Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Использование в пробирке и в клеток форму расследовать малые молекулы индуцированной пре мРНК структурные изменения

Published: January 30, 2019 doi: 10.3791/59021
Automatic Translation
1, 2, 1
1Calibr, The Scripps Research Institute, 2Department of Integrative Structural and Computational Biology, The Scripps Research Institute

Summary

Подробные протоколы для обоих в пробирке и в клеток селективного 2'-гидроксильные Ацилирование анализируемой грунтовка расширение (SHAPE) экспериментов для определения вторичную структуру пре мРНК последовательностей интерес присутствии малых молекул РНК таргетинг представленные в этой статье.

Abstract

В процессе разработки лекарственных средств малых молекул РНК таргетинг желательно изучение структурных изменений после их взаимодействия с РНК последовательности. Здесь мы предоставляем подробный в пробирке и в клеток селективного 2'-гидроксильные Ацилирование анализируемой выдвижение праймера (SHAPE) протокол для изучения структурных изменений РНК в присутствии экспериментальный препарат для спинальной мышечной атрофии (SMA), выживание двигательных нейронов (SMN)-C2 и в экзона 7 пре мРНК гена SMN2. В пробирке формы последовательности РНК 140 нуклеотидов, содержащие SMN2 экзона 7 трансляции, полимераза T7 RNA, сложить в присутствии SMN-C2 и впоследствии изменена мягкая 2'-OH Ацилирование реагент, imidazolide 2-methylnicotinic кислота (NAI). Это 2'-OH-Най adduct далее зондируемой 32P-меченых грунтовка расширение и решены путем электрофореза геля полиакриламида (страница). И наоборот Ацилирование 2'-OH-элементная формы происходит на месте с SMN-C2 связаны клеточной РНК в живых клетках. Пре мРНК последовательность экзона 7 гена SMN2, наряду с формы индуцированной мутации в выдвижение праймера, затем был усиленный PCR и при условии соблюдения следующего поколения последовательности. Сравнение двух методологий, в пробирке форма является более экономически эффективным методом и не требуют вычислительной мощности для визуализации результатов. Однако в пробирке модель формы производные РНК иногда отличается от вторичной структуры в сотовой связи, вероятно из-за потери всех взаимодействий с RNA-связывая протеинов. В клеточной формы не нужно радиоактивного материала на рабочем месте и дает более точные вторичной структуры РНК в сотовой связи. Кроме того, форма в клеток обычно применяется для большего круга РНК последовательности (~ 1000 нуклеотидов) путем использования виртуализации нового поколения, по сравнению с в пробирке формы (~ 200 нуклеотидов), которая обычно основывается на анализе страницы. В случае, если экзона 7 в SMN2 пре мРНК, полученных in vitro и в клеток форму РНК модели схожи друг с другом.

Introduction

Селективный 2'-гидроксильные Ацилирование анализируемой выдвижение праймера (SHAPE) — это метод измерения кинетики каждого нуклеотидов РНК последовательности интерес и выяснения вторичная структура единого нуклеотидом резолюция1. ФОРМУ методологии, оба в vitro условий2,3,4 (очищенная РНК в системе определенного буфера) и в живых клетках млекопитающих5,6, были разработаны для расследования на вторичном Структура средней длины РНК последовательности (обычно < 1000 нуклеотидов в ячейке фигуры и < 200 нуклеотидов в пробирке фигуры). Это особенно полезно для оценки структурных изменений в рецептор РНК после привязки к взаимодействующих РНК малые молекулы метаболиты2,4,,78 и учиться механистический действия молекул РНК ориентации во время наркотиков развития9,10.

РНК таргетинг лекарств недавно обращено внимание в научных лабораториях и в фармацевтической промышленности11,12 через различные подходы и стратегии13,14,15 ,16. Недавние примеры малых молекул РНК таргетинг для клинического использования двух структурно различных экспериментальных наркотиков, LMI-07017 и RG-791618,19, для спинальной мышечной атрофии (SMA), которые показали многообещающие результаты в фазе II клинических испытаний20. Обе молекулы были продемонстрированы цели выживания мотонейрона (SMN) 2 пре мРНК и регулировать процесс сращивания SMN2 ген6,17,21. Ранее мы продемонстрировали применение в пробирке и в клеток формы в рассмотрении целевой РНК структурных изменений в присутствии аналог RG-7916, известный как SMN-C26.

В принципе форма измеряет уровень 2'-OH Ацилирование каждого нуклеотидов РНК последовательности при наличии избыточного количества самостоятельно тушения Ацилирование реагента в непредвзято. Ацилирование реагент не является стабильным в воде, с коротким периодом полураспада (например, T1/2 = 17 s 1-метил-7-nitroisatoic ангидрид; или 1 M 7, ~ 20 мин на 2-methylnicotinic кислоты imidazolide, или Най)22 и нечувствительность к личности баз-23. Это приводит к более благоприятным Ацилирование 2'-OH-групп гибких оснований, которые могут быть преобразованы в точной оценки динамики Каждый нуклеотид. В частности нуклеотидов в паре базы обычно менее реактивно, чем один неспаренный для модификации реагента 2'-OH, Най и 1 M 7.

Глядя на источник шаблона РНК и где происходит 2'-OH ацилирование, форма обычно можно подразделить на форму in vitro и в клеток. В vitro формы использует очищенный T7 транскрипции РНК и не хватает сотовой связи в экспериментальные проекты. В-клеток форму шаблон транскрипции РНК и 2'-OH Ацилирование происходят в живых клеток; Таким образом результаты можно резюмировать структурная модель РНК в сотовой связи. В клеточной формы был передан как в естественных условиях формы для формы, в живых клетках в литературе24. Поскольку этот эксперимент выполняется не в животное, мы назвать этот эксперимент как форму в ячейке для точности.

Стратегии для этапа расширения грунт в пробирке и в клеток формы также отличаются. В пробирке форму обратной транскрипции останавливается в позиции Ацилирование 2'-OH присутствии мг2 +. Выдвижение праймера 32P-помечены таким образом появляется как группу в электрофореза геля полиакриламида (страница) и интенсивность группы пропорциональна Ацилирование скорость1. В-клеточной формы, обратная транскрипция генерирует случайные мутации в 2'-OH аддукт позиции присутствии Mn2 +. Мутационного скорость каждого нуклеотидов может быть захвачено в глубину секвенирование нового поколения, и форма реактивности в резолюции единого нуклеотидом затем может быть рассчитана.

Потенциальная проблема для фигуры в ячейке является низкое соотношение сигнал шум (то есть, большинство 2'-OH-групп неизмененным, в то время как неизмененное последовательности занимают большую часть read в последовательности следующего поколения). Недавно метод обогатить 2'-OH изменения РНК, упоминаемый как в естественных условиях щелкните ФИГУРУ (icSHAPE), был разработан в Чанг Лаборатория25. Этот метод обогащения может быть выгодным в изучении слабых малых молекул, таких как РНК взаимодействия, особенно в ходе допросов транскриптом широкий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. в Vitro форму

Примечание: Протокол изменяется от опубликованного протокола1.

  1. Подготовка шаблона РНК
    Примечание: Шаблон для транскрипции T7 было приказано как синтетическим двуцепочечной ДНК (dsDNA) и усиливается либо вставки в вектора E. coli , несет в себе уникальную пару EcoRI/BamHI эндонуклеазы, например pET28a, или методом ПЦР. Протокол для амплификации PCR иллюстрируется ниже.
    1. Смешайте следующие материалы: 50 мкл ПЦР мастер смесь (см. Таблицу материалы), 2 мкл для каждого праймера в 10 мкм (см. таблицу 1 для последовательностей), 200 нг dsDNA шаблон в 2 мкл и 3 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) и 41 мкл H2O. Алиготе в два PCR трубы (каждая трубка содержит 50 мкл реакционной смеси).
    2. Установите вверх тепловая велосипедист следующим: этап 1) 95 ° C за 30 сек; этап 2) 95 ° C в течение 20 сек; Этап 3) 56 ° C 20 s; Этап 4) 72 ° C для 20 s; этап 5) цикл обратно в сцене 2 для 30 циклов; этап 6) 72 ° C для 3 мин; и этап 7) бесконечные держат при температуре 4 ° C до следующего шага.
    3. Очищать Ампликон ПЦР путем извлечения фрагментов геля (см. Таблицу материалов и использовать протокол изготовителя). Элюировать ДНК продукт с 35 мкл буфера Tris-ЭДТА (TE), содержащий 10 мм трис (рН 8.0) и 1 мм ЭДТА, приносить 0,1 – 0,5 мкг/мкл шаблон. Нормализовать очищенная ДНК шаблон в 0.10 мкг/мкл.
      Примечание: При необходимости качество шаблона могут быть проанализированы на 1,8% геля агарозы с 0.10 мкг ДНК. Ожидается, что на геле однодиапазонный ДНК нужный шаблон.
    4. Настройка реакции транскрипции T7 (общий объем 40 мкл), добавив следующие материалы в ПЦР-пробирку: 4 мкл 10 x буфер реакции, 4 мкл АТФ, 4 мкл CTP, 4 мкл ГТФ, 4 мкл UTP, 4 мкл T7 фермента (см. Таблицу материалы) , 4 мкл очищенный Ампликон ПЦР из шага 1.1.3 (0,4 мкг) и 12 мкл диэтиловым pyrocarbonate (DEPC)-очищенной воды. Смешайте закупорить вверх и вниз 4 x. Инкубируйте при 37 ° C для 4 – 16 h в тепловая велосипедист или инкубатора 37 ° C.
      Примечание: Начните, чтобы настроить шаг 1.1.6, в то время как реакция на шаге 1.1.4 продолжается.
    5. Добавить 2 мкл DNase, смешивать, закупорить вверх и вниз 4 x и инкубировать при 37 ° C на 15 мин микс с равным объемом 2 x трис Борат ЭДТА (КЭ)-буфер образца мочевины (см. Таблицу материалы). Тепло при 70 ° C на 3 мин для инактивации.
    6. В РНКазы бесплатная бутылка, Смешайте 75 мл 40% раствора акриламида/bisacrylamide (29: 1, смотрите Таблицу материалы), 180.2 г мочевины и 50 мл 10 x TBE буфера (РНКазы бесплатно, см. Таблицу материалы). Положить бутылку на орбитальный шейкер (250 об/мин), до тех пор, пока растворяются все кристаллы мочевины (может занять до 2 ч). Отрегулируйте громкость до 500 мл с DEPC-лечение водой. Фильтр решение с мембраной 0.2 мкм (см. Таблицу материалы).
      Примечание: В этом процессе, Избегайте использования зеркального и перемешать бар для предотвращения загрязнения РНКазы. Раствор может храниться при температуре 4 ° C на срок до 1 года.
    7. Очистить два электрофорез стеклянные пластины надлежащего размера (16,5 см х 24 см) с дейонизированной водой и 70% EtOH, используя кусок Протирочная бумага. Совместите пластины с парой распорки 2,0 мм (плита с поверхностью силицированного лицом внутрь) и уплотнить пластин с лентой. Двухместный лента угол пластины для предотвращения утечки.
    8. В стакан смешать 200 мл раствора акриламида с шагом 1.1.6, 2.0 мл 10% раствора Аммония персульфат и 100 мкл tetramethylethylenediamine (TEMED) с наконечником свободный РНКазы пипеткой путем смешивания быстро 30 s. наклона пластины на кусок крышки benchtop и залить решение от разрыв пластин. Нажмите пластину поднять любые пузыри и заложить плашмя на крышке benchtop пластину. Сразу вставить гребень и пусть гель полимеризоваться для по крайней мере 1 час.
      Примечание: Если гель будет использоваться в течение следующего дня, крышка в верхней части гель с куском влажной салфеткой и обернуть с больше кусок полиэтиленовой пленкой. Поместите его лежа плашмя на 4 ° C.
    9. Удалите ленту и зажима плиты электрофореза позицию. Снимите гребень и добавьте достаточное 1 x TBE буфер в верхней и нижней части водохранилища. Предварительно запустить гель для 30 минут 20 Вт.
      Примечание: При необходимости если содержание желаемых РНК ~ 90% или более, Мини-гель может использоваться взамен препаративные геля.
    10. Мыть каждый из скважин загрузки, закупорить вверх и вниз дважды с жидкости в резервуаре. Добавьте сырой РНК из шага 1.1.5 в скважины. Побегите гель на 20 Вт до тех пор, пока краска cyanol FF ксилола (светло-голубой) проходит примерно две трети длины гель (~ 60 мин).
      Примечание: Обеспечить, чтобы загрузить не более чем одной трети высоты также (при необходимости используйте несколько скважин).
    11. Погружать гель в 1 x TBE буфер с мэм разрежения безопасной краски (см. Таблицу материалы) в контейнере достаточно большой для геля. Поместите контейнер на орбитальный шейкер для 5 мин на 80 об/мин.
    12. Под УФ света определить нужный диапазон РНК и быстро вырезать тонкой полоске геля, используя чистые лезвия бритвы. Место 1-2 ломтика гель в 1,7 мл трубку.
    13. Восстановить РНК от среза геля, пассивной элюции. Добавить смесь адекватные элюции/осадков (~0.3 мл на ломтик) к каждой пробке: 0.3 M NaOAc (рН 5.2), 2,5 M LiCl, ЭДТА 1 мм, 0,1% лаурилсульфат натрия (SDS) в DEPC-лечение водой. Поворачивайте трубку, содержащую гель splice(s) на 4 ° C на 16 h.
      Примечание: Типичная восстановления составляет ~ 75% в этом шаге. Для увеличения урожайности, удалите и собирать элюента и добавьте такой же объем Элюирующий буфер, а затем повторите этот шаг.
    14. Объединить элюента в новой 1,7 мл трубки. Добавьте 2.5 x ледяной EtOH, инвертировать трубы шесть раз смешивать жидкости и трубы на-80 ° C для по крайней мере 1 час.
    15. Центрифуги для 10 мин на 10000 x g и 4 ° C. Тщательно удалите супернатант, закупорить. Помыть лепешка РНК путем добавления 80% EtOH (1 мл на трубы), вихрь для 15 s и центрифуги для 10 мин на 10000 x g и 4 ° C.
    16. Удалить супернатант и просушите РНК Пелле за 5 минут добавьте 50 мкл РНКазы свободной воды и перемешать, закупорить вверх и вниз по 10 раз. Нормализации концентрации РНК до 0,10 мкг/мкл. Хранить очищенную РНК-80 ° c.
      Примечание: Не чрезмерно сухие гранулы РНК.
    17. При необходимости, для анализа качества РНК, разбавьте 1 мкл (100 нг) РНК от шага 1.1.16 в 5 мкл воды и перемешать с 5 мкл буфера выборки КЭ мочевина 2 x. Затем тепла при 70 ° C 3 мин и нагрузки на 6% КЭ мочевина мини-гель.
      1. Запустите гель на 180 V на 1 ч. выполнение окрашивание как сделано в шаге 1.1.11. Визуализируйте гель с УФ в систему обработки изображений. Одно-диапазонная ожидается на нужной длины.
  2. Подготовка 32P-меченых грунтовка
    1. Настройка реакции, смешивая следующие материалы: 10 мкл γ -32P-АТФ (~1.5 mCi, ~ 25 мкм, см. Таблицу материалы), 2 мкл обратной транскрипции (RT) праймера (100 мкм, для последовательности см. таблицу 1), 2 мкл 10 x T4 полинуклеотид киназы (ПНК) реакция буфера, 1 мкл T4 PNK (см. Таблицу материалы) и 5 мкл РНКазы свободной воды. Инкубируйте при 37 ° C в течение 1 ч.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Надлежащая защита необходима шаги 1.2-1.5 в уполномоченных на рабочем месте для радиоактивных материалов.
    2. Инактивирует тепла для 20 мин на 65 ° C. Добавьте образцы на ЭЛОУ столбца и центрифуги на 1000 x g за 1 мин смешать элюента с 25 мкл пример буфера 2 x TBE-мочевина. .
      Примечание: Храните меткой сырой продукт при-20 ° C, если это не для того, чтобы быть очищены сразу же.
    3. Побегите гель акриламида 10% на 20 Вт на 1 ч.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Загрузить 32P-меченых грунт из шаг 1.2.1 на гель и избежать кровотечения радиоактивности в верхнем водохранилище. Не загружайте более чем одной трети высоты также обеспечить тонкой полоске на геле (при необходимости используйте несколько скважин). Жидкости в резервуаре дно может быть высоко радиоактивных.
    4. Удаление стекла кассеты гель и выложить гель на кусок полиэтиленовой пленкой. Сложите полиэтиленовой пленкой для покрытия верхней части геля сделать герметичный бутерброд. Поместите гель сэндвич на экране светомассы вольфрамат кальция и разоблачить изображений инструмент. Изображения геля снова с регулярные свет, чтобы знать, где находятся по краям геля.
    5. Использование программного обеспечения для обработки изображения для наложения двух изображений. Выровняйте геля на отпечатанного изображения. Используйте свежие лезвия бритвы вырезать нужную полос из геля. Место 1 до 2 гель ломтики в 1,7 мл трубку.
      Примечание: Убедитесь, что изображение имеет тот же размер, как фактическое геля. Дважды проверьте выравнивание изображения остатки геля снова после вырезания фрагментов геля.
    6. Восстановите 32P-меченых грунт, выполните шаги 1.1.13 для 1.1.16. Возьмите 1.0 мкл раствора в 0,4 мл трубку и размыть грунт с 1 x TE буфер для получения радиоактивности 1.0 мкл на ~ 100000 cpm. Храните очищенную 32P-меченых грунт-80 ° c до РНК реакции модификации 2'-OH, но не более чем 4 недели.
  3. Малые молекулы привязки и модификация 2'-OH РНК
    1. Подготовить четыре образца, добавьте 8 пмоль РНК в 32 мкл 0.5 x TE буфера до 1,7 мл трубки, тепла при 80 ° C в течение 2 мин и оснастки прохладно на льду, по крайней мере 1 мин.
      Примечание: Используйте следующее уравнение для расчета приблизительный вес молекулярного РНК: MW = (# баз) x 340 да.
    2. Добавьте 8 мкл 5 x складывания смесь, содержащая 500 мм HEPES (рН 8,0), 20 мм MgCl2и 500 мм NaCl. Аликвота 9 мкл РНК смеси в каждой из четырех ПЦР пробирок и маркировать их #1-#4. Добавить 1 мкл 10% ДМСО в #1 трубку, 1 мкл концентрированного малые молекулы раствора (10% ДМСО) в #2, 1 мкл разбавленного малые молекулы раствора (10% ДМСО) в #3 и 1 мкл воды в #4.
    3. Инкубируйте ПЦР трубы при 37 ° C в тепловой циклователь на 30 мин.
    4. Прямо перед реакции модификации 2'-OH развести 1 мкл Най Стоковый раствор (2 М) с 3 мкл DEPC-лечение водой для получения рабочего решения 0,5 М. Без промедления добавьте 1 мкл рабочего раствора в пробирки #1, #2 и #3 Най и 1 мкл 25% ДМСО в #4. Инкубируйте при 37 ° C в тепловой циклователь на 15 мин.
    5. Добавьте 100 мкл элюции/осадков смеси (см. шаг 1.1.13 рецепт), 2 мкл гликогена (15 мг/мл) и передавать все жидкости в каждую ПЦР-пробирку в 1,7 мл трубку. Добавьте 0.34 мл ледяной 200-доказательство EtOH (3 x объем) в каждую пробирку. Микс на vortexing для 5 s и место трубы в морозильной камере-80 ° C для по крайней мере 1 час.
      Примечание: В этот период приступайте к настройке последовательности гель для использования в шаг 1.5.1.
    6. Центрифуги для 15 мин при 14.000 x g и 4 ° C. Удалите супернатант не нарушая Пелле РНК. Помыть лепешка РНК путем добавления 80% EtOH (0,5 мл на трубы), вихрь для 15 s и центрифуги для 15 мин на 20000 x g и 4 ° C. Снова удалите супернатант.
      Примечание: При необходимости используйте Гейгера, чтобы радиоактивные Пелле, сохраняя в трубе.
    7. Просушите РНК Пелле за 5 минут добавить 9 мкл РНКазы свободной воды и перемешать, закупорить вверх и вниз по 10 раз.
      Примечание: Не чрезмерно сухие гранулы РНК. Ожидается, что быть распущен в конце этого шага все осадков.
  4. Расширение подготовки и грунтовка маркер
    1. Перенесите изменение РНК в 4 новые трубы ПЦР и маркировать их #1-#4 как ранее. Добавить 2 пмоль управления РНК в 7 мкл воды DEPC-лечение 4 дополнительные ПЦР-пробирки и маркировать их #5 – 8. Добавьте 2 мкл radiolabeled праймера (шаг 1.2.6) всех восьми трубок. Тепло для отжига при 65 ° C за 5 мин, затем Остудите до 4 ° C в тепловая велосипедист.
    2. Добавить 4 мкл 5 x RT буфера (см. Таблицу материалы), 1 мкл Дитиотреитол (DTT, 0.1 М) и 1 мкл dNTP смеси (по 10 мм) для каждого из восьми трубок ПЦР.
    3. Добавьте 2 мкл DEPC-лечение H2O трубы #1-#4. Добавьте 4 мкл ddATP (5 мм), 4 мкл ddTTP (5 мм) и 4 мкл ddCTP (5 мм) в пробирки #5 – 7, соответственно. Добавьте 1 мкл ddGTP (5 мм) и 3 мкл воды DEPC-лечение трубки #8. Пипетка четыре раза смешивать.
    4. Тепло на 52 ° C в течение 1 мин в тепловая велосипедист. Добавить 1 мкл обратной транскриптазы (см. Таблицу материалы), затем смешайте закупорить вверх и вниз четыре раза. Инкубируйте реакции на 52 ° C в течение 20 мин.
    5. Добавьте 1 мкл 5 M NaOH в каждой из трубок для гидролизуют РНК. Тепловые трубы на 95 ° C за 5 мин.
    6. Добавить 5 мкл 1 M HCl и повторить этанола осадков (шаги 1.3.5 и 1.3.6), за исключением опустить гликогена и перекачки жидкостей.
      Примечание: Если результаты шага 1.4.6 размывания региона в середине гель, известный как «соль фронт».
    7. Просушите ДНК Пелле за 5 минут добавить 10 мкл H2O и 10 мкл 2 x TBE-мочевина образец загрузки буфера и пипетки вверх и вниз по 10 раз, чтобы растворяться. Тепла при 70 ° C за 5 минут место трубы на льду перед загрузкой на геле.
  5. Анализ страницы
    1. Для приготовления геля полиакриламида 8% последовательности, выполните шаги 1.1.6 для 1.1.10 со следующими изменениями: используйте 100 мл 40% раствора акриламида/bisacrylamide (29: 1) подготовить 8% раствор акриламида и секвенирования гель стеклянные пластины (например, 46 x 57 см) с распоркой 0,4 мм.
    2. Загрузка 10 мкл пример из шага 1.4.7. Побегите гель на 65 Вт для 2 ч или до нижней краска достигает 3/4 геля.
      Примечание: Храните остальные образцов-80 ° C для повторения, при необходимости.
    3. Удаление Топ силицированного стеклянной пластиной, удалив распорка и аккуратно вставляя шпателем. Поместите кусок большой фильтр-бумаги для покрытия гель и аккуратно нажмите Разрешить гель присоединиться к фильтровальной бумаги. Начиная с нижнего конца, поднимите фильтровальная бумага и удалить гель из стеклянной пластины вместе.
    4. Поместите гель вместе с фильтровальной бумаги на кусок полиэтиленовой пленкой, достаточно большой, чтобы покрыть весь гель (фильтровальной бумаги вверх). Фильтр бумага/гель/пластик оберните сэндвич передать Гель осушитель с фильтровальной бумаги лицевой стороной вниз.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Чтобы избежать радиоактивного материала, использовать 3-4 больше частей больших фильтровальной бумаги между сэндвич гель и Гель осушитель.
    5. Сухие гель при 70 ° C для 1 h с вакуумом. Перевести гель сэндвич на кассету экрана хранения фото отбеленная фосфора. Разоблачить радиоактивности геля на экран для 4 – 16 ч.
    6. Место на экране хранения люминофора на изображений устройства и сканирования со средним разрешением (~ 30 мин).
      Примечание: Если на изображении гель улыбка как артефакт, используйте исправление программного обеспечения (например, Сафа) для обработки изображения в публикуемые качество. Имейте в виду, что стандартный маркер Лейн — 1 нуклеотидов дольше, чем 2'-OH модификации полос.

2. в клетки форму

  1. Конструкция праймера
    Примечание: В отличие от в пробирке форма форма в клеток не нужно создавать выражение кассеты. Однако, набор оптимальных грунт должен использоваться и должны быть оценены до формы эксперимент.
    1. Создайте по крайней мере три уникальных грунтовка пар, взрыв based праймер дизайн инструмента (например, грунт-взрыв). Для изучения пре мРНК в клетках человека, выберите генома человека (не транскриптом) в качестве справочной базы данных в параметры проверки грунтовка пара специфика. Выберите размер ампликон в диапазоне 200 – 1000-пары (bp).
    2. Извлечение геномной ДНК из ~ 106 клеток интерес с спин метод на основе столбцов с лечением РНКазы A и протеаза K (см. Таблицу материалов и использовать протокол изготовителя). Нормализовать очищенного геномной ДНК в 0,1 мкг/мкл буфера TE.
    3. ПЦР с протоколом испытание в шагах 1.1.1 и 1.1.2.
      Примечание: Набор желаемых грунт должен принести однодиапазонный на 1,8% агарозном геле.
  2. Подготовка и модификация 2'-OH
    Примечание: Для увеличения изобилия пре мРНК интерес, minigene с правильной последовательности под цитомегаловирусом (CMV) промоутер для составных выражений является transfected в клетки хозяина.
    1. Предварительно теплой питательной среды, содержащие 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1 x антибиотик смесь в Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) при 37 ° C. Семя 293T клеток на 50% confluency за 24 часа до трансфекции в культурной среде. Изменения среды в 2% FBS в среде DMEM без антибиотиков ~ 1 ч до transfection.
    2. Добавьте 10 мкг minigene плазмид в 100 мкл сокращение сыворотке СМИ (см. Таблицу материалы) в 1 о 96-луночных пластины хорошо. Пипетка решение вверх и вниз четыре раза, чтобы перемешать.
    3. Добавить 40 мкл Реагента трансфекции (см. Таблицу материалы) в 100 мкл сокращение сыворотке СМИ в другой хорошо пластины. Пипетка вверх и вниз четыре раза, чтобы перемешать. Инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин.
    4. Добавьте решение всего плазмида в трансфекции реагент подвеска. Пипетка вверх и вниз четыре раза, чтобы перемешать. Инкубации при комнатной температуре за 30 мин.
    5. Добавьте все ДНК / смеси реагентов трансфекции прикапывают на поверхности среды на протяжении всего блюдо. Инкубируйте при 37 ° C для 6 – 12 ч.
    6. Аспирационная среднего и аккуратно мыть раз с 5 мл фосфат амортизированное saline (PBS, рН 7,4, без CaCl2 и MgCl2, см. Таблицу материалы). Trypsinize клетки с 3 мл раствора трипсина. Инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин.
    7. Стук блюдо осторожно отделить клетки из нижней части блюдо. Нейтрализовать трипсина с 6 мл питательной среды. Центрифуга на 300 x g 4 мин и удалить носитель.
    8. Ресуспензируйте ~ 106 клеток для каждого образца в 199 мкл реакция среды (1% FBS в среде DMEM) и переноса суспензию клеток в 96-луночных плиту. Инкубировать клетки с 1 мкл составного рабочего раствора или 1 мкл ДМСО в всех трех элементов управления для 30 минут при 37 ° C.
      Примечание: Три контрольных образцов должны быть включены: управления ДМСО с Най, денатурированной РНК с Най и Най отрицательного контроля.
    9. Добавьте 10 мкл 2 м NAI для каждого образца, за исключением денатурируя управления (DC) РНК и Най негативные элементы. Пипетка вверх и вниз четыре раза, чтобы перемешать. Инкубируйте при 37 ° C на 15 мин осторожно встряхните пластины вновь приостановить клетки каждые 5 мин.
    10. Переход клеток в 1,7 мл трубки и центрифуги на 400 x g на 2 мин без промедления. Удалите супернатант не нарушая Пелле ячейки.
    11. Добавить 0,4 мл Гуанидиновые тиоцианат (см. Таблицу материалы). Вихрь для 15 s для гомогенизации. Проинкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 5 мин.
      Примечание: Образцы можно хранить при температуре-20 ° C до перехода к следующему шагу.
  3. Извлечение RNA
    1. Добавьте 0,2 мл хлороформа для каждого из образцов тиоцианат гомогенизированные Гуанидиновые. Вихрь для 15 s. инкубировать при комнатной температуре на 2 мин.
    2. Центрифуги для 5 мин в 12000 x g и 4 ° C. Топ бесцветный водный слой содержит РНК. Трансфер ~ 380 мкл водный раствор в новой 1,7 мл трубку.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Не беспокоить интерфаза чтобы избежать загрязнения.
    3. Добавить 1,5 x тома EtOH (~ 570 мкл). Вихрь для 15 s смешивать.
    4. Передача 600 мкл РНК смеси в столбец спин изоляции РНК (см. Таблицу материалы). Центрифуга на 12000 x g для 15 s. отменить элюента. Повторите этот шаг, чтобы пройти через все жидкости в один и тот же столбец спина.
    5. Промойте колонку с 0,35 мл RW1 буфера (см. Таблицу материалы), крутя за 15 с. Добавить 80 мкл бесплатно РНКазы DNase RDD буфера (см. Таблицу материалы). Инкубации при комнатной температуре в течение 20 мин.
      Примечание: Важно, чтобы удалить все загрязнения ДНК.
    6. Затем промойте колонку с 0,35 мл RW1 буфера и 0,6 мл 2 x RPE буфера (см. Таблицу материалы), спиннинг для 15 s на каждом шагу. Сухие столбце центрифугированием столбце спин с пустой коллекции трубки на 12000 x g за 1 мин.
    7. Добавление 32 мкл РНКазы свободной воды в центр столбца. Инкубировать 1 мин центрифуги на 12000 x g 30 s для получения ~ 30 мкл раствора очищенный РНК. Поместите образцы при-20 ° C при обработке денатурированного образца.
  4. Денатурированной РНК управления подготовка
    1. Место 30 мкл пример РНК для DC в 1,7 мл пластиковых труб на льду. Добавьте 50 мкл формамида и 15 мкл DC буфер, содержащий 300 мм HEPES (рН 8.0) и 25 мм ЭДТА в трубу.
    2. Тепла, чтобы денатурировать РНК на 95 ° C в течение 1 мин быстро добавить 5 мкл Най Стоковый раствор (2 М), а затем проведите дважды, чтобы смешивать и положил трубку обратно на Отопление блока. Инкубируйте на 95 ° C для дополнительного 1 мин, а затем сразу же положил трубку на льду.
    3. Добавьте 0,4 мл тиоцианат Гуанидиновые. Повторите шаги 2.3.1–2.3.4.
    4. Промойте колонку с 0,6 мл 2 x RPE буфера (см. Таблицу материалы), спиннинг для 15 s на каждом шагу. Сухие столбце центрифугированием столбце спин с пустой коллекции трубки на 12000 x g за 1 мин.
    5. Добавление 32 мкл РНКазы свободной воды в центр столбца. Инкубировать 1 мин центрифуги на 12000 x g 30 s для получения ~ 30 мкл раствора восстановить DC РНК.
  5. Выдвижение праймера
    1. Нормализовать раствор РНК из 2.3.7 и 2.4.5 в 0,5 мкг/мкл с РНКазы свободной воды. Свеже Подготовьте 30 мм НКД2 решения от НКД2∙4H2O порошок.
    2. Перевести 9 мкл раствора РНК для каждого образца в полосу ПЦР. Добавьте 1 мкл dNTP 10 мм и 1 мкл 2 мкм ген специфического праймера (ВСП) в каждой тюбике. Пипетка вверх и вниз четыре раза, чтобы перемешать. Инкубируйте на 65 ° C за 5 мин в тепловая велосипедист и положить на льду > 1 мин.
      Примечание: Кроме того 1 мкл случайных nonamer может использоваться в замене ВСП.
    3. В каждую ПЦР-пробирку добавить смесь 2 мкл 10 x буфер RT (см. Таблицу материалы), 4 мкл НКД 30 мм2, и 2 мкл, 100 мм DTT. Пипетка вверх и вниз 4 x смешивать. Инкубируйте на 42 ° C на 2 мин.
    4. Добавить 1 мкл обратной транскриптазы (см. Таблицу материалы). Пипетка вверх и вниз 4 x смешивать. Инкубируйте на 42 ° C в тепловой циклователь на 3 ч.
  6. Подготовка библиотеки и секвенирование нового поколения
    1. Настройка реакции PCR, добавив 1 мкл ДНК-полимеразы, 5 мкл 10 x буфер ДНК-полимеразы (см. Таблицу материалы), 2 мкл ДМСО, 1,5 мкл для каждого из грунтовки (10 мкм), 34 мкл H2O и 5 мкл cDNA от шага 2.5.4.
    2. Установите вверх тепловая велосипедист следующим: этап 1) 95 ° C на 2 мин; этап 2) 95 ° C за 30 сек; Этап 3) 60 ° C за 30 сек; Этап 4) 68 ° C за 30 сек; этап 5) цикл обратно в сцене 2 для 30 циклов; этап 6) 68 ° C 3 мин; и этап 7) бесконечные держат при температуре 4 ° C до следующего шага.
    3. Ампликон очищают с помощью геля агарозы 1,8%.
      Примечание: ПЦР группы должен появиться как одной полосы на геле.
    4. Постройте библиотеку с помощью стандартных фрагментации и перевязка методы, определенные в литературе6,26.
    5. За образец считывает последовательность на секвенирование нового поколения оборудования с помощью 1 x 75 сингл конца читает для создания примерно 10 миллионов.
    6. Анализировать результаты, используя ShapeMapper и SuperFold программное обеспечение пакеты, разработанные в недели группа26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы ранее показало, что РНК сплайсинга модулятор, SMN-C2, взаимодействует с AGGAAG мотив на экзона 7 SMN2 ген пре мРНК и использовать форму для оценки структурных изменений РНК в присутствии SMN-C26. Привязка сайта SMN-C2 отличается от FDA утвержденных антисмысловых олигонуклеотидов (АСО) для SMA, nusinersen, который связывает и блокирует intronic сращивания глушителя (МКС) Интрон 727,28 (рис. 1A). Наиболее известные сплайсинга регуляторы SMN2 экзона 7 находятся в диапазоне ~ 100 нуклеотидов экзона 7 в пре мРНК29; Таким образом, 140 и 276 РНК нуклеотидов длинные последовательности были использованы для фигуры, в пробирке и в клеток, репрезентивно, который охватывает экзона 7 и прилегающих Интрон региона (рис. 1A).

В этот представитель в пробирке анализ формы последовательности РНК интерес внедряется в оптимизированный кассеты, разработанный лабораторией недели, которая подходит для большинства РНК последовательности1. Иногда последовательность интереса взаимодействует или мешает этой кассеты. В таких случаях изменение кассета может использоваться со следующими тремя характеристиками: i) 3'-конце привязки сайт конкретных грунт с более эффективным гибридизации сродство для грунтовки чем любой частью последовательности РНК, ii) петлю высокоструктурированных шпильки Расположенный прямо вверх по течению от сайт связывания праймера, который покажет конкретные и воспроизводимость формы сигнала (это будет выступать в качестве как внутреннего контроля для эксперимента и метод для выравнивания сигнал от эксперимента к эксперимент) и iii) 5'-конце структура элемент, который указывает конец формы сигнала. Кассетные формы дальнейшего бокам с самостоятельной раскалывание рибозима последовательности на оба 5'- и 3'-концы для того чтобы сформировать однородный РНК30. Мы обнаружили, что молот и гепатит Дельта вирус рибозимы совместимы форма кассету и обычно дают высокодоходных желаемого РНК. Результирующий шаблон РНК имеет 3'-конец 2', 3'-циклических фосфата и 5'-конце гидроксильной группы, которые не мешают выдвижение праймера. 140-нуклеозидные длинная последовательность охватывающих экзона 7 SMN2 и прилегающие области в пре мРНК был синтезирован в форму и рибозима кассеты, как показано на схеме 1.

В общем последовательность интереса лигируют в кассету выражение должно быть достаточно долго, для покрытия потенциальных среднего или высшего порядка структуры. В случае SMN2 экзона 7 140-нуклеотида региона содержит два ствола петля структуры6,-31. Структура области интереса варьируется-от индивидуальной и должны оцениваться путем проб и ошибок.

Секвенирование геля полиакриламида с 32P-меченых грунтовка расширение продуктов был выбран визуализировать в vitro форме профиля в этот представитель эксперимента. Альтернативные визуализации метод заключается в использовании капиллярного электрофореза с дневно обозначенные грунтовка ДНК32. В последовательности гелях полиакриламида ~ 20 нуклеозидов вблизи 5'-конце и ~ 10 нуклеотидов около 3'-конце РНК последовательности интерес не быть визуализированы количественно, из-за иногда останавливается на действия инициации обратной транскрипции и интенсивной полосы на странице гели для полнометражных стенограммы1.

Альтернативный способ для восстановления препаративные гель РНК шаблона (шаги 1.1.6 для 1.1.12) является перегрузка мини-гель, если урожайность нужный шаблон РНК-> 90%. Рекомендуется удалить избыток NTP из РНК продукта обессоливания столбце и элюирующие РНК в 50 мкл буфера TE. Измерение концентрации РНК и загрузить 5,0 мкг в каждую лунку. Во время очистки шаг T7 транскрипции РНК шаблон, остановить страницы, когда ксилол cyanol FF красителя (голубой) прошли две трети 6% денатурированного КЭ мочевина гель. Self расщепление фрагмент РНК (< 80 нуклеозидов) прошли через гель, который оставил желаемого РНК как единственной крупной группы в гель после окрашивания (Рисунок 1B).

SMN-C2 (рис. 1 c) был синтезирован согласно опубликованным процедуры33 и растворяют в 10 мм ДМСО Стоковый раствор. Стоковый раствор далее разводят в 500 и 50 мкм в 10% ДМСО решения для достижения окончательного концентрации 50 и 5 мкм, соответственно. Snap охлаждением РНК сложил его стадии равновесия в присутствии ДМСО или SMN-C2 в течение 30 минут при 37 ° C. Длиннее время инкубации не изменились итоги эксперимента. Два экспериментальных образцов (50 и 5 мкм SMN-C2), два контролирует (ДМСО и Най контроль), и четыре маркеры (A, T, G, C) обращаются за выдвижение праймера. После разоблачения гель экран хранения люминофора, покажет успешный эксперимент форме: i один и наиболее интенсивный полоса в верхней части гель и ii) полосы на протяжении геля на единого нуклеотидом резолюции без мазка (рис. 1 d). Общей проблемой в анализ страницы является, что мазок региона, известного как «соль фронт» может появиться в середине гель (Рисунок 1E). Это, вероятно, из-за высокой концентрации соли, ДМСО, или другие нежелательные вещества в образце загрузки, которые могут быть удалены высыпанием этанола.

В в vitro форму, чистый шаблон РНК является ключевым для успешного эксперимента. Нечистый РНК шаблон обычно является причиной нежелательных результатов. Если страница анализ ясно показывает шаблон 2 набора маркеров, он указывает, что шаблон РНК не является однородной и нуждается в repurified по подготовке КЭ мочевина гель.

В ячейке фигуры ключ к успешный эксперимент заключается в разработке набор оптимизированных грунтовка для амплификации. С 0.10 мкг геномной ДНК бесплатный шаблон cDNA одной полосы должны соблюдаться в течение 25 циклов PCR анализа геля агарозы. Поэтому следует избегать повторяющихся Интрон последовательности. Для изучения структурных был испытан воздействия SMN-C2 на SMN2 пре мРНК, три грунтовка наборы (Таблица 2), и все они были удовлетворительными (рисунок 2A).

Низкая копирования, количество целевых РНК последовательности как правило является проблемой для фигуры в ячейке. Чтобы обогатить РНК интерес, minigene, который содержит последовательность РНК интерес под сильный промоутер ЦМВ был transfected в 293T клетки. Потому что SMN2 minigene сплайсинга структура повторяет что эндогенного SMN2, с или без SMN-C219,34, мы предполагаем, что структура SMN-C2 взаимодействующих РНК в гиперэкспрессия SMN2 пре мРНК скорее всего сделано так же, как эндогенные гена продукт. Хотя в ЕС50 SMN-C3 в сплайсинга assay ~0.1 мкм6,19, концентрация на более высоком конце (20 мкм) был использован для обеспечения состояние привязки и малых молекул РНК последовательности.

После изоляции RNA как ген специфического, так и случайных праймеров может использоваться для расширения. В случае экзона 7 SMN2 мы обнаружили, что SMN2E7-338-RV (Таблица 2) дает копию выше желаемого cDNA чем случайных nonamer, подтверждается более интенсивным группы в амплификации PCR с набором грунтовка SMN2E7-276 (Таблица 2) после 25 циклов. На шаге 2'-OH модификации 91 мкм конечная концентрация Най был использован для инкубационный период 15 мин. Если используется тип разные ячейки или средний, время инкубации должен быть повторно оптимизации. Если время инкубации слишком долго, анализ геля агарозы amplicon иногда не Показать группы.

Python основе программа, ShapeMapper, разработанная в недели, Лаборатория35 использовался для анализа данных, генерируемых следующего поколения секвенирования [для необработанных данных SMN-C2 лечение в клеточной формы SMN2 экзона 7 пре мРНК, обратитесь к последовательности чтения Архив (SRA) [база данных]. На протяжении всего ампликонами, форма реактивности существенно не изменилось (> 1), который указал, что вторичная структура остается в присутствии SMN-C2 (Рисунок 2Б). Это также подтверждается участки дуги, порожденных SuperFold35. Линии связи указывают на возможные низкопробный спаривать, основанный на форму деятельности каждого нуклеотидов. SMN-C2 и ДМСО пропитанная РНК-моделирование является по существу же (рис. 2 c). Дифференциальный в клеточной формы реактивности была рассчитана для каждой нуклеотидов (рис. 2B), и произошло большинство изменение реактивности на TSL-1 (5'-конец экзона 7), но не TSL-2 (3'-конец экзона 7). Этот результат соглашается с в пробирке форму; Хотя, низкопробный спаривать смещается от в пробирке РНК формы моделирования в форме в клеток анализирует (Рисунок 2D).

Общей проблемой в ячейке фигуры является уровень низкий мутации на протяжении amplicon. Обычно это происходит из-за загрязнения геномной ДНК. ДНК не содержат 2'-OH группы; Таким образом продукт не Ацилирование формируется с Най. Таким образом амплификации PCR просто отражает уровень низкий мутации ДНК полимеразы. Изоляция РНК по Гуанидиновые тиоцианат, следуют по столбцу DNase пищеварение достаточно, чтобы удалить все ДНК в большинстве случаев. Если загрязнение ДНК сохраняется, повторите шаг 2.3 для изоляции РНК.

Scheme 1
Схема 1: последовательность ДНК для шаблона транскрипции РНК. 12 bp последовательность в пределах последовательности рибозима Hammerhead вирус в красный цвет является обратный дополнением первых 12 bp 5'-кассеты. РНК последовательности интерес, представленные здесь составляет 140 bp пре мРНК последовательность содержит экзона 7 человека SMN2 ген. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 1
Рисунок 1: Экспериментальный дизайн и результат в пробирке формы для SMN2 экзона 7 пре мРНК присутствии SMN-C2. (A) Обзор последовательность интереса для исследования in vitro и в клеток форму SMN2 ген. SMN-C2 привязывается к AGGAAG мотив на экзона 7, собственный местоположение из nusinersen привязки сайта. (B) очистки продукта транскрипции T7. Каждый из трех полос движения содержит 5,0 мкг сырой РНК. КЭ мочевина гель был окрашенных с SYBR-Safe (1:10, 000) для 5 минут в 1 x TBE буфера. Красный пунктирный прямоугольник указывает на краю обрезания для восстановления РНК. (C) структура SMN-C2. (D) In vitro форму эксперимент с Най и 140 нуклеотида Лонг РНК шаблон, содержащий экзона 7. 1 = ДМСО; 2 = SMN-C2 (50 МКМ); 3 = SMN-C2 (5 МКМ); 4 = отсутствует Най; 5-8 = лестницы, порожденных Добавление ddATP, ddTTP, ddCTP и ddGTP во время выдвижение праймера. СТРАНИЦА была проведена вне на КЭ мочевина последовательности гель 60 W для 3 h. красной звездочки показывают увеличение группа интенсивности с 50 мкм SMN-C26. (E) пример «соль фронт» региона в пунктирной красной коробке из отдельного эксперимент. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: ФОРМА в клеток, полученных РНК моделирования для SMN2 экзона 7 пре мРНК. (A) ПЦР амплификации со всеми тремя грунтовка (Таблица 2) принесли однодиапазонный анализа геля агарозы. 1 = SMN2E7-338, 2 = SMNE7-276, 3 = SMN2E7-251, 4 = лестница ДНК. (B) дифференциальной в клеточной формы реактивности в SMN2 293T minigene-transfected клеток для 10 мкм SMN-C2 и ДМСО в TSL1. Реактивности в форме единого нуклеотидом разрешением. Его стандартное отклонение рассчитывалась путем программного обеспечения ShapeMapper35. Зеленые звездочки показывают значительное изменение реактивности формы, индуцированных 10 мкм SMN-C2. Нумерация нуклеотидов в 276 ампликон bp, показан на x-оси. Планки погрешностей оценивались по форме-Mapper программного обеспечения26. (C) участок дуги, порожденных SuperFold35 для наиболее правдоподобной вторичной структуры РНК, моделирование данных в ячейке фигуры. (D) In vitro и в клеток направлен форму моделирование экзона 7 и прилегающих регионов. В пробирке РНК модели формы, стабилизации кассеты (оранжевый) и нуклеотидов (синий) 1-19 показаны в эскиз. Для модели-клеточной РНК нумерация нуклеотидов выравнивается в пробирке шаблон формы. Нуклеотиды 1-18-120-140 были опущены. Реактивности значительные изменения указаны в красных и зеленых звездочки для фигуры, в пробирке и в клеток, соответственно. Вторичные структуры, которые ранее были названы TSL1 и TSL231 , заключаются в синие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Грунтовка имя 5' - 3' последовательность
Рибозима FW TAAAACGACGGCCAGTGAAT
Рибозима RV GCAGGTCGACTCTAGAGGAT
Грунтовка RT GAACCGGACCGAAGCCCG

Таблица 1: Грунтовка последовательности используется в представитель эксперимента.

Имя Последовательность (5 '-> 3')
SMN2E7-338-FW AAAGACTATCAACTTAATTTCTGA
SMN2E7-338-RV TGTTTTACATTAACCTTTCAACT
SMN2E7-276-FW AATGTCTTGTGAAACAAAATGCT
SMN2E7-276-RV AACCTTTCAACTTTCTAACATCT
SMN2E7-251-FW TGAAACAAAATGCTTTTTAACATCC
SMN2E7-251-RV TCAACTTTCTAACATCTGAACTTTT

Таблица 2: грунтовка задает для амплификации пре мРНК последовательность интереса. Все три грунтовка наборы дают один ампликон в реакции PCR с геномной ДНК бесплатный шаблон cDNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В форме в лабораторных условиях важно использовать высокое качество однородной РНК шаблон. Однако, транскрипции T7, часто дает разнородные последовательности36. Особенно последовательности нуклеотидов ±1 на 3'-Отель terminus с не ничтожно малый урожайности36 обычно трудно быть удалены путем очищения геля полиакриламида. Гетерогенной РНК шаблон может привести к более чем одного набора сигнала в последовательности профилирование гель грунтовка расширения продукта, который иногда делает его трудно интерпретировать результат. Рибозима в оба 5'- и 3'-конца кассеты выражение шаблона РНК сделает обоих концах однородной.

Для фигуры, как in vitro, так и в клеток время инкубации 2'-OH модификации реагентов является еще одним важнейшим фактором. Недели группа предложила, что по крайней мере пять раз half-life закалочной воде 2'-OH Ацилирование Реагент должен быть используется1. В наших руках, инкубации с Най (T1/2 = ~ 20 мин) для > 30 мин в форме как in vitro, так и в клеток приводит к overreacted результат. Как показано на рисунке 1 d, должны иметь хорошо в vitro форме профилирования > 50% всего сигнала поверх геля как полнометражный стенограмма, является обеспечение что большинство модифицированных РНК ацилированных только один раз. Чрезмерная реакция будет оказывать двойной ацилированных продукта не ничтожно малый и профилирования предвзято к продукции обогащенного короткая длина расширения. В-клеточной формы ампликон на строительство библиотеки должен появиться как одну группу анализа геля агарозы (шаг 2.6.3). Мазок группы свидетельствует о чрезмерной реакции, и инкубировать время следует сократить. В представитель экспериментах время инкубации 15 мин при 37 ° C был оптимальным для фигуры в пробирке и в клеток. Должно использоваться в качестве отправной точки для изменения Най в подобных приложениях.

Есть другие реализацию реагентов модификация 2'-OH22 , широко используется для фигуры, такие как 1 М 7. По сравнению с Най, 1M 7 имеет лучше реактивности 2'-OH группы и более короткий период полураспада в воде22. В наших руках 1M 7 сформировал огромное количество желтых осадков в СМИ культуры клеток в эксперименте форма в клеток, что осложнило РНК изоляции. Для сравнения причины как in vitro, так и в клеток формы используется Най как 2'-OH модификации реагента для изучения SMN-C2 и SMN2 пре мРНК взаимодействий. В vitro форме требуется, если только 1 M 7 является альтернативный вариант, как показали различные исследования в riboswitch структурные определения7,,8.

В общем форма в клеток в пробирке формой является предпочтительным, особенно если молекулы предположительно действует в ядре эукариотических клеток. Обильны RNA-связывая протеинов в ядре, и это почти невозможно резюмировать сотовой связи в vitro условиях.

В последнее десятилетие фигура становится стандартным методом для изучения вторичной структуры РНК. По сравнению с традиционными footprinting РНК с РНКазы37, он больше подходит для изучения взаимодействия малых молекул РНК, как эти взаимодействия может иногда быть слабой и нечувствительны к РНКазы вызовы.

Основным ограничением использования формы для изучения малых молекулы-РНК структурных изменений, вызванных является, что его результаты не свидетельствуют привязки сайта. В форме in vitro и в клеток SMN-C2 связывания пре мРНК, форма реактивности не изменился на участке разоблачало привязки (рис. 1 d, рис. 2B); скорее реактивность на удаленных объектах 2-3 цикла или сдвинуть региона были изменены. SMN-C2 предположительно связывает регион РНК двойной спирали (рис. 1 d, 2D фигура), который обычно имеет форму реакционную способность низкая. Таким образом дальнейшей стабилизации структуры для снижения реактивности форму вероятно не будет наблюдаемый объект. Для создания предполагаемого привязки сайта, другие методы, такие, как должны использоваться ChemCLIP38 , в которой участвует зондом химической сшивки.

Общий альтернативный подход к карте РНК среднего или выше структуры и динамики нуклеотидов — ЯМР спектрометрия39,40. Было продемонстрировано, что динамика РНК производные от количественного анализа ЯМР сильно коррелируют с ФОРМОЙ деятельности39. В контексте привязки малые молекулы химический сдвиг возмущения может выявить взаимодействующих нуклеотидов21.

Как малых молекул РНК ориентация стала новая форма препарата развития11, мы предполагаем, что форма будет создана в качестве стандартной методологии для оценки воздействия структурных целевых РНК в присутствии маленьких молекул. В будущем требуемый метод допроса транскриптом общесистемной для наркотиков малых молекул РНК таргетинг.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Acknowledgments

Эта работа стало возможным благодаря НИЗ R01 Грант (NS094721, K.A.J.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNA oligonucleotide IDT gBlock for >200 bp DNA synthesis
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix Thermo Fisher F566S
NucleoSpin gel and PCR clean-up kit Takara 740609.50
MegaScript T7 transcription kit Thermo Fisher AM1333 Contains 10x reaction buffer, T7 enzyme, NTP and Turbo DNase
DEPC-treated water Thermo Fisher 750023
2x TBE-urea sample buffer Thermo Fisher LC6876
40% acrylamide/ bisacrylamide solution (29:1) Bio-Rad 1610146
10x TBE buffer Thermo Fisher 15581044
Nalgene Rapid-Flow™ Filter Unit Thermo Fisher 166-0045
Kimwipe Kimberly-Clark 34133
TEMED Thermo Fisher 17919
SYBR-Safe dye Thermo Fisher S33102
6% TBE-urea mini-gel Thermo Fisher EC6865BOX
ChemiDoc Bio-Rad
T4 PNK NEB M0201S
γ-32P-ATP Perkin Elmer NEG035C005MC
Hyperscreen™ Intensifying Screen GE Healthcare RPN1669 calcium tungstate phosphor screen
phosphor storage screen Molecular Dynamics BAS-IP MS 3543 E
Amersham Typhoon GE Healthcare
NAI (2M) EMD Millipore 03-310
GlycoBlue Thermo Fisher AM9515
SuperScript IV Reverse Transcriptase Thermo Fisher 18090010 Contains 5x RT buffer, SuperScript IV
dNTP mix (10 mM) Thermo Fisher R0192
ddNTP set (5 mM) Sigma GE27-2045-01
large filter paper Whatman 1001-917
Gel dryer Hoefer GD 2000
QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen 51104 Also contains RNase A and protease K
SMN2 minigene34 Addgene 72287
Heat inactivated FBS Thermo Fisher 10438026
Pen-Strep Thermo Fisher 15140122
Opti-MEM I Thermo Fisher 31985062
FuGene HD Promega E2311
TrpLE Thermo Fisher 12605010
DPBS without Ca/Mg Thermo Fisher 14190250
TRIzol Thermo Fisher 15596018
RNeasy mini column Qiagen 74104 Also contains RW1, RPE buffer
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 Contains DNase I and RDD buffer
Deionized formamide Thermo Fisher AM9342
MnCl2•4H2O Sigma-Aldrich M3634
random nonamer Sigma-Aldrich R7647
SuperScript First-Strand Synthesis System Thermo Fisher 11904-018 Contains 10x RT buffer, SuperScript II reverse transcriptase
AccuPrime pfx DNA polymerse Thermo Fisher 12344024
NextSeq500 Illumina
NucAway column Thermo Fisher AM10070 for desalting purpose

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilkinson, K. A., Merino, E. J., Weeks, K. M. Selective 2'-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE): Quantitative RNA structure analysis at single nucleotide resolution. Nature Protocols. 1, 1610-1616 (2006).
  2. Trausch, J. J., et al. Structural basis for diversity in the SAM clan of riboswitches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, 6624-6629 (2014).
  3. Souliere, M. F., et al. Tuning a riboswitch response through structural extension of a pseudoknot. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, E3256-E3264. , E3256-E3264 (2013).
  4. Rice, G. M., Busan, S., Karabiber, F., Favorov, O. V., Weeks, K. M. SHAPE Analysis of Small RNAs and Riboswitches. Methods in Enzymology. , 165-187 (2014).
  5. Spitale, R. C., et al. RNA SHAPE analysis in living cells. Nature Chemical Biology. 9, 18-20 (2013).
  6. Wang, J., Schultz, P. G., Johnson, K. A. Mechanistic studies of a small-molecule modulator of SMN2 splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, E4604-E4612 (2018).
  7. Price, I. R., Gaballa, A., Ding, F., Helmann, J. D., Ke, A. Mn 2+ -Sensing Mechanisms of yybP-ykoY Orphan Riboswitches. Molecular Cell. 57, 1110-1123 (2015).
  8. Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tertiary contacts control switching of the SAM-I riboswitch. Nucleic Acids Research. 39, 2416-2431 (2011).
  9. Abulwerdi, F. A., et al. Development of Small Molecules with a Noncanonical Binding Mode to HIV-1 Trans Activation Response (TAR) RNA. Journal of Medicinal Chemistry. 59, 11148-11160 (2016).
  10. Shortridge, M. D., et al. A Macrocyclic Peptide Ligand Binds the Oncogenic MicroRNA-21 Precursor and Suppresses Dicer Processing. ACS Chemical Biology. 12, 1611-1620 (2017).
  11. Warner, K. D., Hajdin, C. E., Weeks, K. M. Principles for targeting RNA with drug-like small molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 547-558 (2018).
  12. Mullard, A. Small molecules against RNA targets attract big backers. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 813-815 (2017).
  13. Shortridge, M. D., Varani, G. Structure based approaches for targeting non-coding RNAs with small molecules. Current Opinion in Structural Biology. 30, 79-88 (2015).
  14. Gallego, J., Varani, G. Targeting RNA with Small-Molecule Drugs: Therapeutic Promise and Chemical Challenges. Accounts of Chemical Research. 34, 836-843 (2001).
  15. Rizvi, N. F., Smith, G. F. RNA as a small molecule druggable target. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, 5083-5088 (2017).
  16. Connelly, C. M., Moon, M. H., Schneekloth, J. S. The Emerging Role of RNA as a Therapeutic Target for Small Molecules. Cell Chemical Biology. 23, 1077-1090 (2016).
  17. Palacino, J., et al. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nature Chemical Biology. 11, 511-517 (2015).
  18. Ratni, H., et al. Discovery of Risdiplam, a Selective Survival of Motor Neuron-2 ( SMN2 ) Gene Splicing Modifier for the Treatment of Spinal Muscular Atrophy (SMA). Journal of Medicinal Chemistry. 61, 6501-6517 (2018).
  19. Naryshkin, N., et al. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science. 345, (2014).
  20. Chiriboga, C., et al. Preliminary Evidence for Pharmacodynamics Effects of RG7916 in JEWELFISH, a Study in Patients with Spinal Muscular Atrophy who Previously Participated in a Study with Another SMN2-Splicing Targeting Therapy (S46.003). Neurology. 90, (2018).
  21. Sivaramakrishnan, M., et al. Binding to SMN2 pre-mRNA-protein complex elicits specificity for small molecule splicing modifiers. Nature Communications. 8, (2017).
  22. Lee, B., et al. Comparison of SHAPE reagents for mapping RNA structures inside living cells. RNA. 23, 169-174 (2017).
  23. Weeks, K. M., Mauger, D. M. Exploring RNA Structural Codes with SHAPE Chemistry. Accounts of Chemical Research. 44, 1280-1291 (2011).
  24. Smola, M. J., et al. SHAPE reveals transcript-wide interactions , complex structural domains , and protein interactions across the Xist lncRNA in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113, 10322-10327 (2016).
  25. Flynn, R. A., et al. Transcriptome-wide interrogation of RNA secondary structure in living cells with icSHAPE. Nature Protocols. 11, 273-290 (2016).
  26. Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2 ′ -hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct , versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10, 1643-1669 (2015).
  27. Hua, Y., et al. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & Development. 24, 1634-1644 (2010).
  28. Hua, Y., et al. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature. 478, 123-126 (2011).
  29. Wee, C. D., Havens, M. A., Jodelka, F. M., Hastings, M. L. Targeting SR proteins improves SMN expression in spinal muscular atrophy cells. PloS One. 9, e115205 (2014).
  30. Hammond, J. A., Rambo, R. P., Filbin, M. E., Kieft, J. S. Comparison and functional implications of the 3D architectures of viral tRNA-like structures. RNA. 15, 294-307 (2009).
  31. Singh, N. N., Singh, R. N., Androphy, E. J. Modulating role of RNA structure in alternative splicing of a critical exon in the spinal muscular atrophy genes. Nucleic Acids Research. 35, 371-389 (2007).
  32. Deigan, K. E., Li, T. W., Mathews, D. H., Weeks, K. M. Accurate SHAPE-directed RNA structure determination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 97-102 (2009).
  33. Qi, H., et al. Preparation of pyridopyrimidine derivatives and related compounds for treating spinal muscular atrophy. , (2013).
  34. Lorson, C. L., Hahnen, E., Androphy, E. J., Wirth, B. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 6307-6311 (1999).
  35. Siegfried, N. A., Busan, S., Rice, G. M., Nelson, J. A. E., Weeks, K. M. RNA motif discovery by SHAPE and mutational profiling (SHAPE-MaP). Nature Methods. 11, 959 (2014).
  36. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
  37. Nilsen, T. W. RNase Footprinting to Map Sites of RNA-Protein Interactions. Cold Spring Harbor Protocols. , (2014).
  38. Velagapudi, S. P., et al. Design of a small molecule against an oncogenic noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 5898-5903 (2016).
  39. Barnwal, R. P., Yang, F., Varani, G. Applications of NMR to structure determination of RNAs large and small. Archives of Biochemistry and Biophysics. 628, 42-56 (2017).
  40. Scott, L. G., Hennig, M. RNA structure determination by NMR. Methods in Molecular Biology. 452, 29-61 (2008).

Tags

В этом месяце в Юпитер выпуск 143 малые молекулы ориентация РНК РНК структуры в пробирке форму в клеток SHAPE спинальной мышечной атрофии RG-7916
Использование в пробирке и в клеток форму расследовать малые молекулы индуцированной пре мРНК структурные изменения
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, J., Hammond, J., Johnson, K.… More

Wang, J., Hammond, J., Johnson, K. A. Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes. J. Vis. Exp. (143), e59021, doi:10.3791/59021 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter