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Genetics

इन विट्रो और में-सेल आकार छोटे अणु प्रेरित पूर्व mRNA संरचनात्मक परिवर्तन की जांच करने के लिए का उपयोग करना

Published: January 30, 2019 doi: 10.3791/59021
Automatic Translation
1, 2, 1
1Calibr, The Scripps Research Institute, 2Department of Integrative Structural and Computational Biology, The Scripps Research Institute

Summary

दोनों इन विट्रो और में सेल चयनात्मक 2 ' के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल-हाइड्रॉक्सिल acylation प्राइमर विस्तार (आकार) प्रयोगों द्वारा विश्लेषण के लिए एक आरएनए-लक्ष्यीकरण छोटे अणु की उपस्थिति में ब्याज की पूर्व mRNA अनुक्रम के माध्यमिक संरचना निर्धारित करने के लिए कर रहे हैं इस लेख में प्रस्तुत किया ।

Abstract

छोटे अणुओं को लक्षित करने वाली आरएनए के औषध विकास की प्रक्रिया में, elucidating के साथ उनकी बातचीत पर संरचनात्मक परिवर्तन को लक्षित आरएनए अनुक्रम वांछित है । हम इस के साथ साथ इन विट्रो में एक विस्तृत प्रदान और सेल चयनात्मक 2 '-हाइड्रॉक्सिल acylation प्राइमर विस्तार द्वारा विश्लेषण (आकार) के लिए आरएनए रीढ़ की हड्डी में पेशी शोष के लिए एक प्रयोगात्मक दवा की उपस्थिति में संरचनात्मक परिवर्तन का अध्ययन (SMA), की उत्तरजीविता मोटर न्यूरॉन (SMN)-C2, और SMN2 जीन के प्री-mRNA के एक्सॉन 7 में. इन विट्रो आकृति में, १४० न्यूक्लियोटाइड SMN2 एक्सॉन 7 युक्त एक आरएनए अनुक्रम T7 आरएनए पोलीमरेज़ द्वारा लिखित है, SMN-C2 की उपस्थिति में जोड़कर, और बाद में एक हल्के 2 द्वारा संशोधित '-ओह acylation रिएजेंट, 2-methylnicotinic एसिड imidazolide (NAI). यह 2 '-ओह-NAI adduct आगे एक ३२पी द्वारा जांच की है-प्राइमर विस्तार लेबल और polyacrylamide जेल ट्रो द्वारा हल (पृष्ठ) । इसके विपरीत, 2 '-ओह acylation में सेल आकार में रहने वाले कोशिकाओं में SMN-C2 बाउंड सेलुलर आरएनए के साथ सीटू में जगह लेता है. SMN2 जीन में एक्सॉन 7 के पूर्व mRNA अनुक्रम, प्राइमर विस्तार में आकार प्रेरित उत्परिवर्तनों के साथ, तो पीसीआर द्वारा परिलक्षित और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के अधीन था । दोनों के तरीके की तुलना में, इन विट्रो आकार एक अधिक लागत प्रभावी तरीका है और गणना के लिए परिणाम कल्पना शक्ति की आवश्यकता नहीं है । हालांकि, इन विट्रो में आकार-प्राप्त आरएनए मॉडल कभी कभार एक सेलुलर संदर्भ में माध्यमिक संरचना से भटक, आरएनए-बंधन प्रोटीन के साथ सभी बातचीत के नुकसान की संभावना के कारण. में सेल आकार एक रेडियोधर्मी सामग्री कार्यस्थल की जरूरत नहीं है और सेलुलर संदर्भ में एक और अधिक सटीक आरएनए माध्यमिक संरचना पैदावार । इसके अलावा, सेल आकार में आम तौर पर अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग करके आरएनए अनुक्रम (~ १,००० न्यूक्लियोटाइड) की एक बड़ी रेंज के लिए लागू है, इन विट्रो आकार (~ २०० न्यूक्लियोटाइड) है कि आमतौर पर पृष्ठ विश्लेषण पर निर्भर करता है की तुलना में । SMN2 प्री-mRNA में 7 एक्सॉन के मामले में, इन विट्रो और सेल में आकार व्युत्पंन आरएनए मॉडल एक दूसरे के समान हैं ।

Introduction

चयनात्मक 2 '-हाइड्रॉक्सिल acylation प्राइमर विस्तार द्वारा विश्लेषण (आकार) ब्याज की एक आरएनए अनुक्रम में प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड के कैनेटीक्स को मापने की एक विधि है और एकल-elucidating संकल्प1पर माध्यमिक संरचना न्यूक्लियोटाइड । आकार के तरीके में, दोनों इन विट्रो स्थितियों में2,3,4 (एक परिभाषित बफर सिस्टम में शुद्ध आरएनए) और लिविंग स्तनधारी कोशिकाओं में5,6, माध्यमिक की जांच करने के लिए विकसित किया गया है मध्यम लंबाई शाही सेना के अनुक्रम की संरचना (आमतौर पर < इन-सेल आकार के लिए 1000 न्यूक्लियोटाइड और < इन विट्रो आकार के लिए 200 न्यूक्लियोटाइड) । यह विशेष रूप से आरएनए के लिए बाध्यकारी पर रिसेप्टर आरएनए में संरचनात्मक परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी है-बातचीत छोटे अणु चयापचयों2,4,7,8 और यंत्रवत क्रियाओं का अध्ययन करने के लिए आरएनए-औषध विकास के दौरान अणुओं को लक्षित करने के9,10.

आरएनए-लक्ष्यीकरण ड्रग डिस्कवरी हाल ही में शैक्षिक प्रयोगशालाओं और दवा उद्योग में ध्यान खींचा है11,12 अलग दृष्टिकोण और रणनीतियों के माध्यम से13,14,15 ,16. आरएनए के हाल के उदाहरणों-नैदानिक उपयोग के लिए छोटे अणुओं लक्ष्यीकरण दो संरचनात्मक रूप से अलग प्रयोगात्मक दवाओं, LMI-०७०17 और आरजी-७९१६18,19, रीढ़ की हड्डी में पेशी शोष (SMA) के लिए, जो होनहार दिखाया द्वितीय चरण नैदानिक परीक्षणों में परिणाम20. दोनों अणुओं मोटर ंयूरॉन (SMN) 2 पूर्व mRNA के अस्तित्व को लक्षित करने और SMN2 जीन6,17,21के ब्याह की प्रक्रिया को विनियमित करने के लिए प्रदर्शन किया गया । हम पहले इन विट्रो और में सेल आकार में लक्ष्य आरएनए की एक परीक्षा में संरचनात्मक परिवर्तन आरजी-७९१६ के रूप में जाना जाता SMN-C26के एक एनालॉग की उपस्थिति में प्रदर्शन किया ।

सिद्धांत रूप में, आकार 2 '-ओह acylation दर एक आरएनए अनुक्रम के प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड एक आत्म की अधिक मात्रा में एक निष्पक्ष तरीके से शमन acylation एजेंट की उपस्थिति में के उपाय । acylation एजेंट पानी में स्थिर नहीं है, के साथ एक छोटी आधा जीवन (जैसे, टी1/2 = 17 एस के लिए 1-मिथाइल-7-nitroisatoic एनहाइड्राइड; या 1M7, ~ 2 के लिए 20 मिनट-methylnicotinic एसिड imidazolide, या NAI)22 और संवेदनहीनता की पहचान के लिए ठिकाने23. यह 2 ' के एक अधिक अनुकूल acylation में परिणाम लचीले अड्डों के OH समूहों, जो प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड की गतिशीलता का एक सटीक आकलन में तब्दील किया जा सकता है । विशेष रूप से, एक आधार में एक न्यूक्लियोटाइड-जोड़ी आमतौर पर कम प्रतिक्रियाशील एक से एक 2 '-ओह संशोधित एजेंट, जैसे NAI और 1M7 है ।

आरएनए टेंपलेट के स्रोत को देखते हुए और जहां 2 '-ओह acylation जगह लेता है, आकार आम तौर पर इन विट्रो में वर्गीकृत किया जा सकता है और में सेल आकार । इन विट्रो आकार शुद्ध T7 लिखित आरएनए का उपयोग करता है और प्रयोगात्मक डिजाइन में एक सेलुलर संदर्भ का अभाव है । में सेल आकार, दोनों आरएनए टेंपलेट प्रतिलेखन और 2 '-ओह acylation जीवित कोशिकाओं के भीतर होते हैं; इसलिए, परिणाम एक सेलुलर संदर्भ में आरएनए संरचनात्मक मॉडल दोहराऊंगा कर सकते हैं । इन-सेल शेप में साहित्य24में लिविंग सेल में किए गए शेप के लिए वीवो शेप में भेजा गया है । चूंकि यह प्रयोग किसी जानवर में नहीं किया जाता है, इसलिए हमने इस प्रयोग को सटीकता के लिए इन-सेल आकार के रूप में माना है ।

इन विट्रो और इन-सेल शेप के प्राइमरी एक्सटेंशन स्टेज के लिए रणनीतियां भी अलग हैं । इन विट्रो में आकार, रिवर्स प्रतिलेखन 2 मिलीग्राम पर बंद हो जाता है '-ओह acylation की उपस्थिति में की स्थिति2 Mg +. एक ३२पी लेबल प्राइमर विस्तार इसलिए polyacrylamide जेल ट्रो (पृष्ठ) में एक बैंड के रूप में प्रकट होता है और बैंड की तीव्रता acylation दर1के लिए आनुपातिक है । में कक्ष आकार, रिवर्स प्रतिलेखन 2 में यादृच्छिक उत्परिवर्तनों उत्पंन '-2 Mn की उपस्थिति में ओह adduct स्थिति+। प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड के उत्परिवर्तन दर अगली पीढ़ी के अनुक्रमण गहराई में द्वारा कब्जा कर लिया जा सकता है, और एकल-न्यूक्लियोटाइड संकल्प पर आकार जेट फिर गणना की जा सकती है ।

में सेल आकार के लिए एक संभावित समस्या कम संकेत करने वाली शोर अनुपात है (यानी, 2 ' के बहुमत-OH समूह unmodified है, जबकि unmodified दृश्यों अगली पीढ़ी के अनुक्रमण में पढ़ने के सबसे कब्जा) । । हाल ही में, एक विधि 2 ' को समृद्ध-ओह संशोधित आरएनए, vivo क्लिक करें आकार (icSHAPE) के रूप में संदर्भित, चांग प्रयोगशाला25द्वारा विकसित किया गया था । यह संवर्धन पद्धति ऐसे आरएनए बातचीत के रूप में कमजोर छोटे अणुओं का अध्ययन करने में लाभप्रद हो सकता है, विशेष रूप से एक transcriptome व्यापक पूछताछ में ।

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Protocol

1. इन विट्रो शेप

नोट: प्रोटोकॉल प्रकाशित प्रोटोकॉल1से संशोधित किया गया है ।

  1. आरएनए टेम्पलेट तैयार करना
    नोट: T7 प्रतिलेखन के लिए टेंपलेट के रूप में आदेश दिया गया था एक सिंथेटिक डबल फंसे डीएनए (dsDNA) और एक ई. कोलाई वेक्टर है कि EcoRI/BamHI प्रतिबंध endonuclease साइटों, की एक अनूठी जोड़ी वहन करती है में या तो सम्मिलन द्वारा प्रवर्धित जैसे pET28a, या पीसीआर द्वारा । पीसीआर प्रवर्धन के लिए प्रोटोकॉल के नीचे सचित्र है ।
    1. मिश्रण निंनलिखित सामग्री: ५० पीसीआर मास्टर मिक्स की μL ( सामग्री की तालिकादेखें), 10 माइक्रोन में प्रत्येक प्राइमरी के लिए 2 μL (अनुक्रम के लिए तालिका 1 देखें), dsDNA टेम्पलेट के २०० एनजी में 2 μL और 3 μL के dimethyl sulfoxide (DMSO), और एच2ओ के ४१ μL दो पीसीआर में Aliquot ट्यूबों (प्रत्येक ट्यूब शामिल हैं ५० प्रतिक्रिया मिश्रण के μL).
    2. इस प्रकार के रूप में थर्मल साइकिल चालक की स्थापना: 1 चरण) ९५ ° c 30 s के लिए; चरण 2) 20 एस के लिए ९५ ° c; चरण 3) ५६ ° c 20 एस के लिए; स्टेज 4) ७२ ° c 20 एस के लिए; स्टेज 5) 30 चक्र के लिए 2 चरण के लिए वापस पाश; चरण 6) 3 मिनट के लिए ७२ ° c; और चरण 7) अनंत होल्डिंग पर 4 ° c निम्न चरण तक.
    3. जेल स्लाइस के निष्कर्षण द्वारा पीसीआर amplicon शुद्ध ( सामग्री की तालिका देखें और निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग करें) । Elute ३५ μL के साथ उत्पाद डीएनए Tris-EDTA (ते) बफर, 10 मिमी Tris (पीएच ८.०) और 1 मिमी EDTA, एक 0.1 – 0.5 μg/μL टेम्पलेट उपज करने के लिए शामिल हैं । ०.१० μg/μL में शुद्ध डीएनए टेम्पलेट को सामान्य.
      नोट: वैकल्पिक रूप से, टेंपलेट की गुणवत्ता डीएनए के ०.१० μg के साथ एक १.८% agarose जेल ट्रो पर विश्लेषण किया जा सकता है । वांछित डीएनए की एक एकल बैंड जेल पर अपेक्षित है ।
    4. एक पीसीआर ट्यूब में निंनलिखित सामग्री जोड़कर T7 प्रतिलेखन प्रतिक्रिया (कुल मात्रा ४० μL) सेट करें: 4 μL की 10x प्रतिक्रिया बफर, एटीपी के 4 μL, CTP के 4 μL, GTP के 4 μL, μL के 4 UTP, μL एंजाइम के 4 T7 ( सामग्री की तालिकादेखें) , 4 μL शुद्ध पीसीआर amplicon से कदम 1.1.3 (०.४ μg), और 12 μL के diethyl pyrocarbonate (DEPC)-इलाज पानी । ऊपर और नीचे 4x pipetting द्वारा मिक्स । एक थर्मल साइकिल चालक में या एक ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में 4-16 एच के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
      नोट: चरण 1.1.6 सेट अप करने के लिए प्रारंभ करें, जबकि 1.1.4 चरण में प्रतिक्रिया चल रही है ।
    5. DNase के 2 μL जोड़ें, ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण, और 15 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी । 2x Tris-बोराटे-EDTA (TBE)-यूरिया नमूना बफर की बराबर मात्रा के साथ मिश्रण ( सामग्री की तालिकादेखें) । निष्क्रिय करने के लिए 3 मिनट के लिए ७० ° c पर हीट ।
    6. एक RNase-मुक्त बोतल में, ४०% acrylamide/bisacrylamide समाधान (29:1, सामग्री की तालिकादेखें), यूरिया के १८०.२ ग्राम, और 10x TBE बफर के ५० मिलीलीटर (RNase-मुक्त, सामग्री की तालिकादेखें) के ७५ मिलीलीटर मिश्रण । एक कक्षीय शेखर (२५० rpm) पर बोतल रखो जब तक यूरिया के सभी क्रिस्टल भंग कर रहे है (2 घंटे तक लग सकते हैं) । DEPC-इलाज पानी के साथ ५०० मिलीलीटर के लिए मात्रा समायोजित करें । एक ०.२ माइक्रोन झिल्ली के साथ समाधान फ़िल्टर ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
      नोट: इस प्रक्रिया में, RNase संदूषण को रोकने के लिए specular और हलचल पट्टी का उपयोग करने से बचें । समाधान के लिए 1 साल के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
    7. साफ एक उचित आकार के दो ट्रो ग्लास प्लेटें (१६.५ सेमी x 24 cm) के साथ पानी और ७०% पोंछते कागज के एक टुकड़े का उपयोग कर ेतोः । प्लेटें २.० mm स्पेसर की एक जोड़ी के साथ संरेखित करें (एक सिलिकॉन सतह के साथ थाली आवक का सामना करना पड़ रहा है) और टेप के साथ प्लेटों के किनारे सील । डबल-टेप प्लेट के कॉर्नर लीक को रोकने के लिए ।
    8. एक यूरिन में, स्टेप 1.1.6 से acrylamide सॉल्यूशन की २०० मिलीलीटर, 10% अमोनियम persulfate सॉल्यूशन की २.० मिलीलीटर, और १०० μL की tetramethylethylenediamine (TEMED) के साथ एक RNase-फ्री पिपेट टिप के साथ तेजी से चमचे से 30 एस के लिए मिलाएं । benchtop कवर के एक टुकड़े पर प्लेटें झुकाव और डालो प्लेटों के अंतर से समाधान । किसी भी बुलबुले उठा और benchtop कवर पर फ्लैट प्लेट बिछाने के लिए थाली नल । तुरंत कंघी डालें और जेल polymerize के लिए दो से कम 1 ज ।
      नोट: जेल अगले दिन के भीतर इस्तेमाल किया जा करने के लिए है, तो गीले कागज तौलिया के एक टुकड़े के साथ जेल के शीर्ष कवर और प्लास्टिक लपेटो का एक बड़ा टुकड़ा के साथ लपेटो । यह 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्लैट झूठ बोल ।
    9. टेप निकालें और एक ट्रो स्टैंड में प्लेट दबाना । कंघी निकालें और जलाशय के ऊपर और नीचे पर्याप्त 1x TBE बफर जोड़ें । पूर्व में 30 मिनट के लिए जेल चलाने के 20 डब्ल्यू ।
      नोट: वैकल्पिक, यदि वांछित आरएनए की सामग्री ~ ९०% या अधिक है, एक मिनी जेल एक preparative जेल के प्रतिस्थापन में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    10. pipetting ऊपर और नीचे दो बार जलाशय में तरल के साथ द्वारा लोडिंग कुओं में से प्रत्येक को धो लें । वेल्स में कदम 1.1.5 से क्रूड आरएनए जोड़ें । 20 डब्ल्यू पर जेल भागो xylene cyanol एफएफ डाई (हल्का नीला) तक जेल की लंबाई (~ ६० मिनट) के बारे में दो तिहाई से गुजरता है ।
      नोट: अच्छी तरह की ऊंचाई के एक तिहाई से अधिक नहीं लोड करने के लिए सुनिश्चित करें (एकाधिक कुओं का उपयोग यदि आवश्यक हो तो) ।
    11. 1 के साथ 1x TBE बफर में जेल विसर्जित: 10000 सुरक्षित डाई के कमजोर पड़ने ( सामग्री की तालिकादेखें) जेल के लिए काफी बड़े एक कंटेनर में । ८० rpm पर 5 मिनट के लिए एक कक्षीय शेखर पर कंटेनर रखो ।
    12. यूवी प्रकाश के तहत, वांछित आरएनए बैंड की पहचान और तेजी से एक साफ उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर जेल की एक पतली बैंड में कटौती । एक १.७ मिलीलीटर ट्यूब में 1-2 जेल स्लाइस प्लेस ।
    13. निष्क्रिय रेफरेंस द्वारा जेल स्लाइस से आरएनए पुनर्प्राप्त करें । प्रत्येक ट्यूब के लिए पर्याप्त रेफरेंस/वर्षा मिश्रण (~ ०.३ मिलीलीटर) जोड़ें: ०.३ मीटर NaOAc (पीएच ५.२), २.५ एम LiCl, 1 मिमी EDTA, ०.१% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) में DEPC-उपचारित पानी । 4 डिग्री सेल्सियस पर जेल ब्याह (ओं) शामिल है कि ट्यूब घुमाएं 16 एच ।
      नोट: एक ठेठ वसूली दर इस चरण में ~ ७५% है । उपज बढ़ाने के लिए, निकालें और eluent इकट्ठा और रेफरेंस बफर की एक ही मात्रा जोड़ने के लिए, फिर इस चरण को दोहराएँ ।
    14. एक नया १.७ मिलीलीटर ट्यूब में eluent गठबंधन । जोड़ें 2.5 x बर्फ-शीत ेतोः, पलटना ट्यूबों छह बार तरल मिश्रण करने के लिए, और ट्यूब पर जगह-८० ° c के लिए कम से 1 h.
    15. १०,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक । सावधानी से supernatant को pipetting से हटा दें । ८०% ेतोः (ट्यूब प्रति 1 मिलीलीटर), 15 एस के लिए भंवर जोड़कर आरएनए गोली धो, और १०,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
    16. supernatant और हवा-सूखी आरएनए गोली 5 मिनट के लिए निकालें RNase-नि: शुल्क पानी और मिश्रण के ५० μL जोड़ें ऊपर और नीचे 10 बार pipetting । आरएनए एकाग्रता को सामान्य करने के लिए ०.१० μg/μL. -८० ° c पर शुद्ध आरएनए स्टोर.
      नोट: आरएनए गोली सूखी खत्म मत करो ।
    17. वैकल्पिक रूप से, आरएनए की गुणवत्ता का विश्लेषण करने के लिए, पानी की 5 μL में कदम 1.1.16 से आरएनए के 1 μL (१०० एनजी) पतला और 2x TBE-यूरिया नमूना बफर के 5 μL के साथ मिश्रण. फिर, 3 मिनट के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर गर्मी और एक 6% TBE-यूरिया मिनी जेल पर लोड ।
      1. चलाने के लिए १८० पर जेल V 1 h. के रूप में चरण 1.1.11 में किया धुंधला प्रदर्शन । एक इमेजिंग प्रणाली में यूवी के साथ जेल कल्पना । एक एकल बैंड वांछित लंबाई में की उंमीद है ।
  2. ३२पी-लेबल प्राइमर की तैयारी
    1. निंनलिखित सामग्री को मिलाकर प्रतिक्रिया सेट करें: 10 μL के γ-३२पी-एटीपी (~ १.५ एमसीआई, ~ 25 माइक्रोन, सामग्री की तालिकादेखें), रिवर्स प्रतिलेखन के 2 μL (आरटी) प्राइमर (१०० माइक्रोन, अनुक्रम के लिए देखें तालिका 1), 2 μL के 10x टी-4 polynucleotide कळेनासे (PNK) प्रतिक्रिया बफर, टी-4 PNK के 1 μL ( सामग्री की तालिकादेखें), और RNase के 5 μL-मुक्त पानी । 1 एच के लिए ३७ ° c पर मशीन ।
      सावधानी: रेडियोधर्मी सामग्री के लिए एक अधिकृत कार्यस्थल में 1.2-1.5 कदम के लिए उचित सुरक्षा की आवश्यकता है ।
    2. ६५ डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए गर्मी निष्क्रिय । एक नमकीन कॉलम पर नमूने जोड़ें और 1 मिनट के लिए, 000x g पर 1 min. eluent 2x TBE-यूरिया नमूना बफर के 25 μL के साथ मिश्रण । .
      नोट: यदि इसे तुरंत शुद्ध नहीं किया जाए तो लेबल वाले क्रूड उत्पाद को-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
    3. 1 h के लिए 20 W पर 10% acrylamide जेल चलाएं ।
      सावधानी: जेल पर कदम 1.2.1 से ३२पी लेबल प्राइमर लोड और शीर्ष जलाशय में रेडियोधर्मिता रक्तस्राव से बचने । जेल पर एक पतली बैंड सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह की ऊंचाई के एक तिहाई से अधिक लोड न करें (यदि आवश्यक हो तो कई कुओं का उपयोग करें) । नीचे जलाशय में तरल अत्यधिक रेडियोधर्मी हो सकता है ।
    4. जेल कैसेट के गिलास प्लेटें निकालें और प्लास्टिक लपेटो के एक टुकड़े पर जेल देना । प्लास्टिक लपेटो एक हवा तंग सैंडविच बनाने के लिए जेल के शीर्ष कवर करने के लिए गुना । एक कैल्शियम tungstate फॉस्फोरस स्क्रीन पर जेल सैंडविच प्लेस और एक इमेजिंग साधन के साथ बेनकाब । जेल के किनारों कहाँ हैं पता करने के लिए नियमित रूप से प्रकाश के साथ फिर से gel.
    5. दो छवियों ओवरले के लिए एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें । जेल को मुद्रित छवि पर संरेखित करें । जेल से बाहर वांछित बैंड काटने के लिए एक ताजा उस्तरा ब्लेड का प्रयोग करें । एक १.७ मिलीलीटर ट्यूब में 1 से 2 जेल स्लाइस प्लेस ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि मुद्रित छवि वास्तविक जेल के रूप में एक ही आकार की है । डबल बाहर जेल टुकड़ा काटने के बाद फिर से बचे हुए जेल इमेजिंग द्वारा संरेखण की जांच करें ।
    6. 1.1.16 करने के लिए 1.1.13 चरणों का पालन करके ३२पी-लेबल प्राइमर पुनर्प्राप्त. एक ०.४ मिलीलीटर ट्यूब में समाधान के १.० μL लो और 1x ते बफर के साथ प्राइमर को पतला १.० μL की रेडियोधर्मिता पर ~ १००,००० सीपीएम प्राप्त करने के लिए । शुद्ध ३२पी-पर पुस्तक-८० ° c ' आरएनए 2 तक--ओह संशोधन प्रतिक्रिया, लेकिन अब से 4 सप्ताह के लिए लेबल की दुकान ।
  3. लघु अणु बाध्यकारी और आरएनए 2 '-ओह संशोधन
    1. चार नमूने तैयार करने के लिए, 0.5 x ते बफर के ३२ μL में 8 pmol आरएनए जोड़ने के लिए एक १.७ मिलीलीटर ट्यूब, गर्मी ८० डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए, और कम से कम 1 मिनट के लिए बर्फ पर स्नैप-कूल ।
      नोट: आरएनए के अनुमानित आणविक भार की गणना करने के लिए निम्न समीकरण का उपयोग करें: मेगावाट = (# कुर्सियां) x ३४० डा.
    2. ५०० मिमी HEPES (पीएच ८.०), 20 मिमी MgCl2, और ५०० मिमी NaCl युक्त 5x तह मिश्रण के 8 μL जोड़ें । चार पीसीआर ट्यूबों में से प्रत्येक में आरएनए मिश्रण के 9 μL Aliquot और उन्हें #1-#4 लेबल । #1 ट्यूब में 10% DMSO के 1 μL जोड़ें, केंद्रित छोटे अणु समाधान के 1 μL (10% DMSO) में #2, पतला छोटे अणु समाधान के 1 μL (10% DMSO) #3 में, और #4 में पानी की 1 μL ।
    3. 30 मिनट के लिए एक थर्मल साइकिल चालक में ३७ ° c पर पीसीआर ट्यूबों मशीन ।
    4. ठीक 2 ' से पहले-ओह संशोधन प्रतिक्रिया, 1 μL की नई स्टॉक समाधान (2 एम) DEPC के 3 μL के साथ-पानी के इलाज के लिए एक ०.५ मीटर काम समाधान उपज पतला । देरी के बिना, #1, #2, और #3, और #4 में 25% DMSO के 1 μL में NAI काम समाधान के 1 μL जोड़ें । 15 मिनट के लिए एक थर्मल साइकिल चालक में ३७ ° c पर मशीन ।
    5. जोड़ें १०० μL का रेफरेंस/मिश्रण (नुस्खा के लिए चरण 1.1.13 देखें), 2 μL ग्लाइकोजन (15 मिलीग्राम/एमएल), और प्रत्येक पीसीआर ट्यूब में एक १.७ मिलीलीटर ट्यूब में सभी तरल स्थानांतरण । प्रत्येक ट्यूब में बर्फ ठंडा २०० प्रूफ ेतोः (3x मात्रा) के ०.३४ मिलीलीटर जोड़ें । 5 एस के लिए भंवर द्वारा मिक्स और एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ट्यूबों के लिए कम से 1 ज जगह है ।
      नोट: इस अवधि के दौरान, चरण 1.5.1 में उपयोग किया जा करने के लिए sequencing जेल सेट करना प्रारंभ करें ।
    6. १४,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए केंद्रापसारक । आरएनए गोली परेशान बिना supernatant निकालें । ८०% ेतोः (ट्यूब प्रति ०.५ मिलीलीटर), 15 एस के लिए भंवर जोड़कर आरएनए गोली धो, और २०,००० x जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए केंद्रापसारक । supernatant को पुन: निकालें ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एक Geiger काउंटर का उपयोग करने के लिए रेडियोधर्मी गोली ट्यूब में बनाए रखने सुनिश्चित.
    7. एयर सूखी आरएनए गोली 5 मिनट के लिए. RNase के 9 μL जोड़ें-नि: शुल्क पानी और मिश्रण ऊपर और नीचे से 10 बार pipetting ।
      नोट: आरएनए गोली सूखी खत्म मत करो । सभी वर्षण इस कदम के अंत में भंग होने की उंमीद है ।
  4. मार्कर तैयारी और प्राइमर विस्तार
    1. संशोधित आरएनए 4 नई पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरण और पहले के रूप में उन्हें #1 #4 लेबल । 4 अतिरिक्त पीसीआर ट्यूबों के लिए DEPC-इलाज पानी की 7 μL में 2 pmol नियंत्रण आरएनए जोड़ें और उन्हें #5 लेबल – #8. सभी आठ ट्यूबों में radiolabeled प्राइमरी (step 1.2.6) के 2 μL जोड़ें । 5 मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर ऐनी के लिए हीट, तो तुरंत थर्मल साइकिल चालक में 4 डिग्री सेल्सियस के लिए नीचे शांत ।
    2. 5x आरटी बफर के 4 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें), dithiothreitol के 1 μL (डीटीटी, ०.१ मीटर), और μL मिश्रण के 1 dNTP (10 मिमी प्रत्येक) आठ पीसीआर ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए ।
    3. DEPC-स्वास्थ्यकर्मी एच2ओ के 2 μL जोड़ें #1 – #4. ddATP के 4 μL जोड़ें (5 मिमी), ddTTP के 4 μL (5 मिमी), और μL के 4 ddCTP (5 मिमी) ट्यूबों में #5 – #7, क्रमशः. ddGTP के 1 μL जोड़ें (5 मिमी) और DEPC के 3 μL-इलाज पानी ट्यूब #8 । पिपेट चार बार मिश्रण करने के लिए ।
    4. थर्मल साइकिल चालक में 1 मिनट के लिए ५२ ° c पर हीट । रिवर्स transcriptase के 1 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें), तो pipetting द्वारा मिश्रण और नीचे चार बार । 20 मिनट के लिए ५२ ° c पर प्रतिक्रिया की मशीन ।
    5. आरएनए hydrolyze करने के लिए प्रत्येक ट्यूबों में 5 एम NaOH की 1 μL जोड़ें । 5 मिनट के लिए ९५ ° c पर ट्यूबों गर्मी ।
    6. 1 M HCl के 5 μL जोड़ें और ग्लाइकोजन और तरल अंतरण को छोड़ कर, इथेनॉल वर्षण (स्टेप्स 1.3.5 और 1.3.6) को दोहराएं ।
      नोट: "नमक सामने" के रूप में जाना जाता जेल के बीच में एक धुंधला क्षेत्र में चरण 1.4.6 परिणाम छोड़ रहा है ।
    7. एयर-5 मिनट के लिए डीएनए गोली सूखी, एच2ओ के 10 μL और 2x TBE के 10 μL-यूरिया नमूना लोड हो रहा बफर और पिपेट ऊपर और नीचे redissolve करने के लिए 10 बार जोड़ें । 5 मिनट के लिए ७० डिग्री सेल्सियस पर गर्मी । जेल पर लोड करने से पहले बर्फ पर ट्यूबों रखें ।
  5. पृष्ठ विश्लेषण
    1. एक 8% polyacrylamide sequencing जेल तैयार करने के लिए, निम्न संशोधनों के साथ 1.1.10 करने के लिए 1.1.6 चरणों का पालन करें: एक 8% bisacrylamide समाधान तैयार करने के लिए ४०% acrylamide/acrylamide समाधान (29:1) के १०० मिलीलीटर का उपयोग करें, और sequencing जेल ग्लास प्लेट्स का उपयोग करें (उदा., ४६ x ५७ सेमी) के साथ एक ०.४ mm स्पेसर ।
    2. नमूना चरण 1.4.7 से 10 μL लोड । 2 ज के लिए ६५ डब्ल्यू पर जेल भागो या जब तक नीचे डाई जेल के 3/4 तक पहुंचता है ।
      नोट: यदि आवश्यक हो तो दोहराने के लिए-८० ° c पर नमूनों के बाकी की दुकान ।
    3. स्पेसर को हटाने और धीरे से एक रंग डालने के द्वारा शीर्ष सिलिकॉन कांच की थाली निकालें । बड़े फिल्टर कागज का एक टुकड़ा प्लेस को जेल कवर और धीरे प्रेस को जेल फिल्टर कागज का पालन करने की अनुमति । नीचे अंत से शुरू, फिल्टर कागज उठा और ग्लास प्लेट से जेल को एक साथ हटा दें ।
    4. एक साथ जेल प्लेस प्लास्टिक लपेटो के एक टुकड़े पर फिल्टर कागज के साथ कि काफी बड़ी है पूरे जेल कवर (फिल्टर कागज ऊपर का सामना करना पड़) । फिल्टर पेपर पक्ष नीचे का सामना करना पड़ के साथ एक जेल सुखाने के लिए फ़िल्टर कागज जेल/
      सावधानी: रेडियोधर्मी सामग्री संदूषण से बचने के लिए, जेल सैंडविच और जेल सुखाने के बीच 3 से 4 बड़े फिल्टर कागज के टुकड़े का उपयोग करें ।
    5. एक वैक्यूम के साथ 1 एच के लिए ७० ° c पर जेल सूखी । एक तस्वीर पर जेल सैंडविच-प्रक्षालित फास्फोरस भंडारण स्क्रीन कैसेट स्थानांतरण । 4 – 16 एच के लिए स्क्रीन करने के लिए जेल की रेडियोधर्मिता का पर्दाफाश.
    6. एक इमेजिंग डिवाइस पर फास्फोरस भंडारण स्क्रीन प्लेस और मध्यम संकल्प (~ 30 मिनट) के साथ स्कैन ।
      नोट: यदि एक मुस्कान की तरह विरूपण साक्ष्य जेल छवि पर मौजूद है, सॉफ्टवेयर को सही करने का उपयोग करें (उदाहरणके लिए, साफा) छवि को एक प्रकाशित गुणवत्ता के लिए प्रक्रिया । ध्यान रखें कि मानक मार्कर लेन 2 '-ओह संशोधन गलियों से 1 न्यूक्लियोटाइड लंबा है ।

2. इन-सेल आकार

  1. प्राइमरी डिजाइन
    नोट: इन विट्रो में विपरीत आकार, में सेल आकार के लिए एक अभिव्यक्ति कैसेट डिजाइन की जरूरत नहीं है । हालांकि, एक इष्टतम प्राइमर सेट इस्तेमाल किया जाना चाहिए और आकार प्रयोग से पहले मूल्यांकन किया जाना चाहिए ।
    1. एक विस्फोट आधारित प्राइमर डिजाइन उपकरण (जैसे, प्राइमर ब्लास्ट) द्वारा कम से तीन अद्वितीय प्राइमर जोड़े उत्पन्न करते हैं । मानव कोशिकाओं में पूर्व mRNA अध्ययन करने के लिए, मानव जीनोम का चयन करें (नहीं transcriptome) प्राइमरी जोड़ी विशिष्टता जांच मापदंडों में एक संदर्भ डाटाबेस के रूप में । 200 की सीमा में amplicon के आकार उठाओ-1000 आधार जोड़ी (बीपी) ।
    2. एक स्पिन कॉलम के साथ ब्याज की ~ 106 कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए निकालें एक RNase के उपचार के साथ विधि आधारित और कश्मीर को छेड़ो ( सामग्री की तालिका देखें और निर्माता के प्रोटोकॉल का उपयोग करें) । ०.१ μg/μL ते बफर में शुद्ध जीनोमिक डीएनए को सामान्य.
    3. परीक्षण पीसीआर 1.1.1 और 1.1.2 कदम में प्रदर्शन प्रोटोकॉल के साथ ।
      नोट: वांछित प्राइमर सेट १.८% agarose जेल पर एक एकल बैंड उपज चाहिए ।
  2. सेल की तैयारी और 2 '-ओह संशोधन
    नोट: पूर्व-mRNA ब्याज की बहुतायत को बढ़ाने के लिए, गठित अभिव्यक्ति के लिए cytomegalovirus (सीएमवी) प्रवर्तक के अंतर्गत सही अनुक्रम वाला एक minigene मेजबान कोशिकाओं में transfected है.
    1. पूर्व गर्म संस्कृति मध्यम ३७ डिग्री सेल्सियस पर Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1x एंटीबायोटिक मिश्रण युक्त । बीज 293T कोशिकाओं पर ५०% अच 24 ज से पहले अभिकर्मक संस्कृति माध्यम में । DMEM में 2% FBS में मध्यम एंटीबायोटिक दवाओं के बिना ~ 1 अभिकर्मक से पहले एच बदलें ।
    2. कम सीरम मीडिया के १०० μL में minigene प्लाज्मिड के 10 μg जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) 1 में एक अच्छी तरह से ९६ प्लेट की । पिपेट समाधान को ऊपर और नीचे चार बार मिश्रण करने के लिए ।
    3. जोड़ें ४० μL के अभिकर्मक रिएजेंट ( सामग्री की तालिकादेखें) में कम सीरम मीडिया के १०० μL में एक और अच्छी तरह से प्लेट की । पिपेट ऊपर और नीचे चार बार मिश्रण करने के लिए । 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    4. अभिकर्मक एजेंट निलंबन के लिए संपूर्ण प्लाज्मिड समाधान जोड़ें । पिपेट ऊपर और नीचे चार बार मिश्रण करने के लिए । 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    5. पूरे डीएनए/अभिकर्मक रिएजेंट मिश्रण dropwise डिश भर में मध्यम की सतह पर जोड़ें । 6 के लिए ३७ ° c पर मशीन-12 एच ।
    6. मध्यम महाप्राण और धीरे फॉस्फेट के 5 मिलीलीटर के साथ एक बार धो-खारा (पंजाब, पीएच ७.४,2 CaCl और MgCl2के बिना, सामग्री की तालिकादेखें) बफर । Trypsinize trypsin के 3 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को हल । 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    7. पकवान के नीचे से कोशिकाओं को अलग कर देना करने के लिए धीरे से पकवान दस्तक । संस्कृति माध्यम के 6 मिलीलीटर के साथ trypsin बेअसर । 4 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक और मध्यम निकालें ।
    8. प्रतिक्रिया मध्यम के १९९ μL में प्रत्येक नमूने के लिए ~ 106 कोशिकाओं resuspend (DMEM में 1% FBS) और एक ९६ अच्छी तरह से प्लेट में सेल निलंबन स्थानांतरण । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सभी तीन नियंत्रणों में यौगिक कार्य समाधान के 1 μL या DMSO के 1 μL के साथ कोशिकाओं को मशीन ।
      नोट: तीन नियंत्रण नमूनों में शामिल किया जाना चाहिए: nai, विकृत आरएनए के साथ DMSO नियंत्रण, और nai नकारात्मक नियंत्रण.
    9. denaturing नियंत्रण (DC) आरएनए और NAI नकारात्मक नियंत्रण के अलावा प्रत्येक नमूने के लिए 2 एम NAI के 10 μL जोड़ें. पिपेट ऊपर और नीचे चार बार मिश्रण करने के लिए । 15 मिनट के लिए ३७ ° c में मशीन धीरे से प्लेटें हिला हर 5 मिनट फिर से सस्पेंड ।
    10. १.७ मिलीलीटर ट्यूबों में कोशिकाओं स्थानांतरण और ४०० एक्स जी में देरी के बिना 2 मिनट के लिए केंद्रापसारक । सेल गोली परेशान बिना supernatant निकालें ।
    11. guanidinium thiocyanate की ०.४ मिलीलीटर जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) । 15 एस के लिए भंवर homogenize । 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूनों की मशीन ।
      नोट: अगले चरण पर कार्यवाही करने तक नमूनों को-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  3. आरएनए निष्कर्षण
    1. guanidinium thiocyanate homogenized नमूनों में से प्रत्येक के लिए ०.२ मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म जोड़ें । 15 एस के लिए भंवर 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    2. १२,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक । शीर्ष बेरंग जलीय परत आरएनए शामिल हैं । स्थानांतरण ~ ३८० जलीय समाधान के μL एक नया १.७ एमएल ट्यूब में ।
      सावधानी: प्रदूषित होने से बचने के लिए इस फेज को डिस्टर्ब न करें ।
    3. ेतोः (~ ५७० μL) के 1.5 x वॉल्यूम जोड़ें । 15 एस मिश्रण करने के लिए भंवर ।
    4. एक आरएनए अलगाव स्पिन-स्तंभ ( सामग्री की तालिकादेखें) में आरएनए मिश्रण के ६०० μL स्थानांतरण । 15 एस के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक eluent त्यागें । एक ही स्पिन कॉलम में सभी तरल के माध्यम से पारित करने के लिए इस कदम को दोहराएँ ।
    5. RW1 बफर के ०.३५ मिलीलीटर के साथ कॉलम धो ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए कताई द्वारा 15 s. Add ८० μL के RNase-नि: शुल्क DNase मैं RDD बफर में ( सामग्री की तालिकादेखें) । 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
      नोट: यह सभी डीएनए संदूषण को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    6. बाद में RW1 बफर के ०.३५ मिलीलीटर और 2x RPE बफर के ०.६ मिलीलीटर के साथ कॉलम धो ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए कताई द्वारा 15 एस हर कदम पर । 1 मिनट के लिए १२,००० x g पर एक खाली संग्रह ट्यूब के साथ स्पिन कॉलम केंद्रापसारक द्वारा कॉलम सूखी ।
    7. जोड़ें ३२ RNase के μL-मुक्त पानी कॉलम के केंद्र के लिए । 30 एस के लिए १२,००० x g पर 1 min. केंद्रापसारक के लिए मशीन ~ शुद्ध आरएनए समाधान के 30 μL प्राप्त करने के लिए । विकृत नमूना प्रसंस्करण जबकि-20 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों रखो.
  4. विकृत आरएनए नियंत्रण की तैयारी
    1. बर्फ पर १.७ मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूब में डीसी के लिए 30 µ एल आरएनए नमूना रखें । formamide के ५० μL जोड़ें और डीसी बफर के 15 μL ३०० mm HEPES (पीएच ८.०) और ट्यूब में 25 मिमी EDTA युक्त ।
    2. 1 मिनट के लिए ९५ ° c पर आरएनए को विकृत करने के लिए हीट. जल्दी से 5 μL नई स्टॉक समाधान (2 एम), फिर दो बार मिश्रण करने के लिए झटका और ट्यूब वापस हीटिंग ब्लॉक करने के लिए डाल करने के लिए जोड़ें । एक अतिरिक्त 1 मिनट के लिए ९५ ° c पर मशीन तो तुरंत बर्फ पर ट्यूब डाल दिया ।
    3. guanidinium thiocyanate की ०.४ मिलीलीटर जोड़ें । दोहराएँ चरण 2.3.1 – 2.3.4.
    4. 2x RPE बफर के ०.६ मिलीलीटर के साथ कॉलम धो ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए कताई द्वारा 15 एस हर कदम पर । 1 मिनट के लिए १२,००० x g पर एक खाली संग्रह ट्यूब के साथ स्पिन कॉलम केंद्रापसारक द्वारा कॉलम सूखी ।
    5. जोड़ें ३२ RNase के μL-मुक्त पानी कॉलम के केंद्र के लिए । 30 एस के लिए १२,००० x जी पर 1 min. केंद्रापसारक के लिए मशीन बरामद डीसी आरएनए समाधान के ~ 30 μL प्राप्त करने के लिए ।
  5. प्राइमरी एक्सटेंशन
    1. 2.3.7 और 2.4.5 से ०.५ μg/μL में RNase मुक्त पानी के साथ आरएनए समाधान सामान्य । हौसले से तैयार 30 मिमी MnCl2 MnCl2∙ 4H2ओ पाउडर से समाधान ।
    2. एक पीसीआर पट्टी में प्रत्येक नमूने के लिए आरएनए समाधान के 9 μL स्थानांतरण । प्रत्येक ट्यूब में 10 मिमी dNTP और 1 μL के 2 माइक्रोन जीन विशिष्ट प्राइमरी (जीएसपी) के 1 μL जोड़ें । पिपेट ऊपर और नीचे चार बार मिश्रण करने के लिए । एक थर्मल साइकिल चालक में 5 मिनट के लिए ६५ ° c पर मशीन और > 1 मिनट के लिए बर्फ पर डाल दिया ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एक यादृच्छिक nonamer के 1 μL जीएसपी के प्रतिस्थापन में इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    3. प्रत्येक पीसीआर ट्यूब में, 10x आरटी बफर के 2 μL का एक मिश्रण जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें), 30 मिमी MnCl2के 4 μL, और १०० मिमी डीटीटी के 2 μL. पिपेट ऊपर और नीचे 4x मिश्रण करने के लिए । 2 मिनट के लिए ४२ ° c पर मशीन ।
    4. रिवर्स transcriptase के 1 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) । पिपेट ऊपर और नीचे 4x मिश्रण करने के लिए । 3 एच के लिए एक थर्मल साइकिल चालक में ४२ ° c पर मशीन ।
  6. पुस्तकालय की तैयारी और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण
    1. डीएनए पोलीमरेज़ के 1 μL को जोड़कर एक पीसीआर रिएक्शन सेट करें, 5 μL की 10x डीएनए पोलीमरेज़ बफर ( सामग्री की तालिकादेखें), DMSO के 2 μL, १.५ μL के प्रत्येक प्राइमरों के लिए (10 माइक्रोन), एच2ओ के ३४ μL, और कदम μL से सीडीएनए के 5 2.5.4.
    2. इस प्रकार के रूप में थर्मल साइकिल चालक की स्थापना: 1 चरण) 2 मिनट के लिए ९५ ° c; चरण 2) ९५ ° c 30 s के लिए; चरण 3) ६० ° c 30 s के लिए; स्टेज 4) ६८ ° c 30 s के लिए; स्टेज 5) 30 चक्र के लिए 2 चरण के लिए वापस पाश; चरण 6) 3 मिनट के लिए ६८ ° c; और चरण 7) अनंत होल्डिंग पर 4 ° c निम्न चरण तक.
    3. १.८% agarose जेल का उपयोग करके amplicon को शुद्ध करे ।
      नोट: जेल पर सिंगल बैंड के रूप में पीसीआर बैंड दिखनी चाहिए ।
    4. साहित्य6,26में स्थापित मानक विखंडन और बंधाव विधियों का उपयोग कर पुस्तकालय का निर्माण ।
    5. एक अगली पीढ़ी के sequencing उपकरण का उपयोग कर 1 x ७५ एकल-अंत में लगभग १०,०००,००० पढ़ता नमूना प्रति जनरेट करने के लिए पढ़ता है पर अनुक्रम ।
    6. ShapeMapper और SuperFold सॉफ्टवेयर सप्ताह समूह26द्वारा विकसित संकुल का उपयोग कर परिणामों का विश्लेषण ।

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Representative Results

हम पहले से प्रदर्शित किया है कि एक आरएनए ब्याह मॉडुलन, SMN-C2, SMN2 जीन के पूर्व mRNA के एक्सॉन 7 पर AGGAAG आकृति के साथ सूचना का आदान प्रदान, और SMN-C26की उपस्थिति में आरएनए संरचनात्मक परिवर्तन का आकलन करने के लिए आकार का उपयोग. SMN-C2 का बाइंडिंग साइट, SMA, nusinersen के लिए FDA-अनुमोदित antisense oligonucleotide (ASO) से अलग है, जो intronic ब्याह साइलेंसर (आईएसएस) को 727,28 (फिगर 1a) पर बांधता है और ब्लॉक करता है । SMN2 एक्सॉन 7 के सबसे ज्ञात ब्याह नियामकों-mRNA29में एक्सॉन 7 के ~ १०० न्यूक्लियोटाइड रेंज के भीतर हैं; इसलिए, एक १४० और २७६ न्यूक्लियोटाइड-लांग आरएनए अनुक्रम में इन विट्रो और कक्ष आकार, प्रतिनिधि, जो एक्सॉन 7 और निकटवर्ती intron क्षेत्र (चित्र 1a) को कवर करने के लिए उपयोग किए गए थे ।

इन विट्रो में इस प्रतिनिधि में आकार विश्लेषण, ब्याज की आरएनए अनुक्रम एक अनुकूलित कैसेट सप्ताह प्रयोगशाला है, जो सबसे आरएनए1दृश्यों के लिए संगत है द्वारा विकसित में एंबेडेड है । कभी-कभार, ब्याज का अनुक्रम इस कैसेट के साथ इंटरैक्ट या हस्तक्षेप करता है. इन मामलों में, एक संशोधित कैसेट निंनलिखित तीन विशेषताओं के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है: i) एक 3 '-आरएनए अनुक्रम के किसी भी भाग से प्राइमर के लिए एक अधिक कुशल संकरण संबध के साथ अंत विशिष्ट प्राइमर बंधन साइट, द्वितीय) एक उच्च संरचित hairpin लूप प्राइमर बंधन साइट है कि विशिष्ट और reproducible आकार संकेत दिखाएगा के ऊपर सीधे ऊपर स्थित (यह प्रयोग करने के लिए प्रयोग से संकेत और विधि के लिए दोनों एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य करेंगे), और iii) एक ' 5 अंत hairpin संरचना तत्व, जो आकृति संकेत के अंत को इंगित करता है । आकार कैसेट आगे स्वयं के साथ पार्श्व है दोनों 5 ' में ribozyme दृश्यों-और 3 '-समाप्त क्रम में एक समरूप आरएनए30उत्पंन करने के लिए । हमने पाया है कि हथौड़ा और हेपेटाइटिस डेल्टा वायरस ribozymes आकार कैसेट के लिए संगत कर रहे है और आम तौर पर वांछित आरएनए की उच्च उपज दे । परिणामी टेम्पलेट आरएनए एक 3 ' के अंत 2 ', 3 '-चक्रीय फॉस्फेट और एक 5 '-अंत हाइड्रॉक्सिल समूह है, जो प्राइमर विस्तार के साथ हस्तक्षेप नहीं करते. एक १४०-nucleoside लंबे समय पूर्व mRNA में SMN2 और आसंन क्षेत्र के 7 एक्सॉन कवर अनुक्रम आकार और ribozyme कैसेट के रूप में 1 योजनामें सचित्र के भीतर संश्लेषित किया गया था ।

सामांय में, अभिव्यक्ति कैसेट में ब्याज ligated के अनुक्रम काफी लंबे समय के लिए संरचना के संभावित माध्यमिक या उच्च क्रम को कवर किया जाना चाहिए । SMN2 एक्सॉन 7, एक १४०-न्यूक्लियोटाइड क्षेत्र के मामले में दो स्टेम-पाश संरचनाओं6,31शामिल हैं । ब्याज के क्षेत्र की संरचना मामला दर मामला बदलता है और परीक्षण द्वारा मूल्यांकन किया जाना चाहिए-और त्रुटि ।

३२P-लेबल प्राइमर विस्तार उत्पादों के साथ Polyacrylamide अनुक्रमण जेल इस प्रतिनिधि प्रयोग में इन विट्रो आकार प्रोफ़ाइल में कल्पना करने के लिए चुना गया था । एक वैकल्पिक दृश्य विधि एक फ्लोरोसेंट लेबल डीएनए प्राइमरी३२के साथ केशिका ट्रो का उपयोग करने के लिए है । polyacrylamide sequencing जैल में, ~ 20 nucleosides के पास 5 '-अंत और ~ 10 न्यूक्लियोटाइड के पास 3 '-अंत में आरएनए अनुक्रम के हित के लिए मात्रात्मक visualized नहीं किया जाएगा, रिवर्स प्रतिलेखन और तीव्र के दीक्षा चरणों में कभी-कभार बंद हो जाता है के कारण पूर्ण लंबाई टेप के लिए पृष्ठ जैल पर बैंड1।

एक आरएनए के preparative जेल वसूली के लिए एक वैकल्पिक तरीका टेम्पलेट (steps 1.1.6 to 1.1.12) एक मिनी जेल अधिभार करने के लिए है, तो वांछित आरएनए टेम्पलेट की उपज > 90% है । यह सलाह दी जाती है कि इस स्तम्भ को नमक से eluting कर आरएनए उत्पाद से अतिरिक्त NTP को हटा दें और ते के ५० µ एल में आरएनए का बफर करें. आरएनए की एकाग्रता को मापने और प्रत्येक अच्छी तरह से ५.० µ जी लोड । T7 प्रतिलिखित आरएनए टेम्पलेट के शुद्धिकरण कदम के दौरान, जब xylene cyanol एफएफ डाई (हल्का नीला) के दो-तिहाई 6% विकृत TBE-यूरिया जेल के पारित कर दिया पृष्ठ बंद करो । स्व-क्लीवेज आरएनए टुकड़ा (< 80 nucleosides) जेल के माध्यम से पारित कर दिया है, जो धुंधला (आंकड़ा 1b) पर जेल में ही प्रमुख बैंड के रूप में वांछित आरएनए छोड़ा ।

SMN-C2 (चित्रा 1C) प्रकाशित प्रक्रिया३३ के अनुसार संश्लेषित किया गया था और 10 मिमी DMSO स्टॉक समाधान में भंग. शेयर समाधान आगे ५०० और ५० µ मीटर में 10% DMSO समाधान में पतला है ५० और 5 µ एम, क्रमशः के अंतिम सांद्रता प्राप्त करने के लिए । स्नैप-कूल्ड आरएनए ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के भीतर DMSO या SMN-C2 की उपस्थिति में अपने संतुलन चरण के लिए फिर से सामने आया । एक लंबी मशीन समय प्रयोग के परिणाम में परिवर्तन नहीं किया । दो प्रयोगात्मक नमूनों (५० और 5 µ एम SMN-C2), दो नियंत्रण (DMSO और NAI नियंत्रण), और चार मार्करों (ए, टी, जी, सी) प्राइमरी एक्सटेंशन के लिए इलाज किया गया. फॉस्फोरस भंडारण स्क्रीन करने के लिए जेल को उजागर करने के बाद, एक सफल आकार प्रयोग दिखाएगा: i) जेल और द्वितीय के शीर्ष पर एक एकल और सबसे तीव्र बैंड) धब्बा बिना एक न्यूक्लियोटाइड संकल्प पर जेल भर में बैंड (1 डी) । पृष्ठ विश्लेषण में एक आम समस्या यह है कि एक धब्बा क्षेत्र "नमक सामने" जेल (चित्रा 1E) के बीच में प्रकट हो सकता है के रूप में जाना जाता है । यह शायद नमक, DMSO, या अंय अवांछित पदार्थ लदान नमूना है कि इथेनॉल वर्षण द्वारा हटाया जा सकता है में उच्च एकाग्रता के कारण है ।

इन विट्रो में आकार, एक शुद्ध आरएनए टेम्पलेट एक सफल प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण है । एक पतित आरएनए टेम्पलेट आमतौर पर अनचाहे परिणामों के कारण होता है । यदि पृष्ठ विश्लेषण स्पष्ट रूप से मार्कर के 2 सेट का एक पैटर्न से पता चलता है, यह इंगित करता है कि आरएनए टेम्पलेट समरूप नहीं है और preparative TBE-यूरिया जेल द्वारा पुनर्शुद्ध करने की जरूरत है ।

में सेल आकार, एक सफल प्रयोग करने के लिए एक महत्वपूर्ण के लिए एक अनुकूलित प्राइमर प्रवर्धन के लिए सेट डिजाइन है । जीनोमिक डीएनए के ०.१० µ जी के साथ मुक्त सीडीएनए टेम्पलेट, agarose जेल विश्लेषण में 25 पीसीआर चक्रों के भीतर एक एकल बैंड मनाया जाना चाहिए । दोहराव intron अनुक्रम को इसलिए टाला जाना चाहिए । SMN2 पूर्व mRNA पर SMN-C2 के संरचनात्मक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, तीन प्राइमरी सेट (टेबल 2) का परीक्षण किया गया था, और सभी संतोषजनक थे (चित्रा 2a).

एक लक्ष्य आरएनए अनुक्रम की एक कम कॉपी संख्या आम तौर पर इन-सेल आकार के लिए एक समस्या है । के लिए ब्याज की आरएनए समृद्ध, एक minigene है कि एक मजबूत सीएमवी प्रवर्तक के तहत ब्याज की आरएनए अनुक्रम शामिल 293T कोशिकाओं में transfected था । क्योंकि SMN2 minigene के ब्याह पैटर्न recapitulates के साथ या SMN2 के बिना अंतर्जात SMN-c219,३४, हम कल्पना है कि SMN-c2 की संरचना में व्यक्त SMN2 पूर्व mRNA संभावना के रूप में एक ही था अंतर्जात जीन उत्पाद । हालांकि चुनाव आयोग५० SMN-C3 ब्याह परख में था ~ ०.१ µ एम6,19, उच्च अंत (20 µ m) पर एक एकाग्रता के लिए छोटे अणु और लक्ष्य आरएनए अनुक्रम की बाध्यकारी राज्य को सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

आरएनए के अलगाव पर, दोनों जीन विशिष्ट और यादृच्छिक प्राइमरों विस्तार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । SMN2 के एक्सॉन 7 के मामले में, हमने पाया है कि SMN2E7-338-RV (तालिका 2) एक यादृच्छिक nonamer से वांछित सीडीएनए की एक उच्च प्रतिलिपि पैदावार, SMN2E7 के साथ पीसीआर प्रवर्धन में एक अधिक तीव्र बैंड द्वारा सबूत-276 प्राइमरी सेट (तालिका 2) 25 चक्र के बाद । 2 में '-ओह संशोधन कदम, एक ९१ µ एम अंतिम NAI एकाग्रता 15 मिनट की एक मशीन की अवधि के लिए इस्तेमाल किया गया था । एक अलग सेल प्रकार या मध्यम उपयोग किया जाता है, तो मशीन समय फिर से अनुकूलित किया जाना चाहिए । अगर मशीन समय बहुत लंबा है, amplicon के agarose जेल विश्लेषण कभी भी एक बैंड दिखाने के लिए असफल हो जाएगा ।

एक अजगर आधारित कार्यक्रम, ShapeMapper, सप्ताह प्रयोगशाला३५ द्वारा विकसित करने के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा उत्पंन डेटा का विश्लेषण किया गया था [SMN-C2 के कच्चे डेटा में इलाज के सेल आकार SMN2 एक्सॉन 7 पूर्व mRNA, अनुक्रम पढ़ें पुरालेख को देखें (SRA) डेटाबेस] । amplicon के दौरान, आकार प्रतिजेट काफी बदल नहीं किया (> 1), जो संकेत दिया कि द्वितीयक संरचना SMN-C2 (चित्रा 2 बी) की उपस्थिति में रहता है. यह भी SuperFold३५द्वारा उत्पंन चाप भूखंडों द्वारा की पुष्टि की है । कनेक्शन रेखाएं प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड के आकार गतिविधि के आधार पर संभव आधार युग्मन को इंगित करती हैं । SMN-C2 और DMSO-स्वास्थ्यकर्मी आरएनए मॉडलिंग मूलतः एक ही है (चित्रा 2c). अवकलन में कक्ष आकार पुनर्क्रिया प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड (चित्रा 2 बी) के लिए गणना की गई थी, और सबसे reactivity परिवर्तन-1 (5 '-एक्सॉन 7 के अंत) पर हुई, लेकिन नहीं TSL-2 (3 '-एक्सॉन 7 के अंत) । इस परिणाम में इन विट्रो आकार के साथ सहमत हैं; हालांकि, आधार बाँधना इन विट्रो आकार आरएनए मॉडलिंग में सेल आकार विश्लेषण (चित्रा 2d) में से खिसकाया ।

में सेल आकार की एक आम समस्या amplicon भर में कम उत्परिवर्तन दर है । यह आमतौर पर जीनोमिक डीएनए संदूषण के कारण होता है । डीएनए 2 '-ओह समूह शामिल नहीं है; इसलिए, कोई acylation उत्पाद के साथ बना है NAI । पीसीआर प्रवर्धन इस प्रकार केवल डीएनए पोलीमरेज़ की कम उत्परिवर्तन दर को दर्शाता है । guanidinium द्वारा आरएनए का अलगाव thiocyanate द्वारा पीछा किया पर कॉलम DNase पाचन ज्यादातर मामलों में सभी डीएनए को दूर करने के लिए पर्याप्त है । डीएनए संक्रमण बनी रहती है, तो आरएनए अलगाव के लिए २.३ कदम दोहराएँ ।

Scheme 1
योजना 1: आरएनए प्रतिलेखन के टेम्पलेट के लिए डीएनए अनुक्रम । लाल रंग में हथौड़ा वायरस ribozyme अनुक्रम के भीतर 12 बीपी अनुक्रम 5 ' के पहले 12 बीपी-कैसेट के रिवर्स पूरक है । यहां प्रस्तुत है ब्याज की आरएनए अनुक्रम एक १४० बीपी प्री-mRNA अनुक्रम मानव SMN2 जीन के एक्सॉन 7 होते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगात्मक डिजाइन और के परिणाम में इन विट्रो SMN2 एक्सॉन 7 पूर्व mRNA के लिए आकार SMN-C2 की उपस्थिति में. (क) इन विट्रो में के लिए ब्याज के अनुक्रम का अवलोकन और SMN2 जीन के कक्ष आकार अध्ययनों में । SMN-C2 AGGAAG आकृति को एक्सॉन 7, nusinersen बाइंडिंग साइट से एक अलग स्थान पर बाइंड कर देता है । (ख) T7 प्रतिलेखन उत्पाद का शुद्धिकरण. तीन लेन के प्रत्येक क्रूड आरएनए के ५.० µ जी शामिल हैं । TBE-यूरिया जेल SYBR-सुरक्षित (1:10000) 1x TBE बफर में 5 मिनट के लिए के साथ दाग था । लाल डैश बॉक्स आरएनए वसूली के लिए उत्पाद शुल्क के किनारे को इंगित करता है । (ग) SMN-C2 की संरचना । (D) इन विट्रो आकृति प्रयोग विथ NAI और a १४० न्यूक्लियोटाइड-long आरएनए टेम्पलेट जिसमे एक्सॉन 7. 1 = DMSO; 2 = SMN-C2 (५० µ m); 3 = SMN-C2 (5 µ m); 4 = कमी ंै; 5-8 = प्राइमर विस्तार के दौरान ddATP, ddTTP, ddCTP, और ddGTP के अलावा द्वारा उत्पंन सीढ़ी । पृष्ठ पर बाहर किया गया था एक TBE-यूरिया sequencing जेल ६० डब्ल्यू पर 3 एच के लिए लाल तारक ५० µ m SMN-C26के साथ बढ़ी हुई बैंड तीव्रता इंगित करते हैं । (ङ) एक अलग प्रयोग से धराशायी लाल बॉक्स में एक "नमक सामने" क्षेत्र का एक उदाहरण है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: में सेल आकार व्युत्पंन आरएनए मॉडलिंग SMN2 एक्सॉन 7 पूर्व mRNA के लिए । (एक) सभी तीन प्राइमर सेट (तालिका 2) के साथ पीसीआर प्रवर्धन agarose जेल विश्लेषण में एक एकल बैंड झुकेंगे । 1 = SMN2E7-338, 2 = SMNE7-276, 3 = SMN2E7-251, 4 = डीएनए सीढ़ी । (ख) SMN2 minigene-transfected 293T कोशिकाओं में अवकलन-कक्ष आकार प्रतिक्रिया में 10 µ मीटर SMN-C2 और DMSO में TSL1. एकल-न्यूक्लियोटाइड रिज़ॉल्यूशन पर आकृति पुनर्क्रिया । इसके मानक विचलन ShapeMapper सॉफ्टवेयर३५द्वारा गणना की गई । हरी तारक 10 µ m SMN-C2 द्वारा प्रेरित महत्वपूर्ण आकृति प्रतिक्रिया परिवर्तन का संकेत देता है । २७६ बीपी amplicon में न्यूक्लियोटाइड का क्रमांकन x-अक्ष पर दिखाया गया है । त्रुटि पट्टियां आकार द्वारा अनुमानित थे-मैपर सॉफ्टवेयर26। (ग) में सेल आकार डेटा द्वारा सबसे प्रशंसनीय आरएनए माध्यमिक संरचना मॉडलिंग के लिए SuperFold३५ द्वारा उत्पन्न चाप साजिश । (डी) इन विट्रो और इन-सेल शेप-एक्सॉन 7 और अगल-बगल के क्षेत्रों में मॉडलिंग का निर्देशन किया है । इन विट्रो में के लिए आरएनए मॉडल, आकार स्थिर कैसेट (नारंगी) और न्यूक्लियोटाइड 1-19 (नीला) स्केच में दिखाए गए हैं. इन-सेल आरएनए मॉडल के लिए, न्यूक्लियोटाइड क्रमांकन इन विट्रो आकृति टेम्पलेट के साथ संरेखित है । न्यूक्लियोटाइड 1-18 और 120-140 का लोप किया गया. महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया परिवर्तन लाल और हरे तारांकन में इन विट्रो और में-कक्ष आकृति, क्रमशः के लिए इंगित किए गए हैं । TSL1 और TSL231 नाम पहले थे जो द्वितीयक संरचनाएं नीले बक्से में संलग्न हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

प्राइमरी का नाम 5 '-3 ' अनुक्रम
Ribozyme-परिवार कल्याण TAAAACGACGGCCAGTGAAT
Ribozyme-RV GCAGGTCGACTCTAGAGGAT
आरटी प्राइमर GAACCGGACCGAAGCCCG

तालिका 1: प्रतिनिधि प्रयोग में प्राइमरी जुगाड़ का इस्तेमाल किया ।

नाम अनुक्रम (5 '-> 3 ')
SMN2E7-338-परिवार कल्याण AAAGACTATCAACTTAATTTCTGA
SMN2E7-338-RV TGTTTTACATTAACCTTTCAACT
SMN2E7-276-परिवार कल्याण AATGTCTTGTGAAACAAAATGCT
SMN2E7-276-RV AACCTTTCAACTTTCTAACATCT
SMN2E7-251-परिवार कल्याण TGAAACAAAATGCTTTTTAACATCC
SMN2E7-251-RV TCAACTTTCTAACATCTGAACTTTT

तालिका 2: पूर्व के प्रवर्धन के लिए प्राइमर सेट ब्याज की mRNA अनुक्रम । सभी तीन प्राइमर सेट जीनोमिक डीएनए मुक्त सीडीएनए टेम्पलेट के साथ एक पीसीआर प्रतिक्रिया में एक एकल amplicon उपज ।

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Discussion

इन विट्रो में आकार, यह उच्च गुणवत्ता सजातीय आरएनए टेम्पलेट का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । T7 प्रतिलेखन, हालांकि, अक्सर विषम अनुक्रम३६पैदावार । विशेष रूप से, 3 में ± 1 न्यूक्लियोटाइड के साथ अनुक्रम-गैर नगण्य पैदावार३६ के साथ टर्मिनस आमतौर पर मुश्किल polyacrylamide जेल शोधन द्वारा हटाया जा करने के लिए कर रहे हैं । विषम आरएनए टेम्पलेट प्राइमरी एक्सटेंशन उत्पाद के अनुक्रमण जेल की रूपरेखा में संकेत के एक से अधिक सेट में परिणाम कर सकते हैं, जो कभी-कभार परिणाम की व्याख्या करने के लिए मुश्किल बना देता है । दोनों 5 '-और 3 '-आरएनए टेंपलेट अभिव्यक्ति कैसेट के सिरों पर ribozyme दोनों सिरों समरूप कर देगा ।

दोनों विट्रो में और में सेल आकार, 2 ' की मशीन समय-ओह संशोधन रिएजेंट एक और महत्वपूर्ण कारक है । यह सप्ताह समूह द्वारा सुझाव दिया गया था कि पानी के आधे से कम पांच बार-शमन 2 '-ओह acylation रिएजेंट1इस्तेमाल किया जाना चाहिए । हमारे हाथों में, NAI के साथ (टी1/2 = ~ 20 मिनट) में > 30 मिनट के लिए दोनों इन विट्रो में और कक्ष में आकार परिणाम एक प्रतिक्रियात्मक परिणाम में । के रूप में चित्रा 1 डीमें दिखाया गया है, इन विट्रो आकार में एक अच्छा > पूर्ण लंबाई प्रतिलिपि के रूप में जेल के शीर्ष पर 50% कुल संकेत होना चाहिए, यह सुनिश्चित करना है कि संशोधित आरएनए के अधिकांश केवल एक बार acylated है । रिएक्शन डबल-acylated उत्पाद गैर-नगण्य और समृद्ध लघु लंबाई विस्तार उत्पादों के लिए पक्षपातपूर्ण रूपरेखा प्रदान करेगा । in-कक्ष आकृति में, लायब्रेरी निर्माण के लिए amplicon agarose जेल विश्लेषण (चरण 2.6.3) में एक एकल बैंड के रूप में प्रकट होना चाहिए । बैंड का धब्बा एक प्रतिक्रिया इंगित करता है, और मशीन समय कम किया जाना चाहिए । प्रतिनिधि प्रयोगों में, ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक 15 मिनट की मशीन समय इन विट्रो और इन-सेल आकार के लिए इष्टतम था । यह इसी तरह के अनुप्रयोगों में NAI संशोधन के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.

वहां अंय 2 '-ओह संशोधन रिएजेंट22 व्यापक रूप से आकार के लिए इस्तेमाल किया, ऐसे 1M7 के रूप में कर रहे हैं । NAI की तुलना में, 1M7 2 ' के लिए एक बेहतर जेट है-ओह समूह और कम आधा पानी में जीवन22. हमारे हाथों में, 1M7 में सेल संस्कृति मीडिया में पीली वर्षा के विशाल राशि का गठन एक में सेल आकार प्रयोग, जो आरएनए अलगाव जटिल । एक तुलना कारण के लिए, दोनों विट्रो में और में सेल आकार 2 ' के रूप में उपयोग NAI-SMN-C2 और SMN2 पूर्व mRNA बातचीत के एक अध्ययन के लिए संशोधन एजेंट. यदि केवल इन विट्रो आकार में आवश्यक है, 1M7 riboswitch संरचनात्मक निर्धारण7,8में विभिंन अध्ययनों द्वारा प्रदर्शन के रूप में एक वैकल्पिक विकल्प है ।

सामांय में, इन इन विट्रो आकार में सेल आकार पसंद है, खासकर यदि अणु संभवतः एक eukaryotic कोशिका के नाभिक में अभिनय है । शाही सेना-नाभिक में प्रोटीन बंधन प्रचुर मात्रा में हैं, और यह लगभग इन विट्रो शर्तों के तहत सेलुलर संदर्भ दोहराऊंगा असंभव है ।

पिछले दशक में, आकार आरएनए के माध्यमिक संरचना का अध्ययन करने के लिए मानक विधि बन जाता है । RNase३७के साथ पारंपरिक आरएनए के पदचिह्न की तुलना में, यह छोटे अणु-आरएनए बातचीत का अध्ययन करने के लिए अधिक उपयुक्त है, क्योंकि ये बातचीत कभी-कभार कमजोर और RNase चुनौतियों के प्रति असंवेदनशील हो सकती है ।

आकार का उपयोग करने के लिए छोटे अणु प्रेरित आरएनए संरचनात्मक परिवर्तन का अध्ययन करने की प्रमुख सीमा है कि इसके परिणाम बाध्यकारी साइट प्रकट नहीं है । इन विट्रो और इन-सेल शेप में SMN-C2 बाउंड pre-mRNA के लिए, शेप रिजेट को ख्यात बाइंडिंग साइट (figure d, figure b) में परिवर्तित नहीं किया; बल्कि, पाश या हिलता क्षेत्र में 2 से 3 दूरदराज के स्थलों पर जेट बदल रहे थे । SMN-C2 संभवतः एक आरएनए डबल कुण्डली क्षेत्र (चित्रा 1 डी, चित्रा 2d), जो आम तौर पर एक कम आकार जेट है करने के लिए बाइंड कर देता है । इसलिए, आगे संरचना स्थिर आकार जेट कम करने के लिए शायद चौकस नहीं होगा । एक ख्यात बाइंडिंग साइट उत्पन्न करने के लिए, ChemCLIP३८ जैसे अन्य विधियों का उपयोग किया जाना चाहिए, जिसमें एक crosslinking रासायनिक जांच शामिल है ।

आरएनए माध्यमिक या उच्चतर संरचना और न्यूक्लियोटाइड गतिशीलता को मैप करने के लिए एक आम वैकल्पिक दृष्टिकोण एनएमआर स्पेक्ट्रोमेट्री३९,४०है । यह दर्शाया गया है कि आरएनए गतिशीलता मात्रात्मक एनएमआर विश्लेषण से व्युत्पंन दृढ़ता से आकार गतिविधि३९के साथ सहसंबंधी बनाना । छोटे अणु बंधन के संदर्भ में, रासायनिक बदलाव perturbations21न्यूक्लियोटाइड बातचीत प्रकट कर सकते हैं ।

के रूप में आरएनए-लक्ष्यीकरण छोटे अणुओं दवा विकास11के एक नए साधन बन जाते हैं, हम कल्पना है कि आकार एक मानक पद्धति के रूप में स्थापित किया जाएगा छोटे अणुओं की उपस्थिति में लक्ष्य आरएनए के संरचनात्मक प्रभावों का मूल्यांकन । भविष्य में, आरएनए के लिए एक transcriptome व्यापक पूछताछ विधि लक्ष्यीकरण छोटे अणु दवाओं वांछित है ।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं की ।

Acknowledgments

यह काम NIH R01 ग्रांट (NS094721, K.A.J.) द्वारा संभव बनाया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNA oligonucleotide IDT gBlock for >200 bp DNA synthesis
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix Thermo Fisher F566S
NucleoSpin gel and PCR clean-up kit Takara 740609.50
MegaScript T7 transcription kit Thermo Fisher AM1333 Contains 10x reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase
DEPC-treated water Thermo Fisher 750023
2x TBE-urea sample buffer Thermo Fisher LC6876
40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) Bio-Rad 1610146
10x TBE buffer Thermo Fisher 15581044
Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit Thermo Fisher 166-0045
Kimwipe Kimberly-Clark 34133
TEMED Thermo Fisher 17919
SYBR-Safe dye Thermo Fisher S33102
6% TBE-urea mini-gel Thermo Fisher EC6865BOX
ChemiDoc Bio-Rad
T4 PNK NEB M0201S
γ-32P-ATP Perkin Elmer NEG035C005MC
Hyperscreen™ Intensifying Screen GE Healthcare RPN1669 calcium tungstate phosphor screen
phosphor storage screen Molecular Dynamics BAS-IP MS 3543 E
Amersham Typhoon GE Healthcare
NAI (2M) EMD Millipore 03-310
GlycoBlue Thermo Fisher AM9515
SuperScript IV Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18090010 Contains 5x RT buffer, SuperScript IV
dNTP mix (10 mM) Thermo Fisher R0192
ddNTP set (5 mM) Sigma GE27-2045-01
large filter paper Whatman 1001-917
Gel dryer Hoefer GD 2000
QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen 51104 Also contains RNase A and protease K
SMN2 minigene34 Addgene 72287
Heat inactivated FBS Thermo Fisher 10438026
Pen-Strep Thermo Fisher 15140122
Opti-MEM I Thermo Fisher 31985062
FuGene HD Promega E2311
TrpLE Thermo Fisher 12605010
DPBS without Ca/Mg Thermo Fisher 14190250
TRIzol Thermo Fisher 15596018
RNeasy mini column Qiagen 74104 Also contains RW1, RPE buffer
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 Contains DNase I and RDD buffer
Deionized formamide Thermo Fisher AM9342
MnCl2•4H2O Sigma-Aldrich M3634
random nonamer Sigma-Aldrich R7647
SuperScript First-Strand Synthesis System Thermo Fisher 11904-018 Contains 10x RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase
AccuPrime pfx DNA polymerse Thermo Fisher 12344024
NextSeq500 Illumina
NucAway column Thermo Fisher AM10070 for desalting purpose

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References

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इस महीने में जौव अंक १४३ लघु अणु आरएनए-लक्ष्यीकरण आरएनए संरचना इन विट्रो आकृति इन-सेल आकार रीढ़ की हड्डी में मांसपेशियों शोष आरजी-७९१६
इन विट्रो और में-सेल आकार छोटे अणु प्रेरित पूर्व mRNA संरचनात्मक परिवर्तन की जांच करने के लिए का उपयोग करना
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