Summary
通过引物扩展 (shape) 实验分析的体外和细胞内选择性 2 '-羟基酰化的详细方案, 以确定在存在 rna 靶向小分子的情况下, mrna 前序列的二级结构。本文中介绍。
Abstract
在针对小分子的药物开发过程中, 需要阐明它们与目标 rna 序列相互作用的结构变化。本文提供了一个详细的体外和细胞内选择性 2 '-羟基酰化分析引物延伸 (shape) 协议, 以研究 rna 结构的变化, 在存在的实验药物存在的脊髓肌肉萎缩 (sma), 生存运动神经元 (smn)-c2, 以及 smn2 基因的前 mrna 的外显子7。在体外形态中, 含有 smn2 外显子7的140个核苷酸的 rna 序列通过 t7 rna 聚合酶转录, 在 smn-c2 存在下折叠, 然后用温和的 2 '-oh 酰化试剂 2-甲基咪唑 (nai) 进行改性。这种 2 '-oh-nai 加合物通过32p 标记引物延伸进一步探测, 并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 (page) 进行求解。相反, 2 '-oh 酰化在细胞内的形状发生在原位与 smn-c2 结合细胞 rna 在活细胞。然后, pcr 扩增了 smn2 基因中外显子7的 mrna 前序列, 以及 shape 诱导的引物延伸突变, 并进行了下一代测序。通过对这两种方法的比较, 体外 shape 是一种更具成本效益的方法, 不需要计算能力来可视化结果。然而, 体外 shape 衍生 rna 模型有时会偏离细胞环境中的二级结构, 这可能是由于与 rna 结合蛋白的所有相互作用的丧失。细胞内形状不需要放射性物质工作场所, 并在细胞环境中产生更准确的 rna 二级结构。此外, 细胞内 shape 通常适用于更大范围的 rna 序列 (~ 1, 000个核苷酸), 利用下一代测序, 而体外 shape (~ 200 核苷酸) 通常依赖于 page 分析。在 smn2 前 mrna 中的外显子7的情况下, 体外和细胞内形状 rna 模型是相似的。
Introduction
选择性 2 '-羟基酰化分析引物延伸 (shape) 是一种测量每个核苷酸在感兴趣的 rna 序列中的动力学的方法, 并阐明单核苷酸分辨率 1下的二级结构。在体外条件 2,3,4 (纯化 rna 在一个定义的缓冲系统) 和在活哺乳动物细胞5, 6,已经开发了 shape 方法来研究继发中长 rna 序列的结构 (通常和 lt;1,000 核苷酸用于细胞内形状和 lt;200 核苷酸体外形状)。它是特别有用的评估的结构变化后, 结合 rna 相互作用的小分子代谢物2,4,7,8 和研究机械作用在药物开发过程中的 rna 靶向分子 9,10。
rna 靶向药物发现最近通过不同的方法和策略引起了学术实验室和制药业的关注 11、 12,分别为 13、14、15 ,16。最近针对临床使用的小分子的例子包括两种结构不同的实验药物, lmi-070 17 和 rg-7916 18,19, 用于脊髓肌肉萎缩 (sma), 这表明很有希望在第二阶段临床试验20。这两种分子都被证明是针对运动神经元 (smn) 2 的存活, 并调节 smn2 基因 6、17、21 的剪接过程.我们之前展示了体外和细胞内形状在检测目标 rna 结构变化的应用, 在存在的类似的 rg-7916 被称为 smn-c26.
原则上, shape 以无偏见的方式测量 rna 序列的每个核苷酸在存在过量的自淬火酰化试剂的情况下的 2 '-oh 酰化速率。酰化试剂在水中不稳定, 对 1-甲基-7-亚硝基二酸酐的半衰期较短 (例如, 1 -甲基-7-亚硝基二氢化物的半衰期为 17; 1 m7, 2-甲基烟酸咪唑 (nai) 22 的半衰期较短,对其同一性不敏感, 对其同一性不敏感。基地23。这将导致更有利的酰化 2 '-oh 组的柔性碱基, 这可以转化为一个准确的评估动态的每个核苷酸。具体而言, 基对中的核苷酸通常比未配对的核苷酸对 2 '-oh 改性试剂 (如 nai 和 1m7) 的反应性较低。
查看 rna 模板的来源和 2 '-oh 酰化发生的位置, shape 通常可分为体外和细胞内形状。体外 shape 使用纯化的 t7 转录 rna, 在实验设计中缺乏细胞环境。在细胞内形态中, rna 模板转录和 2 '-oh 酰化都发生在活细胞内;因此, 研究结果可以在细胞环境中重述 rna 结构模型。在文献24中, 细胞内形状被称为活体形状, 用于活细胞中携带的形状。由于这个实验不是在动物身上进行的, 我们把这个实验称为细胞内形状的准确性。
体外引物延伸期和细胞内形状的策略也不同。在体外形态中, 逆转录酶在 mg2+存在的情况下停止在 2 '-oh 酰化位置。因此, 在聚丙烯酰胺凝胶电泳 (page) 中, 一个32p-ld 引物延伸率显示为一个带, 该带的强度与酰化速率1成正比。在细胞内形态中, 逆转录酶在 mn2 +存在的情况下, 在 2 '-oh 加合物位置产生随机突变。通过深度下一次测序可以捕获每个核苷酸的突变速率, 然后可以计算单核苷酸分辨率下的 shape 反应性。
细胞内 shape 的一个潜在问题是低信噪比 (即, 大多数 2 '-oh 组未被修改, 而未修改的序列占据了下一代测序中的大部分读数)。最近, 由 chang 实验室25开发了一种浓缩2-oh 改性 rna 的方法, 该方法被称为体内点击 shape (icshape)。这种浓缩方法可能有利于研究弱小分子, 如 rna 相互作用, 特别是在转录全范围的审讯中。
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Protocol
1. 体外形状
请注意:从已发布的协议1修改协议.
- 准备 rna 模板
请注意:t7 转录模板被排序为合成双链 dna (dsdna), 并通过插入大肠杆菌载体进行扩增 , 该载体携带独特的一对 ecrori/bamhi 限制性内切酶位点, 如 pet28a, 或通过 pcr 进行扩增。pcr 扩增协议如下图所示。- 混合以下材料: 50μl pcr 主混合物 (见材料表), 10μm 中的每种引物 2μl (序列见表 1 ), 2μl 中的 dsdna 模板为2μl 和3μl 的二甲基亚硫酸盐 (dsDNA), 41μlh2o aliot 分为两个 pcr管 (每个管含有50μl 的反应混合物)。
- 设置热循环器如下: 第1阶段) 95°c 30秒;阶段 2) 95°c 为 20秒;阶段 3) 56°c 为 20秒;阶段 4) 72°c, 20秒;第5阶段) 循环回到第2阶段, 循环30个周期;阶段 6) 72°c 3分钟;和阶段 7) 无限保持在 4°c, 直到下一步。
- 通过提取凝胶切片纯化 pcr 放大器 (参见材料表并使用制造商的协议)。用35μl 的 Tris-EDTA (te) 缓冲液 (包含 10 mm tris (ph 8.0) 和 1 mm edta) 对产品 dna 进行洗脱, 从而产生0.1–0.5μμl 模板。将纯化后的 dna 模板规范化为0.10μgμμl。
请注意:(可选) 模板的质量可以在1.8% 的琼脂糖凝胶电泳与0.10 微克的 dna 进行分析。在凝胶上需要一个单一的模板 dna 带。 - 通过在 pcr 管中添加以下材料, 建立 t7 转录反应 (总体积 40μl): 10x 反应缓冲液的4μl、atp 的4μl、ctp 的4μl、utp 的4μl、t7 酶的4μl、4μl 的 t7 酶 (见材料表), 从步骤 1.1.3 (0.4μg) 和12升的二乙基碳酸热盐 (depc) 处理水的纯化 pcr 放大器4升。通过向上和向下移液4倍来混合。在37°c 时, 在热循环器或37°c 孵化器中孵育4-16小时。
请注意:在1.1.4 的步进反应进行时, 开始设置步骤1.1.6。 - 加入2μl 的 dnase, 通过向上和向下液位混合 4倍, 在37°c 孵育 15分钟. 与相同体积的 2倍-硼酸-edta (tbe) 尿素样品缓冲液混合 (见材料表)。在70°c 时加热3分钟以停用。
- 在无 rnase 瓶中, 混合75% 毫升的40% 丙烯酰/双丙烯酰胺溶液 (292:1, 见材料表)、180.2 克尿素和50毫升的 10x tbe 缓冲液 (无 rnase, 见材料表)。将瓶子放在轨道振动台 (250 转/分) 上, 直到所有尿素晶体被溶解 (可能需要 2小时)。使用经过 depc 处理的水将体积调整到500毫升。用0.2μm 膜过滤溶液 (见材料表)。
请注意:在此过程中, 避免使用镜面和拉杆来防止 rnase 污染。该溶液可在4°c 下保存长达1年。 - 用一张抹布纸, 用去离子水和 70% etoh 清洗两个大小合适 (16.5 厘米 x24 厘米) 的电泳玻璃板。将板与一对 2.0 mm 的间隔 (表面为硅化的板面向内部) 对齐, 并用胶带密封板的边缘。双贴在板的一角, 防止漏水。
- 在烧杯中, 将步骤1.1.6 的200毫升丙烯酰丙烯酰的丙烯酰胺溶液、10% 过硫酸铵溶液的 2.0 ml 和四甲基亚甲基的四甲基二胺 (temed) 与无拉姆提克尖混合在一起, 快速搅拌 30秒. 将板倾斜在一块台式盖上并倾吐从板的缝隙的解决方案。轻触板, 以提升任何气泡, 并将其平铺在桌面盖上。立即插入梳子, 让凝胶聚合至少1小时。
请注意:如果要在第二天内使用凝胶, 用一块湿纸巾覆盖凝胶的顶部, 用更大的塑料包装包裹起来。将其平躺在4°c 处。 - 取下胶带, 将盘子夹在电泳支架上。取下梳子, 在储层的顶部和底部添加足够的 1x tbe 缓冲液。在20瓦的情况下将凝胶预运行30分钟。
请注意:或者, 如果所需 rna 的含量是 ~ 90% 或更多, 可以使用微型凝胶来替代制备凝胶。 - 用储液中的液体向上和向下移液两次, 清洗每个装载井。将1.1.5 的步骤中的粗 rna 添加到井中。在 20 w 处运行凝胶, 直到二甲苯氰醇 ff 染料 (浅蓝色) 通过凝胶长度的大约三分之二 (~ 60分钟)。
请注意:确保装载的高度不超过井高的三分之一 (如有必要, 请使用多个井)。 - 将凝胶浸入 1x tbe 缓冲液中, 将其稀释1:10000 的安全染料 (见材料表) 浸入足够大的容器中, 以容纳凝胶。在晚上80转的情况下, 将容器放在轨道振动台上5分钟。
- 在紫外光下, 识别所需的 rna 带, 并使用干净的剃须刀片快速切割凝胶的薄带。将1-2 凝胶切片放入 1.7 ml 管中。
- 通过被动洗脱从凝胶切片中恢复 rna。在每管中加入足够的洗脱/沉淀混合物 (每片约0.3 毫升): 0.3 m naoac (ph 5.2), 2.5 m 锂蛋白, 1 mm edta, 0.1% 十二烷基硫酸钠 (sds)。在4°c 下旋转含有凝胶拼接的管16小时。
请注意:在这一步中, 典型的回收率约为75%。若要提高产量, 请取出并收集洗脱液, 并添加相同体积的洗脱缓冲液, 然后重复此步骤。 - 将洗脱液混合在一个新的 1.7 ml 管中。加入2.5倍冰凉 etoh, 倒置管六次混合液体, 并将管在-80°c 放置至少1小时。
- 在 10, 000 x g和4°c 下离心10分钟。通过移液小心地取出上清液。在 10, 000 x g 和4°c 下加入 80% etoh (每管1毫升)、15个月的涡流和10分钟的离心机, 以清洗 rna 颗粒.
- 取出上清液, 风干 rna 颗粒 5分钟, 加入50μl 的无 rnase 水, 通过移液上下混合10次。将 rna 浓度归一化为0.10μgμμl。将纯化后的 rna 存放在-80°c。
请注意:不要过度干燥 rna 颗粒。 - (可选) 分析 rna 的质量, 从步进1.1.16 在5μl 水中稀释 1μl (100 ng) rna, 并与5μl 的 2x tbe-尿素样品缓冲液混合。然后, 在70°c 加热 3分钟, 并加载 6% tbee-尿素微型凝胶。
- 在 180 v 的情况下运行凝胶 1小时. 按步骤1.1.11 进行染色。在成像系统中使用紫外线显示凝胶。一个单一的波段是预期的长度。
- 准备32个p 标签底漆
- 通过混合以下材料来设置反应: 10μl 的γ-32p-atp (~ 1.5 mci, ~ 25μm , 见材料表), 2 微米的逆转录酶 (rt) 引物 (100μm, 序列见表 1), 2μl 10x t4 多核苷酸激酶 (pnk)反应缓冲液、t4 pnk 1μl (见材料表) 和5μl 无 rnase 水。在37°c 下孵化1小时。
注意事项:在经授权的工作场所需要适当保护步骤 1.2-1.5, 以保护放射性材料。 - 在65°c 下, 热失活20分钟。将样品加入脱盐柱和离心机, 以 1, 000 克 g, 1分钟. 将洗脱液与2μl 的 2x tbe-u2000 样品缓冲液混合。.
请注意:如果标记的粗产品不立即提纯, 请将其存放在-20°c。 - 在 20 w 下运行10% 的丙烯酰胺凝胶1小时。
注意事项:将32p 标记的底漆从步骤1.2.1 加载到凝胶上, 避免将放射性排出到顶部储罐。不要装载超过三分之一的井的高度, 以确保凝胶上有一个薄带 (必要时使用多个井)。底部储罐中的液体具有很高的放射性。 - 取下胶凝盒的玻璃板, 将凝胶放在一块塑料包装上。将塑料包装折叠起来, 盖上凝胶的顶部, 制成气密三明治。将凝胶三明治放在钨酸钙荧光粉筛上, 并用成像仪器暴露。用规则的光线再次将凝胶图像, 以知道凝胶的边缘在哪里。
- 使用图像处理软件覆盖这两个图像。将凝胶与打印的图像对齐。使用新鲜的剃须刀刀片, 以削减所需的带从凝胶。将1到2块凝胶切片放入 1.7 ml 管中。
请注意:确保打印的图像与实际凝胶大小相同。在切掉凝胶片之后, 再次对剩余的凝胶进行成像, 以此对齐, 从而对对齐方式进行双重检查。 - 按照 1.1.13 1.1.16 的步骤恢复 32个 p 标记的底漆。将1.0 微米的溶液放入 0.4 ml 管中, 用 1x te 缓冲液稀释底漆, 在 ~ 100, 000 cpm 时获得1.0μl 的放射性。将纯化后的 32份标记底漆存放在-80°c, 直到 rna 2 '-oh 改性反应, 但不超过4周。
- 通过混合以下材料来设置反应: 10μl 的γ-32p-atp (~ 1.5 mci, ~ 25μm , 见材料表), 2 微米的逆转录酶 (rt) 引物 (100μm, 序列见表 1), 2μl 10x t4 多核苷酸激酶 (pnk)反应缓冲液、t4 pnk 1μl (见材料表) 和5μl 无 rnase 水。在37°c 下孵化1小时。
- 小分子结合和 rna 2 '-oh 修饰
- 要制备四个样品, 请在 0.5x te 缓冲液的32μl 中加入 8 pmol rna, 在80°c 下加热 2分钟, 并在冰上冷却至少1分钟。
请注意:使用以下公式计算 rna 的近似分子量: mw = (碱数) x 340 da。 - 加入5μl 的5倍折叠混合物, 包含 500 mm hepes (ph 8.0)、20 mm mgcl2和 500 mm ncl。将 rna 混合物的9μl 注入四个 pcr 管中的每一个, 并将它们标记 #1-#4。在 #1 管中加入1μl 的 10% dmso, 将浓缩小分子溶液 (10% dmso) 加入 #2, 将稀释的小分子溶液 (10% dmso) 加入 #3, 将1μl 的水加入 #4。
- 在37°c 的热循环器中培养 pcr 管30分钟。
- 就在 2 '-oh 改性反应之前, 将 nai 库存溶液 (2m) 的1μl 与3μl 的 depc 处理水稀释, 以产生 0.5 m 的工作溶液。无需延迟, 将 nai 工作溶液的1μl 添加到管中 #1、#2 和 #3, 将 1μl 25% dmso 添加到 #4 中。在37°c 的热循环器中孵化15分钟。
- 加入100μl 的洗脱/沉淀混合物 (见步骤1.1.13 的配方), 2μl 的糖原 (15 mg/ml), 并将每个 pcr 管中的所有液体转移到 1.7 ml 管中。在每个管中加入0.34 毫升的低温200防 etoh (3倍体积)。通过涡流混合 5秒, 并将管放置在-80°c 的冰柜中至少1小时。
请注意:在此期间, 开始设置要在步骤1.5.1 中使用的测序凝胶。 - 在 14, 000 x g和4°c 下离心15分钟。在不干扰 rna 颗粒的情况下取出上清液。在 20, 000 x g 和4°c 下加入 80% etoh (每管 0.5 ml)、15个月的涡流和15分钟的离心机, 清洗 rna 颗粒。再次取出上清液。
请注意:或者, 使用盖革计数器, 以确保放射性颗粒保留在管中。 - 空气干燥 rna 颗粒 5分钟, 加入9μl 的无 rnase 水, 通过移液上下混合10次。
请注意:不要过度干燥 rna 颗粒。预计在这一步骤结束时, 所有降水都将被溶解。
- 要制备四个样品, 请在 0.5x te 缓冲液的32μl 中加入 8 pmol rna, 在80°c 下加热 2分钟, 并在冰上冷却至少1分钟。
- 标记准备和引物扩展
- 将修改后的 rna 转移到4个新的 pcr 管中, 并将它们标记 #1-#4 像以前一样。在7μl 的 depc 处理水中添加 2个 pmol 控制 rna, 添加到4个额外的 pmol 管中, 并将其贴 #5 #8。在所有八个管中加入2μl 的放射性标记底漆 (步骤 1.2.6)。在65°c 下加热退火 5分钟, 然后在热循环中立即冷却至4°c。
- 在 8个 pcr 管中的每个管中加入4μl 的 5倍 rt 缓冲液 (见材料表)、1μl 的二硫醇 (dNTP, 0.1 m) 和1μl 的 dntp 混合 (每个 10 mm)。
- 在 #1 #4 的管中加入 2μl的 depc 处理的 h2o。将4μl 的 ddatp (5 mm)、4μl 的 ddATP (5 mm) 和4μl 的 ddctp (5 mm) 分别加入管中 #5 #7。在管 #8 中加入1μl 的 ddgtp (5 mm) 和3μl 的 depc 处理水。移液器四次混合。
- 在52°c 下, 在热循环器中加热1分钟。加入1μl 的逆转录酶 (见材料表), 然后通过向上和向下移液混合四次。在52°c 下将反应培养20分钟。
- 在每个试管中加入1μl 的 5m naoh 来水解 rna。在95°c 下加热管5分钟。
- 加入5μl 的 1 m hcl, 重复乙醇沉淀 (步骤1.3.5 和 1.3.6), 省略糖原和液体转移。
请注意:省略步骤1.4.6 导致凝胶中间的模糊区域, 被称为 "盐前"。 - 空气干燥 dna 颗粒 5分钟, 加入10μl 的 h2o 和10μl 的 2x tbe-use 样品加载缓冲液和移液上下10次重新溶解。在70°c 下加热 5分钟, 将管子放在冰上, 然后装上凝胶。
- 页面分析
- 要制备8% 聚丙烯酰胺测序凝胶, 请按照步骤 1.1.6, 通过以下修改 1.1.10: 使用100毫升的40% 丙烯酰胺/双酰胺溶液 (29:1) 制备8% 丙烯酰胺溶液, 并使用测序凝胶玻璃板 (例如, 46x 57 厘米) 与0.4 毫米间隔。
- 从步骤1.4.7 加载10μl 的样品。在 65 w 处运行凝胶2小时或直到底部染料到达凝胶的 ""。
请注意:将其余样品存放在-80°c, 以便在需要时重复。 - 取下隔板, 轻轻插入铲子, 取下顶部的硅化玻璃板。放置一张大滤纸覆盖凝胶, 然后轻轻按压, 使凝胶粘附在滤纸上。从底部开始, 提起滤纸, 并将凝胶从玻璃板上取出。
- 将凝胶与滤纸放在一块足够大的塑料包装上, 以覆盖整个凝胶 (滤纸面朝上)。将滤纸/凝胶包装三明治转移到凝胶干燥器上, 滤纸面朝下。
注意事项:为避免放射性物质污染, 请在凝胶夹层和凝胶干燥器之间再使用3至4张大型滤纸。 - 用真空将凝胶在70°c 下干燥1小时。将凝胶三明治转移到光漂荧光粉储存盒上。将凝胶的放射性暴露在屏幕上4-16小时。
- 将荧光粉存储屏幕放置在成像设备上, 并以中等分辨率 (~ 30分钟) 进行扫描。
请注意:如果凝胶图像上存在类似笑脸的工件, 请使用校正软件 (例如, safa) 将图像处理到可发布的质量。请记住, 标准标记车道比 2 '-oh 改性车道长1个核苷酸。
2. 细胞内形状
- 底漆设计
请注意:与体外形状不同, 细胞内形状不需要设计表达式盒式磁带。但是, 应使用最佳引物集, 并且必须在 shape 实验之前进行评估。- 通过基于 blast 的引物设计工具 (例如, primer-blast) 生成至少三个独特的引物对。要研究人类细胞中的 mrna 前, 请选择人类基因组 (而不是转录组) 作为引物对特异性检查参数中的参考数据库。选择放大器的大小, 范围为200–1000基对 (bp)。
- 用自旋柱法提取 ~ 106个感兴趣的细胞的基因组 dna, 并采用 rnase a 和蛋白酶 k (见材料表, 并使用制造商的协议)。在0.1μgμlte 缓冲液中对纯化后的基因组 dna 进行归一化。
- 使用1.1.1 和1.1.2 步骤执行的协议测试 pcr。
请注意:所需的引物集应该在1.8% 的琼脂糖凝胶上产生一个单一的波段。
- 细胞制备和 2 '-oh 改性
请注意:为了增加感兴趣的 mrna 前的丰度, 将具有正确序列的巨细胞病毒 (pre-mRNA) 启动子进行本构表达的小烯转染宿主细胞。- 在杜尔贝科的修饰鹰培养基 (dmem) 中, 在37°c 条件下对含有10% 胎儿牛血清 (fbs) 和1x 抗生素混合物的培养基进行预热。种子293t 细胞在50% 融合24小时前转染在培养基中。在没有抗生素的情况下, 在 dmem 中将培养基转化为 2% fbs, 而不是在转染前1小时。
- 在96孔板的1口井中, 将10微克的小基因质粒加入100μl 的减少血清介质 (见材料表)。将溶液上下四次混合。
- 在板的另一口井中加入40μl 转染试剂 (见材料表), 加入100μl 的减少血清介质。移液器上下四次混合。在室温下孵化5分钟。
- 在转染试剂悬浮液中加入整个质粒溶液。移液器上下四次混合。在室温下孵化30分钟。
- 在整个盘子的介质表面滴滴加入整个 dnaa/转 faust试剂混合物。在37°c 下孵化6-12小时。
- 吸入培养基, 用5毫升的磷酸盐缓冲盐水轻轻清洗一次 (pbs, ph 7.4, 不含 cacl2和 mgcl2, 见材料表)。用3毫升的胰蛋白酶溶液对细胞进行胰化。在室温下孵化5分钟。
- 轻轻敲盘子, 把盘子底部的细胞分开。用6毫升培养基中和胰蛋白酶。以 300 x g 离心 4分钟 , 并取出介质。
- 在199μl 反应介质 (dmem 中的 1% fbs) 中, 为每个样品重新注入 ~ 106个细胞, 并将细胞悬浮液转移到96孔板中。在所有三个对照中, 用1μl 的复合工作溶液或 1μl dmso 在37°c 下将细胞培养30分钟。
请注意:应包括三个控制样本: nai dmso 控制、nai 变性 rna 控制和 nai 阴性对照。 - 在每个样品中加入10μl 的 2m nai, 但变性控制 (dc) rna 和 nai 阴性对照除外。移液器上下四次混合。在37°c 下孵化 15分钟, 轻轻摇晃板, 每5分钟重新悬浮细胞。
- 将细胞转移到 1.7 ml 管和离心机在 400 x g , 2分钟, 毫不拖延。在不干扰细胞颗粒的情况下取出上清液。
- 加入0.4 毫升硫氰酸酯 (见材料表)。旋涡为15秒进行均质化。在室温下将样品孵化5分钟。
请注意:样品可以储存在-20°c, 直到继续下一步。
- rna 提取
- 在每个硫氰酸酯均质样品中加入0.2 毫升氯仿。旋涡 15次, 在室温下插入2分钟。
- 在 12, 000 x g和4°c 下离心5分钟。顶部无色水层含有 rna。将 ~ 388μl 的水溶液转移到一个新的 1.7 ml 管。
注意事项:不要打扰中间阶段, 以避免污染。 - 加入1.5倍体积的 etoh (~ 570μl)。漩涡为15秒混合。
- 将600μl 的 rna 混合物转移到 rna 分离自旋柱中 (见材料表)。离心以 12, 000 x g的速度进行15秒的离心。重复此步骤, 将所有液体通过到同一自旋柱中。
- 用0.35 毫升的 rw1 缓冲液 (见材料表) 在 rdd 缓冲液中加入80μl 的无 rnasase dnase i (见材料表), 将其清洗。在室温下孵化20分钟。
请注意:去除所有 dna 污染是至关重要的。 - 随后用 0.35 ml 的 rw1 缓冲液和 0.35 ml 的 2x rpe 缓冲液 (见材料表) 在每一步旋转15秒来清洗柱。用 12, 000 x 克的空收集管将旋转柱离心 1分钟, 使柱干燥。
- 在柱的中心加入32μl 的无 rnase 水。以 12, 000 x 克的离心离心器, 以 30秒的速度进行培养, 以获得 ~ 30μl 的纯化 rna 溶液。在处理变性样品时, 将样品置于-20°c。
- 变性 rna 控制制剂
- 将直流的 30μl rna 样品放入 1.7 ml 塑料管的冰上。在管内加入50μl 的甲酰和15μl 的直流缓冲液, 其中含有 300 mm hepes (ph 8.0) 和 25 mm edta。
- 在95°c 下将 rna 变热 1分钟, 快速加入5μl 的 nai 库存溶液 (2m), 然后轻拍两次混合, 将管重新放入加热块。在95°c 下额外培养 1分钟, 然后立即将管放在冰上。
- 加入0.4 毫升的硫氰酸鸟。重复步骤2.3.1 –2.3.4。
- 用 2 x rpe 缓冲液的0.6 毫升 (见材料表) 在每一步旋转15秒来清洗色谱柱。用 12, 000 x 克的空收集管将旋转柱离心 1分钟, 使柱干燥。
- 在柱的中心加入32μl 的无 rnase 水。以 12, 000 x 克的离心离心器, 以获得 ~ 30μl 的回收 dc rna 溶液。
- 底漆扩展名
- 用无 rnase 水将 rna 溶液从2.3.7 中归一化, 并将其2.4.5 为0.5μμμl。从 mncl2* 4h2 o 粉体中快速制备 30 mm mncl 2 溶液.
- 将每个样品的 9μl rna 溶液转移到 pcr 条。在每个管中加入1μl 的 10 mm dntp 和1μl 的2μm 基因特异性引物 (gsp)。移液器上下四次混合。在65°c 下, 在热循环器中孵化 5分钟, 并在冰上加冰 gt;1 0分钟。
请注意:或者, 可以用1μl 的随机非胺剂来替代普惠制。 - 在每个 pcr 管中, 加入2μl 的 10倍 rt 缓冲液 (见材料表)、4μl 30 mm mncl2和 2μl 100 mm dtt 的混合物。上下的移液器4倍混合。在42°c 下孵化2分钟。
- 加入1μl 的逆转录酶 (见材料表)。上下的移液器4倍混合。在42°c 时在热循环器中孵化3小时。
- 库准备和下一代测序
- 通过添加1μl 的 dna 聚合酶、10x dna 聚合酶缓冲液 5μl (见材料表)、2μl 的 dmso、1.5μl 的每个引物 (10μm)、34μl 的 h2o 和从步骤 2.5.4中添加5μl 的 cdna 来建立 pcr 反应。
- 设置热循环器如下: 第1阶段) 95°c 2分钟;阶段 2) 95°c 为 30秒;阶段 3) 60°c 为 30秒;阶段 4) 68°c 为 30秒;第5阶段) 循环回到第2阶段, 循环30个周期;阶段 6) 68°c 3分钟;和阶段 7) 无限保持在 4°c, 直到下一步。
- 使用1.8% 琼脂糖凝胶纯化放大器。
请注意:pcr 带应显示为凝胶上的单个带。 - 利用文献6、26中确定的标准分割和结扎方法构建图书馆。
- 下一代测序设备上使用 1 x 75次单端读取的序列, 每个样本可产生约 1, 000万次读取。
- 使用 "周" 组26开发的 ShapeMapper 和 superfold 软件包分析结果。
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Representative Results
我们之前证明, rna 拼接调节剂 smn-c2 与 smn2 基因前 mrna 的外显子7上的 aggaag 母题相互作用, 并使用 shape 评估 smn-c26 存在时的 rna 结构变化。smn-c2 的结合位点不同于 fda 批准的 sma、nusinersen 反义寡核苷酸 (aso), 它在内含子 7、28 (图 1 a) 上结合和阻断了内含子上的内含子拼接消声器 (iss)。大多数已知的 smn2 外显子7的剪接调节剂在 mrna前29 的外显子7的 ~ 100个核苷酸范围内;因此, 140 和276个核苷酸长 rna 序列被用于体外和细胞内的形状, 具有代表性, 涵盖外显子7和相邻的内含区域 (图 1a)。
在这种具有代表性的体外 shape 分析中, 感兴趣的 rna 序列被嵌入到周实验室开发的优化盒式磁带中, 该盒式磁带与大多数 rna 序列1兼容。有时, 兴趣的顺序与这个盒式磁带相互作用或干扰。在这些情况下, 改进后的盒式磁带可用于以下三个特性: (i) 3 ' 端特定引物结合位点, 与 rna 序列的任何部分相比, 对引物具有更有效的杂交亲和力, (二) 高度结构化的发夹环路位于引物结合位置的直接上游, 将显示特定和可重现的 shape 信号 (这将作为实验的内部控制和对齐从实验到实验的信号的方法), 和 iii) 5 ' 端发夹结构元素, 表示 shape 信号的结束。shape 盒盒盒在 5 '-和 3 '-端都有额外的自切核酶序列, 以生成同质 rna30。我们发现锤头和三角洲肝炎病毒核酶与 shape 盒是兼容的, 通常能产生较高的 rna 产量。生成的模板 rna 具有 3 '-端的 2 ', 3 ' 循环磷酸盐和 5 ' 端的羟基, 这不干扰引物延伸。如方案 1所示, 在 shape 和核酶盒内合成了一个140核苷长序列, 覆盖了 smn2 和前 mrna 中相邻区域的外显子7。
一般来说, 在表达式盒中连接的兴趣序列应该足够长, 以涵盖潜在的二级或更高的结构顺序。在 smn2 外显子7的情况下, 140 核苷酸区包含两个茎环结构6,31。感兴趣区域的结构因案而异, 应通过试错进行评价。
在本实验中, 采用32p 标记引物延伸产物的聚丙烯酰胺测序凝胶, 对体外shape 型材进行了可视化。另一种可视化方法是使用毛细管电泳与荧光标记 dna 引物32。在聚丙烯酰胺测序凝胶中, 由于在逆转录酶的起始阶段偶尔停止和强烈的反应, 在 5 '-端附近的 ~ 20个核苷和在 3 '-端附近的 ~ 10个核苷酸的感兴趣序列将无法定量地显示出来。全长度成绩单1的 page 凝胶上的带.
rna 模板的制备凝胶恢复的另一种方法 (步骤 1.1.6 1.1.12) 是超载一个迷你凝胶, 如果所需的 rna 模板的产量是 & gt;90%。建议通过脱盐色谱柱并在50μl 的 te 缓冲液中洗脱 rna 来去除 rna 产物中多余的 ntp。测量每口井中 rna 的浓度和负载5.0 微克。在 t7 转录 rna 模板的纯化步骤中, 当二甲苯氰醇 ff 染料 (浅蓝色) 通过6% 变性 tbe-尿素凝胶的三分之二时, 停止 page。自裂解 rna 片段 (和 lt;80 核苷) 通过凝胶, 这使得所需的 rna 作为染色后凝胶中唯一的主要带 (图 1b)。
smn-c2 (图 1c) 是根据公布的程序33合成的, 并溶解在 10 mm dmso 库存溶液中。在 10% dmso 溶液中, 库存溶液进一步稀释为500和 50μm, 以实现分别为50和5μm 的最终浓度。在37°c 的30分钟内, 在 dmso 或 smn-c2 存在的情况下, 分氧 rna 重新折叠到其平衡阶段。较长的孵育时间并没有改变实验的结果。对两个实验样品 (50 和 5μm smn-c2)、两个对照 (dmso 和 nab-控制) 和四个标记 (a、t、g、c) 进行了引物延伸处理。将凝胶暴露在荧光粉存储屏幕中之后, 一个成功的 shape 实验将显示: (i) 凝胶顶部的单个最强烈的波段和 ii) 凝胶中的单个核苷酸分辨率下的带, 无需涂片 (图 1d)。page 分析中的一个常见问题是凝胶中间可能会出现一个被称为 "盐前" 的涂片区域 (图 1e)。这可能是由于高浓度的盐, dmso, 或其他不需要的物质在装载样品中, 可以通过乙醇沉淀去除。
在体外形状中, 纯 rna 模板是实验成功的关键。不纯 rna 模板通常是导致不受欢迎的结果的原因。如果 page 分析清楚地显示了2组标记的模式, 则表明 rna 模板不是同质的, 需要用制备的 tbe-尿素凝胶进行再纯化。
对于细胞内形状, 成功实验的关键是设计用于放大的优化引物集。使用0.10 微克的无基因组 dna cdna 模板, 在琼脂糖凝胶分析中, 应在 25个 pcr 周期内观察到一个带。因此, 应避免重复的内子序列。为了研究 smn-c2 对 smn2 前 mrna 的结构影响, 对三套引物进行了测试 (表 2), 均令人满意 (图 2 a)。
目标 rna 序列的低拷贝数通常是细胞内形状的一个问题。为了丰富感兴趣的 rna, 一个包含在强 cmv 启动子下的 rna 感兴趣序列的小恒星烯被转染到293t 细胞中。由于 smn2 微型基因的拼接模式重述了具有或不具有 smn-c219、34的内源性 smn2, 因此我们设想 smn-c2 在过度表达的 smn2 前 mrna 中相互作用 rna 的结构可能与相同内源性基因产物。在拼接试验中, smn-3分钟的 ec50为 ~ 0.1μm6,19, 采用高端浓度 (20μm) 来保证小分子和靶点 rna 序列的结合状态。
在分离 rna 后, 可将基因特异性引物和随机引物用于扩展。在 smn2 的 exon 7 的情况下, 我们发现 smn2e7-33-rv (表 2) 产生的所需 cdna 的副本比随机的非 er 高, 这证明在 pcr 扩增与 SMN2E7-338 引物集 (表 2) 后25个周期后。在 2 '-oh 改性步骤中, 91μm 最终 nai 浓度使用了15分钟的潜伏期。如果使用不同的细胞类型或培养基, 则必须重新优化培养时间。如果孵化时间过长, 琼脂糖凝胶分析的放大器有时会无法显示带。
由周实验室35开发的一个基于测试的程序 shapemapper 被用来分析下一代测序生成的数据 [用于 smn2 外显子7前 mrna 细胞内处理的 smn-c2 的原始数据, 请参阅序列读取存档 (sna)数据库]。在整个放大器中, shape 的反应性没有发生重大变化 (& gt;1), 这表明二级结构仍然存在 smn-c2 (图 2b)。superfold 35 生成的电弧图也证实了这一点。连接线表示基于每个核苷酸的 shape 活性的可能基对。DMSO-treated 和 dmso 处理的 rna 建模基本相同 (图 2c)。计算了每个核苷酸的差异细胞内形状反应性 (图 2b), 反应性变化最大的是 tsl-1 (外显子7的 5 '-端), 而不是 tsl-2 (外显子7的 3 '-端)。这一结果与体外形状一致;虽然, 基础配对转移从细胞内形状分析的体外形状 rna 建模 (图 2d)。
细胞内变形的一个常见问题是整个放大器的低突变率。这通常是由于基因组 dna 污染。dna 不包含 2 '-oh 组;因此, 没有形成酰化产物与 nai。因此, pcr 扩增仅仅反映了 dna 聚合酶的低突变率。在大多数情况下, 通过鸟苷硫氰酸酯分离 rna, 然后在柱上 dnase 消化, 足以去除所有 dna。如果 dna 污染持续存在, 重复步骤2.3 进行 rna 分离。
方案1:dna 转录模板的 dna 序列.在锤头病毒核酶序列中, 红色的 12 bp 序列是 5 '-盒的前 12 bp 的反向补充。本文所介绍的 rna 序列是一个 140 bp 的 mrna 前序列, 其中含有人 smn2 基因的外显子7。请点击这里查看此图的较大版本.
图 1:smn-c2 存在下 smn2 外显子7前 mrna 的体外形状实验设计及结果。(a) smn2 基因体外和细胞内形状研究的兴趣序列概述。smn-c2 与外显子7上的 aggaag 主题结合, 这与 nusinersen 结合位点的位置不同。(b) t7 转录产物的纯化。这三条车道中的每一个都含有5.0 微克的粗 rna。在 1x tbe 缓冲液中, 用 sybr-sae (1:10000) 染色5分钟。红色虚线框表示 rna 恢复的切除边缘。(c) smn-c2 的结构。(d) 用 nai 和一个140核苷酸长 rna 模板进行体外形状实验, 其中含有外显子7。1 = dmso;2 = smn-c2 (50μm);3 = smn-c2 (5μm);4 = 缺乏 nai;5-8 = 在引物延长过程中, 由 ddatp、ddttp、ddctp 和 ddgtp 的加入产生的梯子。在 60 w 的 tbe-尿素测序凝胶上进行了页, 3 h. 红色星号表示带强度增加, 为 50μm smn-c26.(e) 一个单独实验中红色虚线框中 "盐前" 区域的例子。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2:smn2 外显子7前 mrna 的细胞内形状 rna 建模。(a) 所有三套引物 (表 2) 的 pcr 扩增在琼脂糖凝胶分析中产生了一个单一的波段。1 = smn2e7-338, 2 = smne7-276, 3 = SMN2E7-338, 4 = dna 阶梯。(b) smn2 微型转染293t 细胞中的差动细胞内形状反应性, 适用于 tsl1 中的 10μm smn-c2 和 dmso。单核苷酸分辨率下的形状反应性。其标准偏差是由 ShapeMapper 软件35计算的。绿色星号表示 10μm smn-c2 引起的显著形状反应变化。x 轴上显示的 276个 bp 振幅中核苷酸的编号. 错误条是由形状映射器软件26估计的。(c) 由 super折叠35 生成的电弧图, 用于细胞内 shape 数据的最合理的 rna 二级结构建模。(d)外显子7及相邻区域的体外和细胞内 shape 定向建模。对于体外 rna 模型, shape 稳定盒 (橙色) 和核苷酸 1-19 (蓝色) 在草图中显示。对于细胞内 rna 模型, 核苷酸编号与体外 shape 模板对齐。省略了1-18 和120-140 核苷酸。体外和细胞内形状的红色和绿色星号分别显示显著的反应性变化。以前名为 tsl1 和 tsl231 的辅助结构用蓝色框括起来。请点击这里查看此图的较大版本.
| 底漆名称 | 5 '-3 ' 序列 |
| 核子 | taaacggcacggggggggat |
| 核子 | ggaggggtagaggat |
| rt 底漆 | gaccggacgagcg |
表 1: 代表性实验中使用的引物序列。
| 名字 | 序列 (5 '->3 ') |
| smn2e7-337-fw | aagatacttattcta |
| smn2e7-33-rv | tgtttatatactcaccacacact |
| smn2e7-276-fw | aatgtggagaaaatgct |
| smn2e7-276-rv | aacctcacatacatact |
| smn2e7-251-fw | tagaaacattttaactactaccc |
| smn2e7-251-rv | tcacttacattacattattt |
表 2: 用于扩增感兴趣的前 mrna 序列的引物集.所有三个引物集在 pcr 反应中产生一个单一的放大器, 并与无基因组 dna 模板进行。
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Discussion
在体外形状中, 使用高质量的均质 rna 模板至关重要。然而, t7 转录通常会产生异质序列36。特别是在 3 '-末端有±1核苷酸的序列, 产量不可忽略36 , 通常很难通过聚丙烯酰胺凝胶纯化去除。异构 rna 模板可以在引物延伸产物的测序凝胶分析中产生多组信号, 这有时会使其难以解释结果。rna 模板表达盒的 5 '-和 3 ' 端的核酶将使两端同质化。
无论是体外型还是细胞内形状型, 2 '-oh 改性试剂的培养时间是另一个关键因素。周组建议使用水淬火 2 '-oh 酰化试剂的半衰期至少为1的 5倍.在我们的手中, 用 nai (t半= ~ 20分钟) 孵育, 在体外和细胞内的形状中 gt;30 分钟, 会导致反应过度的结果。如图1d 所示, 一个好的体外shape 分析应该有 & gt;50% 的总信号在凝胶上作为全长转录, 确保大多数修改后的 rna 只进行一次酰化。过度反应将使双酰化产物不可忽视, 并使特征分析偏向于丰富的短长度延伸产物。在单元格形状中, 库构造的放大器应显示为琼脂糖凝胶分析中的单个波段 (步骤 2.6.3)。带的涂片表示反应过度, 孵育时间应缩短。在有代表性的实验中, 37°c 时15分钟的孵育时间是体外和细胞内形状的最佳选择。这应该作为在类似应用中进行 nai 修改的起点。
还有其他 2 '-oh 改性剂22广泛用于形状, 如1m7。与 nai 相比, 1m7 与 2 '-oh 组相比具有更好的反应性, 在水中的半衰期更短。在我们手中, 1m7 在细胞内形状实验中形成了大量的细胞培养介质中的黄色沉淀, 使 rna 分离复杂化。为了比较起见, 体外和细胞内的 shape 都使用 nai 作为 2 '-oh 改性剂, 用于研究 smn-c2 和 smn2 mrna 前相互作用。如果只需要体外形状, 1m7 是一个替代方案, 在核糖结构测定7,8的各种研究证明了这一点。
一般来说, 细胞内的形状高于体外的形状是首选, 特别是如果分子大概是在真核细胞的细胞核中作用。细胞核中的 rna 结合蛋白是丰富的, 在体外条件下几乎不可能重述细胞环境。
在过去的十年里, shape 成为研究 rna 二级结构的标准方法。与传统的 rnase 37 rna 足迹相比, 它更适合于研究小分子-rna 相互作用, 因为这些相互作用有时可能很弱, 对 rnase 的挑战不敏感。
使用 shape 研究小分子诱导的 rna 结构变化的主要局限性在于其结果不能揭示结合位点。在 smn-c2 结合 mrna 前的体外和细胞内形状中, 在假定的结合位点上, shape 反应性没有改变 (图 1d,图 2b);相反, 在循环或移动区域的2到3个远程站点的反应被改变。smn-c2 大概与 rna 双螺旋区域 (图 1d,图 2d) 结合在一起, 该区域通常具有较低的形状反应性。因此, 进一步稳定结构以减少形状反应性可能无法观察到。要生成假定的结合位点, 应使用其他方法, 如 chemclip38 , 其中涉及交联化学探针。
一个常见的替代方法来映射 rna 二级或更高的结构和核苷酸动力学是核磁共振光谱39,40。结果表明, 从定量核磁共振分析中获得的 rna 动力学与 shape 活性密切相关.在小分子结合的背景下, 化学移位扰动可以揭示相互作用的核苷酸21。
由于针对 rna 的小分子成为药物开发的一种新的模式11, 我们设想将建立 shape 作为一种标准的方法来评估目标 rna 在小分子存在的情况下的结构影响。今后, 需要一种针对小分子药物的全转录范围的广鼠审讯方法。
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Disclosures
提交人声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作是由国家卫生研究院 r01 赠款 (ns094721, k. a. j.) 促成的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA oligonucleotide | IDT | gBlock for >200 bp DNA synthesis | |
| Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix | Thermo Fisher | F566S | |
| NucleoSpin gel and PCR clean-up kit | Takara | 740609.50 | |
| MegaScript T7 transcription kit | Thermo Fisher | AM1333 | Contains 10x reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase |
| DEPC-treated water | Thermo Fisher | 750023 | |
| 2x TBE-urea sample buffer | Thermo Fisher | LC6876 | |
| 40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) | Bio-Rad | 1610146 | |
| 10x TBE buffer | Thermo Fisher | 15581044 | |
| Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34133 | |
| TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
| SYBR-Safe dye | Thermo Fisher | S33102 | |
| 6% TBE-urea mini-gel | Thermo Fisher | EC6865BOX | |
| ChemiDoc | Bio-Rad | ||
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| γ-32P-ATP | Perkin Elmer | NEG035C005MC | |
| Hyperscreen™ Intensifying Screen | GE Healthcare | RPN1669 | calcium tungstate phosphor screen |
| phosphor storage screen | Molecular Dynamics | BAS-IP MS 3543 E | |
| Amersham Typhoon | GE Healthcare | ||
| NAI (2M) | EMD Millipore | 03-310 | |
| GlycoBlue | Thermo Fisher | AM9515 | |
| SuperScript IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18090010 | Contains 5x RT buffer, SuperScript IV |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher | R0192 | |
| ddNTP set (5 mM) | Sigma | GE27-2045-01 | |
| large filter paper | Whatman | 1001-917 | |
| Gel dryer | Hoefer | GD 2000 | |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit | Qiagen | 51104 | Also contains RNase A and protease K |
| SMN2 minigene34 | Addgene | 72287 | |
| Heat inactivated FBS | Thermo Fisher | 10438026 | |
| Pen-Strep | Thermo Fisher | 15140122 | |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher | 31985062 | |
| FuGene HD | Promega | E2311 | |
| TrpLE | Thermo Fisher | 12605010 | |
| DPBS without Ca/Mg | Thermo Fisher | 14190250 | |
| TRIzol | Thermo Fisher | 15596018 | |
| RNeasy mini column | Qiagen | 74104 | Also contains RW1, RPE buffer |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | Contains DNase I and RDD buffer |
| Deionized formamide | Thermo Fisher | AM9342 | |
| MnCl2•4H2O | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| random nonamer | Sigma-Aldrich | R7647 | |
| SuperScript First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 11904-018 | Contains 10x RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase |
| AccuPrime pfx DNA polymerse | Thermo Fisher | 12344024 | |
| NextSeq500 | Illumina | ||
| NucAway column | Thermo Fisher | AM10070 | for desalting purpose |
References
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