Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Ved hjælp af in Vitro og i celler form at undersøge lille molekyle induceret Pre-mRNA strukturelle ændringer

Published: January 30, 2019 doi: 10.3791/59021
Automatic Translation
1, 2, 1
1Calibr, The Scripps Research Institute, 2Department of Integrative Structural and Computational Biology, The Scripps Research Institute

Summary

Detaljerede protokoller for både in vitro og i celle selektiv 2'-hydroxyl acylation analyseret af primer forlængelse (SHAPE) forsøg at bestemme sekundær struktur af pre-mRNA sekvenser af interesse i overværelse af et RNA-targeting lille molekyle er præsenteret i denne artikel.

Abstract

I forbindelse med udvikling af lægemidler af RNA-targeting små molekyler ønskes belyse de strukturelle ændringer på deres interaktioner med target RNA sekvenser. Vi giver heri en detaljeret i in vitro og i celle selektiv 2'-hydroxyl acylation analyseret af primer forlængelse (SHAPE) protokol for at studere RNA strukturændringer i overværelse af en eksperimentel stof for spinal muskelatrofi (SMA), overlevelse motor neuron (SMN)-C2, og i pre-mRNA af gen, SMN2 exon 7. I in vitro-form, er en RNA-sekvens af 140 nukleotider indeholdende SMN2 exon 7 transskriberet af T7 RNA-polymerase, foldet i overværelse af SMN-C2 og efterfølgende ændret af en mild 2'-OH acylation reagens, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). Denne 2'-OH-NAI adduct er yderligere aftestede af et 32P-mærket primer extension og løst af polyacrylamid gelelektroforese (side). Omvendt, 2'-OH acylation i i celler form finder sted på stedet med SMN-C2 bundet cellulære RNA i levende celler. Pre-mRNA-sekvensen af exon 7 i SMN2 gen, sammen med figur-induceret mutationer i filtypenavnet primer blev derefter forstærkes ved PCR og næste generation sequencing. Sammenligner de to metoder, in vitro-form er en mere omkostningseffektiv metode og kræver ikke datakraft til at visualisere resultater. Dog, modellens in vitro form-afledte RNA undertiden afviger fra sekundærstruktur i cellulære sammenhæng, sandsynligvis på grund af tabet af alle interaktioner med RNA-bindende proteiner. I celle form behøver ikke et radioaktivt materiale arbejdspladsen og giver en mere nøjagtig RNA sekundær struktur i den trådløse forbindelse. Desuden, i celle figur er normalt gældende for en større vifte af RNA sekvenser (~ 1.000 nucleotider) ved at udnytte næste generations sekventering, i forhold til in vitro-forme (~ 200 nucleotider), som regel afhængig af SIDERS analyse. I tilfælde af exon 7 i SMN2 pre-mRNA, FIGUREN in vitro og i celle afledte er RNA modeller lig hinanden.

Introduction

Selektiv 2'-hydroxyl acylation analyseret af primer forlængelse (form) er en metode til måling af kinetik af hver nukleotid i en RNA-sekvens af interesse og belyse sekundærstruktur på enkelt-nukleotid løsning1. Figur metoder, både i in vitro betingelser2,3,4 (oprensede RNA i en defineret buffersystem) og i levende pattedyrceller5,6, er blevet udviklet for at undersøge sekundært struktur af medium længde RNA sekvenser (typisk < 1.000 nucleotider i celler form og < 200 nucleotider for in vitro-form). Det er især nyttig til at vurdere strukturelle ændringer i receptor RNA ved binding til RNA-interagere lille molekyle metabolitter2,4,7,8 og studere mekanistiske handlinger målretning af RNA molekyler under stof udvikling9,10.

RNA-targeting drug discovery har for nylig henledt opmærksomhed i akademiske laboratorier og medicinalindustrien11,12 via forskellige tilgange og strategier13,14,15 ,16. De seneste eksempler på målretning af RNA små molekyler til klinisk brug er to strukturelt forskellige eksperimentelle narkotika, LMI-07017 og RG-791618,19, for spinal muskelatrofi (SMA), som viste lovende resultater i fase II kliniske forsøg20. Begge molekyler blev demonstreret at målet overlevelse af motordrevne neuron (SMN) 2 pre-mRNA og regulere splejsning processen af SMN2 gen6,17,21. Vi viste tidligere anvendelse af in vitro og i celler form i en undersøgelse af mål RNA strukturelle ændringer i overværelse af en analog af RG-7916 kaldes SMN-C26.

I princippet måler figur 2'-OH acylation hastigheden på hver nukleotid i en RNA-sekvens i overværelse af overskydende beløb af en selvstændig quenching acylation reagens i en fordomsfri måde. Acylation reagens er ikke stabilt i vand, med en kort halveringstid på (f.eks. T1/2 = 17 s 1-methyl-7-nitroisatoic anhydrid; eller 1 M 7, ~ 20 min til 2-methylnicotinic acid imidazolide, eller NAI)22 og ufølsomhed over for identitet baser23. Dette resulterer i en mere gunstig acylation af 2'-OH-grupper af fleksible baser, som kan omdannes til en præcis vurdering af dynamikken i hver nukleotid. Specifikt, er et nukleotid i en basepar normalt mindre reaktivt end en uparret, til en 2 'er-OH modificerer reagens, såsom NAI og 1 M 7.

Ser man på kilden til skabelonen RNA og hvor 2'-OH acylation finder sted, kan figur generelt inddeles i in vitro og i celler form. I vitro form bruger renset T7 transskriberet RNA og mangler en cellulær kontekst, eksperimenterende design. I i celler form forekomme både RNA skabelon transskription og 2'-OH acylation i levende celler; Derfor kan resultaterne sammenfatte RNA strukturelle model i forbindelse med cellulære. I celle form er blevet henvist til som vivo form for FIGUREN i levende celler i litteratur24. Da dette eksperiment ikke er udført i et dyr, betegnes vi dette eksperiment som i celler form for nøjagtighed.

Strategier for den primer udvidelse fase af in vitro og i celler form er også forskellige. I in vitro form stopper reverse transkription ved 2'-OH acylation holdning i nærværelse af Mg2 +. Filtypenavnet 32P-mærket primer derfor vises som et band i polyacrylamid gelelektroforese (side) og intensiteten af bandet er proportional med acylation sats1. I i celler form, reverse transkription genererer tilfældige mutationer på 2'-OH addukt holdning i nærværelse af Mn2 +. Den mutationsmønstre sats af hver nukleotid kan blive fanget af i dybde næste generation sequencing, og figur reaktivitet med enkelt-nukleotid opløsning kan derefter beregnes.

Et potentielt problem for i celler form er det lavt signal / støj-forhold (dvs. et flertal af grupperne 2'-OH er uændret, mens de umodificerede sekvenser indtager de fleste af læse i næste generation sequencing). For nylig, en metode til at berige 2'-OH ændret RNA, nævnt som vivo Klik figur (icSHAPE), blev udviklet af Chang laboratorium25. Denne berigelse metode kan være fordelagtige i at studere svage små molekyler som RNA interaktion, især i en transkriptom-wide forhør.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. in Vitro form

Bemærk: Protokollen er ændret fra den udgivne protokol1.

  1. Forberede skabelonen RNA
    Bemærk: Skabelon for T7 transskription blev bestilt som en syntetisk dobbelt-strenget DNA (dsDNA) og forstærkes af enten indsættelse i en E. coli vektor der bærer en unik par af EcoRI/BamHI begrænsning liv1975 steder, såsom pET28a, eller ved PCR. Protokol til PCR-amplifikation er illustreret nedenfor.
    1. Bland det følgende materiale: 50 μl PCR master mix (Se Tabel af materialer), 2 μl for hver primer i 10 μM (Se tabel 1 for sekvenser), 200 ng af dsDNA skabelon i 2 μl og 3 μL af dimethylsulfoxid (DMSO) og 41 μL af H2O. alikvot i to PCR rør (hver tube indeholder 50 μL af reaktionsblandingen).
    2. Oprettet den termiske cycler som følger: fase 1) 95 ° C til 30 s; fase 2) 95 ° C til 20 s; Stage 3) 56 ° C i 20 s; 4. etape) 72 ° C i 20 s; 5. etape) loop tilbage til fase 2 for 30 cykler; fase 6) 72 ° C i 3 min. og etape 7) uendelig holder ved 4 ° C indtil de følgende trin.
    3. Rense PCR-amplikon af udvinding af gel skiver (Se Tabel af materialer og bruge producentens protokol). Elueres produkt DNA med 35 μL af Tris-EDTA (TE) buffer, som indeholder 10 mM Tris (pH 8,0) og 1 mM EDTA, til at give en 0,1-0,5 μg/μL skabelon. Normalisere skabelonen oprenset DNA til 0,10 μg/μL.
      Bemærk: Valgfrit, kan kvaliteten af skabelonen analyseres på et 1.8% Agarosen gelelektroforese med 0,10 μg af DNA. En enkelt band ønskede skabelon DNA forventes på gelen.
    4. Oprette T7 transskription reaktion (samlede volumen 40 μl) ved at tilføje følgende materialer i en PCR rør: 4 μl af 10 x reaktion buffer, 4 μL af ATP, 4 μL af CTP, 4 μL af GTP, 4 μL af UTP, 4 μL af T7 enzym (Se Tabel af materialer) , 4 μL af renset PCR-amplikon fra trin 1.1.3 (0,4 μg) og 12 μl af diethyletheren pyrocarbonate (DEPC)-behandlet vand. Mix af pipettering op og ned 4 x. Der inkuberes ved 37 ° C i 4-16 h i en termisk cycler eller i et 37 ° C inkubator.
      Bemærk: Begynde at konfigurere trin 1.1.6 mens reaktion i trin 1.1.4 er igangværende.
    5. Tilføj 2 μl af DNase, mix af pipettering op og ned 4 x og inkuberes ved 37 ° C i 15 min. Bland med lige saa stort volumen af 2 x Tris-Borat-EDTA (TBE)-urea prøvebuffer (Se Tabel af materialer). Varme ved 70 ° C i 3 min, på listesiden.
    6. I en RNase-fri flaske, bland 75 mL 40% acrylamid/bisacrylamide løsning (29: 1, se Tabel af materialer), 180.2 g af urinstof, og 50 mL af 10 x TBE buffer (RNase-fri, se Tabel af materialer). Sætte flasken på en orbitalryster (250 rpm), indtil alle krystaller af urinstof er opløst (kan tage op til 2 h). Regulér lydstyrken til 500 mL med DEPC-behandlet vand. Filtrer løsning med en 0,2 μm membran (Se Tabel af materialer).
      Bemærk: I denne proces, undgå benytter spejlende og røre-bar for at forhindre RNase forurening. Opløsningen kan opbevares ved 4 ° C i op til 1 år.
    7. Ren to elektroforese glasplader af en ordentlig størrelse (16,5 cm x 24 cm) med deioniseret vand og 70% EtOH ved hjælp af et stykke af aftørring papir. Juster plader med et par af 2,0 mm spacere (plade med en Silikoniseret overflade vender indad) og tætning kanten af pladerne med tape. Dobbelt-tape hjørnet af pladen til at undgå utæt.
    8. I et bægerglas blandes 200 mL af acrylamid løsning fra trin 1.1.6, 2,0 mL 10% ammonium persulfat løsning, og 100 μL af tetramethylethylenediamine (TEMED) med en RNase-fri pipette tip ved omrøring hurtigt i 30 s. Tilt plader på et stykke af benchtop cover og hæld løsning fra hul i pladerne. Tryk på pladen for at løfte alle bobler og læg pladen fladt på dækslet til Benchtops. Straks indsætte kammen og lad gel polymerisere i mindst 1 time.
      Bemærk: Hvis gelen er skal anvendes inden for den næste dag, dække toppen af gel med et stykke vådt papir håndklæde og wrap op med et større stykke plastic wrap. Placer det liggende fladt på 4 ° C.
    9. Fjern tapen og klemme pladen i en elektroforese bevoksning. Fjern kammen og tilføje passende 1 x TBE buffer på toppen og bunden af reservoiret. Pre Kør gelen i 30 min på 20 W.
      Bemærk: Valgfrit, hvis indholdet af den ønskede RNA er ~ 90% eller derover, kan en mini gel bruges i substitution af en forberedende gel.
    10. Vask hver af lastning wells af pipettering op og ned to gange med væske i reservoiret. Tilføje rå RNA fra trin 1.1.5 i brøndene. Kør gelen på 20 W indtil xylen cyanol FF farvestof (lyseblå) passerer omkring to tredjedele af gel's længde (~ 60 min).
      Bemærk: Sikre for at indlæse mere end en tredjedel af højden af brønden (brug flere brønde, hvis nødvendigt).
    11. Fordyb gel i 1 x TBE buffer med 1:10,000 fortynding af sikker farvestof (Se Tabel af materialer) i en container stort nok for gel. Sætte beholderen på en orbitalryster for 5 min. ved 80 rpm.
    12. I UV-lys, identificere RNA bølgeområde og hurtigt skære et tyndt bånd af gel ved hjælp af en ren barberblad. Sted 1-2 gel skiver i en 1,7 mL tube.
    13. Genskab RNA fra gel skive ved passiv eluering. Tilføje passende eluering/nedbør mix (~0.3 mL pr. Skive) til hver tube: 0.3 M NaOAc (pH 5,2), 2,5 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% sodium dodecyl sulfat (SDS) i DEPC-behandlet vand. Rotere røret, der indeholder gel splice(s) ved 4 ° C for 16 h.
      Bemærk: En typisk opsving er ~ 75% i dette trin. Fjerne for at øge udbyttet, og indsamle elueringsvæsken og tilføje den samme mængde af eluering buffer, så Gentag dette trin.
    14. Kombinere elueringsvæsken i en ny 1,7 mL tube. Tilføje 2.5 x iskold EtOH, invertere rør seks gange for at blande væsken og placere rør ved-80 ° C i mindst 1 time.
    15. Der centrifugeres i 10 min på 10.000 x g og 4 ° C. Fjern forsigtigt supernatanten af pipettering. Vaske RNA pellet ved at tilføje 80% EtOH (1 mL pr tube), vortex for 15 s, og der centrifugeres i 10 min på 10.000 x g og 4 ° C.
    16. Fjern supernatanten og lufttørre RNA pellet for 5 min. tilsættes 50 μL af RNase-fri vand og blanding af pipettering op og ned 10 gange. Normalisere RNA-koncentrationen til 0,10 μg/μL. Gemme den oprensede RNA ved-80 ° C.
      Bemærk: Ikke over tørre RNA pellet.
    17. Du kan vælge for at analysere kvaliteten af RNA, fortyndes 1 μL (100 ng) af RNA fra trin 1.1.16 i 5 μl vand og blandes med 5 μl af 2 x TBE-urea prøvebuffer. Derefter varme ved 70 ° C i 3 min og belastning på en 6% TBE-urea mini gel.
      1. Kør gelen på 180 V for 1 h. udføre farvning som gjort i trin 1.1.11. Visualisere gel med UV i et billedbehandlingssystem. En enkelt band forventes på den ønskede længde.
  2. Forberede 32P-mærket primer
    1. Oprettet reaktionen ved at blande de følgende materialer: 10 μL af γ -32P-ATP (~1.5 mCi, ~ 25 μM, se Tabel af materialer), 2 μl af reverse transkription (RT) primer (100 μM, sekvens Se tabel 1), 2 μl af 10 x T4 polynucleotide kinase (PNK) reaktion buffer, 1 μL af T4 PNK (Se Tabel af materialer), og 5 μl af RNase-fri vand. Der inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
      Forsigtighed: Ordentlig beskyttelse er behov for trin 1,2-1,5 i en autoriseret arbejdsplads for radioaktive materialer.
    2. Varme-inaktivere i 20 min. ved 65 ° C. Tilføje prøver på en udvanding kolonnen og centrifugeres ved 1.000 x g for 1 min. Bland elueringsvæsken med 25 μL af prøvebuffer 2 x TBE-urea. .
      Bemærk: Gemme den mærkede rå vare ved-20 ° C, hvis den ikke skal renses straks.
    3. Kør en 10% acrylamid gel på 20 W i 1 time.
      Forsigtighed: Indlæse 32P-mærket primer fra skridt 1.2.1 ind på gelen og undgå blødning radioaktivitet i det øverste vandreservoir. Læg ikke mere end en tredjedel af højden af nå til sikre en tynd band på gel (brug flere brønde, hvis nødvendigt). Væske i den nederste reservoir kan være yderst radioaktivt.
    4. Fjerne glasplader af gel kassette og lægge gel på et stykke plastic wrap. Fold den plast wrap til at dække toppen af gel til at gøre en lufttæt sandwich. Placer gel sandwich på en calcium tungstate fosfor skærm og udsætte med billedbehandling instrument. Image gel igen med regelmæssige lys at vide, hvor kanterne af gelen.
    5. Bruge et billedbehandlingsprogram til at overlejre to billeder. Juster gel på det udskrevne billede. Brug en frisk barberblad til at skære de ønskede bands ud af gelen. Sted 1-2 gel skiver i en 1,7 mL tube.
      Bemærk: Sørg for det udskrevne billede har den samme størrelse som den faktiske gel. Dobbelt-tjekke justeringen af imaging sidesten gelen igen efter opskæring gel udsnit.
    6. Genskab 32P-mærket primer ved at følge trin 1.1.13 til 1.1.16. Tage 1,0 μL af løsningen et 0,4 mL rør og fortyndes primer med 1 x TE buffer til at opnå radioaktivitet i 1,0 μL på ~ 100.000 cpm. Gemme den renset 32P-mærket primer på-80 ° C, indtil RNA 2'-OH ændring reaktion, men længere end 4 uger.
  3. Lille molekyle bindende og RNA 2'-OH ændring
    1. For at forberede fire prøver, skal du tilføje 8 pmol RNA i 32 μl af 0,5 x TE buffer til en 1,7 mL tube, heat på 80 ° C i 2 min., og snap-cool på køl i mindst 1 minut.
      Bemærk: Brug følgende formel til at beregne den omtrentlige molekylvægt af RNA: MW = (# af baser) x 340 Da.
    2. Tilsæt 8 μL af 5 x folde blanding indeholdende 500 mM HEPES (pH 8.0), 20 mM MgCl2og 500 mM NaCl. Alikvot 9 μL af RNA blandingen i hver af de fire PCR rør og mærke dem #1-#4. Tilføj 1 μl af 10% DMSO i #1 rør, 1 μL af koncentreret lille molekyle løsning (10% DMSO) i #2, 1 μL fortyndet lille molekyle løsning (10% DMSO) i #3 og 1 μL af vand i #4.
    3. Inkuber PCR rør ved 37 ° C i en termisk cycler i 30 min.
    4. Lige før 2'-OH ændring reaktionen, fortyndes 1 μL af NAI stamopløsning (2 M) med 3 μL DEPC-behandlet vand til at give en 0,5 M brugsopløsning. Straks tilføje 1 μL af NAI arbejder løsning i rør #1, #2 og #3 og 1 μL af 25% DMSO i #4. Der inkuberes ved 37 ° C i en termisk cycler i 15 min.
    5. Tilføj 100 μL eluering/nedbør mix (Se trin 1.1.13 for opskrift), 2 μl af glykogen (15 mg/mL), og overføre al væsken i hver PCR rør ind i en 1,7 mL rør. Tilføje 0,34 mL iskold 200-bevis EtOH (3 x volume) i hvert rør. Blanding af vortexing til 5 s, og rør i et-80 ° C fryser i mindst 1 time.
      Bemærk: I denne periode, begynde at etablere sekventering gel til bruges i trin 1.5.1.
    6. Der centrifugeres i 15 min. ved 14.000 x g og 4 ° C. Fjern supernatanten uden at forstyrre RNA pellet. Vaske RNA pellet ved at tilføje 80% EtOH (0,5 mL pr tube), vortex for 15 s, og der centrifugeres i 15 min. ved 20.000 x g og 4 ° C. Fjern supernatanten igen.
      Bemærk: Vælge at bruge en geigertæller for at sikre den radioaktive pellet bevarer i røret.
    7. Lufttørre RNA pellet for 5 min. tilføje 9 μL af RNase-fri vand og blandes ved pipettering op og ned 10 gange.
      Bemærk: Ikke over tørre RNA pellet. Alle nedbør forventes at være opløst i slutningen af dette trin.
  4. Markør forberedelse og primer forlængelse
    1. Overføre den modificerede RNA til 4 nye PCR rør og mærke dem #1-#4 som tidligere. Tilføje 2 pmol kontrol RNA i 7 μL DEPC-behandlet vand til 4 yderligere PCR rør og mærke dem #5 – #8. Tilføj 2 μl af radiolabeled primer (trin 1.2.6) i alle otte rør. Opvarme at anneal ved 65 ° C i 5 min og derefter straks køle ned til 4 ° C i den termiske cycler.
    2. Tilsæt 4 μL af 5 x RT buffer (Se Tabel af materialer), 1 μL dithiothreitol (DTT, 0,1 M), og 1 μL dNTP mix (10 mM) til hver af de otte PCR rør.
    3. Tilsæt 2 μL DEPC-behandlet H2O rør #1 – #4. Tilsæt 4 μL af ddATP (5 mM), 4 μL af ddTTP (5 mM) og 4 μL af ddCTP (5 mM) i rør #5 – #7. Tilføje 1 μL ddGTP (5 mM) og 3 μL DEPC-behandlet vand til tube #8. Med pipette udtages fire gange for at blande.
    4. Varme ved 52 ° C i 1 min i den termiske cycler. Tilsæt 1 μL af reverse transkriptase (Se Tabel af materialer), derefter blandes ved pipettering op og ned ad fire gange. Inkuber reaktion ved 52 ° C i 20 min.
    5. Tilføj 1 μL af 5 M NaOH i hver af rør til at hydrolysere RNA. Varme rør ved 95 ° C i 5 min.
    6. Tilsættes 5 μl 1 M HCl og Gentag ethanol nedbør (trin 1.3.5 og 1.3.6), bortset fra udelader glykogen og flydende overførsel.
      Bemærk: Udelade trin 1.4.6 resultater i en slørende region midt i gelen kendt som den "salt front".
    7. Lufttørre DNA pellet for 5 min. tilføje 10 μL af H2O og 10 μl af 2 x TBE-urea prøve loading bufferen og pipetteres op og ned 10 gange til inddampningsresten. Varme på 70 ° C i 5 min. placere rør på is før pålæsning på gelen.
  5. SIDERS analyse
    1. For at forberede en 8% sekventering Polyacrylamiden, Følg trin 1.1.6 til 1.1.10 med følgende ændringer: bruge 100 mL 40% acrylamid/bisacrylamide opløsning (29: 1) til at forberede en 8% acrylamid løsning, og bruge sekventering gel glasplader (f.eks.46 x 57 cm) med en 0,4 mm spacer.
    2. Indlæse 10 μl af prøven fra trin 1.4.7. Kør gelen på 65 W i 2 timer, eller indtil bunden farvestof når 3/4 af gelen.
      Bemærk: Gemme resten af prøver ved-80 ° C til at gentage, hvis nødvendigt.
    3. Fjern den øverste Silikoniseret glasplade ved at fjerne spacer og forsigtigt indsætte en spatel. Placer et stykke store filtrerpapir til at dække gel og tryk forsigtigt for at tillade gel til at overholde filtrerpapir. Starter fra den nederste ende, løfte filtrerpapir og fjerne gel fra glasplade sammen.
    4. Placer gel sammen med filter papir på et stykke plastic wrap, der er stor nok til at dække hele gel (filtrerpapir opad). Overføre filtrerpapir/gel/plast wrap sandwich til en tørrere gel med filtrerpapir side vender nedad.
      Forsigtighed: For at undgå radioaktivt materiale kontaminering, brug 3 til 4 flere stykker af store filtrerpapir mellem gel sandwich og gel tørrere.
    5. Tørre gel ved 70 ° C i 1 time med et vakuum. Overføre gel sandwich på en foto-bleget fosfor opbevaring screen kassettebånd. Udsætte radioaktivitet af gel til at screene for 4-16 h.
    6. Placer fosfor opbevaring skærmen på en imaging enhed og scan med medium opløsning (~ 30 min).
      Bemærk: Hvis et smil-lignende genstand er til stede på gel billede, bruge korrigerende software (fxSAFA) til at behandle billedet til en publicerbar kvalitet. Husk på at standard markør lane er 1 nukleotid længere end 2'-OH ændring baner.

2. i-celle form

  1. Primer design
    Bemærk: I modsætning til in vitro-FIGUREN behøver i celle form ikke at designe et udtryk kassette. Men en optimal primer sæt bør anvendes og skal evalueres før figur eksperimentere.
    1. Generere mindst tre unikke primer par af en BLAST-baserede primer designværktøj (f.eks.Primer-BLAST). For at studere pre-mRNA i humane celler, skal du vælge det menneskelige genom (ikke transkriptom) som en referencedatabase i Primer par specificitet kontrol parametre. Vælge størrelsen på amplikonen i rækken af 200 – 1.000 basepar (bp).
    2. Uddrag af genomisk DNA fra ~ 106 celler af interesse med et spin kolonne-baseret metode med behandling af RNase A og proteinase K (Se Tabel af materialer og bruge producentens protokol). Normalisere renset genomisk DNA i 0,1 μg/μL TE-buffer.
    3. Test PCR med protokollen udført i trin 1.1.1 og 1.1.2.
      Bemærk: Det ønskede primer sæt bør give et enkelt band på en 1.8% agarosegel.
  2. Celle forberedelse og 2'-OH ændring
    Bemærk: For at øge overfloden af pre-mRNA af interesse, er en minigene med den korrekte rækkefølge cytomegalovirus (CMV) promotor for konstituerende udtryk transfekteret i værtsceller.
    1. Pre varm næringssubstratet indeholdende 10% føtal bovint serum (FBS) og 1 x antibiotika blanding i Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) ved 37 ° C. Seed 293T celler på 50% confluency 24 h før Transfektion i dyrkningsmediet. Ændre medium til 2% FBS i DMEM uden antibiotika ~ 1 h før Transfektion.
    2. Tilføje 10 μg af minigene plasmid til 100 μL af reducerede serum media (Se Tabel af materialer) i 1 godt af en 96-brønd plade. Der afpipetteres løsning op og ned ad fire gange for at blande.
    3. Tilføje 40 μL Transfektion reagens (Se Tabel af materialer) i 100 μL af reducerede serum medier i et andet hul i pladen. Pipetteres op og ned, fire gange for at blande. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
    4. Tilføje hele plasmid løsning til Transfektion reagens suspension. Pipetteres op og ned, fire gange for at blande. Inkuber ved stuetemperatur i 30 min.
    5. Tilføje hele DNA / Transfektion reagens blanding dråbevis på overfladen af medium i hele fadet. Der inkuberes ved 37 ° C i 6-12 h.
    6. Opsug mediet og forsigtigt vaske en gang med 5 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS, pH 7,4, uden CaCl2 og MgCl2, se Tabel af materialer). Trypsinize celler med 3 mL trypsin løsning. Inkuber ved stuetemperatur i 5 min.
    7. Banke parabol forsigtigt for at adskille celler fra bunden af skålen. Neutralisere trypsin med 6 mL af næringssubstratet. Der centrifugeres ved 300 x g i 4 min. og fjern mediet.
    8. Resuspend ~ 106 celler for hver prøve i 199 μL af reaktion medium (1% FBS i DMEM) og overføre cellesuspension til en 96-brønd plade. Inkuber celler med 1 μL af sammensatte brugsopløsning eller 1 μL af DMSO i alle tre kontrolelementer i 30 minutter ved 37 ° C.
      Bemærk: Tre kontrolprøver bør medtages: DMSO kontrol med NAI, denatureret RNA med NAI og NAI negativ kontrol.
    9. Tilsættes 10 μL 2 M NAI til hver prøve, med undtagelse af denaturering kontrol (DC) RNA og NAI negative kontroller. Pipetteres op og ned, fire gange for at blande. Der inkuberes ved 37 ° C i 15 min. Ryst forsigtigt plader til genopslæmmes celler hver 5 min.
    10. Overfør celler til 1,7 mL rør og centrifugeres ved 400 x g i 2 min. uden forsinkelse. Fjern supernatanten uden at forstyrre den celle pellet.
    11. Tilføje 0,4 mL af guanidinium kaliumthiocyanat (Se Tabel af materialer). Vortex for 15 s for at homogenisere. Inkuber prøverne ved stuetemperatur i 5 min.
      Bemærk: Prøverne kan opbevares ved-20 ° C indtil fortsætter til næste trin.
  3. RNA udvinding
    1. Tilføje 0,2 mL chloroform til hver af guanidinium kaliumthiocyanat homogeniseret prøverne. Vortex for 15 s. Incubate ved stuetemperatur i 2 min.
    2. Der centrifugeres i 5 min på 12.000 x g og 4 ° C. Den øverste farveløs vandig lag indeholder RNA. ~ 380 μL af vandig opløsning overføres til en ny 1,7 mL tube.
      Forsigtighed: Forstyr ikke interphase for at undgå kontaminering.
    3. Tilføj 1,5 x mængden af EtOH (~ 570 μL). Vortex for 15 s at blande.
    4. Overføre 600 μl af RNA blandingen ind i en RNA isolering spin-kolonne (Se Tabel af materialer). Centrifugeres ved 12.000 x g for 15 s. udsmid af elueringsvæsken. Gentag dette trin til at passere gennem alle væske i kolonnen samme spin.
    5. Kolonnen udvaskes med 0,35 mL RW1 buffer (Se Tabel af materialer) af spinning for 15 s. tilføje 80 μl af RNase-fri DNase jeg i RDD buffer (Se Tabel af materialer). Inkuber ved stuetemperatur i 20 min.
      Bemærk: Det er vigtigt at fjerne alle DNA forurening.
    6. Efterfølgende vask kolonnen med 0,35 mL RW1 buffer og 0,6 mL 2 x RPE buffer (Se Tabel af materialer) af spinning for 15 s på hvert trin. Tørre kolonnen ved centrifugering kolonnen spin med en tom collection tube på 12.000 x g i 1 minut.
    7. Tilføje 32 μl af RNase-fri vand til midten af kolonnen. Der inkuberes i 1 min. Centrifuge på 12.000 x g for 30 s til at indhente ~ 30 μL af oprenset RNA løsning. Sætte prøverne ved-20 ° C under behandlingen denatureret prøven.
  4. Denatureret RNA kontrol forberedelse
    1. Sted 30 µL RNA prøve for DC i en 1,7 mL plastikrør på is. Tilsæt 50 μL af formamid og 15 μl af DC buffer indeholdende 300 mM HEPES (pH 8,0) og 25 mM EDTA ind i røret.
    2. Varme til at denaturere RNA ved 95 ° C i 1 min. hurtigt tilsættes 5 μl af NAI stamopløsning (2 M), og derefter svippe to gange for at blande og lægge røret tilbage på den varme blok. Der inkuberes ved 95 ° C for en yderligere 1 min så straks lægge røret på is.
    3. Tilføje 0,4 mL af guanidinium kaliumthiocyanat. Gentag trin 2.3.1–2.3.4.
    4. Kolonnen udvaskes med 0,6 mL 2 x RPE buffer (Se Tabel af materialer) af spinning for 15 s på hvert trin. Tørre kolonnen ved centrifugering kolonnen spin med en tom collection tube på 12.000 x g i 1 minut.
    5. Tilføje 32 μl af RNase-fri vand til midten af kolonnen. Der inkuberes i 1 min. Centrifuge på 12.000 x g for 30 s til at indhente ~ 30 μL af gendannede DC RNA løsning.
  5. Primer forlængelse
    1. Normalisere RNA-løsning fra 2.3.7 og 2.4.5 i 0,5 μg/μL med RNase-fri vand. Frisk forberede 30 mM frihedsbevægelse2 løsning fra frihedsbevægelse2∙4H2O pulver.
    2. Overføre 9 μL af RNA løsning for hver prøve til en PCR strip. Tilføj 1 μl af 10 mM dNTP og 1 μL 2 μM gen-specifikke primer (GSP) i hver tube. Pipetteres op og ned, fire gange for at blande. Der inkuberes ved 65 ° C i 5 min i en termisk cycler og lagt på is for > 1 min.
      Bemærk: Alternativt, 1 μL af en tilfældig nonamer kan bruges i substitution af GSP.
    3. I hver PCR rør, tilføje en blanding af 2 μl af 10 x RT buffer (Se Tabel af materialer), 4 μL af 30 mM frihedsbevægelse2og 2 μl af 100 mM DTT. Pipetteres op og ned 4 x til at blande. Der inkuberes ved 42 ° C i 2 min.
    4. Tilsæt 1 μL af reverse transkriptase (Se Tabel af materialer). Pipetteres op og ned 4 x til at blande. Der inkuberes ved 42 ° C i en termisk cycler til 3 h.
  6. Biblioteket forberedelse og næste generation sequencing
    1. Oprette en PCR reaktion ved at tilføje 1 μL af DNA polymerase, 5 μl af 10 x DNA polymerase buffer (Se Tabel af materialer), 2 μl af DMSO, 1,5 μL for hver af primere (10 μM), 34 μL af H2O og 5 μl cDNA fra trin 2.5.4.
    2. Oprettet den termiske cycler som følger: fase 1) 95 ° C i 2 min.; fase 2) 95 ° C til 30 s; Stage 3) 60 ° C i 30 s; 4. etape) 68 ° C til 30 s; 5. etape) loop tilbage til fase 2 for 30 cykler; fase 6) 68 ° C i 3 min. og etape 7) uendelig holder ved 4 ° C indtil de følgende trin.
    3. Rense amplikonen ved hjælp af 1,8% agarosegel.
      Bemærk: PCR band skal vises som en enkelt band på gelen.
    4. Konstruere biblioteket ved hjælp af standard fragmentering og ligatur metoder etableret i litteratur6,26.
    5. Sekvens på et næste generations sekventering udstyr bruger 1 x 75 single-ende læser til at generere cirka 10 millioner læser pr. prøve.
    6. Analysere resultaterne ved hjælp af ShapeMapper og SuperFold software pakker udviklet af uger gruppe26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi viste tidligere at et RNA-splicing modulator, SMN-C2, interagerer med AGGAAG motiv på exon 7 af SMN2 gen pre-mRNA og brugt form for at vurdere RNA strukturelle ændringer i overværelse af SMN-C26. Bindingssted af SMN-C2 adskiller sig fra den FDA-godkendt antisense oligonukleotide (ASO) for SMA, nusinersen, som binder og blokerer intronic splejsning lyddæmperen (ISS) på intron 727,28 (figur 1A). Mest kendte splejsning regulatorer af SMN2 exon 7 er inden for ~ 100 nukleotid vifte af exon 7 i pre-mRNA29; Derfor, en 140 og 276 nucleotid-lange RNA sekvenser blev brugt for in vitro og i celle figur, repræsentativt, som dækker exon 7 og regionen tilstødende intron (figur 1A).

I denne repræsentative in vitro form analyse, er RNA-sekvens af interesse indlejret i en optimeret kassette udviklet af uger laboratorium, som er kompatibel med de fleste RNA sekvenser1. Lejlighedsvis, rækkefølgen af interesse arbejder sammen eller forstyrrer denne kassette. I disse tilfælde, en modificeret kassette kan bruges med følgende tre egenskaber: i) et 3'-enden specifikke primer bindingssted med en mere effektiv hybridisering affinitet for primeren end nogen del af RNA-sekvens, ii) en meget struktureret hårnål løkke beliggende direkte opstrøms af bindingssted primer, der vil vise specifikke og reproducerbare figur signal (dette vil fungere som både en intern kontrol for eksperiment og metode til at justere signalet fra forsøg til eksperiment), og iii) en 5'-enden hårnål struktur element, der angiver slutningen af figur signal. Figur kassette er yderligere flankeret med selvstændige holde ribozym sekvenser på både 5'- og 3'-ender for at generere en homogen RNA30. Vi fandt, at hammerhead og hepatitis delta virus ribozymer er kompatible hen til figur kassetten og normalt give højt udbytte af den ønskede RNA. Den resulterende skabelon RNA har en 3'-enden af 2', 3'-cyklisk fosfat og en 5'-enden af hydroxylgruppe, som ikke forstyrrer primer forlængelse. En 140-nucleoside lang sekvens der dækker exon 7 af SMN2 og tilstødende region i pre-mRNA blev syntetiseret i form og ribozym kassette som illustreret i skema 1.

Generelt, være rækkefølgen af interesse forbundet i udtryk kassette lang nok til at dække den potentielle sekundære eller højere orden af struktur. I tilfælde af SMN2 exon 7 indeholder en 140-nukleotid regionen to stem-loop strukturer6,31. Strukturen i det pågældende område, varierer fra sag og bør vurderes af trial-and-error.

Sekventering Polyacrylamiden med 32P-mærket primer udvidelse produkter blev valgt til at visualisere profilen i vitro form i denne repræsentative eksperiment. En alternativ Visualisering metode er at bruge kapillær elektroforese med en fluorescently mærket DNA primer32. I sekventering polyacrylamidgeler, ~ 20 Nukleosider nær 5'-enden og ~ 10 nukleotider i 3'-slutningen af RNA-sekvens af interesse vil ikke visualiseres kvantitativt, grund lejlighedsvis stopper ved indledningen trin af reverse transkription og intens bands på side geler til fuld længde udskrifter1.

En alternativ måde for forberedende gel inddrivelse af en RNA skabelon (trin 1.1.6 til 1.1.12) er at overbelaste en mini gel, hvis udbyttet af ønskede RNA skabelon er > 90%. Det tilrådes at fjerne den overskydende NTP fra RNA produkt ved udblødning kolonnen og eluerer RNA i 50 µL af TE buffer. Måler koncentrationen af RNA og indlæse 5,0 µg i hver brønd. Under rensning trin af T7 transskriberet RNA skabelon, stop siden da xylen cyanol FF farvestof (lyseblå) vedtog to tredjedele af 6% denatureret TBE-urea gel. Self-kavalergang RNA fragment (< 80 Nukleosider) passeret gel, som forlod den ønskede RNA som det eneste store band i gel ved farvning (figur 1B).

SMN-C2 (figur 1 c) blev syntetiseret ifølge offentliggjorte procedure33 og opløst i 10 mM DMSO stamopløsning. Stamopløsning fortyndes yderligere til 500 og 50 µM i 10% DMSO løsning til at opnå endelige koncentrationer på 50 og 5 µM, henholdsvis. Snap-køles RNA refolded til sin ligevægt fase DMSO eller SMN-C2 inden for 30 minutter ved 37 ° C. En længere inkubationstiden ændre ikke resultatet af eksperimentet. To eksperimentelle prøver (50 og 5 µM SMN-C2), to kontrolelementer (DMSO og NAI-kontrol) og fire markører (A, T, G, C) blev behandlet for primer forlængelse. Efter udsætter gel til fosfor opbevaring skærmen, en vellykket figur eksperiment vil vise: i) et enkelt og mest intense bandet på toppen af gel og ii) bands i hele gel på enkelt-nukleotid opløsning uden smear (fig. 1 d). Et fælles problem i SIDERS analyse er, at en smear region kendt som den "salt front" kan vises i midten af gel (figur 1E). Dette er sandsynligvis på grund af høj koncentration af salt, DMSO, eller andre uønskede stof i eksemplet lastning, der kan fjernes af ethanol nedbør.

I i vitro form, en ren RNA skabelon er nøglen til en vellykket eksperiment. En uren RNA skabelon er normalt årsagen til uønskede resultater. Hvis SIDERS analyse viser klart et mønster af 2 sæt af markører, angiver det, at skabelonen RNA er ikke homogene og har brug for at være repurified af præparativ TBE-urea gel.

For i celler form er nøglen til en vellykket eksperiment til at designe en optimeret primer er defineret for forstærkning. Med 0,10 µg af genomisk DNA-fri cDNA skabelon, skal en enkelt band overholdes inden for 25 PCR cyklusser i Agarosen gel analyse. De gentagne intron sekvenser bør derfor undgås. Hvis du vil studere strukturelle indvirkning af SMN-C2 på SMN2 pre-mRNA, tre primer sæt (tabel 2) blev testet, og alt var tilfredsstillende (figur 2A).

En lav kopier række en target RNA-sekvens er generelt et problem for i celler form. For at berige RNA af interesse, var en minigene, der indeholder RNA-sekvens af interesse under en stærk CMV initiativtageren transfekteret i 293T celler. Fordi det splejsning mønster af SMN2 minigene sammenfatter de endogene SMN2 med eller uden SMN-C219,34, vi forestiller os at strukturen af SMN-C2 interagerende RNA i den overexpressed SMN2 pre-mRNA sandsynligt var det samme som produktets endogene genet. Mens EF50 af SMN-C3 i splejsning analysen var ~0.1 µM6,19, blev en koncentration i den højere ende (20 µM) brugt til at sikre bindende tilstand lille molekyle og target RNA sekvens.

Ved isolering af RNA, kan både gen-specifikke og tilfældige primere bruges til udvidelse. I tilfælde af SMN2 exon 7 fandt vi at SMN2E7-338-RV (tabel 2) giver en højere kopi af ønskede cDNA end en tilfældig nonamer, fremgår af en mere intens band i PCR-amplifikation med SMN2E7-276 primer sæt (tabel 2) efter 25 cykler. Ændring-taktfast 2'-OH, blev en 91 µM endelig NAI koncentration brugt til en inkubationstid på 15 min. Benyttes en anden celletype eller medium, skal inkubationstiden re optimeret. Hvis Inkubationstiden er for lang, mislykkes Agarosen gel analyse af amplikonen undertiden til at vise et band.

En python-baseret program, ShapeMapper, udviklet af uger laboratorium35 blev brugt til at analysere de data, der genereres af næste generation sequencing [for rå data af SMN-C2 behandlet i celle form af SMN2 exon 7 pre-mRNA, henvise til sekvens Læs arkiv (SRA) databasen]. Hele amplikon, figur reaktivitet ikke væsentligt ændre (> 1), som viste, at den sekundære struktur forbliver i overværelse af SMN-C2 (figur 2B). Dette bekræftes også af arc parceller genereret af SuperFold35. Forbindelse linjer angiver de mulige base parring baseret på figur aktivitet af hver nukleotid. SMN-C2 - og DMSO-behandlede RNA modellering er stort set det samme (figur 2 c). Differentieret i celle figur reaktivitet blev beregnet for hver nukleotid (figur 2B), og de fleste reaktivitet ændringen fandt sted på TSL-1 (5'-enden af exon 7) men ikke TSL-2 (3'-enden af exon 7). Dette resultat er enig med den in vitro form; selv om den base parring flyttet fra in vitro-analyserer figur RNA modellering i FIGUREN i celle (figur 2D).

Et fælles problem i celler form er den lave Mutationshastighed hele amplikonen. Dette er normalt på grund af genomisk DNA forurening. DNA indeholder ikke 2'-OH-gruppen; Derfor er ingen acylation produkt dannet med NAI. PCR-amplifikation afspejler således blot lav mutation satsen for den DNA-polymerasen. Isolering af RNA ved guanidinium kaliumthiocyanat efterfulgt af på kolonnen DNase fordøjelsen er tilstrækkelige til at fjerne alle DNA i de fleste tilfælde. Hvis DNA forurening fortsætter, skal du gentage trin 2.3 for RNA isolering.

Scheme 1
Skema 1: DNA-sekvens for skabelon af RNA transskription. De 12 bp sekvens i Hammerhead virus ribozym sekvens i rød er den omvendte supplement af de første 12 bp af 5'-kassette. RNA-sekvens af interesse præsenteres heri er en 140 bp pre-mRNA sekvensen indeholder exon 7 af menneskelige SMN2 gen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentelle design og resultat af in vitro form for SMN2 exon 7 pre-mRNA i overværelse af SMN-C2. (A) oversigt over for sekvensen af interesse for in vitro og i celle figur undersøgelser af SMN2 gen. SMN-C2 binder sig til AGGAAG motiv på exon 7, en særskilt placering fra nusinersen bindingssted. (B) rensning af T7 transskription produkt. Hver af de tre baner indeholder 5,0 µg af rå RNA. TBE-urea gel var farvet med SYBR-Safe (1:10, 000) for 5 min i 1 x TBE buffer. Rød stiplet boks angiver kanten af excision for RNA opsving. (C) strukturen af SMN-C2. (D) In vitro form eksperiment med NAI og en 140 nukleotid-lange RNA skabelon der indeholder exon 7. 1 = DMSO; 2 = SMN-C2 (50 ΜM); 3 = SMN-C2 (5 ΜM); 4 = mangler af NAI; 5-8 = stiger genereret ved tilsætning af ddATP, ddTTP, ddCTP og ddGTP under primer forlængelse. SIDEN blev båret ud på en TBE-urea sekventering gel på 60 W til 3 h. røde stjerner angiver øget band intensitet med 50 µM SMN-C26. (E) et eksempel på en "salt front" region i den stiplede røde boks fra en særskilt eksperiment. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: I celle figur afledt RNA modellering for SMN2 exon 7 pre-mRNA. (A) PCR forstærkning med alle tre primer sæt (tabel 2) givet en enkelt band i Agarosen gel analyse. 1 = SMN2E7-338, 2 = SMNE7-276, 3 = SMN2E7-251, 4 = DNA ladder. (B) forskellen i celle figur reaktivitet i SMN2 minigene-transfekteret 293T celler til 10 µM SMN-C2 og DMSO i TSL1. Figur reaktivitet med enkelt-nukleotid opløsning. Dens standardafvigelse blev beregnet ved ShapeMapper software35. Grønne stjerner angiver betydelig figur reaktivitet ændring induceret af 10 µM SMN-C2. Nummerering af nukleotider i 276 bp amplikonen vist på x-aksen. Fejllinjer blev anslået af form-Mapper software26. (C) Arc plot genereret af SuperFold35 for det mest plausible RNA sekundær struktur modellering af i celler figurdata. (D) In vitro og i celler form-instrueret modellering af exon 7 og tilstødende regioner. For in vitro-RNA model, er figur stabilisere kassette (orange) og nukleotider 1-19 (blå) vist i skitse. For i celler RNA model, er nukleotid nummerering justeret med in vitro form skabelon. Nukleotider 1-18 og 120-140 var udeladt. Signifikant reaktivitet ændringer er anført i røde og grønne stjerner for in vitro og i celler form, henholdsvis. De sekundære strukturer, der tidligere blev navngivet TSL1 og TSL231 er omsluttet af blå kasser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Primer navn 5' - 3' sekvens
Ribozym-FW TAAAACGACGGCCAGTGAAT
Ribozym-RV GCAGGTCGACTCTAGAGGAT
RT primer GAACCGGACCGAAGCCCG

Tabel 1: Primer sekvenser anvendes i repræsentative eksperiment.

Navn Rækkefølge (5 '-> 3')
SMN2E7-338-FW AAAGACTATCAACTTAATTTCTGA
SMN2E7-338-RV TGTTTTACATTAACCTTTCAACT
SMN2E7-276-FW AATGTCTTGTGAAACAAAATGCT
SMN2E7-276-RV AACCTTTCAACTTTCTAACATCT
SMN2E7-251-FW TGAAACAAAATGCTTTTTAACATCC
SMN2E7-251-RV TCAACTTTCTAACATCTGAACTTTT

Tabel 2: primeren sæt til forstærkning af pre-mRNA-sekvensen af interesse. Alle tre primer sæt udbytte en enkelt amplikon i en PCR reaktion med genomisk DNA-fri cDNA skabelon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I in vitro-form er det kritisk at bruge høj kvalitet homogene RNA skabelon. T7 transskription, dog udbytter ofte heterogene sekvenser36. Især er sekvenser med ±1 nukleotid på 3'-terminalen med ikke-ubetydelig udbytter36 som regel vanskeligt at blive fjernet af polyacrylamid gel rensning. Heterogene RNA skabelon kan resultere i mere end ét sæt af signalet i sekventering gel profilering af primer forlængelse produkt, hvilket nogle gange gør det vanskeligt at fortolke resultatet. Ribozym på både 5'- og 3'-ender af RNA skabelon udtryk kassette vil gøre begge ender homogen.

For både in vitro og i celle figur er inkubationstiden for 2'-OH ændring reagenser en anden afgørende faktor. Det blev foreslået af gruppen uger at mindst fem gange halveringstiden af vand-quenching 2'-OH acylation reagens skal anvendes1. I vores hænder, inkubere med NAI (T1/2 = ~ 20 min) til > 30 min i både in vitro og i celle figur resulterer i en overreagerede resultat. Som vist i figur 1 d, en god i vitro form profilering bør have > 50% samlede signal på toppen af gel som fuld-længde udskrift, at sikre, at de fleste af de modificerede RNA er kun acylated én gang. Overreaktion vil gøre dobbelt-acylated produkt ikke ubetydelig og profilering forudindtaget til beriget kort længde udvidelse produkter. I i celler form, skal amplikon for bibliotek opbygningen vises som en enkelt band i Agarosen gel analyse (trin 2.6.3). Udstrygningspræparat af bandet angiver en overreaktion, og incubate tid bør reduceres. I de repræsentative eksperimenter var gangen 15 min inkubation ved 37 ° C optimal for in vitro og i celle figur. Dette bør anvendes som udgangspunkt for NAI ændring i lignende applikationer.

Der er andre 2'-OH ændring reagenser22 udbredte til form, såsom 1 M 7. I forhold til NAI, har 1M 7 en bedre reaktivitet til 2'-OH-gruppen og kortere halveringstid i vand22. I vores hænder dannet 1M 7 massiv mængde af gule nedbør i celle kultur medier i et i celle figur eksperiment, som kompliceret RNA isolering. En sammenligning derfor anvendes både in vitro og i celler form NAI som 2'-OH ændring reagens for en undersøgelse af SMN-C2 og SMN2 pre-mRNA interaktioner. Hvis der kun i vitro form er påkrævet, er 1 M 7 en alternativ mulighed, som det fremgår af forskellige undersøgelser i riboswitch Strukturbestemmelse7,8.

I celle figur over in vitro-figur er generelt foretrukne, især hvis molekylet handler formentlig i kernen i en eukaryote celle. RNA-bindende proteiner i kernen er rigelige, og det er næsten umuligt at sammenfatte den cellulære kontekst under in vitro betingelser.

I det seneste årti bliver figur standard metode til at studere den sekundære struktur af RNA. Sammenlignet med traditionelle RNA footprinting med RNase37, er det mere egnet til at studere små molekyle-RNA interaktion, som disse interaktion kan undertiden være svag og ufølsom over for RNase udfordringer.

De store begrænsning ved at bruge formen til at studere små molekyle-induceret RNA strukturelle ændringer er, at dens resultater ikke afsløre bindingssted. I in vitro og i celler form for SMN-C2 bundet pre-mRNA, ændrede figur reaktivitet ikke på den formodede bindingssted (figur 1 d, figur 2B); snarere, reaktivitet på 2 til 3 fjerntliggende steder i regionen løkke eller rokke blev ændret. SMN-C2 formentlig binder sig til en RNA dobbelt-helix region (figur 1 d, figur 2D), som normalt har en lav form reaktivitet. Derfor, yderligere stabilisering af strukturen for at formindske figur reaktivitet ville sandsynligvis ikke kan iagttages. Til at generere en formodede bindingssted, andre metoder, såsom ChemCLIP38 bør anvendes, hvor en crosslinking kemiske sonde er involveret.

Et fælles alternativ tilgang til at tilknytte RNA sekundære eller højere struktur og nukleotid dynamics er NMR massespektrometri39,40. Det er blevet påvist, at RNA dynamics afledt af kvantitative NMR analyse kraftigt korrelerer med figur aktivitet39. I forbindelse med lille molekyle bindende, kan kemiske Skift perturbationer afsløre de interagerende nukleotider21.

Som RNA-targeting små molekyler bliver en ny modalitet for drug udvikling11, forestiller vi at form vil blive etableret som en standardmetode til at evaluere de strukturelle virkninger af target RNA i overværelse af små molekyler. I fremtiden, ønskes en transkriptom-wide forhør metode for målretning af RNA små molekyle narkotika.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev muliggjort af NIH R01 grant (NS094721, K.A.J.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNA oligonucleotide IDT gBlock for >200 bp DNA synthesis
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix Thermo Fisher F566S
NucleoSpin gel and PCR clean-up kit Takara 740609.50
MegaScript T7 transcription kit Thermo Fisher AM1333 Contains 10x reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase
DEPC-treated water Thermo Fisher 750023
2x TBE-urea sample buffer Thermo Fisher LC6876
40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) Bio-Rad 1610146
10x TBE buffer Thermo Fisher 15581044
Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit Thermo Fisher 166-0045
Kimwipe Kimberly-Clark 34133
TEMED Thermo Fisher 17919
SYBR-Safe dye Thermo Fisher S33102
6% TBE-urea mini-gel Thermo Fisher EC6865BOX
ChemiDoc Bio-Rad
T4 PNK NEB M0201S
γ-32P-ATP Perkin Elmer NEG035C005MC
Hyperscreen™ Intensifying Screen GE Healthcare RPN1669 calcium tungstate phosphor screen
phosphor storage screen Molecular Dynamics BAS-IP MS 3543 E
Amersham Typhoon GE Healthcare
NAI (2M) EMD Millipore 03-310
GlycoBlue Thermo Fisher AM9515
SuperScript IV Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18090010 Contains 5x RT buffer, SuperScript IV
dNTP mix (10 mM) Thermo Fisher R0192
ddNTP set (5 mM) Sigma GE27-2045-01
large filter paper Whatman 1001-917
Gel dryer Hoefer GD 2000
QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen 51104 Also contains RNase A and protease K
SMN2 minigene34 Addgene 72287
Heat inactivated FBS Thermo Fisher 10438026
Pen-Strep Thermo Fisher 15140122
Opti-MEM I Thermo Fisher 31985062
FuGene HD Promega E2311
TrpLE Thermo Fisher 12605010
DPBS without Ca/Mg Thermo Fisher 14190250
TRIzol Thermo Fisher 15596018
RNeasy mini column Qiagen 74104 Also contains RW1, RPE buffer
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 Contains DNase I and RDD buffer
Deionized formamide Thermo Fisher AM9342
MnCl2•4H2O Sigma-Aldrich M3634
random nonamer Sigma-Aldrich R7647
SuperScript First-Strand Synthesis System Thermo Fisher 11904-018 Contains 10x RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase
AccuPrime pfx DNA polymerse Thermo Fisher 12344024
NextSeq500 Illumina
NucAway column Thermo Fisher AM10070 for desalting purpose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).
  2. Trausch, J. J., et al. Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).
  3. Souliere, M. F., et al. Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).
  4. Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches. Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).
  5. Spitale, R. C., et al. RNA SHAPE analysis in living cells. Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).
  6. Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).
  7. Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches. Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).
  8. Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch. Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).
  9. Abulwerdi, F. A., et al. Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).
  10. Shortridge, M. D., et al. A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing. ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).
  11. Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. Principles for targeting RNA with drug-like small molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).
  12. Mullard, A. Small molecules against RNA targets attract big backers. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).
  13. Shortridge, M. D., Varani, G. Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules. Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).
  14. Gallego, J., Varani, G. Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges. Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).
  15. Rizvi, N. F., Smith, G. F. RNA as a small molecule druggable target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).
  16. Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules. Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).
  17. Palacino, J., et al. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).
  18. Ratni, H., et al. Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA). Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).
  19. Naryshkin, N., et al. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science. 345, (2014).
  20. Chiriboga, C., et al. Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003). Neurology. 90, (2018).
  21. Sivaramakrishnan, M., et al. Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers. Nature Communications. 8, (2017).
  22. Lee, B., et al. Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells. RNA. 23, 169-174 (2017).
  23. Weeks, K. M., Mauger, D. M. Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry. Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).
  24. Smola, M. J., et al. SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).
  25. Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).
  26. Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).
  27. Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).
  28. Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
  29. Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells. PloS One. 9, e115205 (2014).
  30. Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures. RNA. 15, 294-307 (2009).
  31. Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes. Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).
  32. Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).
  33. Qi, H., et al. Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).
  34. Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).
  35. Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP). Nature Methods. 11, 959 (2014).
  36. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
  37. Nilsen, T. W. RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions. Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).
  38. Velagapudi, S. P., et al. Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).
  39. Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small. Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).
  40. Scott, L. G., Hennig, M. RNA structure determination by NMR. Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).

Tags

Denne måned i JoVE spørgsmålet 143 lille molekyle RNA-targeting RNA struktur in vitro- figur figur spinal muskelatrofi RG-7916 i celle
Ved hjælp af in Vitro og i celler form at undersøge lille molekyle induceret Pre-mRNA strukturelle ændringer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, J., Hammond, J., Johnson, K.… More

Wang, J., Hammond, J., Johnson, K. A. Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes. J. Vis. Exp. (143), e59021, doi:10.3791/59021 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter