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Isolamento chimico, quantificazione e separazione dei lipidi della pelle da rettili

doi: 10.3791/59018 Published: February 7, 2019

Summary

Nei rettili, i lipidi della pelle da conspecifici sono cruciali per segnalazione sessuale, con uso potenziale nella gestione di specie invasive. Qui, descriviamo i protocolli per l'estrazione dei lipidi della pelle da pelle capannone o animali interi, determinare e analizzare la massa totale del lipido che separa i lipidi mediante frazionamento via colonna cromatografia.

Abstract

Rettili segnalano conspecifici utilizzo di lipidi nella loro pelle, principalmente per consentire compagno di monitoraggio e valutazione. L'isolamento di questi lipidi ha utilità nella ricerca focalizzata su percorsi evolutivi e i meccanismi di comunicazione chimica, oltre a comprendere il ruolo d'impermeabilizzazione dei lipidi nell'evoluzione della vita terrestre. In un approccio applicato, tali spunti basati su pelle avere uso potenziale per i gestori di fauna selvatica a che fare con le specie invasive. I principali passaggi per quantificare i lipidi della pelle di rettile nel protocollo presentato qui includono l'estrazione, determinazione del lipido totale e frazionamento tramite cromatografia su colonna, il processo di quest'ultimo conseguente purificati eluati di composti che possono quindi o essere analizzati per assegnare composti identificazioni (ad es., gas cromatografia spettrometria di massa [GC-MS]) e/o utilizzato direttamente nelle analisi biologiche più raffinate. I lipidi della pelle può essere estratta da pelle viva, della pelle, o morto tutto animali, utilizzando solventi organici non polari (ad es., esano, benzene, toluene) della tettoia. Estrazione solubilizza i lipidi e, quindi, il solvente può essere volatilizzato per produrre un estratto lipido-solo misurabile. Frazionamento comporta la separazione dell'estratto lipidico totale in eluati specifici tramite tradizionale cromatografia su colonna. L'estratto lipidico totale prima è associato a una colonna basata su substrato (ad es., allumina) e, quindi, eluati individuali ("frazioni") di solvente a volumi specifici sono passati in sequenza attraverso la colonna per eluire set composti da una miscela di lipidi Basato su polarità comune. I progressi di frazioni in polarità durante una sequenza standardizzata aumentando la relativa quantità di solvente polare (per esempio, etere etilico) in solventi non polari. In questo manoscritto, descriviamo i diversi metodi per l'estrazione dei lipidi della pelle dei rettili e, quindi, fornire un protocollo standard per l'isolamento di diversi gruppi di composti a base di polarità, mediante cromatografia su colonna tradizionale. Estratti lipido intero o frazioni specifiche possono, quindi, essere utilizzate nelle analisi biologiche per determinare qualsiasi attività biologica suscitata dai composti in esso.

Introduction

Rettili producono lipidi nell'epidermide, direttamente da cellule della pelle o da ghiandole discrete che vengono usate nella comunicazione sociale, come compagno valutazione e monitoraggio, territorialità e intra - e interspecifiche riconoscimento1,2 ,3,4. L'isolamento di questi lipidi della pelle ha programma di utilità di ricerca focalizzato su percorsi evolutivi e meccanismi di comunicazione chimica, oltre a comprendere il ruolo d'impermeabilizzazione dei lipidi nell'evoluzione della vita terrestre2,3 ,4. Ulteriormente, molti rettili, soprattutto degli Squamati (lucertole, serpenti), sono specie invasive in ecosistemi sensibili, e lo sviluppo di esche feromone-based per migliorare l'intrappolamento e la rimozione in corso5,6. L'impermeabilità della pelle del rettile facilita l'estrazione dei lipidi presenti e ottenere estrazioni relativamente pure di una fonte potenzialmente robusta di segnali chimici. I passaggi di principio per quantificare i lipidi della pelle di rettile nel protocollo descritto includono l'estrazione, determinazione del lipido totale e frazionamento via colonna cromatografia1,6,7. I metodi sono stati utilizzati ordinariamente come cedono bioattivi isolati che spiegano molto circa la scelta e selezione, soprattutto in serpenti2.

I lipidi della pelle possono essere estratti da pelle viva, pelle capannone, o rettili morti interi, utilizzando non polari o solventi organici polari1,7,8,9. Dovrebbe essere notato che esemplari conservati in solventi come etanolo non sono ottimali per l'estrazione dei lipidi della pelle, e carcasse solo fresche o congelate fresco dovrebbero essere considerate come possibili fonti per l'estrazione. I lipidi della pelle sono inerti, che li rende stabile sulla superficie della pelle e facile da estrarre7. Nei loro ruoli di segnalazione in ecologia del rettile, stecche del lipido della pelle spesso sono depositati in ambienti difficili, ma a causa delle loro proprietà chimiche robusto, tali indicazioni possono conservano il loro valore di informazioni per lunghi periodi di tempo10,11 , 12. il processo di estrazione solubilizza i lipidi, utilizzando un solvente non polare (ad es., esano, benzene, toluene) sopra un ore di ammollo, seguita dall'evaporazione del solvente, per lasciare una massa misurabile di lipido estratto7 , 8. i lipidi della pelle sono altamente miscibili in solventi non polari, e una vasta gamma di idrocarburi può essere estratta da una gamma Analogamente diversificata di fonti.

Frazionamento è più laborioso rispetto estrazione ma serve a separare l'estratto lipidico totale in frazioni specifiche tramite cromatografia a colonna, per facilitare la purificazione e la possibile identificazione dei composti ivi1, 6 , 7 , 8. l'estratto lipidico totale è associato a una colonna basata su substrato, e quindi, eluati individuali ("frazioni") di solvente a volumi specifici sono passati in sequenza attraverso la colonna per eluire set composti da una miscela di lipidi che hanno una comune polarità6,7,8. Nella cromatografia del lipido, i progressi di frazioni in polarità ad alcuni standardizzato sequenza aumentando la relativa quantità di solvente polare (per esempio, etere etilico) in solventi non polari (in genere espressa in percentuale: 0%, 2%, 4% etere, ecc. )6,7,8. Anche se i metodi come cromatografia di strato sottile (TLC) può essere utilizzato per separare i lipidi in una miscela e sono più semplice, cromatografia a colonna è preferito perché utilizza un sistema chiuso, è facile da controllare, può separata più concentrato miscele ed è compatibile con multiplexing per efficienza. In questo manoscritto, descriviamo i diversi metodi per l'estrazione dei lipidi della pelle dei rettili e, quindi, fornire un protocollo standard per l'isolamento di diversi gruppi di composti a base di polarità, mediante cromatografia su colonna tradizionale. In molti progetti di ricerca che coinvolgono l'isolamento dei segnali chimici, l'obiettivo finale è per ottenere un cambiamento nei ricevitori esposti a quei segnali. Estratti lipido intero o frazioni specifiche possono, quindi, essere utilizzate nelle analisi biologiche per determinare che qualsiasi attività biologica ha suscitato dai composti ivi1,2,6,7. Nella ricerca biologica di base, per esempio, le analisi biologiche utilizzando frazioni specifiche possono rivelare ai ricercatori che una fonte purificata di feromoni è stata isolata, e quindi, metodi per l'identificazione dei composti bersaglio possono essere perseguiti. Da una prospettiva di gestione della fauna selvatica, identificazione non può essere l'obiettivo, e invece, la frazione attiva potrebbe essere utilizzata nel campo per ottenere conspecifici di trappole o inibire compagno di rilevamento in habitat non nativi13,14.

Protocol

Tutte le procedure che prevedono l'uso di vertebrati sono state approvate dal istituzionale Animal Care e utilizzare Comitato di James Madison University.

1. estrazione

  1. Estrazione della pelle capannone
    1. Raccogliere circa 30 cm2 di capannone da un singolo rettile, rimuovendo la testa e cloacal sezioni che possono contaminare i campioni. Indossare guanti di cloroprene e pulire il capannone di detriti.
    2. Tarare la bilancia con un sacchetto o pesare barca e pesare il capannone (± 0,01 g).
      Nota: La precisione di massa è determinata dalla precisione dell'equilibrio. Pelle capannone massa è il fattore di normalizzazione per massa di pelle estratti lipidici (Vedi sotto) e significativamente covaries con estratto lipido massa.
    3. Separare il capannone in pezzi più piccoli (5 cm2) e aggiungerli a un contenitore di vetro richiudibile con un coperchio di esano-compatibile (ad esempio, un barattolo di vetro con un coperchio di metallo o una boccetta del laboratorio con un coperchio PTFE). Decantare abbastanza esano nel contenitore per immergere completamente i pezzi di pelle capannone. Sigillare il contenitore.
      Attenzione: Esano è infiammabile, un irritante delle vie respiratorie ed è associato con parecchi breve e lungo termine pericoli per la salute. Procedure che coinvolgono esano vengono eseguite in una cappa aspirante (laboratorio) o all'aperto (campo) indossando appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE) (ad es., splash occhiali, cloroprene guanti, maniche lunghe, scarpe a punta stretta).
    4. Etichettare i contenitori dei con una matita o una penna resistente ai solventi. Lasciare i contenitori nella cappa fumi a temperatura ambiente durante la notte o fino a 24 h.
    5. Togliere i pezzi di capannone utilizzando metalliche pulito pinze o tenaglie. Agitare i pezzi per conservare qualsiasi esano rimanente nel contenitore. Consentire i pezzi di pelle ad asciugare su carta assorbente; quindi, ignorarle. Se vengono eseguite le estrazioni multiple, pulire le pinze/tenaglie tra ogni campione. Per pulire le pinze/tenaglie, sciacquarli in ~ 50 mL di esano in un becher.
    6. Se l'estratto non deve essere utilizzato immediatamente, decantare o dispensare l'estratto in un flaconcino di vetro di volume appropriato, sigillare con un tappo rivestito in PTFE, etichettarlo e conservarlo a-20 ° C.
      Attenzione: Poiché l'estratto contiene esano, conservare i flaconi in un congelatore di esplosioni.
  2. Estrazione animale morto intero
    1. Registrare la lunghezza del muso-vent (SVL; in centimetri) e massa (in grammi) dell'animale. Se la produzione totale di lipidi o feromone per unità di superficie della pelle è determinato, è possibile utilizzare misura di nastro di un sarto per ottenere la circonferenza massima corpo (in centimetri).
    2. Per l'estrazione, scegliere un contenitore che ha un diametro che è 1/3 della lunghezza dell'animale. Posizionare la carcassa in modo sicuro nella parte inferiore del contenitore con la testa e la cloaca in alto. Decantare esano sufficiente nel contenitore per massimizzare la superficie sommersa del corpo.
      Nota: Se la testa o la cloaca diventata sommerso per qualsiasi quantità di tempo nell'estrazione, prendere nota.
    3. Avvitare il coperchio, etichettare il contenitore e immergerlo in una cappa a temperatura ambiente durante la notte o fino a 24 h.
    4. Quando si rimuove la carcassa, utilizzare metalliche pulito pinze o tenaglie. Mantenere l'esano residuo sulla carcassa nel contenitore consentendo di gocciolare dal corpo, non dalla testa o coda. Sigillare il contenitore.
    5. Se l'estratto non deve essere utilizzato immediatamente, decantare l'estratto o lo pipettare in un flaconcino di vetro di volume appropriato, sigillare con un tappo rivestito in PTFE, etichettarlo e conservare a-20 ° C.

2. determinazione della massa lipidica

Nota: Estratto lipido massa può essere determinata in due modi: con una fiala di vetro o con un pallone, utilizzando un evaporatore rotante.

  1. Determinare l'estratto lipidico massa tramite il metodo del flaconcino di vetro.
    1. Utilizzare un flacone prepesato di dimensioni sufficienti (7ml, 22 mL, 50 mL, ecc.). Includere il tappo e l'etichetta della massa totale, o sempre pesare il flaconcino senza tappo ed etichetta (marcature sull'etichetta anche aggiungono massa). Posizionare l'etichetta sul collo del pallone per evitare il contatto con l'acqua.
      Nota: L'evaporazione in flaconcini di vetro è efficiente se il ricercatore ha accesso ad un sistema collettore gas dove fiale multiple possono essere volatilizzati contemporaneamente sotto un flusso di2 N.
    2. Trasferire l'estratto per la fiala, utilizzando una pipetta di vetro con un bulbo di gomma o, per gli estratti di grande volume, un pipettatore elettronico con una pipetta di vetro monouso da 10 mL. Sciacquare il serbatoio con circa 3 mL di esano e trasferimento al flaconcino pure.
    3. Evaporare il campione sotto un leggero getto di2 N. Inclinare il flaconcino in un angolo per consentire una massima superficie solvente. Condensa si forma sulla parte esterna del flaconcino come l'esano evapora.
      Nota: Anelli del lipido formerà nel flaconcino come l'esano evapora, così periodicamente l'Estratto di turbinio.
    4. Evaporare il campione ad essiccazione; quindi, ripesare. Registrare la resa totale di lipidi.
      Nota: Per l'analisi tra i diversi gruppi, standardizzare il lipido sia per capannone massa di massa (massa lipidica [in grammi] diviso per capannone massa [in grammi] x 100 produce la massa percentuale lipidica della tettoia) o per SVL dell'animale (lipidi massa [in milligrammi] divisa per SVL [in centimetri]; produce la massa lipidica per unità di lunghezza). Gli animali più grandi producono più del lipido e molte specie sono fortemente sessualmente dimorphic, che impone notevoli pregiudizi nei dati.
  2. Determinare l'estratto lipidico massa tramite evaporatore rotante.
    1. Per una più rapida evaporazione per singolo campione, trasferire l'Estratto di un pallone da prepesati ed evaporare utilizzando un evaporatore rotante.
      1. Se le particelle sono evidenti nell'estratto, è possibile filtrare il campione inserendo un cono di carta da filtro nel collo del pallone; quindi, trasferire l'estratto al pallone e lasciarlo al filtro di gravità. Smaltire la carta da filtro dopo l'estratto completo viene trasferito.
        Nota: Il volume del campione di trasferimento (fino al volume di ~ 80% boccetta) prima evaporazione rotante. Qualsiasi bubbling dell'estratto nel condensatore dell'evaporatore rotante determina una contaminazione e richiede il condensatore da pulire. Una trappola di urto può essere posizionata tra il pallone e il collo del condensatore se bolle o "urtare" si verificano nella maggior parte dei campioni.
    2. Attivare l'alimentazione al bagno acqua ed evaporatore rotante (50 ° C; inferiore al punto di ebollizione solvente). Attivare il flusso di acqua freddo al condensatore.
      Nota: Il condensatore dell'evaporatore rotante è collegato a un rubinetto d'acqua freddo allo scarico di ventilazione o un refrigeratore a ricircolo. La portata può essere lenta se l'acqua è più fredda di ambiente, di condensare il vapore solvibile lasciando il pallone e immettendo il condensatore.
    3. Accendere la fonte di vuoto (vuoto di acqua o pompa). Assicurare che la pressione è sufficiente a contenere il pallone al collo del condensatore. Aprire lo sfiato all'estremità del condensatore prima di collegare il pallone. Far scorrere il pallone sul collo del condensatore, chiudere la valvola per sigillare e assicurarsi che il pallone non può staccare dal condensatore quando il pallone viene rilasciato.
    4. Abbassare il pallone fino a ~ 50% è sommerso nel bagno. Avviare la rotazione del pallone a media velocità. Se il vuoto, velocità, flusso di condensatore e temperatura del bagno sono ottimali, il vapore solvibile lasciando il pallone sarà condensare sulla bobina e gocciolare nel pallone di recupero.
      1. Se il campione si riduce (ad esempio, grandi bolle, rapida formazione di gas), ridurre immediatamente il vuoto e/o la velocità dell'evaporatore rotante. Se il punto di ebollizione continua, disattivare la rotazione del pallone, disattivare il vuoto, sollevare il pallone dal bagno e rilasciare la tenuta di vuoto. Ripetere i passaggi 2.2.3 e 2.2.4.
        Nota: Se nessun solvente è raccolta nel pallone di recupero ma l'estratto è ovviamente evaporazione, il vuoto è molto probabilmente optimize e dovrà essere regolato.
    5. Evaporare il campione sotto il vuoto fino a ~ 2 mL di solvente rimane nel matraccio (estratti di grande volume), o, se viene utilizzato un pallone prepesato, evaporare fino a quando una goccia di liquido con un < 1 cm di diametro è visibile nella parte inferiore del pallone. Disattivare la rotazione e il vuoto; quindi, sollevare il pallone fuori dalla vasca.
    6. Tenere il collo del pallone come il vuoto sigillo viene rilasciato; poi, torcere il collo per farla scorrere dal condensatore. Se viene utilizzato un pallone di grande volume, agitare l'estratto condensato nel pallone per sciogliere i lipidi visibili; quindi, trasferire la soluzione tramite pipetta in un pallone piccolo-volume, prepesato. Aggiungere 3 mL di esano per sciacquare il pallone grande, turbolenza, pipettare esso al più piccolo pallone ed evaporare nuovamente (punti 2.2.3 - 2.2.5).
    7. Il tallone di liquido nell'estratto solidificherà come l'esano evapora. Una volta asciutto, permettono di raggiungere la temperatura ambiente. I lipidi si formeranno un bianco traslucido, a cera gialla nel pallone (~ 5 min). Pesare il pallone per ottenere la massa finale.
      Nota: A seconda della natura dei lipidi estratti, essi avrà solide (per esempio, cera) o proprietà semisolido (ad es., petrolio greggio), soprattutto quando frazionati lipidi sono evaporati (Vedi sotto).
  3. Solubilizzare i lipidi nel volume registrato di esano per produrre ≥ 1 mg di lipidi per 1 mL di esano. Il volume di lavoro per la progressione alla cromatografia è ~ 5 mL. Se il trasferimento dalla boccetta per fiala, 2 mL di volume totale di sciacquare il pallone dopo aver trasferito la maggior parte dell'estratto al flaconcino di mantenere.
  4. Etichettare le fiale, sigillarli con tappi rivestiti in PTFE e conservarli a-20 ° C.

3. colonna cromatografia

Nota: Per separare composti sconosciuti basati sulla polarità in frazioni specifiche, estratto lipido massa può essere colonne cromatografiche liquide aggiunto al preparato e frazionato mediante eluizione standard.

  1. Preparazione della colonna
    1. In funzione della massa lipidica nell'estratto, utilizzare un grande - o una colonna di cromatografia di vetro piccolo-volume con un rubinetto in Teflon. La colonna è dotata o fusa ad un serbatoio di volume fisso (500 mL per una grande colonna; 250 mL per una piccola colonna). D'ora in poi, questo protocollo si riferisce solo a una colonna di cromatografia di grande volume fusa ad un serbatoio. Pulire accuratamente qualsiasi nuova cristalleria e parti da utilizzarsi in cromatografia, come descritto nella sezione 4; risciacquateli con esano o un altro solvente non polare.
    2. Piegare un pezzo di lana di fibra di vetro (~ 14 cm di lunghezza [L] x 4 cm in larghezza [W]) più volte fino a formare un quadrato di ~ 4 x 4 cm. Utilizzare una canna di tassello di legno più lungo della colonna per posizionare la fibra di vetro nella parte inferiore della colonna.
    3. Fissare la colonna in una cappa per uno stand di anello standard con due morsetti (ad es., girevole o modulare), quello sopra il rubinetto e uno sotto il collo del serbatoio. Livello della colonna. Posizionare la colonna ad un'altezza per consentire sufficiente distanza di lavoro per il becher da 500 mL per adattarsi facilmente sotto la colonna. Aprire il rubinetto.
    4. Versare lavato e asciugato la sabbia nella colonna, finché un ~ 3 cm di sabbia riposa sopra la fibra di vetro. Posizionare la carta nera o scura sotto la colonna e toccare delicatamente. Se la sabbia cade dalla colonna con ogni rubinetto, la barriera della vetroresina è insufficiente. Ripetere i passaggi 3.1.2 - 3.1.4.
      Nota: Utilizzare una graffetta dispiegata registrata alla fine di un asta di centraggio per recuperare la fibra di vetro dalla parte inferiore.
    5. Porre il becher di 500 mL sotto la colonna. Decantare lentamente ~ 25 mL di esano da un becher da 100 mL o cilindro graduato nel serbatoio colonna a bagnare la sabbia. Chiudere il rubinetto quando ~0.5 cm di esano sopra la sabbia.
    6. Pesare allumina neutra. Per ogni piccola colonna, utilizzare ~ 50 g; ~ 175 g per ogni colonna di grandi dimensioni. Versare l'allumina in una beuta da 1 L. Limite di 400 g di allumina al pallone da 1 L.
    7. Per attivare l'allumina (attività III), pipettare acqua deionizzata di un volume pari al 6% dell'allumina massa (cioè, per 100 g di allumina, aggiungere 6 mL di acqua). Aggiungere l'acqua come gocce in tutto l'allumina.
    8. Coprire il recipiente con carta stagnola o un tappo di sughero. Agitare vigorosamente (non agitare) per disperdere uniformemente la carica. Continuare fino a quando non visibile restino grumi.
      Nota: Il pallone scalderà come l'acqua reagisce con l'allumina, che deve essere previsto.
    9. Aggiungere esano fino a quando l'allumina è completamente coperto, con ~0.5 cm di esano sopra l'allumina. Agitare la beuta per formare un impasto.
    10. Posizionare un imbuto ventilato nel serbatoio della colonna e un bicchiere di vetro 500 mL sotto la colonna. Aprire il rubinetto. L'allumina di turbinio e costantemente versarlo nella colonna. Garantire l'allumina è assestamento uniformemente nella colonna e senza grandi bolle o crepe stanno formando nella colonna di allumina. Picchiettare delicatamente il lato della colonna a stabilirsi in modo uniforme l'allumina.
      Nota: Ulteriore esano devono essere aggiunto per ulteriori versa, per mantenere l'impasto. L'esano raccolta nel becher sotto la colonna può essere riutilizzato se il bicchiere di vetro era pulito all'inizio.
    11. La colonna è formata quando la parte superiore dell'allumina è stabile e ~ 4 cm sotto il collo della colonna alla base del serbatoio. Utilizzare una pipetta per sciacquare l'interno del serbatoio con esano per allumina residua. Utilizzando un imbuto, delicatamente aggiungere un secondo strato di sabbia in cima l'allumina, a ~ 1 cm sotto il serbatoio.
      Nota: Esano fluirà dalla colonna in quanto il rubinetto rimane aperto. La colonna non lasciare asciugare. Se la colonna si asciuga, il processo deve iniziare di nuovo, partendo dal punto 3.1.2. Il protocollo può essere fermato qui se le colonne sono preparate un giorno prima del frazionamento. Fermamente posto un tappo di sughero nella parte superiore del serbatoio o coprite con un foglio. Riempire il serbatoio con ~ 100 mL di esano. Stringere il rubinetto.
  2. Frazionamento dell'estratto lipidico
    Nota: Indipendentemente dalle dimensioni della colonna, le frazioni di estratto lipidico possono essere raccolti singolarmente e riunite basata sulla loro polarità di frazione o scartato completamente se non contengono composti qualsiasi destinazione noto/identificate. Turni di eluizione replica (n = 3 volumi) sono passati attraverso la colonna per garantire la sufficiente eluizione dei lipidi. Seguire la tabella 1 per l'eluizione di colonna di grandi dimensioni (con un Estratto di massa > 30 mg) o piccolo-colonna eluizione (con un estratto massa < 30 mg). È un protocollo di eluizione su misura per isolare solo chetoni di metile nella tabella 2.
    1. Rimuovere l'esano rimanente nella parte superiore della colonna, utilizzando una pipetta di grande volume, oppure consentire l'esano a gocciolare fuori in un bicchiere pulito. Lasciare ~ 3 mL di esano sopra la sabbia nella parte superiore della colonna.
      Nota: L'esano raccolto è puro se solo contattato cristalleria pulita e può essere riciclato nella prima frazione.
    2. Trasferire l'estratto lipidico per la colonna, utilizzando una pipetta di vetro lunghe. Pipettare lentamente l'estratto per evitare di disturbare lo strato di sabbia. Risciacquare la fiala di estratto o boccetta con ~ 5 mL di esano e trasferirlo alla colonna.
      Nota: Se l'estratto è stato conservato a-20 ° C, i lipidi saranno essere precipitati. Scaldare il flaconcino fino a quando non più precipitato è visibile.
    3. Aprire il rubinetto e lasciare il campione caricare nella colonna. Se l'estratto ha una grande massa (> 30 mg), una band giallastra potrebbe essere visibile in allumina, appena sotto la sabbia nella parte superiore. Raccogliere il flusso attraverso in un becher da rifiuti come questo esano non è più pulito. Chiudere il rubinetto quando ~ 3 mL rimane in cima alla sabbia.
      Attenzione: Il lipido nell'estratto, ora associato all'allumina e la colonna, non è possibile asciugare o il campione sarà perso.
    4. Inserire un pallone a sfondo sferico prepesato ed etichettato (100 mL, 250 mL o 500 mL) sotto la colonna prima di versare la prima frazione. Le frazioni devono essere eliminati possono essere raccolti in un contenitore di vetro comune.
    5. Preparare la prima frazione (100% esano: 0% dietil etere [finora, "etere"]) in un cilindro graduato. Se la preparazione delle frazioni in anticipo, coprire con un foglio o tappo di sughero.
      Nota: Le frazioni progresso nella polarità; di conseguenza, il cilindro non deve necessariamente essere risciacquati tra frazioni.
    6. Aggiungere la prima frazione al serbatoio di versamento tramite un imbuto di vetro ventilato diretto ad un lato del serbatoio per evitare di disturbare lo strato di sabbia. Aprire il rubinetto per iniziare l'eluizione. Chiudere il rubinetto quando ~ 3 mL di esano rimane sopra la sabbia nella parte superiore della colonna.
      Nota: Mai smettere un'eluizione all'interno di una frazione individuale chiudendo il rubinetto prima che la maggior parte dell'eluato è stato raccolto. Tra le frazioni, non lasciare il rubinetto chiuso per più di ~ 1 h perché ritardi possono alterare la qualità e la ripetibilità dell'eluizione.
    7. Ripetere i passaggi 3.2.4 - 3.2.6 per frazioni 2 e 3. Raccogliere le frazioni in boccette di dimensioni appropriate che consentono spazio di testa per evaporazione rotativa, soprattutto se le frazioni sono in fase di pool.
    8. Preparare una quarta frazione (2% etere) e aggiungerlo al serbatoio. Posizionare il pallone successivo sotto la colonna, aprire il rubinetto e raccogliere la quarta frazione. Preparare una frazione Quinta; quindi, continuare come necessario.
      Nota: È possibile per far evaporare il primo fraction(s) via rotativo evaporazione durante la raccolta frazioni successive.
    9. Per la preparazione delle frazioni da utilizzare nelle analisi GC-MS, ottenere una massa di frazione usando una bilancia di precisione 0,01 o 0,1 mg. Solubilizzare le frazioni lipidiche per produrre 1 mg di lipidi per 1 mL di esano.

4. pulizia

  1. Lasciare il rubinetto aperto e invertire la colonna nel becher dei rifiuti. L'allumina e la sabbia esaurirà la colonna; in alternativa, agitare per accelerare il processo. Utilizzare un'asta di centraggio per recuperare la lana di fibra di vetro, se è bloccato (evitare di graffiare il vetro) o soffiare con un flusso di2 N.
  2. Smontare e pulire tutta la cristalleria, con laboratorio-grado detergente in acqua calda in una vasca di plastica con una spazzola di vetro (con peli o setole di plastica). Lavare 3X. Sciacquare bene con abbondante acqua tiepida fino a quando il vetro è non più liscia al tatto.
  3. Sciacquare la vetreria e attrezzi x 3 con acqua deionizzata. Metterli su una cremagliera per asciugare all'aria. Per accelerare l'asciugatura, aggiungere una piccola quantità di acetone (3 mL) per la vetreria, ricciolo e lasciarlo asciugare all'aria o eseguirlo sotto un flusso di2 N.

Representative Results

Dopo l'estrazione, il lipido totale massa è il primo tipo di dati che possono essere acquistati attraverso il protocollo presentato qui. Tuttavia, i valori di massa lipidica totale non dovrebbero essere analizzati mai senza qualche tentativo di standardizzare i valori ottenuti. Diversi approcci possono essere usati, ma si consiglia di entrambi standardizzando la massa dei lipidi estratti a SVL dell'animale (in centimetri) o alla massa della pelle capannone che è stato estratto. I risultati precedenti in un valore di lipido-messa-a-lunghezza e quest'ultimo sarà una percentuale di origine massa. La ragione per la standardizzazione è che gli animali più grandi producono naturalmente più lipidi della pelle perché hanno una maggiore area superficiale totale della pelle. Figura 1A esemplifica questa associazione, dove le scale di massa dei lipidi estratti pelle linearmente con la massa del capannone pelle estratta. Una volta standardizzata per la massa di pelle capannone totale, questa relazione lineare è completamente rimosso (Figura 1B).

A seguito di frazionamento, lo stesso approccio di standardizzazione può essere utilizzato con le masse delle singole frazioni (Figura 2). In questo set di dati campione, ogni frazione non è ugualmente contribuiscono al totale estratto lipido massa: lipidi neutri (frazioni 1-3) sono l'insieme dominante dei composti di massa proporzione rispetto a ogni set di altri lipidi polari (frazioni 4-6, 7-9 e 10-12).

Figure 1
Figura 1: relazioni tra estratti materiale lipidico di massa e di input. (A) In rettili, il rapporto tra il totale capannone della pelle il pelle estratti del lipido e massa massa è correlato positivamente (P < 0,001). (B) quando i lipidi estratti pelle massa è standardizzato al totale versato massa (il lipido massa diviso per il capannone massa), questo rapporto non è più presente (P = 0,46). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: standardizzata masse frazione seguendo eluizione. Mediante cromatografia su colonna, estratti del lipido della pelle possono essere eluiti in frazioni, basate sulla polarità composto. La frazione di massa è, quindi, espressa come una percentuale dell'estratto lipidico totale (massa frazione [in milligrammi] divisa per massa estratto lipidico totale [in milligrammi) per determinare le differenze tra frazioni o sperimentali gruppi di8. Le barre rappresentano i mezzi. L'errore superiore è SEM; l'errore di fondo è CI di 95%. Singoli punti dati sono forniti per chiarezza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: gascromatografi rappresentative delle frazioni di metil chetone. (A) con l'eluizione corretta, metil chetoni sono i composti più abbondanti nella frazione 7 da tabella 2 e può essere visto come distici di picchi (tempo di ritenzione = min 24-34). (B) frazione 6 dalla tabella 2, tuttavia, produce solo composti del nontarget. Questo stesso risultato può verificarsi quando il solvente polare utilizzato nella fase mobile è scaduto o se la colonna è stata arrestata per lunghi periodi di tempo (> 1 h) tra le frazioni. Si noti la differenza in abbondanza molecolare tra le due tracce. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Frazione Esano (mL) Etere etilico (mL)
1, 2,3 100 [30] 0 [0]
4, 5,6 98 [29.4] 2 [0,6]
7, 8,9 96 [28,8] 4 [1.2]
10, 11,12 92 [27.6] 8 [2.4]
13, 14,15 84 [25,2] 16 [4.8]

Tabella 1: volumi di eluizione Standard per il frazionamento dei lipidi della pelle. Percentuali e volumi di solvente sono date per il grande volume (ad es., 250 mL) e [piccolo-volume] (ad esempio, 100 mL) colonne cromatografiche con allumina (attività III). Esano è il solvente; etere etilico è la fase mobile.

Frazione Esano (mL) Etere etilico (mL) Note
1, 2, 3 30 0 eluire; non raccogliamo
4, 5 28,8 1.2 eluire; non raccogliamo
6, 7, 8 28,8 1.2 raccogliere singolarmente; maggioranza di metil chetone massa sarà in frazione 7; GC-MS di controlli di qualità devono essere eseguiti su 6 a 8 per garantire la corretta eluizione dei chetoni

Tabella 2: schema di eluizione modificate per i chetoni metile serpente giarrettiera. Questi volumi sono per l'uso con una colonna di cromatografia di piccolo volume e con il marchio di allumina attualmente disponibile. La frazione eluita positiva per i chetoni di metile ha una forte bioattività nelle analisi di campo con wild, corteggiamento maschile serpenti giarrettiera1,7. Per confermare la presenza di metil chetoni nelle frazioni di destinazione, i campioni possono essere diluiti a 1 mg/mL e analizzati tramite GC-MS. Figura 3 fornisce cromatogrammi rappresentativi per risultati positivi e negativi a seguito di eluizione.

Discussion

L'estrazione dei lipidi della pelle nei rettili può essere applicato alla pelle vivere o morta, oltre a pelle capannone, che offre versatilità nell'applicazione sperimentale di questa tecnica. Ulteriormente, le estrazioni di lipidi della pelle possono essere fatto in campo, per attivare un'applicazione dinamica del metodo ad una vasta gamma di biologi2,13. Estrazione dei lipidi della pelle è semplice; Pertanto, è facile da scalare le estrazioni come necessario per ogni esperimento o progettazione e significativa esperienza per eseguire i metodi non hanno bisogno i professionisti. La disponibilità di spazio cappa fumi, un'abbondanza di vetro pulito, sigillabile e spazio di immagazzinaggio solvente sono gli unici fattori limitanti per la scalabilità.

Frazionamento di estratto lipidico della pelle può essere adattata alle esigenze di un ricercatore e, pertanto, ha flessibilità simile all'estrazione dei lipidi. Ad esempio, lipidi neutri possono essere eluiti e poi scartati, per provocare le frazioni di destinazione che possono purificare composti di interesse o semplificare le analisi biologiche. Frazionamento può essere eseguito a scale multiple all'interno e tra i campioni del lipido. Ad esempio, più colonne possono essere eseguite simultaneamente per rendere il processo più efficiente. In alternativa, solo una parte di un estratto lipidico totale può essere frazionata su una piccola colonna a, quindi, risparmiare i reagenti ed il tempo. Frazionamento è limitato principalmente dalla massa dell'estratto lipidico totale e la precisione delle apparecchiature disponibili al ricercatore. Ad esempio, se il ricercatore ha un equilibrio con una precisione di 10,0 mg, la determinazione della frazione di massa e, di conseguenza, la precisione della preparazione del campione per l'analisi GC-MS è significativamente, se non completamente, ostacolata. Lo stesso vale per la vetreria. Se il ricercatore ha una colonna di grande volume per frazionamento, ma ha una massa di piccoli lipidico totale per separare, l'eluizione o la separazione dei composti progredirà ma richiederà un significativo spreco di solventi, reagenti, tempo e, potenzialmente, la destinazione composti di se stessi.

Si consiglia di eseguire un controllo di qualità prima di determinare il regime di eluizione, come si vede nella tabella 2e decidere quali frazioni possono essere scartate. Per confermare l'eluizione dei lipidi desiderati, una colonna possono essere dove ogni frazione, 1-15, è raccolti singolarmente e poi analizzati tramite GC-MS. Nella Figura 3, rappresentante gascromatografo tracce mostrano che chetoni di metile da serpenti giarrettiera eluire solo dalla colonna in una frazione di specifica. Eseguendo questo passaggio di controllo di qualità, un regime di eluizione modificate possa essere sviluppato per una data specie garantire la massima resa dei composti di interesse. Modifiche nei materiali, ad esempio il fornitore o il sacco dell'allumina o l'età dell'etere dietilico, assolutamente si tradurrà in differenze di eluizione che dovrebbe essere controllato per eseguendo un test di controllo qualità.

Le tecniche descritte sono limitate principalmente dalla natura chimica dei segnali che possono essere ottenuti. Principalmente, questi metodi solo permettono ai ricercatori di isolare e separare i lipidi catena lunga dalla pelle di rettili. Molte specie di rettili utilizzano segnali nell'aria e/o proteici come segnali chimici, e i metodi descritti sono incompatibili con isolamento cues ha detto. Più ulteriormente, non polare solventi non estrarre acquose spunti dalle superfici dei rettili o fonti di deposizione di cue (ad es., acqua di gabbia, materia fecale, substrato acquatica) che possono effettivamente contenere abbondanti segnali chimici. Metodi appropriati per l'acquisizione di questi tipi di segnali sono disponibili ai ricercatori (ad es., fase solida microextraction [SPME] per volatili spunti e cromatografia liquida ad alte prestazioni [HPLC] per stecche acquose), anche se, come i metodi descritto sopra, c'è una curva di apprendimento tecnica.

La cosa più importante, l'utilità della miscela chimica finale al ricercatore dovrebbe guidare i metodi utilizzati. Ad esempio, se un ricercatore vuole sapere se un animale maschio focale possibile distinguere tra le stecche prodotte da uomo vs donna conspecifici in un'analisi biologica mirata, l'estrazione è che l'unico metodo necessari2,3. Se l'obiettivo è l'identificazione di composti sessualmente dimorphic, tuttavia, l'Estratto dovrebbe essere purificato, per consentire una maggiore fiducia nell'assegnazione di identificazioni a specifiche molecole o gruppi di molecole tramite analisi chimica1, 6,9,11. Tuttavia, per condurre anche cromatografia con una fonte di lipidi, una massa significativa di avviamento estratto è necessaria affinché masse misurabili frazione possono essere ottenute; in caso contrario, la messa in comune dei campioni può essere perseguito, ma non è ottimale14.

Futuri sviluppi del presente protocollo comprendono misure per utilizzare e adattare la procedura per le specie più rettile. Ulteriori metodi non invasivi di estrazione di lipidi della pelle sono anche in fase di sviluppo.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Lo sviluppo di questi metodi, soprattutto capannone estrazione di lipidi della pelle, si è verificato durante accordi di cooperazione (14-7412-1061-CA, 15-7412-1155-CA e 16-7412-1269-CA) tra James Madison University (JMU) e animale di l'US Department of Agriculture e Plant Health Inspection Service (APHIS). M.R.P riconosce i contributi degli studenti seguenti allo sviluppo dei metodi pelle capannone: S. Patel (Washington and Lee University [WLU]), J. Zanetti (WLU), R. Flores (JMU), J. Noll (JMU) e S. Ashton (JMU).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Powder-free Chloroprene Gloves Microflex NEC-288 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves")
Ohaus Adventurer Precision Balance Ohaus AX622 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance")
Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid Ball NC9661590 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar")
Hexane, Mixtures of Isomers Sigma-Aldrich 650544 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane")
Hi/Lo Write-On Temperature Tape Electron Microscopy Sciences 5029927 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL Sigma-Aldrich Z414514 See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL Sigma-Aldrich Z414492 See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL")
Cork Flask Support Ring Sigma-Aldrich Z512419 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring")
Accu-jet Pro Pipette Controller Sigma-Aldrich Z671533 See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller")
Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL Pyrex 13-666-7E See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette")
Rotavapor R II Buchi 2422A0 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator")
Elliptical Bump Trap Chemglass Life Science 501215241 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap")
7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass Supelco 27151 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial")
7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner Supelco 27152 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap")
22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass Supelco 27173 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial")
22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner Supelco 27174-U See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap")
Excellence XS Analytical Balance Mettler-Toledo XS205DU See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance")
5 3/4" Disposable Glass Pipette Fisherbrand NC0418555 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette")
Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly Kimble-Chase 17810-19300 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column")
Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands Fischerbrand 11474207 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand")
3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp Troemner 2300203 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps")
Clamp Regular Holder Fischerbrand 05754Q See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder")
Sand,Washed and Dried Macron Fine Chemical MK-7062-212 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand")
Alumina, Neutral Sorbtech 15740-5 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US
Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL Pyrex 4980-1L See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL Sigma-Aldrich Z100684 See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask")
Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir Sigma-Aldrich Z560553 See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column")
Ethyl Ether Anhydrous Fisher Chemical E138500 See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether")
Alconox Detergnet Sigma-Aldrich 242985 See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox")
Acetone (Certified ACS) Fisher Chemical A18P-4 See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone")

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References

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Isolamento chimico, quantificazione e separazione dei lipidi della pelle da rettili
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Baedke, P. E., Rucker, H. R., Mason, R. T., Parker, M. R. Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles. J. Vis. Exp. (144), e59018, doi:10.3791/59018 (2019).More

Baedke, P. E., Rucker, H. R., Mason, R. T., Parker, M. R. Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles. J. Vis. Exp. (144), e59018, doi:10.3791/59018 (2019).

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