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Environment

화학, 정량화, 고립과 파충류의 피부 지질 분리

doi: 10.3791/59018 Published: February 7, 2019

Summary

파충류, 피부 지질 conspecifics에서 성적 신호 침입 종 관리에서 잠재적인 사용에 대 한 중요 한 있습니다. 우리가 헛간 피부 또는 전체 동물에서 피부 지질을 추출 하기 위한 프로토콜을 설명 하는 여기, 결정 및 총 지질 질량 분석 및 분류를 통해 칼럼 크로마토그래피를 사용 하 여 지질을 분리.

Abstract

파충류 conspecifics 친구 추적 및 평가에 주로 그들의 피부에 지질을 사용 하 여 신호. 이러한 지질 격리는 진화 패턴 및 지질 지구 생명의 진화에서의 방수 역할을 이해 하는 것 외에도 화학 통신의 메커니즘에 초점을 맞춘 연구에 유틸리티가 있습니다. 적용된 방법에서는 이러한 피부 기반 신호 침입 종으로 취급 하는 야생 동물 관리자에 대 한 사용 가능성 있다. 여기에 제시 된 프로토콜에 파충류 피부 지질을 측정 하는 주요 단계 추출, 총 지질 결정 및 분류를 통해 열 착 색 인쇄기, 다음에 할 수 있는 화합물의 순화 있다 결과 후자의 과정 포함 중 복합 신원 (예를 들면, 가스 크로마토그래피-질량 분석 [GC-MS])을 지정 하려면 분석 될 또는 더 세련 된 생물 검정에 직접 사용. 피부 지질 생활 피부에서 추출 될 수 있다, 피부, 또는 전체 죽은 동물, 비 극성 유기 용 매 (예를 들어, 헥 산, 벤젠, 톨루엔)를 사용 하 여 창 고. 추출 solubilizes 지질 그리고, 다음, 용 매 측정 지질 전용 추출을 증발 수 있습니다. 분별에 전통적인 칼럼 크로마토그래피를 통해 특정 있다 총 지질 추출의 분리를 포함 한다. 총 지질 추출 물 (예를 들어, 알 루미나) 기판 기반 열에 바인딩되어 먼저 하 고, 다음, 용 매 특정 볼륨에서의 개별 있다 ("분수") 열 elute 지질 혼합물에서 화합물의 집합을 통해 순차적으로 전달 됩니다. 일반적인 극성을 기반으로 합니다. 비 극성 용 매에서 극 지 용 매 (예를 들어, diethyl 에테르)의 상대적인 양을 증가 하 여 표준화 된 시퀀스에 극성에 분수 진행. 이 원고에서 우리 파충류의 피부 지질을 추출 하기 위한 여러 가지 방법을 설명 하 고, 다음, 제공 표준 프로토콜 기반 극성 화합물의 다른 세트를 격리 하기 위한 전통 칼럼 크로마토그래피를 사용 하 여. 전체 지질 추출 또는 특정 분수 사용할 수 있습니다, 다음, 생물 검정에는 화합물에 의해 거기에 elicited 어떤 생물 학적 활동을 결정 하.

Introduction

파충류에 표 피, 피부 세포에서 직접 또는 동료 평가 추적, 세력권이, 내부-그리고 interspecific 인식1,2 등 사회적 통신에 사용 되는 개별 동맥에서 지질 생산 ,,34. 이러한 피부 지질 격리는 유틸리티 진화 패턴 및 지질 지상파2,3의 진화에의 방수 역할을 이해 뿐 아니라 화학 통신의 메커니즘에 초점을 맞춘 연구에 ,4. 또한, 많은 파충류 squamates (도마뱀, 뱀), 특히 민감한 생태계에 관심사의 침략 적인 종 그리고 페로몬 기반 미끼 트랩 및 제거 향상의 개발은 지속적인5,6. 파충류 피부의 불 침투성의 화학 신호의 잠재적으로 강력한 소스의 비교적 순수한 기사를 현재 지질 추출 용이. 설명된 프로토콜에 파충류 피부 지질을 측정 하는 원리 단계 추출, 총 지질 결정 및 분류를 통해 열 크로마토그래피1,,67포함 됩니다. 방법을은 정기적으로 그들은 많은 메이 트 선택과 뱀2에 특히 선택에 대해 설명 하는 생리 활성 격리 항복으로 사용 되었습니다.

피부 지질 생활 피부, 헛간 피부, 또는 비 극성을 사용 하 여 죽은 모든 파충류 또는 극 지 유기 용 매1,7,,89에서 추출할 수 있습니다. 박물관 표본 에탄올 같은 용 매에 저장 된 피부 지질 추출에 최적 되지 않습니다 고만 싱싱한 갓 냉동 시체 추출 위한 가능한 근원으로 고려 되어야 한다 주목 한다. 피부 지질은 불활성,이 그들이7추출 하기 쉬운 피부를의 표면에 안정적인 게. 파충류 생태에서 그들의 신호 역할, 피부 지질 신호는 가혹한 환경에서 입금 자주 하지만 그들의 강력한 화학 특성 때문에 이러한 신호 수 시간10,11 의 오랜 기간 동안 그들의 정보 가치를 유지 , 12. 추출 과정 지질 추출7 의 측정 질량을 두고 솔벤트의 증발에 의해 다음 시간 동안 흠뻑 젖어 통해 지질, 비 극성 용 매 (예를 들어, 헥 산, 벤젠, 톨루엔)를 사용 하 여 solubilizes , 8. 피부 지질은 매우 비 극성 용 매에 혼합할 수 있는 마찬가지로 다양 한 소스에서에서 다양 한 탄화수소를 추출할 수 있습니다.

분류 추출 보다 더 힘 드는입니다 하지만 특정 분수를 통해 열 착 색 인쇄기, 화합물의 정화 및 가능한 식별에 도움이 거기에1, 로 총 지질 추출 분리 하는 역 6 , 7 , 8. 총 지질 추출 기판 기반 열에 바인딩되어 있고 다음, 용 매 특정 볼륨에서의 개별 있다 ("분수") 열 elute 일반적인 있는 지질 혼합물에서 화합물의 집합을 통해 순차적으로 전달 됩니다 극성6,,78. 지질 크로마토그래피, 일부 극성에 분수 진행 비 극성 용 매에서 극 지 용 매 (예를 들어, diethyl 에테르)의 상대적인 양을 늘려 시퀀스 표준화 (일반적으로 백분율로 표시: 0%, 2%, 4% 에테르, 등. )6,,78. 방법 처럼 얇은 층 크로마토그래피 (TLC) 지질 혼합물에는 간단 하 게 분리 하는 데 사용할 수 있습니다, 열 착 색 인쇄기는 제어, 수 쉽습니다 선호 하는 닫힌된 시스템을 사용 하기 때문에 별도 더 집중 혼합물, 고 호환 효율성에 대 한 다중화 한다. 이 원고에서 우리 파충류의 피부 지질을 추출 하기 위한 여러 가지 방법을 설명 하 고, 다음, 제공 표준 프로토콜 기반 극성 화합물의 다른 세트를 격리 하기 위한 전통 칼럼 크로마토그래피를 사용 하 여. 화학 신호의 격리와 관련 된 많은 연구 프로젝트에 궁극적인 목적은 그 단서에 노출 하는 수신기에 효과 변화입니다. 전체 지질 추출 또는 특정 분수, 사용할 수 있습니다 생물 검정에서 어떤 생물 활성 화합물에 의해 elicited1,2,,67거기에 결정을. 기본적인 생물학 연구, 예를 들어 특정 분수를 사용 하 여 생물 검정 밝힐 수 있다 연구는 페로몬의 순화 소스 고립 되었으며 다음, 대상 화합물의 식별을 위한 방법 추구 될 수 있습니다. 야생 동물 관리 관점에서 식별 목표, 되지 않을 수도 있습니다 그리고 대신, 활성 분수 사용할 수 필드에 트랩 conspecifics를 유치 또는 억제 nonnative 서식 지13,14에서 추적 하는 친구.

Protocol

척추 동물의 사용을 포함 하는 모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 제임스 매디슨 대학에 의해 승인 되었다.

1입니다. 추출

  1. 창 고 스킨 추출
    1. 단일 파충류, 머리 및 샘플 오염 수 cloacal 섹션에서에서 약 30 ㎝2 창 고를 수집 합니다. 클 장갑 착용 하 고 파편의 창 고를 청소.
    2. 포장 가방 균형 또는 보트의 무게와 창 고 (± 0.01 g)를 무게.
      참고: 대량 정밀 균형의 정밀도 의해 결정 됩니다. 창 고 피부 대량 추출된 피부 지질 질량 (아래 참조)에 대 한 표준화 요소 이며 크게 추출한 지질과 covaries 질량.
    3. 더 작은 (5 c m2) 조각으로 창 고를 구분 하 고 (예를 들면, 금속 뚜껑 유리 메이슨 항아리 또는 PTFE 뚜껑 실험실 플라스 크) 헥 산 호환 뚜껑 접착성 유리 컨테이너에 추가 합니다. 완전 잠수함 헛간 피부 조각 컨테이너에 충분 한 헥을 가만히 따르다. 컨테이너 봉인.
      주의: 제 초 제는 가연성, 호흡기 자극, 관련 된 여러 가지 단기 및 장기 건강 위험. 헥 산을 포함 하는 절차는 적절 한 개인 보호 장비 (PPE) (예:스플래시 고글, 클 장갑, 긴 소매, 가까이 터진 신발)을 착용 하는 동안 증기 두건 (실험실) 또는 야외 (필드)에서 수행 됩니다.
    4. 연필 또는 용 매 저항 펜 벗길 레이블을 지정 합니다. 실내 온도 1 박 또는 최대 24 h에서 증기 두건에는 컨테이너를 둡니다.
    5. 깨끗 한 금속 집게 또는 집게를 사용 하 여 창 고 조각을 제거 합니다. 컨테이너에 모든 나머지 hexane을 유지 하려면 조각을 흔들어. 종이 수건;에 건조 피부 조각 허용 다음, 그들을 삭제 합니다. 여러 기사를 수행 하는 경우 각 샘플 사이의 집게/집게 청소. 집게/집게 청소, ~ 50 mL 비 커에 헥에에서 린스.
    6. 추출은 즉시 사용할 수, 경우 가만히 따르다 또는 플라스틱 유리 유리병의 적절 한 볼륨으로 추출, PTFE 줄지어 모자와 함께 봉인, 그것, 및-20 ° c.에 그것을 저장합니다
      주의: 추출 물 hexane에 포함 되므로 방 냉장고에 튜브를 저장 합니다.
  2. 완전히 죽은 동물 추출
    1. 주 둥이 통풍구 길이 기록 (SVL; 센티미터에서)와 질량 (그램) 동물의. 경우 총 지질 또는 페로몬 생산 단위당 피부 표면적의 결정 될 것 이다, (센티미터)에서 최대 몸 둘레를 재단사의 테이프 측정값을 사용 합니다.
    2. 추출, 동물의 길이의 1/3는 직경을 가진 컨테이너를 선택 하십시오. 머리와 cloaca 컨테이너의 하단에 안전 하 게 시체를 위에 놓습니다. 본문의 침수 표면적을 최대화 하기 위해 컨테이너에 충분 한 헥을 가만히 따르다.
      참고: 머리 또는 cloaca 추출에 시간의 금액에 대 한 침수 되 고, 주를가지고 가십시오.
    3. 컨테이너, 라벨 및 실내 온도 1 박 또는 최대 24 h에서 증기 두건에 담가 뚜껑을 보호.
    4. 시체를 제거, 깨끗 한 금속 집게 또는 집게를 사용 합니다. 머리 또는 꼬리에서가 아니라 몸에서 물방울을 함으로써 컨테이너에 시체에 잔여 hexane을 유지 합니다. 컨테이너 봉인.
    5. 추출은 즉시 사용할 수, 경우 가만히 따르다 추출 또는 적절 한 볼륨의 유리 유리병에 플라스틱, PTFE 줄지어 모자와 함께 인감, 그것, 및-20 ° c.에 그것을 저장합니다

2. 지질 대량 결정

참고: 추출 된 지질 질량은 두 가지 방법 중 하나로 결정 될 수 있다: 회전 증발 기를 사용 하 여 유리 유리병 또는 둥근 바닥 플라스 크.

  1. 추출 된 지질 대량 통해 유리 유리병 메서드를 결정 합니다.
    1. 충분 한 크기 (7 mL, 22 mL, 50 mL, )의 preweighed 유리병을 사용 합니다. 총 질량에 뚜껑과 라벨을 포함 하거나 항상 모자와 레이블 없이 유리병 무게 (질량 또한 추가 라벨에 표시). 물 접촉을 피하기 위해 플라스 크의 목에 레이블을 배치 합니다.
      참고: 유리 튜브에 증발 경우 연구원 가스 매니폴드 시스템에 액세스할 수 여러 튜브는 N2 스트림 아래 동시에 증발 될 수 효율적입니다.
    2. 유리병을 추출 전송, 고무 전구 또는 큰 볼륨에 대 한 유리 피 펫을 사용 하 여 추출, 일회용 10 mL 유리 피 펫과 전자 피 펫 컨트롤러. 또한 유리병에 헥 산 및 전송의 ~ 3 mL와 함께 컨테이너를 씻어.
    3. 부드러운 N2 스트림 아래 샘플 증발. 최대 용 매 표면 영역을 활성화 하는 각도에서 유리병을 기울기. 응축 수는 헥 산 증발로 유리병의 외부에 형성할 것 이다.
      참고: 지질의 고리는 헥 산 증발로 유리병에 형성할 것 이다 그래서 주기적으로 추출 소용돌이.
    4. 증발 건조;을 샘플 다음, reweigh입니다. 총 지질 수확량을 기록 합니다.
      참고: 서로 다른 그룹 분석을 위해 표준화는 지질 질량을 창 고에 대량 (지질 질량 [그램] 헛간의 질량 [그램] 100 x로 나눈 수익률 헛간의 백분율 지질 질량) 또는 동물의 SVL (지질 질량 [밀리 그램] SVL로 나눈 값을 센티미터]; 단위 길이 당 지질 질량을 생성) 합니다. 더 큰 동물 생성 더 많은 지질, 그리고 많은 종은 강하게 성적으로 동종이 형, 어떤 데이터에 중요 한 바이어스를 부과.
  2. 추출 된 지질 대량 통해 회전 증발 기를 결정 합니다.
    1. 개별 샘플 당 빠른 증발, 추출 물 preweighed 둥근 바닥 플라스 크에 전송 하 고 회전 증발 기를 사용 하 여 증발.
      1. 미 립 자 추출에서 눈에 띄는 경우, 필터 종이 콘; 플라스 크의 목에에 배치 하 여 샘플을 필터링 그리고 플라스 크를 추출 전송 중력 필터를 허용 합니다. 전체 추출 전송 후 필터 종이의 처분.
        참고: 샘플 볼륨을 전송 (최대 ~ 80% 플라스 크 볼륨) 회전 증발 하기 전에. 로터리 증발 기의 콘덴서에 추출의 모든 버블링 오염 발생 하며 청소를 콘덴서. 범프 트랩 플라스 크와 콘덴서의 목 사이 거품 또는 "지원 해주" 대부분의 샘플에서 발생 하는 경우에, 놓일 수 있다.
    2. 로터리 증발 기 및 물 목욕을 전원을 켭니다 (50 ° C, 용 매 비등 점 보다 낮은). 콘덴서에 차 물 흐름을 켭니다.
      참고: 회전 증발 기의 콘덴서 순환 냉각기 또는 드레인에 빠져나가 차 물 마 개에 연결 된다. 물이 플라스 크를 떠나 고 콘덴서 입력 용 매 증기를 압축 하는 주변 보다 쿨러 흐름 속도 느려질 수 있습니다.
    3. 진공 소스 (물 진공 또는 펌프)를 켭니다. 진공 압력은 콘덴서의 목에 플라스 크를 잡고 충분 한 확인 하십시오. 플라스 크를 연결 하기 전에 콘덴서의 끝에 환기를 엽니다. 콘덴서의 목에 플라스 크를 밀어, 인감, 고 플라스 크를 놓을 때 플라스 크는 콘덴서에서 분리 수 없습니다 환기 있습니다.
    4. ~ 50%는 목욕에 빠져들 때까지 플라스 크를 낮춥니다. 중간 속도에서 플라스 크의 회전을 시작 합니다. 진공, 속도, 콘덴서 흐름, 그리고 목욕 온도 최적의 플라스 크를 떠나 용 매 증기 코일에 응축 하 고 복구 플라스 크에 물방울 것입니다.
      1. 샘플 비등 하는 경우 (예를 들어, 큰 거품 급속 한 가스), 즉시 진공 또는 회전 증발 기의 속도 감소. 계속 끓는 플라스 크 회전을 해제 하 고, 진공을 해제 하 고, 목욕에서 플라스 크 올리고 진공 봉인 해제. 2.2.3 및 2.2.4 단계를 반복 합니다.
        참고: 복구 플라스 크에 없는 용 매를 수집 하지만 추출 분명 증발, 진공 대부분 nonoptimal 이며 재조정 해야 합니다.
    5. (대형-볼륨 추출 물), 플라스 크에서 용 매 남아 ~ 2 mL까지 진공 아래 샘플을 증발 또는 preweighed 플라스 크를 사용 하는 경우와 액체의 구슬까지 증발 한 < 1 cm 직경 플라스 크의 아래쪽에 표시 됩니다. 회전 및 진공; 다음, 목욕에서 플라스 크를 발생 시킵니다.
    6. 봉인 해제; 진공 플라스 크 목 잡아 그런 다음 트위스트를 콘덴서에서 목. 큰 볼륨 플라스 크를 사용 하는 경우 압축 된 추출 물; 보이는 지질 분해를 플라스 크에 소용돌이 다음, 작은 볼륨, preweighed 플라스 크에 피 펫을 통해 솔루션을 전송. 큰 플라스 크를 씻어 그것은 소용돌이, 작은 플라스 크에 플라스틱, 다시 증발 헥 산 3 mL를 추가 (단계 2.2.3-2.2.5).
    7. 추출에 액체의 비드는 헥 산 증발로 응고 됩니다. 일단 건조, 실내 온도 도달 수 있습니다. 지질은 반투명, 흰색 플라스 크 (~ 5 분)에서 노란 왁 스를 형성할 것 이다. 마지막 질량을 얻기 위해 플라스 크의 무게.
      참고: 추출 된 지질 특성에 따라 그들은 있을 것 이다 (예를 들어, 왁 스) 고체 또는 반 고체 (예를 들어, 원유) 속성, 분류 한 지질 (아래 참조) 증발 하는 때에 특히.
  3. 헥 헥 산의 1 mL 당 지질의 ≥1 mg 수익률의 기록된 볼륨에서 지질 solubilize 크로마토그래피를 진행에 대 한 작업 볼륨 ~ 5 mL 이다. 유리병, 유리병을 추출의 대부분을 전송 후 플라스 크를 씻어을 총 볼륨의 2 개 mL를 유지를 플라스 크에서 전송 하는 경우
  4. 튜브 라벨, PTFE 줄지어 모자와 그들을 봉인 하 고-20 ° c.에서 그들을 저장합니다

3. 칼럼 크로마토그래피

참고: 특정 분수, 추출한 지질으로 극성에 따라 알 수 없는 화합물을 분리 하기 위하여 질량 준비에 추가 액체 착 색 인쇄기 열 수 및 표준 차입을 사용 하 여 분류 한.

  1. 열의 준비
    1. 추출에서 지질 질량에 따라 테 플 론 자 지와 큰-또는 작은-볼륨 유리 착 색 인쇄기 열 중 하나를 사용 합니다. 열은 장착 하거나 고정 볼륨 저수지 (큰 열 500 mL, 250 mL 작은 열에 대 한)에 융합. 이제부터,이 프로토콜만 대규모 크로마토그래피 열 저수지에 융합을 말합니다. 철저 하 게 어떤 새로운 유리 제 4;에 설명 된 대로 크로마토그래피에 사용 되는 부품을 청소 그런 다음, 헥 산 또는 다른 비 극성 용 매로 그들을 씻어.
    2. 섬유 유리 모직의 조각을 접어 (길이 [L] x 4 ~ 14 cm 폭 [W] cm) ~ 4 cm x 4 cm의 사각형 형성 될 때까지 반복적으로. 열 보다 더 긴 나무은 못 막대를 사용 하 여 섬유 유리는 열에의 하단에 위치.
    3. 두 개의 클램프 (예를 들어, 회전 또는 모듈) 표준 링 스탠드에 후드, 하나는 자 지 위의 저수지의 목 아래 하나 열을 보호 합니다. 열 수준입니다. 허용 열 아래에서 쉽게 맞게 500 mL 비 커에 대 한 충분 한 작업 거리에 높이에 열을 배치 합니다. 자 지를 엽니다.
    4. 부 어 세차 하 고 모래 ~ 3 cm 유리 섬유 위에 달려있다 때까지 열에 모래를 건조. 열 아래 검은색 또는 어두운 종이 배치 하 고 부드럽게 누릅니다. 모래 모든 탭이 있는 열에서 떨어지면, 섬유 유리 장벽 충분 하지 않습니다. 3.1.4 3.1.2-단계를 반복 합니다.
      참고: 아래쪽에서 유리 섬유를 인출 하는 펼친된 클립은 못 막대의 끝에 테이프를 사용 합니다.
    5. 장소는 열 아래 500 mL 비 커입니다. 천천히 젖은 모래 열 저수지로 100 mL 비 커 또는 졸업된 실린더에서 헥 산 25 mL를 가만히 따르다. 모래 위의 헥 산의 ~0.5 cm 되는 자 지를 닫습니다.
    6. 중립 알 루미나 밖으로 무게. 각 작은 열 사용 ~ 50 g; ~ 각 큰 열 175 g입니다. 1 L 삼각 플라스 크에는 알 루미나를 부 어. 플라스 크 1 L 당 400 g을 제한 합니다.
    7. 알 루미나 (III 활동) 활성화, 6%는 알 루미나의 볼륨의 이온된 수를 플라스틱 질량 (, 알 루미나의 100 g에 대 한 추가 물 6 mL). 알 루미나에 걸쳐 방울으로 물을 추가 합니다.
    8. 커버 알루미늄 호 일 또는 코르크 플라스 크. 적극적으로 소용돌이 (동요 하지 않는) 충전을 균등 하 게 분산. 아니 보이는 덩어리 남을 때까지 계속 합니다.
      참고: 예상 되는 알 루미나와 물을 반응으로 플라스 크가 따뜻한 것입니다.
    9. 알 루미나는 완전히 덮여, 헥 산 위에 알 루미나의 ~0.5 cm까지 제 초 제를 추가 합니다. 슬러리를 플라스 크를 소용돌이 친다.
    10. 열과 열 아래 500 mL 유리 비 커의 저수지에 발명된 깔때기를 배치 합니다. 자 지를 엽니다. 소용돌이 알 루미나와 꾸준히 열에 그것을 붓는 다. 알 루미나를 균등 하 게 정착 하 여 열에 더 큰 거품 또는 알 루미나 열에 형성 되 고 균열을 확인 합니다. 부드럽게 열을 균등 하 게는 알 루미나를 정착의 측면을 누릅니다.
      참고: 추가 hexane 슬러리를 유지 하기 위해 추가 쏟아지는 대 한 추가 되어야 합니다. 열 비 커에 수집 헥 산 유리 비 커에 깨끗 한 경우 재사용할 수 있습니다.
    11. 열은 알 루미나의 상단은 안정적이 고 ~ 4 cm의 저수지의 열 목 아래 때 형성 된다. 한 피 펫을 사용 하 여 잔여 알 루미나에 대 한 제 초 제와 저수지의 내부를 헹 굴. 부드럽게 퍼 널을 사용 하 여, 저수지 아래 ~ 1 cm에 알 루미나, 위에 모래의 두 번째 레이어를 추가 합니다.
      참고: 헥 산 것 이다 흐름 열에서 자 지는 계속 열려. 건조 열을 게 하지 마십시오. 경우에 열을 밖으로 마르면, 과정 시작 해야 합니다 다시 단계 3.1.2에서 시작. 프로토콜 열 분류 전날 준비 하는 경우 여기 중지 될 수 있습니다. 단단히 저수지 상단에 코르크를 배치 하거나 호 일로 단단히 커버. ~ 100 mL의 헥에 저수지를 채우십시오. 자 지를 조여.
  2. 지질 추출의 분류
    참고: 열 크기에 지질 추출의 분수 수 있습니다 개별적으로 수집 되며 어떤 알려진/식별 대상 화합물을 포함 하지 않는 경우 그들의 분수 극성에 따라 또는 폐기를 완전히 풀링된. 복제 차입의 라운드 (n = 3 볼륨) 지질의 충분 한 차입 되도록 열을 통해 전달 됩니다. 큰 열 차입에 대 한 표 1 에 따라 (발췌와 대량 > 30 mg) 또는 작은 열 차입 (발췌와 대량 < 30 mg). 표 2에 메 틸 ketones를 격리 하기 위한 맞춤형된 차입 프로토콜이입니다.
    1. 대용량 피 펫을 사용 하 여 열의 상단에서 나머지 hexane을 제거 하거나 깨끗 한 비 커에 물방울을 헥 산을 허용 합니다. 열 위쪽에 모래 위에 헥 ~ 3 mL를 남겨 주세요.
      참고: 경우에 연락을 깨끗 한 유리 첫 번째 분수에 재활용 될 수 있습니다 수집된 헥 산 순수입니다.
    2. 긴 유리 피 펫을 사용 하 여 열을 지질 추출 전송. 천천히 모래 층을 방해 하지 않으려면 추출 플라스틱. 추출 유리병 또는 헥 산의 ~ 5 mL로 플라스 크를 헹 구 고 열에 그것을 전송.
      참고: 추출 물-20 ° C에 저장 된, 침전 된 수는 지질. 더 이상 침전 표시 될 때까지 유리병을 따뜻한.
    3. 자 지를 열고 샘플 열에 로드할 수 있도록 합니다. 추출의 큰 질량은 경우 (> 30 mg), 노란 밴드 알 루미나, 바로 상단에 모래 아래에 볼 수 있습니다. 이 제 초이 제는 더 이상 깨끗 한 폐기물 비 커를 통해 흐름을 수집 합니다. ~ 3 mL 모래 위에 남아 있는 자 지를 닫습니다.
      주의: 이제는 알 루미나와 열에 바인딩된 추출에서 지질을 건조 수 없습니다 또는 샘플 손실 됩니다.
    4. 첫 번째 분수 하 고 있는걸 전에 열 아래 preweighed 및 레이블이 라운드 바닥 플라스 크 (100 mL, 250 mL, 500 mL)를 배치 합니다. 일반적인 유리 용기에 폐기 하는 분수를 수집할 수 있습니다.
    5. 첫 번째 분수 준비 (100% 헥 산: 0 %diethyl 에테르 [지금까지, "에테르"]) 졸업된 실린더에. 경우 사전에 분수와 코르크 마 개 또는 호 커버를 준비.
      참고: 분수 진행에 극성; 따라서, 실린더 분수 사이 씻어 서 필요가 없습니다.
    6. 추가 붓는 통해 발명된 유리 깔때기로 저수지에 첫 번째 분수 모래 레이어를 방해 하지 않도록 저수지 쪽으로 이동 합니다. 자 지는 차입을 시작을 엽니다. 헥 산의 ~ 3 mL 열의 상단에서 모래 위에 남아 있는 자 지를 닫습니다.
      참고: 절대는 eluate의 대다수를 수집 하기 전에 자 지를 폐쇄 하 여 개별 분수 내 차입을 중지 합니다. 분수, 사이 지연 품질과 반복성은 차입의 변경할 수 있기 때문에 ~ 1 h 이상 폐쇄 자 지를 두지 마십시오.
    7. 단계-3.2.4 3.2.6 분수 2와 3에 대 한 반복 합니다. 분수는 풀링된 되 고 하는 경우에 특히 headspace 회전 증발에 대 한 허용 하는 적절 한 크기의 플라스 크에서 분수를 수집 합니다.
    8. 4 분수 (2% 에테르)를 준비 하 고 저수지에 추가. 열 아래에서 다음 플라스 크를 배치, 자 지, 열고 4 분수를 수집 합니다. 5 분수; 준비 그런 다음, 필요에 따라 계속.
      참고: 그것은 첫 번째 fraction(s) 통해 로타리 증발 연속 분수를 수집 하는 동안 증발 수 있습니다.
    9. GC-MS 분석에 사용 되는 분수를 준비, 0.01 이나 0.1 mg 정밀도 균형을 사용 하 여 분수 질량을 얻을. 헥 산의 1 mL 당 지질의 1 mg를 지질 분수 solubilize

4. 청소

  1. 자 지를 열어두고 하 고 폐기물 비 커에 열 반전. 알 루미나 및 모래 열; 실행할 것 또는, 과정을 신속 하 게 흔들. 못 막대를 사용 하 여 그것이 붙어있다 면 섬유 유리 모직을 인출 (유리를 긁힘 방지) N2 스트림과 함께 그것을 밖으로 날 려 나.
  2. Dissemble 고 모든 유리, 유리 브러쉬 (머리와 플라스틱 bristles) 플라스틱 욕조에 뜨거운 물에 실험실 급 세제를 사용 하 여 청소. 3 배를 씻어. 유리는 더 이상 접촉에 매끄러운 때까지 충분히 따뜻한 물으로 잘 헹 구 십시오.
  3. 유리를 헹 구 고 이온을 제거 된 물으로 배를 도구. 건조 선반에 넣어. 건조를 가속, 작은 볼륨 추가 유리 그릇에 아세톤 (3 mL), 소용돌이, 그리고 그것을 건조 하거나 N2 스트림 아래 그것을 실행 하는 것을 허용.

Representative Results

다음 추출, 총 지질 질량은 여기에 제시 된 프로토콜을 통해 취득 될 수 있는 데이터의 첫 번째 유형은. 그러나, 총 지질 질량 값 없이 얻은 값을 표준화 하려고 일부 결코 분석 되어야 합니다. 몇 가지 방법을 사용할 수 있습니다, 하지만 추출된 지질 질량 (센티미터)에서 동물의 SVL 또는 추출 된 헛간 피부의 질량을 표준화 하는 것이 좋습니다. 길이 당 지질 질량 값에 후자 전 결과 소스의 비율을 될 것입니다 질량. 표준화에 대 한 이유는 큰 총 피부 표면적을가지고 있기 때문에 더 큰 동물 자연스럽 게 더 많은 피부 지질을 생산. 그림 1A 는 어디의 질량으로 선형 추출된 피부 지질 대량 비늘 창 추출 피부 고이 협회를 예로 보여주. 일단 총 헛간 피부 대량 표준화,이 선형 관계는 완전히 제거 (그림 1B).

분별, 다음 동일한 표준화 접근의 개별 부분 (그림 2)와 함께 사용할 수 있습니다. 이 샘플 데이터 집합에서 각 분수는에 기여 하지 똑같이 총 추출된 지질 질량: 중립 지질 (분수 1-3) 더 많은 극 지 지질 (분수 4-6, 7-9, 및 10-12)의 각 세트에 비해 대량 비율에 의해 화합물의 지배적인 설정 됩니다.

Figure 1
그림 1: 간의 관계 추출 지질 대량와 입력 자료. (A) 파충류, 총 창 고 간의 관계 피부 질량 및 추출 된 피부 지질 질량 긍정적으로 상관 (P < 0.001). (B) 때 추출 된 피부 지질 질량은 질량 흘렸다 총 표준화 (대량 헛간을 나눈 지질 대량),이 관계는 더 이상 존재 (P = 0.46). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 분수 대 중 차입에 따라 표준화. 칼럼 크로마토그래피를 사용 하 여, 피부 지질 추출 물 복합 극성에 따라 분수에 eluted 될 수 있습니다. 분수 질량은, 다음, 총 지질 추출 (분수 질량 [밀리 그램] [밀리 그램에 있는 총 지질 추출 물 질량으로 나눈 값)의 비율로 표현 차이 분수 또는 실험적인 그룹8결정. 막대는 의미를 나타냅니다. 최상위 오류는 SEM; 아래 오류는 95 %CI. 개별 데이터 요소는 편의상 제공 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 메 틸 케 톤 분수의 대표적인 가스 chromatographs. (A) 적절 한 차입으로 메 틸 케 톤 분수 7 표 2 에서 가장 풍부한 화합물 이며 봉우리의 대련으로 볼 수 있습니다 (유지 시간 = 24-34 분). 그러나 (B) 분수 6 표 2,, 단지 nontarget 화합물을 생성합니다. 이 같은 결과 극 지 용 매 모바일 단계에 사용 기간이 만료 된 때 또는 열 시간의 오랜 기간 동안 중지 된 경우 발생할 수 있습니다 (> 1 h) 분수 사이. 두 추적 분자 풍부에서 차이 note 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

분수 제 초 제 (mL) Diethyl 에테르 (mL)
1,2,3 100 [30] 0 [0]
4,5,6 98 [29.4] 2 [0.6]
7,8,9 96 [28.8] 4 [1.2]
10,11,12 92 [27.6] 8 [2.4]
13,14,15 84 [25.2] 16 [4.8]

표 1: 피부 지질 분류에 대 한 표준 차입 볼륨. 솔벤트 볼륨 및 백분율 크로마토그래피 열 알 루미나 (행위 III)를 사용 하 여 대규모 (예를 들어, 250 mL)와 [작은 볼륨] (예를 들어, 100 mL) 모두에 대 한 주어 집니다. 제 초 제는 캐리어 용 매; diethyl 에테르 모바일 단계입니다.

분수 제 초 제 (mL) Diethyl 에테르 (mL) 노트
1, 2, 3 30 0 elute; 수집 하지 않습니다
4, 5 28.8 1.2 elute; 수집 하지 않습니다
6, 7, 8 28.8 1.2 개별적으로; 수집 메 틸 케 톤의 대다수 질량 분수 7;에 있을 것입니다 6, 8는 ketones의 적절 한 차입 되도록 GC-MS 품질 관리 검사를 실행 한다

표 2:가 터 뱀 메 틸 케 톤에 대 한 수정 된 차입 계획. 이 볼륨은 현재 사용할 수의 브랜드와 작은 볼륨 크로마토그래피 열 함께 사용 하기 위해. 메 틸 케 톤에 대 한 긍정적인 eluted 분수 야생, 남성가 터 뱀1,7구애와 필드 분석에 강한 bioactivity를 있다. 메 틸 대상 분수, 샘플에서에서 ketones 1 mg/mL를 희석 수 있습니다 및 분석 을 통해 GC-미스의 존재를 확인 하려면 그림 3 차입에 따라 긍정적이 고 부정적인 결과 대 한 대표 chromatograms을 제공 합니다.

Discussion

파충류의 피부 지질 추출 헛간 피부,이 기술 실험 적용에 다양성을 제공 이외에 생활 또는 죽은 피부에 적용할 수 있습니다. 또한, 피부 지질 기사 생물학2,13의 다양 한 방법의 동적 응용 프로그램을 사용 하는 필드에서 수행할 수 있습니다. 피부 지질 추출은 간단 하다; 따라서, 그것은 쉽게 실험 또는 디자인, 필요에 따라 추출 최대 규모 이며 실무자 메서드를 실행 하려면 상당한 전문성을 가질 필요가 없다. 확장에 대 한 유일한 제한 요소는 연기 후드 공간의 가용성, 깨끗 한, 접착성 유리와 용 매 저장 공간입니다.

피부 지질 추출 분류 연구자의 요구에 맞게 수 있으며, 따라서, 지질 추출에 비슷한 유연성. 예를 들어, 중립 지질 eluted 고 후 삭제, 대상 분수 관심사의 화합물을 정화 하거나 단순화 생물 검정에서에서 결과. 분류 및 지질 샘플에서 여러 스케일에서 수행할 수 있습니다. 예를 들어 여러 열 보다 효율적으로 프로세스를 동시에 실행할 수 있습니다. 또는, 총 지질 추출의 단지 부분에, 따라서, 시 약 및 시간 작은 열에 fractionated 수 있습니다. 분류 총 지질 추출의 질량 및 연구원 수 장비의 정밀도 의해 주로 제한 됩니다. 예를 들어 있으면 연구원 10.0 mg 정밀도, 분수의 균형 질량 및, 따라서, GC-MS 분석을 위한 시료 준비의 정확성은 크게, 아니라면 완전히 장애가. 유리는 마찬가지입니다. 연구원 분류에 대 한 대규모 열만 별도로 작은 총 지질 질량, 경우 차입 또는 화합물의 분리 진행 된다 하지만 용 매, 시 약, 시간, 및 잠재적으로, 대상의 중요 한 소모를 요구할 것 이다 스스로 화합물.

표 2에서 보듯이 차입 계획을 결정 하기 전에 품질 관리 검사를 수행 하 고 어떤 분수 삭제 될 수 있습니다 결정 하는 것이 좋습니다. 원하는 지질, 열의 차입을 확인 하 수 있습니다 실행 각 분수, 1-15를 개별적으로 수집 하 고 다음 분석 하는 어디 사용 GC-MS. 그림 3에서는 대표적인 가스 크로마 토 그래프 추적이 터 훈장 뱀이에서 메 틸 케 톤만에 특정 열에서 elute 보여줍니다. 이 품질 관리 단계를 수행 하 여 관심의 화합물의 최대 수익률을 보장 하기 위해 특정된 종족에 대 한 수정 된 차입 계획을 개발할 수 있습니다. 공급 업체 또는의 많은 diethyl 에테르의 나이 등 재료에 변화 차이 대 한 품질 관리 테스트를 수행 하 여 제어 해야 하는 차입에 절대적으로 발생 합니다.

설명 된 기술은 얻을 수 있는 단서의 화학 본질에 의해 주로 제한 됩니다. 주로, 이러한 메서드는만 연구원 분리 하 고 긴 체인 지질 파충류의 피부에서 분리 수 있습니다. 많은 종의 파충류 화학 신호로 공 수 및 배치할 신호를 사용 하 고 설명된 방법 분리 했다 단서와 호환 되지 않습니다. 또한, 비 극성 용 매 하지 파충류의 표면 또는 큐 증 착의 (예를 들어, 케이지 물, 대변, 수생 기판) 참으로 풍부한 화학 신호를 포함할 수 있는 소스에서 수성 신호를 추출할 것 이다. 비록, 이러한 유형의 신호 캡처에 대 한 적절 한 메서드 (예를 들어, 고체 상 미 [SPME] 휘발성 신호를 고성능 액체 크로마토그래피 [HPLC] 수성 단서), 연구원에 게 사용할 수 있습니다 같은 방법 위에서 설명한 기술 학습 곡선입니다.

가장 중요 한 것은, 연구원을 최종 화학 혼합물의 유틸리티 사용 방법을 안내 한다. 예를 들어 연구원 경우 남성 초점 동물 대상된 생물 검정에 남성 여성 conspecifics를 제작한 신호를 구별할 수 있습니다 알고 싶다면, 추출 하는 유일한 방법 필요한2,3입니다. 그러나 성적으로 동종이 형 화합물의 식별 목표 하는 경우에,, 추출에 게 서, 특정 분자 또는 분자를 통해 화학 분석1,의 그룹에 식별 할당에 큰 자신감 수 있도록 정화 6,,911. 그러나, 심지어 지질 소스와 크로마토그래피를 실시, 추출 시작의 중요 한 대량은 필요 측정 분수 질량은 얻어질 수 있다; 그렇지 않으면, 샘플의 풀링 추구 될 수 있지만 최적의14아니에요.

이 프로토콜의 미래 개발 활용 하 고 더 많은 파충류 종에 대 한 절차를 적용 하는 조치를 포함 합니다. 피부 지질을 추출의 추가 비 침 투 적인 방법 또한 개발 되고있다.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 방법, 특히 창 고 피부 지질 추출의 개발 중에 발생 한 제임스 매디슨 대학 (JMU)와 미국 농 무부 동물 사이 협력 계약 (14-7412-1061-CA, 15-7412-1155-CA, 및 16-7412-1269-CA) 과 건강 검사 서비스 (진딧물) 공장. 창 고 스킨 방법의 개발을 다음 학생 들의 기여를 인정 하는 M.R.P.: S. 파 텔 (워싱톤과이 대학 [WLU]), 제이 Zachry (WLU), R. 플로레스 (JMU), J. Noll (JMU), 그리고 미 애쉬 튼 (JMU).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Powder-free Chloroprene Gloves Microflex NEC-288 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.2 "gloves")
Ohaus Adventurer Precision Balance Ohaus AX622 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.3 "balance")
Freund Container Ball 16oz Mason Jar & Lid Ball NC9661590 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.5 "mason jar")
Hexane, Mixtures of Isomers Sigma-Aldrich 650544 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.6 "hexane")
Hi/Lo Write-On Temperature Tape Electron Microscopy Sciences 5029927 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.8 "tape")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 500 mL Sigma-Aldrich Z414514 See "2. Extraction" (step 2.1.2.4 "500 mL")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 100 mL Sigma-Aldrich Z414492 See "3.2 Fractionating" (step 3.2.4 "100 mL")
Cork Flask Support Ring Sigma-Aldrich Z512419 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "cork support ring")
Accu-jet Pro Pipette Controller Sigma-Aldrich Z671533 See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "electric pipette controller")
Disposable Individually Wrapped Glass Serological Pipets, 10 mL Pyrex 13-666-7E See "2. Extraction" (step 2.1.1.3 "10 mL pipette")
Rotavapor R II Buchi 2422A0 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "rotary evaporator")
Elliptical Bump Trap Chemglass Life Science 501215241 See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "bump trap")
7 mL Vials, Screw Top, Clear Glass Supelco 27151 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "7 mL vial")
7 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner Supelco 27152 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap")
22 mL Vials, Screw Top, Clear Glass Supelco 27173 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "22 mL vial")
22 mL Vial Screw Cap, Solid Top with PTFE Liner Supelco 27174-U See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "cap")
Excellence XS Analytical Balance Mettler-Toledo XS205DU See "2. Extraction" (step 2.1.2.1 "balance")
5 3/4" Disposable Glass Pipette Fisherbrand NC0418555 See "1.1 Shed Extraction set-up" (step 1.1.11 "pipette")
Chromatography column with PTFE Stopcock Assembly Kimble-Chase 17810-19300 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "small glass column")
Cast-Iron L-Shaped Base Support Stands Fischerbrand 11474207 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "support stand")
3-Prong Dual Adjust Nickel-Plated Zinc Clamp Troemner 2300203 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamps")
Clamp Regular Holder Fischerbrand 05754Q See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.1 "clamp holder")
Sand,Washed and Dried Macron Fine Chemical MK-7062-212 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.5 "sand")
Alumina, Neutral Sorbtech 15740-5 See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.7 "alumina"); only known manufacturer in the US
Narrow-Neck Heavy-Duty Glass Erlenmeyer Flask, 1000mL Pyrex 4980-1L See "3.1 Preparing the column" (step 3.1.6 "Erlenmeyer flask")
Single-Neck Round-Bottom Flask, capacity 250 mL Sigma-Aldrich Z100684 See "3.1 Preparing the column" (step 3.2.4 "250 mL round bottom flask")
Calibrated Chromatography Column with Solvent Reservoir Sigma-Aldrich Z560553 See "3.2 Preparing the column" (step 3.2.1 "large glass column")
Ethyl Ether Anhydrous Fisher Chemical E138500 See "3.2 Fractionating" (step 3.2.5 "ether")
Alconox Detergnet Sigma-Aldrich 242985 See "4. Cleaning" (step 4.2 "Alconox")
Acetone (Certified ACS) Fisher Chemical A18P-4 See "4. Cleaning" (step 4.4 "acetone")

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References

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화학, 정량화, 고립과 파충류의 피부 지질 분리
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Baedke, P. E., Rucker, H. R., Mason, R. T., Parker, M. R. Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles. J. Vis. Exp. (144), e59018, doi:10.3791/59018 (2019).More

Baedke, P. E., Rucker, H. R., Mason, R. T., Parker, M. R. Chemical Isolation, Quantification, and Separation of Skin Lipids from Reptiles. J. Vis. Exp. (144), e59018, doi:10.3791/59018 (2019).

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