Summary
Optisk kohærens tomografi (OCT), en tre-dimensionel tænkelig teknologi, blev brugt til at overvåge og karakterisere vækst kinetik af flercellede tumor spheroids. Præcise volumetriske kvantificering af tumor spheroids ved hjælp af en voxel tælle tilgang og etiket-fri dødt væv påvisning i spheroids baseret på iboende optiske svækkelseskarakteristika kontrast, blev demonstreret.
Abstract
Tumor spheroids er blevet udviklet som en tre-dimensionelle (3D) celle kultur model i kræft forskning og anti-cancer drug discovery. Men i øjeblikket, høj overførselshastighed imaging modaliteter udnytte lyse felt eller fluorescens detektion, er afskåret fra løse den samlede 3D-struktur af tumor klumpformet på grund af begrænset lys penetration, diffusion af fluorescerende farvestoffer og dybde-resolvability. For nylig, viste vores lab brugen af optisk kohærens tomografi (OCT), en etiket-fri og ikke-destruktiv 3D imaging modalitet for at udføre langsgående karakterisering af flercellede tumor spheroids i en 96-brønd plade. OCT var i stand til at opnå 3D morfologiske og fysiologiske oplysninger af tumor spheroids vokser op til ca. 600 µm i højden. I denne artikel viser vi en høj overførselshastighed OCT (HT-OCT) billedbehandlingssystem, der scanner hele multi godt pladen og henter 3D OCT data af tumor spheroids automatisk. Vi beskrive detaljerne i HT-okt system og byggeri retningslinjer i protokollen. Fra 3D OCT data, man kan visualisere den overordnede struktur af sfæroide med 3D afsmeltet og ortogonale skiver, karakteriserer den langsgående vækstkurve af tumor klumpformet baseret på de morfologiske oplysninger for størrelse og mængde, og overvåge vækst af regionerne døde celler i tumor klumpformet baseret på optiske iboende dæmpning kontrast. Vi viser, at HT-OLT kan bruges som en høj overførselshastighed imaging modalitet for stof screening samt kendetegner biofabricated prøver.
Introduction
Kræft er den næststørste årsag til dødsfald i verden1. Udvikle lægemidler rettet mod kræft er af afgørende betydning for patienter. Dog er det anslås at mere end 90% af nye anti-cancer medicin ikke i udviklingsfasen på grund af manglende effektivitet og uventede toksicitet i kliniske forsøg2. En del af grunden kan henføres til brugen af simple todimensionale (2D) celle kultur modeller for sammensatte screening, som giver resultater med begrænset prædiktive værdier af sammensatte effekt og toksicitet for de følgende faser af drug discovery2 , 3 , 4. seneste, tre-dimensionelle (3D) tumor klumpformet modeller har udviklet for at give klinisk relevante fysiologiske og farmakologiske data for anti-cancer drug discovery3,4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. Da disse spheroids kan efterligne væv-specifikke egenskaber af tumorer i vivo, som næringsstoffer og ilt kan gradient, hypoksiske kerne samt drug modstand19, brugen af disse modeller potentielt forkorte drug discovery tidslinjer, reducere udgifterne til investeringer, og bringe nye lægemidler til patienter mere effektivt. En kritisk tilgang til evaluering af sammensatte effekten i 3D tumor klumpformet udvikling er at overvåge klumpformet vækst og fornyet under behandlinger9,26. For at gøre dette, er kvantitative beskrivelser af tumor morfologi, dens diameter og mængde med høj opløsning billeddiagnostiske modaliteter, bydende nødvendigt.
Konventionelle billeddiagnostiske modaliteter, som lyse-felt, fase kontrast7,9,22,24og Fluorescens mikroskopi8,9,16, 18,22 kan give en måling af den sfæroide diameter, men kan ikke løse den overordnede struktur af klumpformet i 3D-rum. Mange faktorer bidrager til disse begrænsninger, herunder udbredelsen af den dybdeborende lys i klumpformet; Diffusion af de fluorescerende farvestoffer i klumpformet; udsender fluorescerende signaler fra spændte fluorescerende farvestoffer inde eller på den modsatte overflade af klumpformet på grund af stærk absorption og spredning; og dybde-resolvability af disse imaging modaliteter. Dette fører ofte til en unøjagtig volumen måling. Udvikling af nekrotisk kernen i spheroids efterligner nekrose i i vivo tumorer6,10,15,19,25. Denne patologiske funktion er usandsynligt gengivet i 2D celle kulturer19,25,27,28. Med en klumpformet størrelse større end 500 µm i diameter, en tre-lags koncentriske struktur, kan herunder et ydre lag af celler, et midterste lag af inaktiv celler og et nekrotisk kerne, observeres i klumpformet6,10 ,15,19,25, på grund af mangel på ilt og næringsstoffer. Levende og døde celle fluorescens imaging er standardmetoden til at mærke grænsen for de nekrotiske kerne. Dog igen, hindrer gennemføringer af både disse fluorescerende farvestoffer og synligt lys potentiale at sonde ind i nekrotisk kernen til at overvåge udviklingen i dens aktuelle form.
En alternativ 3D imaging modalitet, er optisk kohærens tomografi (OCT) indført for at karakterisere tumor spheroids. OCT er en biomedicinsk billedbehandling teknik, der er i stand til at erhverve etiket-fri, ikke-destruktiv 3D data fra op til 1-2 mm dybder i biologisk væv29,30,31,32,33 ,34. OLT anvender lav-sammenhæng interferometri at opdage back-spredt signaler fra forskellige dybder af prøven og giver rekonstruerede dybde-løst billeder på mikro-niveau rumlige resolutioner i sideretningen og lodret retning. OCT har været udbredt i oftalmologi35,36,37 og angiografi38,39. Tidligere undersøgelser har brugt OCT at observere morfologi af in vitro- tumor spheroids i basalmembranen matrix (f.eks.Matrigel) og evaluere deres svar til Fotodynamisk terapi40,41. For nylig, etableret vores gruppe en høj overførselshastighed OCT imaging platform til systematisk overvågning og kvantificere vækst kinetik af 3D tumor spheroids i multi godt plader42. Præcise volumetriske kvantificering af 3D tumor spheroids ved hjælp af en voxel tælle tilgang og etiket-fri nekrotisk væv påvisning i spheroids baseret på iboende optiske svækkelseskarakteristika kontrast blev demonstreret. Dette papir beskriver detaljerne i hvordan OCT imaging platform blev bygget og ansat til at opnå høj opløsning 3D billeder af tumor spheroids. De trinvise kvantitative analyser af vækst kinetik af 3D tumor spheroids, herunder præcise målinger af klumpformet diameter og mængder, er beskrevet. Også, metoden for ikke-destruktiv påvisning af nekrotisk væv områder ved hjælp af OLT, baseret på de iboende optiske svækkelseskarakteristika kontrast er præsenteret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af celler
- Få cellelinjer fra en kvalificeret leverandør.
Bemærk: Verificer, at celler fra cellelinjer interesse kan danne klumpformet i kultur medier eller ved hjælp af et substrat (basalmembranen matrix som Matrigel). Undersøge litteraturen9 eller udføre en runde af en pre eksperiment for en check. - Optø frosne celler efter den særlige procedure cellelinie leverandøren. En generel procedure kan findes andetsteds43.
- Kultur celler for 1-2 passager i 25 cm2 kultur kolber. Cellerne er derefter klar til brug for 3D cellekultur.
- Overvåge sundhedstilstanden af celler hver dag og fastholde dem i en inkubator under standardbetingelser (37 ° C, 5% CO2, 95% fugtighed). Opdater medierne efter behov.
Bemærk: Substratet består af DMEM (4,5 g/L glukose), 1% antibiotikum-antimykotikum, 10% føtal bovint serum. Subkultur celler før de når sammenløbet i kultur kolben. Følg den celle kultur retningslinje leveres af leverandøren. En generel procedure kan findes elsehwhere44. - Udføre 3D cellekultur i multi godt plader baseret på de følgende generelle protokol9.
- Fjern kultur medier fra kultur kolben og vaske det med steriliseret fosfatbufferet saltopløsning (PBS, opvarmet til 37 ° C).
- Resuspend celler ved tilsætning af 1 mL af trypsin ethylendiamintetra syre (EDTA, 0,5%) i kolben i 3 min. Derefter tilføje kultur medier for at fortynde trypsin.
- Overføre cellesuspension i en 15 mL centrifugeglas, og der centrifugeres i 5 min på 500 x g og stuetemperatur.
- Fjern supernatanten og resuspend celler med 4 mL af pre varmede næringssubstratet. Tilsæt en dråbe af prøven på en hemocytometer til celle optælling for at bestemme celle koncentration. Fortynd celler til passende koncentration for såning (f.eks.3.000 celler/mL).
Bemærk: Optimere den oprindelige celle koncentration af klumpformet for hver celle-linje og hver type af multi godt plade (96-brønd, 384-godt eller 1536-godt). - Frø celler ind i en ultra-lav vedhæftet fil (ULA) rundbundet multi godt plade. Tilføje 200 µL af celler suspension i hver brønd i koncentration på 3.000 celler/mL, således at hver godt har ca. 600 celler.
- På RT, der centrifugeres hele pladen ved hjælp af en plade adapter til 7 min, lige efter såning, på en af 350 x g eller den laveste hastighed fås.
Bemærk: Centrifugen hjælper med at samle celler til midten af godt at lette danner en enkelt, ensartet klumpformet. Centrifuge trin udføres kun en gang i starten for at danne tumor spheroids. Det vil ikke blive gentaget når tumor spheroids begynder at vokse. - Vedligeholde flere godt pladen på 37 ° C og 5% CO2 i en kultur inkubator og opdatere kultur medierne hver 3 dage.
Bemærk: Vækst tid kan variere for forskellige 3D kultur betingelser. I vores undersøgelse anvendes 3.000 celler/mL til både U-87 MG og HCT 116 cellelinjer i 96-brønd plader, således at sfæroide kan vokse til ~ 500 μm i 4\u20127 dage for HCT 116 celler. Overvej at tilføje medier kosttilskud og vækstfaktorer for forskellige klumpformet modeller, baseret på generelle 3D kultur protokol. - Udføre OCT billeddannelse af tumor spheroids hver 3\u20124 dage for en langsgående undersøgelse af deres vækst.
Bemærk: Anbefalede tid point for OCT imaging ville være dag 4, dag 7, dag 11, dag 14, dag 18 og dag 21.
2. høj overførselshastighed okt Imaging Platform
Bemærk: Se henvises til arbejde29,30,31,32,33,34 for en grundig gennemgang af principper og applikationer i OLT. Se figur 1 og Huang et al. 42 for yderligere oplysninger om brugerdefinerede OLT imaging system, der anvendes i denne undersøgelse.
- Vælg en passende bredbånd lyskilde OCT system for tumor klumpformet billeddannelse.
Bemærk: Her, en superluminescent diode (SLD, figur 1A,B) med en central boelgelaengden ~ 1.320 nm og ~ 110 nm båndbredde blev brugt som en bredbånd lyskilde. - Konstruere reference arm og prøve arm af OCT systemet efter skema (Se figur 1A,B for detaljer). Se Tabel af materialer til en liste over optiske komponenter til at konstruere OCT system. Sikre at lysvej reference arm og prøve arm tæt matches.
- Konstruere spektrometer, herunder en kollimator, en rist, en F-theta linse og en linje-scan kamera (Se figur 1 c for setup34) for detaljer om spektrometer design af oktober alternativt vælge en kommerciel spektrometer, som svarer til den Center bølgelængde på lyskilden. Sørg for, at spektrometeret er justeret korrekt for at dække hele laser båndbredde, at opnå høj photon samling effektivitet og give langsom wash-out af interferensmønster.
- Karakterisere udførelsen af OCT system, herunder følgende målinger som stikprøven arm magt, samlede imaging dybde, dybde-afhængige følsomhed, aksial opløsning, dybden af fokus og lateral opløsning. Placer en svag reflektor (fx, et spejl med et filter med neutral tæthed) som en prøve at måle dybde-afhængige følsomhed, aksial opløsning og dybden af fokus. Placere en USAF opløsning test chart mål som prøve hen til indskrive den laterale opløsning.
Bemærk: Se henvisninger34,45 for definitioner af måleparametre OCT ydeevne og protokoller til at karakterisere disse målinger45. Se tabel 1 for en liste over de målte parametre for brugerdefinerede OCT systemet anvendes i vores undersøgelse. - Vælg en motoriseret oversættelse fase at give vandret bevægelse af multi godt pladen til billede tumor spheroids i forskellige brønde (Se figur 1B). Bruge en fase med en travel vifte større end 108 mm x 72 mm til at sikre en fuld scanning af alle brønde af multi godt plade. Brug en 2D eller 3D motoriseret oversættelse fase med software kontrol til at aktivere præcise placering af hver brønd og automatisering af OCT system for høj overførselshastighed billeddannelse.
- Brug en tilslutningsenhed til plade eller designe en plade holder (af 3D udskrivning) for at holde multi godt pladen i en fast stilling.
- Rette hældning og rotation af multi godt plade ved hjælp af en 2D vippe fase og en rotation fase monteret på translationel scenen (Se figur 1 D), før du udfører nogen OCT imaging for at minimere variationen af fokus flyet fra forskellige boringer. Bruge D2, D11, B6, D6, G6 som ledende brøndene ved overvågning af deres relative positioner i OCT billeder (figur 1A).
- Justere rotation af plade til at sikre, at kanten af pladen er parallel med retningen af scenen bevægelse, så brøndene forblive på de samme vandret stilling i OCT billeder (figur 1E). Justere kipning af pladen skal være parallel med den optiske tabel, så brøndene forblive på de samme lodrette placeringer i OLT 's imaging (figur 1F).
Bemærk: Justering af vippe vinkel og fokus hjælper optimere OCT billedkvalitet for alle brøndene. Dog kan variationer af højden af kultur medier i forskellige brønde forårsage ændringer i optisk stier, som kan føre til defocusing af den sfæroide billede. Auto-fokus kan gennemføres for at kontrollere brændplanet af OCT imaging for at opnå en optimeret billedkvalitet. Justering trin løser ikke dårlig OCT billedkvalitet af tumor klumpformet på grund af følgende problemer: klumpformet decentering indledende seeding beliggenhed; klumpformet elevation når indlejret i biofabricated ekstracellulære matricer; dårlig plade kvalitet med store variationer af højden af godt bunde. Ekstra software kontrol med auto-fokus eller selvstændig justering funktioner kan gennemføres for at optimere ydeevnen for OLT imaging system. - Bruge et brugerdefineret edb-program til at styre OCT billede erhvervelse og scenen bevægelse til at indsamle data fra hver godt sekventielt.
3. OLT Scanning og behandling af Tumor Spheroids
- På dagen for OCT billeddannelse af tumor spheroids, tage multi godt pladen fra rugemaskinen. Overføre flere godt pladen under OLT imaging system. Placer den på toppen af pladen adapter.
Bemærk: OCT billeddannelse af tumor spheroids kan udføres med polystyren plade låget til eller fra. Men vand fortætninger på låget på grund af fordampningen fra brøndene kan påvirke lystransmission og fordreje den lette vej, giver mindre optimal OCT billeder fra spheroids. - Justere højden på pladen ved at flytte langs z-retning på stadiet oversættelse. Fastholde positionen brændplanet på ~ 100 – 200 μm under oversiden af hver sfæroide, at minimere effekten af de ikke-ensartet depth-wise fokale profil.
- Angive en ordentlig OCT scanning vifte (fx, 1 mm x 1 mm) i den brugerdefinerede software til at dække hele tumor klumpformet ifølge sin udviklingsfaser. Klik på Gem parametre for at gemme indstillingen.
- Brug den brugerdefinerede software til at erhverve 3D OCT billeder af tumor spheroids én efter én for alle brønde af pladen som indeholder spheroids. Klik på knappen eksempel for at se af eksempelbilledet og klik på knappen erhverve at erhverve OCT billede.
Bemærk: Sikre, at OCT klumpformet dataene indsamles, når scenen ikke er i bevægelse. Sfæroide er normalt placeret i midten af U-bunden godt. Men sfæroide kan flyttet i kultur medier, når scenen accelererende eller aftagende på grund af inertien i klumpformet i kultur medier. - Proces 3D OCT datasæt af tumor spheroids at generere OCT strukturelle billeder med en brugerdefineret behandling af C++ kode. Se figur 2A for et rutediagram for efterbehandling af OCT data.
Bemærk: Se figur 4A for de genererede 3D OCT strukturelle billeder.- Se kapitel 5 i Drexler og Fujimoto34 og Jian et al. 46 for detaljerede beskrivelser af post-processing trin i OCT data. Kalibrere pixelstørrelse i alle tre dimensioner. Re skala OCT strukturelle billeder på korrigeret skalaer.
NOTE: Afstand i aksial retning (z-retning) af OCT billeder er en foranstaltning af optiske sti forskellen på reference arm og prøve arm. Således skal brydningsindekset af stikprøve (n) tages i betragtning, når kalibrering pixelstørrelse i aksial retning for rescaling. I vores studie, bruger vi n = 1,37 som brydningsindekset af tumor klumpformet42.
- Se kapitel 5 i Drexler og Fujimoto34 og Jian et al. 46 for detaljerede beskrivelser af post-processing trin i OCT data. Kalibrere pixelstørrelse i alle tre dimensioner. Re skala OCT strukturelle billeder på korrigeret skalaer.
- Generere collage af klumpformet billeder ved hjælp af 2D OCT billeder i tre tværsnits XY-, XZ- og YZ fly på tværs af sfæroide barycentrum. Se figur 3 c-E for den repræsentative output af collager af klumpformet billeder. Udføre billede registrering for alle spheroids, ved hjælp af MATLAB funktion dftregistration47til at sikre, at alle klumpformet centroids ligger omtrent på samme sted.
- Få 3D rendering af den sfæroide, ved hjælp af en kommerciel eller brugerdefineret software.
Bemærk: De følgende trin viser, hvordan at få 3D-gengivelse af tumor spheroids ved hjælp af en kommerciel software.- Indlæse data om 3D OCT til softwaren.
- Klik på panelet overgå . Klik derefter på Tilføj ny diskenhed. Vælg Blend mode til brug for 3D-gengivelse.
- Justere synsvinkel ved at trække den billed benytter Mus pegepind.
4. morfologiske kvantificering af 3D Tumor Spheroids
Bemærk: En brugerdefineret skriftlig kode i MATLAB behandler denne kvantificering. Klik på knappen Kør for at starte processen. Se figur 2B for rutediagrammet af trinene i morfologiske kvantificering af spheroids.
- Kvantificere klumpformet diameter, højde og diameter-baseret volumen.
- Vælg 2D OCT billeder i tre tværsnits XY-, XZ- og YZ fly, der krydser barycentrum af sfæroide.
- Mål diameter og højden af sfæroide i XY og XZ fly, henholdsvis.
- Beregne diameter-baserede klumpformet volumen ved hjælp af:
, med en formodning om kugleform af tumor.
- Kvantificere voxel-baseret klumpformet volumen.
- Anvende en 3D-gennemsnit filter på OCT strukturelle data af klumpformet at fjerne pletter.
- Segmentere tumor spheroids bruger snu edge detection48 filter, indramme af indramme, med en ordentlig tærskel adskille tumor klumpformet regionen godt nedefra.
- Gruppere bindevæv voxels for 3D-data (Se indbygget funktion: bwconncomp).
- Beregn den gennemsnitlige afstand mellem hver bindevæv voxel i gruppen og klumpformet barycentrum (manuelt valgt), for hver gruppe. Identificere den sfæroide region som gruppen med den mindste gennemsnitlige afstand.
- Tæl antallet af voxels inden for regionen klumpformet og derefter ganges med den faktiske mængde af en individuel voxel (volumen/voxel), giver det samlede volumen af sfæroide.
, med en formodning om kugleform af tumor.5. døde-celle regionen påvisning af 3D Tumor Spheroids
Bemærk: I en homogen medium, OCT back-spredt intensitet opdaget som en funktion af dybden (jeg(z)) kan være beskrevet af øl-Lambert lov49: 
, hvor z repræsenterer dybde, μ er den optiske forvrængning koefficient, og jeg0 hændelse intensitet til prøven. Deraf afledte optisk dæmpning koefficient kan udtrykkes som: 
. Da OCT billeder der ofte afbildes på en logaritmisk skala, kan hældningen af OCT intensitet profil hentes for at udlede den optiske dæmpning koefficient. Se figur 2 c for et rutediagram for generation af optiske svækkelseskarakteristika kort.
- Udføre segmentering for at fjerne uønskede områder udenfor sfæroide. Udføre 3D gennemsnitlige filter for at undertrykke den speckle støj, der er iboende i OCT billeder.
- Få pixel-wise optiske svækkelseskarakteristika koefficienter af lineære montering log-skala OCT intensitet profil over en bestemt dybde interval (bevægelige vindue), uddrag dens hældning, og formere hældningen af -1/2.
Bemærk: Dæmpning koefficient på hver voxel inden for regionen segmenterede klumpformet beregnes baseret på skråningen af OCT intensitet profil i et 10-voxel dybde vindue (~ 40 μm i dybde), med voxel beliggende i midten af vinduet. - Anvende metoder ovenfor (trin 5.1 og 5.2) til hver aksial scanning i en ramme og hver ramme i et 3D datasæt indeholdende den segmenterede klumpformet region indtil optiske svækkelseskarakteristika koefficienter for alle voxels i regionen segmenterede klumpformet beregnes.
- Udføre den binære tærskel for at fremhæve regionen high-dæmpning.
Bemærk: Se Huang et al. 42 til bestemmelse af tærsklen til high-dæmpning regionen ved hjælp af histogrammet analyse. - Fremhæve binarized optiske svækkelseskarakteristika kort på det oprindelige billede til at mærke de døde-celle regionen (blanding). Generere den 3D-afsmeltet billede af blandet dæmpning kort til at visualisere 3D fordelingen af døde-celle regionen.
6. histologi og Immunhistokemi
Bemærk: Histologi og Immunhistokemi (IHC) farvede billeder af tumor spheroids er fremstillet for at korrelere med de tilsvarende OCT resultater.
- Vælg 1-2 tumor spheroids multi godt pladen til histologi og IHC farvning på valgte tidspunkter. Bruge en pipette med 1 mL pipette tips til at overføre sfæroide fra brønden til et 1,5 mL centrifugeglas.
Bemærk: Skåret 1 mL pipette spidsen før overførsel til at sikre, at åbningen af spidsen er større end størrelsen af tumor klumpformet at undgå at beskadige struktur af sfæroide. - Indsamle hver tumor klumpformet i et enkelt 1,5 mL microcentrifuge rør fyldt med 10% formaldehyd og fix for 48 h.
- Udføre histologi og IHC processer for hver sfæroide, ved hjælp af standard paraffin indlejring teknikker.
Bemærk: Plet 5 μm tykt sektioner af tumor spheroids hæmatoxylin og eosin (H & E) og terminal deoxynucleotidyl-transferase dUTP nick ende mærkning (TUNEL) apoptose påvisning. En counterstaining af hæmatoxylin påføres TUNEL. En digital dias scanner blev brugt til at scanne den farvede prøve og få høj opløsning histologiske og IHC billeder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Høj overførselshastighed optisk kohærens tomografi billeddannelse af Spheroids i en 96-brønd plade
Figur 3 udstiller resultatet af HT-okt scanning af en 96-brønd plade med HCT 116 tumor spheroids på dag 3. Den sekventielle scanning af hele pladen starter fra bunden-ret godt (H12). Figur 3B viser flowdiagram af software gennemførelsen af ordningen for HT-okt. Efter én klumpformet data blev indsamlet og behandlet, pladen ville flytte til næste, venter på ~ 2 s at tillade klumpformet til hvile, og indsamle de næste klumpformet data. Hver OLT 's data består af 400 x 400 x 1024 voxels, hvilket svarede til en faktiske volumen af 1.0 x 0,84 x 2,3 mm3. Figur 3 c viser en collage af da-ansigt OCT billeder af HCT 116 spheroids genereret fra de behandlede data. Resultatet er sammenlignelig med billeder fra andre 2D høj overførselshastighed imaging system22. I betragtning af 3D imaging evne til OLT, kunne vi også generere collage af 2D tværsnits klumpformet billeder fra 96 brønde (figur 3D) til at overvåge klumpformet højder og visualisere klumpformet uensartethed i lodret retning. En collage af 3D-afsmeltet klumpformet billeder er også muligt fra enhver foruddefinerede vinkel (figur 3E) til at visualisere den overordnede 3D figur og evaluere rundheden af sfæroide. Bemærk, at den samlede OCT imaging og proces tid for hele 96-brønd plade ville være ~ 21 min. og ~ 25 min. Når line-scan kameraet kører med en hastighed på 92 kHz og 47 kHz, henholdsvis. Se Video 1 for eksempel.
Langsgående morfologiske og fysiologiske overvågning af Tumor klumpformet
Efter vi fremstillet plade for flere tidspunkter OCT strukturelle billeder af tumor spheroids, kunne vi yderligere analysere disse data af kvantificere de morfologiske og fysiologiske oplysninger af tumor spheroids. Figur 4 viser de forskellige tilgange til at karakterisere tumor spheroids og få langsgående morfologiske og fysiologiske oplysninger fra dem.
Figur 4B viser forskellige måder at visualisere tumor klumpformet. Ved hjælp af enten kommercielle eller gratis software, vi kunne indlæse data om 3D til softwaren og oprette en "volumen" af tumor klumpformet (3D-gengivelse), som viser den overordnede struktur af tumor klumpformet i 3D-rum. Med ordentlig tærskel, kunne vi skabe en overflade plot af tumor klumpformet (figur 4B), som kunne bruges til at opdele sfæroide og måle mængden. Vi kunne også generere ortogonale dias (ortho dias) fra forskellige tværsnit fly i forskellige retninger (figur 4B, XZ, YZ og XY) og måle diameter og højden af tumor klumpformet fra disse ortho dias.
Indsamling af OCT data af den samme klumpformet fra flere tidspunkt, kunne vi kvantificere de morfologiske oplysninger og generere vækstkurven af klumpformet at vise sin langsgående ændringer. Figur 4 c viser repræsentative data af en HCT 116 tumor klumpformet overvåges i 21 dage. Fra segmenterede data og ortho dias målte vi diameter, højde og voxel-baseret volumen af klumpformet for alle tidspunkt, som blev opført i tabellen. Vi har også beregnet diameter-baseret volumen for en sammenligning. Vækstkurver i størrelse og omfang var afbildet, henholdsvis. Fra vækstkurver, kunne vi se, at denne HCT 116 tumor klumpformet fulgt en lineær vækstmønster i volumen før dag 11. Før dette tidspunkt, sfæroide holdt vokser og vedligeholdes et relativt ensartet form. Men efter dag 11, sfæroide blev forstyrret, fladtrykt og fuldt kollapsede på dag 21. Vækstkurven voxel-baseret bind viser tydeligt tendensen, med en gradvist faldende mængder efter dag 11.
Baseret på OCT data, kan vi også indhente de fysiologiske oplysninger af fordelingen af døde-celler i tumor spheroids ved at analysere pixel for pixel optiske svækkelseskarakteristika fra 2D tværsnitsdata billeder. Efter de metoder, der er illustreret i figur 2 og protokol 5, kunne vi kvantitativt bestemme de døde-celle regioner og overvåge væksten i disse regioner som funktion af tiden. Figur 4D viser et repræsentativt resultat af langsgående sporing af stigning af døde-celle områder i tumor klumpformet. De områder, der er fremhævet med rødt, som havde høj optisk dæmpning, Vis de mærkede nekrotisk områder. Fra 3D afsmeltet optiske svækkelseskarakteristika kort under 14 dages udvikling, kunne vi se den røde sektor udvider, der viser stigningen i de nekrotiske regioner. Som procentdelen af de nekrotiske områder steg, kunne tumor klumpformet ikke opretholde sin perfekte form. Derfor vil de tendens til at forstyrre og sammenbrud, som blev set i længderetningen overvågning af tumor morfologi i figur 4 c.
Den foreslåede ikke-destruktive dødt væv region opdagelse teknik blev efterprøvet ved at sammenligne OCT optiske svækkelseskarakteristika kort over HCT 116 tumor klumpformet med tilsvarende billeder fremstillet ved histologi og IHC. Figur 4D præsenterer en sådan sammenligning med en dag 14 HCT 116 klumpformet. Et godt match mellem OCT dæmpning kort og svarer H & E og TUNEL skiver fandtes, som blev angivet ved at analysere funktionerne inden for regioner i H & E og TUNEL skiver præget af dash linjer afledt af konturen af OCT høj dæmpning regioner. I H & E skiver, var dødt væv regioner angivet med mindre tætte og aggregerede struktur ligger inden for den stiplede linje region. I TUNEL skiver, blev et godt match observeret mellem høj dæmpning område og TUNEL-mærket apoptotiske cellulære område.
Figur 1: opbygning af et høj overførselshastighed optisk kohærens tomografi (HT-OCT) system for tumor klumpformet imaging. (A) skemaer af HT-okt-systemet. Et diagram over 96-brønd plade er afbildet ved siden af OCT system. Fem brønde (D2, D11, B6, D6, G6) mærket med gult bruges til finjustering af faser i (D). (B) den faktiske konfiguration af HT-okt system. Se Tabel af materialer til optiske komponenter, der anvendes for hver del af systemet. (C) spektrometer design for HT-okt-systemet. (D) fase setup for HT-okt-systemet. Korrekt justering af 6-akse fase og synkronisering mellem OCT erhvervelse og scenen bevægelse er påkrævet for høj overførselshastighed billeddannelse. (E) og (F) Vis virkningerne af rotation og vippe på endelige billede af forskellige brønde. Rotation forårsager OCT billeder af forskellige brønde til at flytte vandret mens vippe vil føre til lodret forskydning af forskellige brønde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: databehandling til OCT billeder af tumor spheroids. (A) rutediagram generelle efterbehandling skridt for OCT data. (B) rutediagram morfologiske kvantificering af tumor klumpformet. (C) rutediagram døde celle regionen påvisning af tumor klumpformet. Skalalinjen: 100 µm af alle subfigures. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: høj overførselshastighed OCT scanning af et godt 96 plade der indeholder U-87 MG tumor spheroids. (A) den faktiske installationsprogrammet med 96-godt plade under målet. (B) flowdiagram af software gennemførelsen af HT-okt system. Collager af 96 da ansigt (C), tværsnits (D) og 3D afsmeltet maksimal intensitet projektion (MIP) (E) OCT billeder af dagen 3 HCT 116 spheroids blev genereret fra de behandlede data. Skalalinjen: 200 µm af alle subfigures. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: langsgående morfologiske og fysiologiske kvantificering af Tumor Spheroids med 3D OCT data. (A) fås 3D OCT strukturelle billeder af en tumor klumpformet efter generelle OCT post-processing. Fra OCT data, kan vi generere en 3D overflade plot og XZ, YZ og XY ortogonale skiver for at visualisere strukturen af tumor klumpformet i alle retninger (B). Vi kan udføre langsgående overvågning af en enkelt tumor klumpformet (C), kendetegner dens diameter, højde og voxel-baseret volumen (listet i Tabel af materialer) og plotte vækstkurver i størrelse og mængde under 21-dages udvikling. I eksemplet, som den sfæroide, udviklet, blev afbrudt på dag 11 og fuldt kollapsede på dag 21. Vi kan yderligere overvåge fysiologiske status af en tumor klumpformet langs baseret på optiske iboende dæmpning kontrast (D). 3D gjort billeder af en tumor klumpformet viste udseende og vækst af døde-celle regioner fra dag 7 dag 14. De høj-dæmpning-mærket døde-celle områder i rød blev matchet med histologiske og immunhistokemiske (IHC) resultater. OCT dæmpning kort, H & E og TUNEL resultatet i figur 4D er ændret fra Ref. 42. Skalere barer: 100 µm af alle subfigures. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: høj overførselshastighed OCT billeddannelse af tumor spheroids. En arbejdsproces 3D OCT imaging, grundlæggende OCT forarbejdning og scenen bevægelse blev præsenteret i videoen med en 5 x hastighed. Previews af forarbejdede OCT strukturelle billeder af spheroids blev også præsenteret. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumor aktivitet er særdeles relevante for dens morfologisk struktur. Lig overvågning karakteristiske vækstkurven for 2D cellekulturer, tracking vækstkurven for 3D tumor spheroids er også en konventionel tilgang til at karakterisere den langsigtede klumpformet vækst opførsel for forskellige cellelinjer. Især kan vi karakterisere drug svar ved at analysere tumor nedbrydning eller tumor genvækst direkte afspejles i vækstkurven. Derfor, kvantitativ vurdering af 3D tumor spheroids, herunder størrelse og volumen, at udlede vækstkurven, er af stor betydning for karakteriseringen af tumor spheroids og evalueringen af sammensatte effekt. I øjeblikket, imaging platforme baseret på lysfelt, fasekontrast eller fluorescerende imaging er blevet fastlagt for rutinemæssig billedbehandling og analyse af morfologi eller funktioner af 3D tumor spheroids8,9,18, 22. Men de er ude af stand til at løse det hele, store tumor struktur på grund af begrænset dybde penetration samt lav opløsning dybde-resolvability. I de repræsentative resultater, har vi vist OCT til at visualisere den hele 3D-struktur af tumor klumpformet udvikling over tid. 3D OCT imaging kunne give visningen af klumpformet i enhver orientering og enhver tværsnit med høj-resolvability, som ikke var tilgængelige i konventionelle billeddiagnostiske modaliteter, der mangler opløsningen langs dybden. Derudover givet voxel-baseret volumen kvantificering baseret på 3D OCT data en nøjagtig kvantificering af klumpformet mængder uden at påtage sig deres oprindelige figurer. Derfor, vi har vist, at OCT er en robust imaging modalitet for 3D morfologi karakterisering af tumor spheroids, der sikrer præcise målinger af karakteristiske vækstmønstre for forskellige cellelinjer og potentielt kan tjene som en alternativ til narkotika svar evaluering.
Levedygtighed test ved hjælp af fluorescerende farvning forblive en populær fremgangsmåde for funktionelle analyser af tumor spheroids, især for stof screening18. Den forstyrrende karakter af fluorescerende farvestoffer tyder imidlertid på, at disse test er kun egnet til end-point undersøgelser. I vores repræsentative resultater (figur 4D) viste vi en alternativ metode, der kan karakterisere cellernes levedygtighed inden for den hele klumpformet. Vores resultater har vist, at OCT kunne skelne regionen døde celler fra regionen levedygtige i klumpformet baseret på iboende optiske svækkelseskarakteristika kontrast. Derudover med 3D imaging evne og ikke-destruktiv karakter af ordningen OCT, kvantitative evaluering af døde-celle distributioner og in situ overvågning af progressionen af døde-celle regioner inden for sfæroide er muligt, som potentielt give mere værdifuld information af den sfæroide vækstmønster. Imidlertid bør vi bemærke, at i vores repræsentative resultater, vi ikke er stand til at skelne mellem forskellige typer af celle død tilstande, såsom apoptose og nekrose i binære OCT dæmpning kort.
Siden et narkotikamisbrug sammensatte bibliotek kan være omfattende (> 10.000), en høj overførselshastighed og robust system til at karakterisere tumor spheroids i multi godt plader under stof screening er bydende nødvendigt. Den nuværende høj overførselshastighed billedbehandlingssystem kan opnå en screening af hele 96-brønd plade i < 5 min i 2D Skan tilstand22. OCT kan tilpasses til high throughput screening formål, ved hjælp af en motoriseret fase. Man kan også opnå en kommercielt tilgængelig OCT system (Se Tabel af materialer til en liste over kommercielle OCT systemer) med en lignende ydeevne til vores brugerdefinerede OCT system og indarbejde en motoriserede Stadium i systemet. Indsats skal dog tages til at ændre det kommercielle OCT systemet for at integrere den motoriserede Stadium. Brugerdefinerede software implementering til at indse synkroniseringen mellem OCT erhvervelse udløser og fase bevægelighed udløser er også påkrævet. For vores prototype HT-okt system tog det 2-18 sekunder til at erhverve en 3D OCT data fra en enkelt tumor sfæroide, afhængigt af valget af kamera hastighed. Således, den samlede anskaffelsessum tid kan være så kort som ~3.2 min for en 96-brønd plade ved hjælp af HT-okt system. Men de mellemliggende skridt for det aktuelle HT-okt system, herunder databehandling, læse og skrive data på harddiske, og scenen bevægelser, forblev tidskrævende. Yderligere ~ 18 min. skulle bruges på toppen af ~3.2 min minimumsdata erhvervelse tid. Den samlede imaging tid kan reduceres yderligere i flere aspekter: anvender state-of-the-art OCT systemer udstyret med en højhastigheds afstemmelige laser kilde50,51; optimeret arbejdsprocessen ved at arrangere kritiske trin (dataopsamling, databehandling, skrivning, scenen bevægelse) arbejder parallelt; ansætte en parallel OCT imaging med en plads-division multiplexing setup52. Med systemoptimering, høj overførselshastighed OCT system kan udnyttes i kræft drug discovery samt karakterisering af andre 3D bio-fabrikeret prøver (fx., 3D væv organoids) til forskellige biomedicinske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne afslører ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NSF tilskud IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (IIP-1640707), NIH tilskud R21EY026380, R15EB019704 og R01EB025209 og Lehigh University start fond.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom Spectral Domain OCT imaging system | Developed in our lab | ||
| Superluminescent Diode (SLD) | Thorlabs | SLD1325 | light source |
| 2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio | AC Photonics | WP13500202B201 | |
| Reference Arm | |||
| Lens Tube | Thorlabs | ||
| Adapter | Thorlabs | ||
| Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
| Focusing Lens | Thorlabs | ||
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | ||
| Mirror | Thorlabs | ||
| 1D Translational Stage | Thorlabs | ||
| Continuous neutral density filter | Thorlabs | ||
| Pedestrial Post | Thorlabs | ||
| Clamping Fork | Thorlabs | ||
| Sample Arm | |||
| Lens Tube | Thorlabs | ||
| Adapter | Thorlabs | ||
| Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
| Galvanometer | Thorlabs | ||
| Relay Lens | Thorlabs | AC254-100-C | two Relay lens to make a telescope setup |
| Triangle Mirror Mount | Thorlabs | ||
| Mirror | Thorlabs | ||
| Objective | Mitutoyo | ||
| Pedestrial Post | Thorlabs | ||
| Clamping Fork | Thorlabs | ||
| Polarization Controller | Thorlabs | ||
| 30mm Cage Mount | Thorlabs | ||
| Cage Rod | Thorlabs | ||
| Stage | |||
| 3D motorized translation stage | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | JTH360XY | |
| 2D Tilting Stage | |||
| Rotation Stage | |||
| Plate Holder | 3D printed | ||
| Spectrometer | |||
| Lens Tube | Thorlabs | ||
| Adapter | Thorlabs | ||
| Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
| Grating | Wasatch | G = 1145 lpmm | |
| F-theta Lens | Thorlabs | FTH-1064-100 | |
| InGaAs Line-scan Camera | Sensor Unlimited | SU1024-LDH2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture Component | |||
| HCT 116 Cell line | ATCC | CCL-247 | |
| Cell Culture Flask | SPL Life Sciences | 70025 | |
| Pipette | Fisherbrand | 14388100 | |
| Pipette tips | Sorenson Bioscience | 10340 | |
| Gibco GlutaMax DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10569044 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3120 | |
| Gloves | VWR | 89428-750 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Transfer pipets | Globe Scientific | 138080 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 R | To centrifuge the 15 mL tube |
| Centrifuge | NUAIRE | AWEL CF 48-R | To centrifuge the 96-well plate |
| Microscope | Olympus | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histology & IHC | |||
| Digital slide scanner | Leica | Aperio AT2 | Obtain high-resolution histological images |
| Histology Service | Histowiz | Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of Commerical OCTs | |||
| SD-OCT system | Thorlabs | Telesto Series | |
| SD-OCT system | Wasatch Photonics | WP OCT 1300 nm | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software for Data Analyses | |||
| Basic Image Analysis | NIH | ImageJ | Fiji also works. |
| 3D Rendering | Thermo Fisher Scientific | Amira | Commercial software. Option 1 |
| 3D Rendering | Bitplane | Imaris | Commercial software. Option 2. Used in the protocol |
| OCT acquisition software | custom developed in C++. | ||
| Stage Control | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | MRC_3 | Incorporated into the custom OCT acquisition code |
| OCT processing software | custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code. | ||
| Morphological and Physiological Analysis | custom developed in MATLAB |
References
- WHO. Cancer. , Available from: http://www.who.int/cancer/en/ (2018).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nature Reviews Drug Discovery. 3 (8), 711-716 (2004).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
- Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 273, C1109-C1123 (1997).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
- Tung, Y. -C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC biology. 10, 29 (2012).
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7, 819-830 (2012).
- Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and Tissue Research. 352, 161-177 (2013).
- Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay and Drug Development Technologies. 11 (7), 435-448 (2013).
- Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Experimental Cell Research. 323 (1), 131-143 (2014).
- Astashkina, A., Grainger, D. W. Critical analysis of 3-D organoid in vitro cell culture models for high-throughput drug candidate toxicity assessments. Innovative tissue models for drug discovery and development. 69, 1-18 (2014).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Gong, X., et al. Generation of multicellular tumor spheroids with microwell-based agarose scaffolds for drug testing. PLoS ONE. 10 (6), e0130348 (2015).
- Hoffmann, O. I., et al. Impact of the spheroid model complexity on drug response. Journal of biotechnology. 205, 14-23 (2015).
- Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High-throughput fluorescence imaging approaches for drug discovery using in vitroand in vivothree-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10, 1347-1361 (2015).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology, Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Li, L., Zhou, Q., Voss, T. C., Quick, K. L., LaBarbera, D. V. High-throughput imaging: Focusing in on drug discovery in 3D. Methods. 96, 97-102 (2016).
- Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Experimental Biology and Medicine. 241 (9), 939-954 (2016).
- Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. Journal of Laboratory Automation. , 2211068216652846 (2016).
- Stock, K., et al. Capturing tumor complexity in vitro: Comparative analysis of 2D and 3D tumor models for drug discovery. Scientific Reports. 6, 28951 (2016).
- Thakuri, P. S., Ham, S. L., Luker, G. D., Tavana, H. Multiparametric analysis of oncology drug screening with aqueous two-phase tumor spheroids. Molecular Pharmaceutics. 13 (11), 3724-3735 (2016).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cancer multicellular spheroids: Volume assessment from a single 2D projection. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 118 (2), 95-106 (2015).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
- Drexler, W., et al. Optical coherence tomography today: speed, contrast, and multimodality. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071412 (2014).
- Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (9), OCT1-OCT13 (2016).
- Vakoc, B. J., Fukumura, D., Jain, R. K., Bouma, B. E. Cancer imaging by optical coherence tomography: preclinical progress and clinical potential. Nature Reviews Cancer. 12 (5), 363-368 (2012).
- Wojtkowski, M. High-speed optical coherence tomography: basics and applications. Applied optics. 49 (16), D30-D61 (2010).
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography: technology and applications. , Springer Science, Business Media. (2008).
- Geitzenauer, W., Hitzenberger, C. K., Schmidt-Erfurth, U. M. Retinal optical coherence tomography: past, present and future perspectives. British Journal of Ophthalmology. 95 (2), 171 (2011).
- Sakata, L. M., DeLeon-Ortega, J., Sakata, V., Girkin, C. A. Optical coherence tomography of the retina and optic nerve - a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 37 (1), 90-99 (2009).
- van Velthoven, M. E. J., Faber, D. J., Verbraak, F. D., van Leeuwen, T. G., de Smet, M. D. Recent developments in optical coherence tomography for imaging the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (1), 57-77 (2007).
- Kashani, A. H., et al. Optical coherence tomography angiography: A comprehensive review of current methods and clinical applications. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 66-100 (2017).
- de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. A review of optical coherence tomography angiography (OCTA). International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5 (2015).
- Sharma, M., Verma, Y., Rao, K. D., Nair, R., Gupta, P. K. Imaging growth dynamics of tumour spheroids using optical coherence tomography. Biotechnology Letters. 29 (2), 273-278 (2006).
- Jung, Y., Nichols, A. J., Klein, O. J., Roussakis, E., Evans, C. L. Label-Free, Longitudinal Visualization of PDT Response In Vitro with Optical Coherence Tomography. Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 728-744 (2012).
- Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Cancer Research. 77 (21), 6011-6020 (2017).
- Spalteholz, W. Über das Durchsightigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten: nebst Anhang, Über Knochenfärbung. , Verlag von S. Hirzel. (1911).
- Dodt, H. -U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331 (2007).
- Leitgeb, R., Hitzenberger, C., Fercher, A. F. Performance of fourier domain vs. time domain optical coherence tomography. Optics express. 11 (8), 889-894 (2003).
- Jian, Y., Wong, K., Sarunic, M. V. Optical Coherence Tomography and Coherence Domain Optical Methods in Biomedicine XVII. , International Society for Optics and Photonics. 85710Z (2013).
- Guizar-Sicairos, M., Thurman, S. T., Fienup, J. R. Efficient subpixel image registration algorithms. Optics Letters. 33 (2), 156-158 (2008).
- Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. (6), 679-698 (1986).
- Vermeer, K. A., Mo, J., Weda, J. J. A., Lemij, H. G., de Boer, J. F. Depth-resolved model-based reconstruction of attenuation coefficients in optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 5 (1), 322-337 (2014).
- Klein, T., et al. Multi-MHz retinal OCT. Biomedical Optics Express. 4, 1890-1908 (2013).
- Klein, T., Huber, R. High-speed OCT light sources and systems [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (2), 828-859 (2017).
- Zhou, C., Alex, A., Rasakanthan, J., Ma, Y. Space-division multiplexing optical coherence tomography. Optics Express. 21, 19219-19227 (2013).
