væskekromatografi kolonner og fraktioneret ved hjælp af standard eluering.

  1. Forberedelse af kolonnen
    1. Afhængigt af lipid massen i uddrag, skal du bruge enten en store- eller en små-volumen kromatografi glaskolonne med en Teflon stophane. Kolonnen er enten udstyret med eller smeltet til en fast volumen reservoir (500 mL til en stor kolonne, 250 mL til en lille kolonne). Fremover, refererer denne protokol kun til en stor volumen kromatografi kolonne sammenvoksede til et reservoir. Grundigt rene enhver ny glasvarer og dele anvendes i kromatografi som beskrevet i afsnit 4; derefter, skyl dem med hexan eller en anden upolære opløsningsmidler.
    2. Fold et stykke i glasfiber uld (~ 14 cm i længden [L] x 4 cm i bredde [W]) gentagne gange indtil et kvadrat af ~ 4 cm x 4 cm er dannet. Brug et træ dyvel stang længere end kolonnen til at placere glasfiber på bunden af kolonnen.
    3. Sikre kolonnen i en hætte til en standard ring stå med to klemmer (fx, swivel eller modular), en ovenfor stophane og en under halsen af reservoiret. Niveau i kolonnen. Placer kolonnen i en højde til at give tilstrækkelig arbejde afstand for 500 mL bægerglas til at passe nemt under kolonnen. Åbne hanen.
    4. Hæld vaskes og tørres sand i kolonnen, indtil en ~ 3 cm sand hviler over glasfiber. Placer sort eller mørk papir under kolonnen og tryk det forsigtigt. Hvis sand falder fra kolonnen med hver tap, er glasfiber barriere utilstrækkelig. Gentag trin 3.1.2 - 3.1.4.
      Bemærk: Brug en udfoldet papirklips tapede til slutningen af en dowel stang til at hente glasfiber fra bunden.
    5. Bægerglasset 500 mL under kolonnen. Langsomt dekanteres ~ 25 mL af hexan fra et 100 mL bægerglas eller måleglas i kolonne reservoiret til våde sand. Luk hanen, når der er ~0.5 cm hexan over sandet.
    6. Der afvejes neutral aluminiumoxid. For hvert lille kolonne, brug ~ 50 g; ~ 175 g for hver stor kolonne. Hæld alumina i en Erlenmeyerkolbe, 1 L. Begrænse 400 g aluminiumoxid per 1 L målekolbe.
    7. At aktivere aluminiumoxid (aktivitet III), afpipetteres deioniseret vand med et volumen svarende til 6% af aluminiumoxid masse (dvs.for 100 g aluminiumoxid, tilføje 6 mL af vand). Tilsæt vand som dråber i hele aluminiumoxid.
    8. Dække kolben med aluminiumsfolie eller en cork. Energisk swirl (Ryst ikke) at jævnt sprede anklagen. Fortsætte indtil ingen synlige klumper tilbage.
      Bemærk: Kolben vil varme som vandet reagerer med aluminiumoxid, som må forventes.
    9. Tilføje hexan, indtil aluminiumoxid er helt dækket med ~0.5 cm hexan ovenfor aluminiumoxid. Swirl kolben til at danne en gylle.
    10. Placer en ventileret tragt i reservoir af kolonnen og en 500 mL glas bægerglas under kolonnen. Åbne hanen. Slyng aluminiumoxid og støt hæld det i kolonnen. Sikre aluminiumoxid er afregning jævnt i kolonnen og ingen store bobler eller revner danner i kolonnen aluminiumoxid. Tryk forsigtigt på side af kolonnen jævnt nøjes aluminiumoxid.
      Bemærk: Yderligere hexan skal føjes til yderligere hælder til at opretholde gyllen. Hexan indsamling i bægerglasset under kolonnen kan genbruges, hvis glas bægerglas var rent fra starten.
    11. Kolonnen dannes når toppen af aluminiumoxid er stabil og ~ 4 cm under halsen af kolonnen i bunden af reservoiret. Bruge en pipette til at skylle indersiden af reservoir med hexan for resterende aluminiumoxid. Hjælp af en tragt, forsigtigt tilføje et andet lag af sand på toppen af aluminiumoxid, ~ 1 cm under reservoiret.
      Bemærk: Hexan vil flyde fra kolonnen, som hanen forbliver åben. Lad ikke kolonnen tørre ud. Hvis kolonnen udtørrer, skal processen begynde igen, starter ved trin 3.1.2. Protokollen kan blive stoppet her, hvis kolonnerne, der er udarbejdet en dag før fraktionering. Fast placere en prop i toppen af reservoiret eller dække det stramt med folie. Fyld beholderen med ~ 100 mL hexan. Spænde hanen.
  2. Fraktionering af lipid ekstrakt
    Bemærk: Uanset kolonne størrelse, brøkdele af lipid ekstrakt kan indsamles individuelt og samlet baseret på deres brøkdel polaritet eller kasserede helt, hvis de ikke indeholder nogen kendte/identificeret mål forbindelser. Runder af replikat eluering (n = 3 bind) er passeret gennem kolonnen for at sikre den tilstrækkelige eluering af lipider. Følg tabel 1 for store-kolonne eluering (med et uddrag masse > 30 mg) eller små-kolonne eluering (med et uddrag masse < 30 mg). En skræddersyet eluering protokol til isolering kun methyl Ketoner er i tabel 2.
    1. Enten fjerne de resterende hexan øverst i kolonnen, ved hjælp af et stort volumen pipette, eller tillade hexan at dryppe ud i en ren bægerglas. Forlade ~ 3 mL af hexan ovenfor sandet i toppen af kolonnen.
      Bemærk: Den indsamlede hexan er ren, hvis det kun kontaktet rene glasvarer og kan genanvendes i den første brøkdel.
    2. Overføre lipid ekstrakt til kolonnen ved hjælp af en lang glas pipette. Langsomt afpipetteres ekstrakt for at undgå at forstyrre den sand lag. Skyl ekstrakt hætteglas eller kolbe med ~ 5 mL af hexan og overføre det til kolonnen.
      Bemærk: Hvis ekstraktet blev opbevares ved-20 ° C, vil lipider blive fældet. Varm hætteglasset, indtil ikke mere bundfaldet er synlige.
    3. Åbne hanen og tillade prøve at indlæse i kolonnen. Hvis ekstraktet har en stor masse (> 30 mg), en gullig band kan ses i alumina, lige under sandet i toppen. Indsamle gennemstrømningen i en affald bægerglas, som denne hexan er ikke længere ren. Luk hanen, når ~ 3 mL er stadig på toppen af sandet.
      Forsigtig: Lipid i uddrag, nu er bundet til aluminiumoxid og kolonne, ikke kan tørre ud eller prøven vil gå tabt.
    4. Læg en preweighed og mærket runde-bunden kolbe (100 mL, 250 mL eller 500 mL) under kolonnen før hælde den første brøkdel. Fraktioner til at blive kasseret kan samles i en fælles glasbeholder.
    5. Forberede den første brøkdel (100% hexan: 0% diethylether [forhen, "Æter"]) i et måleglas. Hvis forbereder fraktioner i forvejen, dække med folie eller prop med kork.
      Bemærk: Fraktioner fremskridt i polaritet; cylinderen skal derfor ikke skylles mellem fraktioner.
    6. Tilføj den første brøk til reservoir af hælde via et udluftet glas tragt dirigeres til en side af reservoiret at undgå at forstyrre den sand lag. Åbne hanen for at starte eluering. Luk hanen, når ~ 3 mL af hexan ligger fortsat over sandet i toppen af kolonnen.
      Bemærk: Aldrig stoppe en eluering inden for en individuel brøkdel ved at lukke hanen før størstedelen af eluatet er blevet indsamlet. Mellem fraktioner, lad ikke hanen lukket for længere end ~ 1 h, fordi forsinkelser kan ændre kvaliteten og repeterbarhed af eluering.
    7. Gentag trin 3.2.4 - 3.2.6 for brøker 2 og 3. Indsamle fraktioner i passende størrelse kolber, der tillader headspace for roterende fordampning, især hvis fraktioner der sammenlægges.
    8. Forberede en fjerde brøkdel (2% æter) og tilføje det til reservoiret. Kolben næste under kolonnen, åbne hanen og indsamle den fjerde brøkdel. Forberede en femte brøkdel; derefter fortsætte efter behov.
      Bemærk: Det er muligt at fordampe den første fraction(s) via roterende fordampning mens indsamling successive fraktioner.
    9. For at forberede brøker anvendes i GC-MS analyser, få en brøkdel masse ved hjælp af en 0,01 eller 0,1 mg præcision balance. Solubilize lipid fraktioner til at give 1 mg af lipid per 1 mL af hexan.

4. rengøring

  1. Lade hanen åben og vend kolonnen i affald bægerglasset. Aluminiumoxid og sand vil løbe tør for kolonnen. Alternativt, ryste for at fremskynde processen. Bruger en dowel stang til at hente glasfiber uld, hvis det er fast (undgå at ridse glas) eller blæse den ud med en N2 stream.
  2. Hykle og rense alle glasvarer, bruge laboratorium-grade vaskemiddel i varmt vand i en plastik badekar med en glasvarer børste (med hår eller plast børster). Vask 3 x. Skyl godt med masser af varmt vand, indtil glasset er ikke længere glat at røre ved.
  3. Skyl glasvarer og værktøjer 3 x med deioniseret vand. Læg dem på en rist til at lufttørre. For at fremskynde tørringen, tilføje en lille mængde af acetone (3 mL) til glasvarer, swirl, og lad det lufttørre eller køre det under en N2 stream.

Representative Results

Følgende udvinding, den samlede lipid masse er den første type af data, der kan erhverves gennem protokollen præsenteres her. Samlede lipid Masseværdier bør dog aldrig analyseres uden nogle forsøg på at standardisere de opnåede værdier. Flere metoder kan bruges, men vi anbefaler enten standardisere den udpakkede lipid masse til dyrets SVL (i centimeter) eller til massen af skur huden, der blev udvundet. De tidligere resultater i en lipid masse pr. længde værdi og sidstnævnte bliver en del af kilde masse. Standardiseringen skyldes at større dyr naturligt producerer flere hud lipider, fordi de har en større samlede hud overflade område. Figur 1A eksemplificerer denne associering, hvor uddraget hud lipid mass skalaer lineært med massen af kaste huden udvundet. Når standardiseret til den samlede skur hud masse, denne lineært forhold er helt fjernet (figur 1B).

Efter fraktionering, den samme standardisering tilgang kan bruges med masser af de enkelte fraktioner (figur 2). I denne eksempeldatasættet hver fraktion ikke bidrager ligeligt til den samlede udtrukne lipid masse: neutral lipider (fraktioner 1-3) er den dominerende sæt forbindelser af masse andel i forhold til hvert sæt af flere polar lipider (fraktioner 4-6, 7-9 og 10-12).

Figure 1
Figur 1: relationer mellem udvundet lipid masse og input materiale. (A) i krybdyr, forholdet mellem den samlede skur hud mass og udpakkede hud lipid massen er positivt korreleret (P < 0,001). (B) når den udpakkede hud lipid massen er standardiseret til den samlede kaste masse (lipid masse divideret med skuret masse), dette forhold er ikke længere til stede (P = 0,46). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: standardiseret brøkdel masserne efter eluering. Brug kolonne kromatografi, kan hud lipid ekstrakter være elueret i fraktioner, baseret på sammensatte polaritet. Brøkdel masse er, så, udtrykt som en andel af den samlede lipid ekstrakt (brøkdel masse [i milligram] divideret med samlede lipid ekstrakt masse [i milligram) til at bestemme forskellene mellem fraktioner eller eksperimentelle grupper8. Barer repræsenterer midler. Den øverste fejl er SEM; den nederste fejl er 95% CI. Individuelle datapunkter er fastsat for klarhed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: repræsentant gas gaskromatografer af methyl keton fraktioner. (A) med den korrekte eluering, methyl Ketoner er de mest rigelige forbindelser i brøkdel 7 fra tabel 2 og kan ses som couplets toppe (retentionstiden = 24-34 min). (B) brøkdel 6 fra tabel 2, giver imidlertid kun nontarget forbindelser. Dette samme resultat kan forekomme når polar opløsningsmidlet anvendes i den mobile fase er udløbet, eller hvis kolonnen er stoppet i lange perioder (> 1 h) mellem fraktioner. Bemærk forskellen i molekylær overflod mellem de to spor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Brøk Hexan (mL) Diethylether (mL)
1,2,3 100 [30] 0 [0]
4,5,6 98 [29,4] 2 [0,6]
7,8,9 96 [28,8] 4 [1,2]
10,11,12 92 [27,6] 8 [2.4]
13,14,15 84 [25,2] 16 [4.8]

Tabel 1: Standard eluering diskenheder til huden lipid fraktionering. Opløsningsmiddel mængder og procentsatser er givet til både store-volumen (fx, 250 mL) og [små-volumen] (fx, 100 mL) kromatografi kolonner ved hjælp af aluminiumoxid (aktivitet III). Hexan er carrier solvens; diethylether er den mobile fase.

Brøk Hexan (mL) Diethylether (mL) Noter
1, 2, 3 30 0 eluere. ikke indsamle
4, 5 28,8 1.2 eluere. ikke indsamle
6, 7, 8 28,8 1.2 indsamle individuelt; flertal af methyl keton massen bliver i brøkdel 7; GC-MS kvalitetskontroller skal køres på 6 og 8 at sikre ordentlig eluering af ketoner

Tabel 2: modificeret eluering ordningen for strømpebåndet slange methyl ketoner. Disse mængder er til brug med et små-volumen kromatografi kolonne og mærke af aluminiumoxid i øjeblikket tilgængelige. Den eluted fraktion positive for methyl ketoner har en stærk bioactivity i feltet assays med vilde, bejle mandlige strømpebånd slanger1,7. For at bekræfte tilstedeværelsen af methyl ketoner i target fraktioner, prøver kan fortyndes til 1 mg/mL og analyseret via GC-MS. giver figur 3 repræsentative kromatogrammer for både positive og negative resultater efter eluering.

Discussion

Udvinding af huden lipider i krybdyr kan anvendes på levende eller døde hud, ud over stald hud, som tilbyder alsidighed i eksperimentel anvendelse af denne teknik. Yderligere, ekstraktioner af huden lipider kan gøres i feltet, at aktivere en dynamisk anvendelse af metoden på en bred vifte af biologer2,13. Udvinding af huden lipider er simpel; Derfor, det er nemt at skalere op ekstraktioner efter behov pr. eksperiment eller design, og praktiserende læger skal ikke have betydelig ekspertise til at udføre metoderne. De eneste begrænsende faktorer for optrapning er tilgængeligheden af aftræk hood plads, en overflod af ren, forsegles glasvarer og opløsningsmidler lagerplads.

Huden lipid ekstrakt fraktionering kan skræddersys til en forsker behov, og derfor har lignende fleksibilitet til lipid udvinding. For eksempel kan neutral lipider elueret og derefter kasseres, hvis du vil resultere i target fraktioner, der kan rense forbindelser af interesse eller forenkle bioassays. Fraktionering kan udføres på flere niveauer inden for og på tværs af lipid prøver. Eksempelvis kan flere kolonner køres samtidigt for at gøre processen mere effektiv. Eller kun en del af en samlet lipid ekstrakt kan være fraktioneret på en lille kolonne til, således reservedele reagenser og tid. Fraktionering er primært begrænset af massen af den samlede lipid ekstrakt og præcisionen af det udstyr til rådighed til forskeren. For eksempel, hvis forskeren har en balance med en 10,0 mg præcision, bestemmelse af brøkdel masse og, derfor, vanskeliggøres nøjagtigheden af prøveforberedelse til GC-MS analyse betydeligt, hvis ikke helt. Det samme er tilfældet for glasvarer. Hvis forskeren har en stor volumen kolonne til fraktionering, men har en lille samlede lipid masse til at adskille eluering eller adskillelse af forbindelser videre men vil kræve et betydeligt spild af opløsningsmidler, reagenser, tid og potentielt, målet forbindelser selv.

Det anbefales at udføre en kvalitetskontrol kontrol før bestemmelse af eluering ordning, som det ses i tabel 2, og beslutter hvilke fraktioner kan kasseres. For at bekræfte eluering af de ønskede lipider, en kolonne kan være løb hvor hver fraktion, 1-15, indsamles individuelt og derefter analyseret ved hjælp af GC-MS. I figur 3viser repræsentative gaskromatograf spor at methyl ketoner fra strømpebånd slanger kun elueres af kolonnen i en bestemt brøkdel. Ved at udføre trinnet kvalitetskontrol, kan en modificeret eluering ordning udvikles til en given art at sikre det maksimale udbytte af forbindelser af interesse. Ændringer i materialer, som leverandøren eller masse af aluminiumoxid eller alder af diethylether, vil absolut medføre forskelle i eluering, der skal kontrolleres ved at udføre en kvalitetskontrol test.

De teknikker, der beskrives er begrænset først og fremmest af den kemiske natur af de signaler, der kan opnås. Primært, tillade disse metoder kun forskere at isolere og separate langkædede lipider fra huden af krybdyr. Mange arter af krybdyr bruge luftbåret og/eller proteinholdige stikord som kemiske signaler, og de beskrevne metoder er uforenelig med isolere sagde stikord. Yderligere, upolære opløsningsmidler vil ikke uddrag vandig stikord fra overflader af krybdyr eller kilder af cue deposition (fx, bur vand, fecal spørgsmål, akvatiske substrat) der kan faktisk indeholde rigelige kemiske signaler. Egnede metoder til at indfange disse typer af stikord er tilgængelige for forskere (f.eks.fast-fase microextraction [SPME] for flygtige stikord og højtydende væskekromatografi [HPLC] for vandige stikord), selv om, som metoderne beskrevet ovenfor, er der en teknisk indlæringskurve.

Vigtigst, bør nytten af den endelige kemisk blanding til forskeren guide de anvendte metoder. For eksempel, hvis en forsker ønsker at vide, hvis en mandlig fokale dyr kan skelne mellem stikord produceret af mandlige vs kvindelige artsfæller i en målrettet bioassay, er ekstraktion metoden kun behov for2,3. Hvis identifikationen af seksuelt dimorfe forbindelser er målet, men bør ekstrakt skal renses for at aktivere større tillid til tildeling af id'er til specifikke molekyler eller grupper af molekyler via kemisk analyse1, 6,9,11. Dog at selv føre kromatografi med en lipid kilde, er en betydelig masse starter ekstrakt påkrævet så at målbare brøkdel masserne kan opnås; ellers, pooling af prøver kan forfølges, men er ikke optimal14.

Fremtidige udvikling af denne protokol omfatter foranstaltninger til at udnytte og tilpasse fremgangsmåden for mere krybdyrs arter. Yderligere noninvasive metoder til udvinding af huden lipider er også under udvikling.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Udviklingen af disse metoder, især skur hud lipid udvinding, der opstod under samarbejdsaftaler (14-7412-1061-CA, 15-7412-1155-CA og 16-7412-1269-CA) mellem James Madison University (JMU) og US Department of Agricultures dyr og Plant Health Inspection Service (APHIS). M.R.P. anerkender bidrag af de følgende studerende til udviklingen af skur hud metoder: S. Patel (Washington and Lee University [WLU]), J. Zachry (WLU), R. Flores (JMU), J. Noll (JMU) og S. Ashton (JMU).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Powder-free Chloroprene Gloves Microflex NEC-288 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves")
Ohaus Adventurer Precision Balance Ohaus AX622 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance")
Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid Ball NC9661590 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar")
Hexane, Mixtures of Isomers Sigma-Aldrich 650544 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane")
Hi/Lo Write-On Temperature Tape Electron Microscopy Sciences 5029927 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL Sigma-Aldrich Z414514 See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL Sigma-Aldrich Z414492 See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL")
Cork Flask Support Ring Sigma-Aldrich Z512419 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring")
Accu-jet Pro Pipette Controller Sigma-Aldrich Z671533 See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller")
Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL Pyrex 13-666-7E See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette")
Rotavapor R II Buchi 2422A0 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator")
Elliptical Bump Trap Chemglass Life Science 501215241 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap")
7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass Supelco 27151 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial")
7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner Supelco 27152 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap")
22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass Supelco 27173 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial")
22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner Supelco 27174-U See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap")
Excellence XS Analytical Balance Mettler-Toledo XS205DU See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance")
5 3/4" Disposable Glass Pipette Fisherbrand NC0418555 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette")
Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly Kimble-Chase 17810-19300 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column")
Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands Fischerbrand 11474207 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand")
3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp Troemner 2300203 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps")
Clamp Regular Holder Fischerbrand 05754Q See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder")
Sand,Washed and Dried Macron Fine Chemical MK-7062-212 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand")
Alumina, Neutral Sorbtech 15740-5 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US
Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL Pyrex 4980-1L See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL Sigma-Aldrich Z100684 See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask")
Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir Sigma-Aldrich Z560553 See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column")
Ethyl Ether Anhydrous Fisher Chemical E138500 See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether")
Alconox Detergnet Sigma-Aldrich 242985 See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox")
Acetone (Certified ACS) Fisher Chemical A18P-4 See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone")

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mason, R. T., et al. Sex pheromones in snakes. Science. 245, (4915), 290-292 (1989).
  2. Mason, R. T., Parker, M. R. Social behavior and pheromonal communication in reptiles. Journal of Comparative Physiology A. 196, (10), 729-749 (2010).
  3. Martín, J., López, P. Pheromones and chemical communication in lizards. Reproductive Biology and Phylogeny of Lizards and Tuatara. Rheubert, J. L., Siegel, D. S., Trauth, S. E. CRC Press. Enfield, NJ. 43-77 (2014).
  4. Mayerl, C., Baeckens, S., Van Damme, R. Evolution and role of the follicular epidermal gland system in non-ophidian squamates. Amphibia-Reptilia. 36, (3), 185-206 (2015).
  5. Mathies, T., Levine, B., Engeman, R., Savidge, J. A. Pheromonal control of the invasive brown treesnake: potency of female sexual attractiveness pheromone varies with ovarian state. International Journal of Pest Management. 59, (2), 141-149 (2013).
  6. Parker, M. R., Patel, S. M., Zachry, J. E., Kimball, B. A. Feminization of male brown treesnake methyl ketone expression via steroid hormone manipulation. Journal of Chemical Ecology. 44, (2), 189-197 (2018).
  7. Parker, M. R., Mason, R. T. Pheromones in snakes: history, patterns, and future research directions. Reproductive Biology and Phylogeny of Snakes. Sever, D., Aldridge, R. CRC Press. Enfield, NJ. 551-572 (2011).
  8. Parker, M. R., Mason, R. T. Low temperature dormancy affects the quantity and quality of the female sexual attractiveness pheromone in red-sided garter snakes. Journal of Chemical Ecology. 35, (10), 1234-1241 (2009).
  9. Parker, M. R., Mason, R. T. How to make a sexy snake: estrogen activation of female sex pheromone in male red-sided garter snakes. Journal of Experimental Biology. 215, (5), 723-730 (2012).
  10. Alberts, A. C. Constraints on the design of chemical communication systems in terrestrial vertebrates. American Naturalist. 139, S62-S89 (1992).
  11. Martín, J., Ortega, J., López, P. Interpopulational variations in sexual chemical signals of Iberian wall lizards may allow maximizing signal efficiency under different climatic conditions. PLoS ONE. 10, (6), e0131492 (2015).
  12. Baeckens, S., et al. Environmental conditions shape the chemical signal design of lizards. Functional Ecology. 32, (2), 566-580 (2018).
  13. Greene, M. J., Mason, R. T. Chemically mediated sexual behavior of the brown tree snake, Boiga irregularis. Ecoscience. 5, (3), 405-409 (1998).
  14. Mason, R. T. Integrated pest management: The case for pheromonal control of habu and brown tree snakes. Snakes and Man: Controlling Pest Species for Conservation and Human Health. Rodda, G., Chiszar, D., Sawai, Y., Tanaka, H. Cornell University Press. Ithaca, NY. 196-205 (1998).
  15. Pruett, J. A., et al. Evolutionary interactions between visual and chemical signals: chemosignals compensate for the loss of a visual signal in male Sceloporus lizards. Journal of Chemical Ecology. 42, (11), 1164-1174 (2016).
Kemiske Isolation, kvantificering og adskillelse af huden lipider fra krybdyr
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baedke, P. E., Rucker, H. R., Mason, R. T., Parker, M. R. Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles. J. Vis. Exp. (144), e59018, doi:10.3791/59018 (2019).More

Baedke, P. E., Rucker, H. R., Mason, R. T., Parker, M. R. Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles. J. Vis. Exp. (144), e59018, doi:10.3791/59018 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter