Fuldt autonome karakterisering og indsamling af Data fra krystaller af biologiske makromolekyler

Summary

Her, beskriver vi, hvordan du bruger automatiseret screening og indstillinger for dataindsamling tilgængelige på nogle synkrotron beamlines. Forskere sende cryocooled prøver at synchrotron, og egenskaberne diffraktion er screenet, sæt data er indsamlet og behandlet og, hvor det er muligt, en struktur løsning udføres — alle uden menneskelig indgriben.

Abstract

Høj-glans X-ray bjælker kombineret med automation har ført til brugen af synkrotron-baserede makromolekylære røntgenkrystallografi (MX) beamlines for selv de mest udfordrende projekter i strukturbiologi. Men de fleste faciliteter stadig kræver tilstedeværelsen af en videnskabsmand på webstedet til at udføre eksperimenter. En ny generation af automatiserede beamlines dedikeret til fuldautomatisk karakterisering af og indsamling af data fra, krystaller af biologiske makromolekyler er for nylig blevet udviklet. Disse beamlines udgør et nyt værktøj til strukturelle biologer at screene resultaterne af indledende krystallisering forsøg og/eller indsamling af et stort antal diffraktion datasæt, uden at brugerne skulle styre beamline sig selv. Her viser vi hvordan du opretter et eksperiment for automatiske screening og dataindsamling, hvordan et eksperiment udføres på beamline, hvor de resulterende datasæt behandles, og hvordan, når det er muligt, krystalstruktur af den biologiske makromolekyle er løst.

Introduction

Bestemmelse af den tre-dimensionelle struktur af specifikke proteiner er afgørende i biologi. De oplysninger, der er afledt fra gør så kaster lys over den biologiske funktion og form og specificitet af aktive og/eller bindende websteder indeholdt i molekylet under studiet. I mange tilfælde, dette giver virkningsmekanismer bestemmes eller eventuelt potentielle terapeutiske molekyler skal udvikles. MX er den mest almindeligt anvendte at opnå strukturelle oplysninger teknik, men en flaskehals er bestemmelse af de optimale betingelser til at opnå godt diffracting krystaller. Derfor, krystallisering forsøg udføres i mange forskellige forhold og er derefter screenes for at finde de bedste krystaller skal bruges til indsamling af diffraktion. Automatisering af opsætningen af krystallisering forsøg¹ har helt klart hjulpet i denne henseende. Men de efterfølgende trin (dvs., krystal montering, diffraktion screening og diffraktion dataindsamling) udføres normalt manuelt, tager en masse tid, kræfter og ressourcer. Automatisering af diffraktion screening og dataindsamling ville derfor betyde en enorm gevinst i tid og effektivitet.

Diffraktion screening og dataindsamling i MX udføres oftest ved synkrotron MX beamlines hvormed automation har i høj grad lettet denne proces. I de fleste tilfælde er det dog nødvendigt for videnskabsmand til at være til stede på beamline under et eksperiment eller at betjene det fjernt. For nylig har en ny generation af fuldstændig automatiseret MX beamlines blevet udviklet². Her, behøver brugere ikke at være til stede, enten fysisk eller fjernt, i løbet af en eksperimentel session. Det giver forskerne til at bruge mere tid på mindre rutineopgaver, snarere end at tilbringe hele dage, og ofte nætter, screening krystaller og indsamle diffraktion data. Verdens første fuldautomatiske beamline er massivt automatiseret prøve udvalg integreret Facility (MASSIF-1, ID30A-1)^2,3 på europæiske synkrotron stråling facilitet (ESRF). Det har en unik prøve miljøet, en høj kapacitet prøve-holdige dewar opererer i tandem med en robot prøve skifter, der også fungerer som beamline's goniometer^4,5. MASSIF-1 er en undulator beamline udstyret med en enkelt-foton-tælle hybrid pixel detektor⁶, der opererer på en fast bølgelængde af 0.969 Å (12.84 keV) med en intens X-ray stråle (2 x 10¹² fotoner/s). Beam størrelse på positionen prøven kan justeres mellem et minimum af 10 µm (runde stråle) til et maksimum på 100 µm x 65 µm (vandret af lodrette beam størrelse). I gennemsnit kan beamline proces, i en helt automatisk mode (se nedenfor), 120 krystaller i 24 timer. Driften af beamline er baseret på en række arbejdsprocesser⁷, hvoraf hver tager intelligente beslutninger baseret på resultaterne af tidligere trin i arbejdsgangen, at sikre måling af de bedste mulige data fra eksemplet under undersøgelsen. Navnlig evalueringen af diffraktion Karakteristik af en individuel prøve tager konto krystal volumen og flux og sikrer, hvor Krystallen er større end den X-ray stråle, at kun den bedste område af crystal bruges til efterfølgende data samling. Diffraktion datasæt er, således er optimeret til maksimal opløsning med minimeret stråling skader^2,3. Krævende data indsamling protokoller, såsom pseudo spiralformet (multi-position) data indsamling strategier for dataindsamling både indfødte og single-bølgelængde anomale diffraktion (SAD) er også tilgængelige⁸.

Helt automatisk forsøg på MASSIF-1 omfatter cryocooling og montering af krystaller på en magnetisk prøve mount egnet til den ønskede beamline udstyr standard stifter RYGSØJLEN⁹, at indtaste de ønskede eksperimentelle parametre i den ' diffraktion planen ' tabel i det integrerede System for Proteinkrystallografi beamlines (ISPyB)¹⁰, en web-baseret information management system for MX eksperimenter, og at sende prøverne til beamline. På ESRF, alle omkostninger ved transport af prøver til/fra beamline understøttes af ESRF bruger Office (Se hjemmesiden for ESRF¹¹ for detaljer). MASSIF-1, ingen restriktioner placeres på løkke størrelse eller crystal kvalitet. Når du vælger en diffraktion plan for en given krystal, kan brugeren enten bruge standardindstillingerne eller vælge fra bestemte arbejdsgange, der kan tilpasses for hver prøve. Der er flere forudprogrammeret arbejdsprocesser. I arbejdsprocessen MXPressE³ justeres prøve-holdige løkken først til prøven position ved hjælp af optisk centrering. Derefter, X-stråle-baserede centrering sikrer at den bedste region af krystal er centreret til X-ray stråle. Data indsamling strategier beregnes derefter ved hjælp af eEDNA, en ramme for udvikling af plugin-baserede programmer især for online dataanalyse i feltet X-ray eksperimenter under hensyntagen til konto krystal volumen og real-time flux på beamline. Efter samlingen af en fuld diffraktion datasæt dette behandles derefter ved hjælp af en række automatisk databehandling rørledninger¹² og resultaterne stilles til rådighed for inspektion og download i ISPyB. MXPressE SAD³ arbejdsgang er rettet mod selenomethionin-holdige krystaller af target proteinet og udnytter, at den operationelle energi af MASSIF-1 er lige over Se K kant. Her, MXPressE eEDNA data indsamling strategi er optimeret til TRIST dataindsamling (dvs. høj redundans, og med opløsningsindstilling for hvor R_fletning mellem Bijvoet par er under 5%). Gennemgå egenskaberne diffraktion af en serie af krystaller uden efterfølgende dataindsamling, kan MXScore³ arbejdsprocessen bruges til at producere en fuld vurdering af krystallerne analyseret. I arbejdsprocessen MXPressI³ er 180 ° rotation data indsamlet ved hjælp af 0,2 ° svingninger og ved hjælp af den begyndende phi vinkel og den beslutning, bestemmes af en eEDNA strategi. MXPressO ³ omfatter en preobserved opløsning i arbejdsprocessen (standard: d_min = 2 Å). For at foretage en indledende vurdering af krystaller som følge af en retssag krystallisering, tilbydes MXPressM³ arbejdsprocessen. Det udfører en høj-dosis mesh Skan over den bredeste orientering af prøven support med ingen dataindsamling eller centrering. To nye eksperiment arbejdsprocesser, MXPressP og MXPressP_SAD, som udfører pseudohelical dataindsamlinger, har for nylig været gennemført⁸. Udførelse af alle trin i alle arbejdsprocesser kan følges online og i realtid af brugeren, via ISPyB.

Her viser vi hvordan du forbereder en fuldt automatiseret MX eksperiment MASSIF-1 og hvordan at hente og analysere de data fra forsøget. Som et eksempel bruge vi menneskelige mitokondrie glycin kavalergang system protein H (GCSH). Denne lipoic acid-holdige proteiner er en del af glycin kavalergang system ansvarlig for nedbrydningen af glycin. Dette system yderligere omfatter P protein, en pyridoxal fosfat-afhængige glycin decarboxylase, T protein, en der kræver tetrahydrofolat enzym og L protein, en lipoamide dehydrogenase. GCSH overfører methylamin gruppe af glycin fra P protein til T protein. Defekter i H protein er årsag til nonketotic hyperglycinemia (NKH) i mennesker¹³.

Protocol

Bemærk: Produktion, rensning og krystallisation af GCSH er beskrevet i supplerende fil 1.

1. kort beskrivelse af offline forberedelse og crystal montering

1. Holdning en nylon sløjfe eller en anden krystal montering støtte allerede fastgjort til en RYGSØJLEN pinkode under en eller flere krystaller og løfte dem ud af nedbør løsning (20 µL af 0,5 M natrium formate pH 4,0 + 25 µL af protein løsning).
   1. Fjern bulk væsken omkring crystal(s) ved at røre ved mount med en papir væge at sutte off overskydende væske.
2. Nyd crystal(s) i den cryoprotective løsning indeholdende nedbør løsning plus 30% glycerol; Fjern derefter både krystal støtte og crystal(s).
   1. Fjern bulk væsken omkring crystal(s) ved at røre ved mount med en papir væge at sutte off overskydende væske.
3. Styrte mount i en SPINE hætteglas fyldt med flydende kvælstof og gemme det, sammen med eventuelle andre krystaller på lignende måde tilberedt i en europæiske molekylærbiologiske laboratorium (EMBL) / ESRF prøve changer puck⁹ på flydende kvælstof temperatur.
   Bemærk: Crystal(s) er stabil i denne tilstand, indtil beamtime er tilgængelige.

2. anmoder om beamtime på MASSIF-1

1. Anmode om beamtime så tidligt som muligt på ESRF hjemmeside (på http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying).
   Bemærk: Der er en række mulige former for adgang til ESRF MX beamlines. Laboratorier kan anvende kollektivt som en del af en blok tildeling gruppe (pose), at have beamtime fordelt i 2 år. Hvis grupper ønsker at anvende individuelt, kan de ansøge om rullende adgang, der giver dem hurtig adgang til beamlines efter peer review. Gruppens forslag bliver gennemgået og ryddet af gruppen ESRF sikkerhed, der kan anmode om yderligere oplysninger. Hvis forslaget accepteres, vil blive meddelt et eksperiment nummer og adgangskode. Farmaceutiske forskning, der kan udføres ved at købe beamtime.
2. Fuldføre den krævede sikkerhed uddannelse online (på http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining).
3. Bog beamtime i MASSIF-1 kalenderen.
   Bemærk: Det er muligt at bestille til et maksimum på 50 prøve indehavere skal analyseres pr. Skift.
4. Udfyld en formular til at erklære en mail-in eksperiment (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form), sammen med de nødvendige sikkerhedsoplysninger for de prøver, der skal måles.

3. oprettelse af en diffraktion plan i ISPyB

Bemærk: Diffraktion planen indeholder alle de oplysninger, der er nødvendige for en prøve i ISPyB og kan indeholde yderligere oplysninger for at skræddersy eksperimentet udføres for hver prøve.

1. Åbne ISPyB (på https://exi.esrf.fr/).
2. Vælg MX eksperimenter.
3. Log ind med eksperiment nummer og adgangskode.
4. Klik på leverance | Tilføj ny og give de nødvendige oplysninger. Klik på Gem.
5. Klik på Tilføj parcel og udfyld de krævede oplysninger. Klik på Gem.
6. Klik derefter på Tilføj container, give puck stregkode som navnet, og vælg RYGSØJLEN pucken. Klik på Gem.
7. Klik på container symbol og Rediger, og udfyld de nødvendige oplysninger, ligesom protein navn, foretrukne workflow, crystal position i puck m.v. vedrørende prøverne.
8. Vælg den protein (for eksempel GCSH eller lysozym), der er blevet godkendt af ESRF sikkerhed gruppe.
9. Angiv et entydigt prøve navn til at identificere hver enkelt prøve. Det er muligt at eventuelt scanne pin stregkode. Resten af nedenstående oplysninger er valgfri.
10. Angiv de valgfrie oplysninger.
    1. For hver enkelt prøve, Angiv typen eksperiment (dvs., MXPressE_SAD, SCORE, eller MXPressO, osv., standard MXPressE) under Exp. Type. Dette definerer, hvilke automatisk arbejdsproces vil blive brugt til at behandle hver enkelt krystal. Da de GCSH krystaller er nåle, vælge MXPressP.
    2. Angiv en plads (for eksempel, P1, C2 eller P2₁2₁2₁), hvis kendt. Hvis til stede, vil dette blive brugt til data indsamling strategi beregninger og ved automatisk databehandling rørledninger tilgængelige.
    3. Angiv den ønskede opløsning (standard: d_min = 2.0 Å). Dette definerer den krystal til detektor afstand til den oprindelige mesh scanninger, karakterisering og standard dataindsamling.
    4. Indstille ønskede tærskel opløsningen (f.eks 1,5 Å eller 2.3Å), at forhindre indsamlingen af fulde datasæt fra krystaller, som ikke diffract til denne grænse. Dette kan spare data opbevaring plads og analyse tid.
    5. Angive de påkrævede fuldstændighed (standard: 0,99). Angive de nødvendige mangfoldighed (standard: 4). Hvis mere end én krystal er indeholdt på prøve støtte, angive det maksimale antal krystaller der skal analyseres. Standardværdien er 1 eller 5 for MXPressP.
    6. Vælg den passende beam størrelse (standard: 50 µm). Hvis en bestemt værdi ikke er markeret, udføres X-stråle-centrering og data indsamling strategi beregninger med en stråle størrelse af 50 µm.
       Bemærk: Under alle efterfølgende indsamling af komplette datasæt, beam størrelse tilpasses automatisk.
    7. Sætte i gruppen plads hvis kendt, i kolonnen tvungen plads gruppen. Indstille stråling-følsomheden af krystaller (0,5-2,0 til lav eller høj følsomhed, med standardværdien 1).
11. Hvis det ønskes, sætte den samlede rotationsvinkel skal indsamles for samlingen fulde datasæt (standard: den samlede rotationsvinkel bestemmes af eEDNA).
12. Gem værdier. Klik på tilbage til forsendelser. Tryk på Send leverance til ESRF.
13. Udskrive etiketten shipping og sende prøverne. Brugere bør arrangere en pickup med en kurer, ved hjælp af ESRF kontooplysninger.
    Bemærk: Det er meget vigtigt at vælge Medtag retur label til at tillade sømløs returnering af prøver (Se https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement).

4. dataindsamling, visning og hentning

Bemærk: På dag i eksperimentet, prøver er overført til MASSIF-1 høj kapacitet Dewar (HCD). Beamline forskerne derefter starte indsamling af data, som kan følges af brugere via fjernadgang. For hver forskellige prøvetypen modtager brugere en e-mail informere dem om, at dataindsamlingen er begyndt. Som tidligere bemærket, udførelse af alle trin i alle arbejdsprocesser kan følges online og i realtid af bruger via ISPyB, som resultaterne kan ses og downloades.

1. For hver prøve analyseres, undersøge resultaterne af den automatiske eksperiment i ISPyB (https://exi.esrf.fr/).
   1. Log ind, ved hjælp af eksperiment nummer og adgangskode, og klik på den ønskede eksperimentelle session på ID30A-1.
   2. Vælg den foretrukne (top-scoring) følgende rørledningen (f.eks granater eller XDS_APP) og downloade data skrevet i den korrekte plads gruppe med den højeste fuldstændighed og højeste opløsning ved at klikke på Sidste indsamle resultater , og derefter downloade.
      Bemærk: Alle mesh, line og karakterisering billeder er i en undermappe for hver prøve, kaldet /MXPressE_01. ESRF kører automatisk fem separate behandling pakker, nemlig EDNA_proc¹², granater¹², XDS_APP¹⁴, autoPROC¹⁵og XIA2¹⁶. Dataintegration er baseret på XDS, med undtagelse af XIA2, som er baseret på ringer. Alle pakker er også køre i forfejlet og nonanomalous tilstande, så den automatiske registrering af en unormal signal, hvis det findes i dataene, der skal anvendes i SAD udfasning protokoller. Hver pakke bruger forskellige parametre og beslutningstræer, hvilket betyder, at nogle pakker køre bedre med visse prøver. Men dette kan gøre for et stort antal resultater, når antallet af pakker og mulige plads grupper tegner sig for. Resultaterne er, derfor, rangeret baseret nogenlunde på opløsning og andre kvalitet målinger, som R_Flet i laveste opløsning shell, CC(1/2) og fuldstændighed. Dette har til formål at vejlede brugeren til de bedste datasæt, men alle mulige plads grupper og resultater skal kontrolleres omhyggeligt.
2. Unzip den downloadede mappe, som vil omfatte alle logfiler og uflettede XDS_ASCII. HKL og flettede og skaleret .mtz filer.
   Bemærk: I tilfælde af struktur (i FBF format) af protein af interesse eller en tæt homolog blev uploadet til ISPyB i begyndelsen af eksperimentet, følgende rørledningen på ESRF vil automatisk udføre en molekylær udskiftning (MR) køres ved hjælp af denne struktur som den Søg efter model på den bedste scoring løsning. Resultaterne af hr. pipeline vises i ISPyB og kan findes i mappen behandlede data (for eksempel, /data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_ mrpipe_dir /). Her, vil den endelige model være navngivet coot1.pdb og refleksion data sidechains.mtz. Bemærk, at rørledningen kan reducere symmetrien i cellen (primitive celle reduktion) for at øge sandsynligheden for at finde en løsning. I tilfældet her skrev hr. pipeline løsning i en monoclinic celle (C2) og ikke i en ændres celle (C222₁). Oplysninger om, hvordan du udføre en molekylær udskiftning køre manuelt (eksemplificeret for den anden bedst scoring følgende løsning) er inkluderet i de Supplerende filer.

Representative Results

MXPressP arbejdsprocessen blev brugt ved ESRF beamline MASSIF-1 til, fuldt automatisk montere, center i X-ray stråle, karakterisere og indsamle fuld diffraktion datasæt fra en serie af krystaller af menneskelige GCSH. Prøverne blev monteret og Løkken analyseret for et område til at scanne (figur 1, venstre). Efter analysen diffraktion udvalgtes fire punkter inden for crystal for indsamling af data (figur 1, højre). Efterfølgende behandling af automatiseret data analyse rørledninger, herunder hr. rørledning, givet høj kvalitet datasæt (tabel 1) som en hr. løsning var fundet. Sidstnævnte tillader brugernes hen til hurtigt vurdere, om den opnåede datasæt og de anvendte søgemodel er egnet til udfasning af molekylære udskiftning. Derudover kan blive bedømt tilstedeværelsen af ligander, således tillader brugeren at fokusere kun på de mest lovende datasæt for yderligere analyse. Manuel struktur bestemmelse af hr. gav en høj kvalitet electron density kort efter en enkelt automatiseret raffinement cyklus (figur 2a). For dette datasæt skære automatiseret rørledningen dataene på en 1,32 Å opløsning; brugere kan dog stadig beslutte at klippe data på et lavere opløsning at nå frem til forskellige kvalitet statistikker (CC_1/2, < I/σ(I) >, R_meas) i den højeste opløsning shell. Krystalstruktur af humane GCSH struktur er svarer til kvæg protein (3KlR)¹⁶.

Kontinuerlig electron density er synlige for hele aminosyre kæde, bortset fra den N-terminale histidin tag. Af de fire erstatninger, der adskiller mennesker og kvæg GCSH, er tre let identificerbare i electron density (Ile/Val66, Asp/Glu98 og Leu/Phe149; Figur 2b -d). Dette er mindre klar for Asp/Lys125 substitution som elektron tæthed af side-kæden er kun delvist løst på grund af fleksibilitet (figur 1e). Den aktuelt opnåede model har R_arbejde og R_gratis værdier på 20,4% og 23,8%, henholdsvis, og yderligere kan optimeres ved yderligere cyklusser af automatiserede og manuelle model bygning og raffinement.

	GRANATER pipeline	XDS_APP pipeline
Dataindsamling og -behandling
X-ray kilde / fjernlys linje	ESRF / MASSIF-1
Bølgelængde (Å)	0.966
Opløsning (Å)	41.88-1,48 (1,53-1,48)	41.86-1,32 (1,39-1,32)
Alt/unikke refleksioner	127670 / 28644	177332 / 40134
	(12178 / 2775)	(23772 / 5714)
Plads gruppe for indeksering, skalering og fletning	C222	C2221
Celle dimensioner
a, b, c (Å)	42.20, 83.75, 95.85	42.19, 83.72, 95,82
Mosaicity	0,05	0,05
Rmultilaterale miljøaftaler (%)	10.0 (110.7)	11.1 (198.2)
< I/σ(I) >	9.6 (1,3)	7.6 (0,7)
CC1/2 (%)	99,7 (53,9)	99,7 (19.1)
Fuldstændighed (%)	99,6 (99,6)	99,5 (98,6)
Mangfoldighed	4.5 (4.4)	4.4 (4.2)
Foreløbige model og molekylær erstatning
Plads gruppe for udfasning	C2	C2221
Celle dimensioner
a, b, c (Å)	83.74, 42.18, 95,82	42.19, 83.72, 95,82
Α, Β, Γ (°)	90, 90.03, 90	90, 90, 90
Søg efter model for hr. (FBF)	3KLR	3KLR
Proteinmolekyler / ASU	2	1
Protein restkoncentrationer	250	125
Rarbejde/rgratis (%) efter 1st raffinement	24.3 / 26,5	20.4 / 23,8
RMSD bond længde (Å) efter 1st raffinement	0,01	0,01
RMSD bond vinkel (°) efter 1st raffinement	1.2	1.83
Rotamer outlier (%) efter 1st raffinement	1.07	4.29
Ramachandran stillede/tilladte/ikke tilladte (%) efter 1st raffinement	95,93 / 4,07 / 0	95.12 / 4,88 / 0

Tabel 1: røntgen diffraktion data indsamling, raffinement og validering statistik. Værdier for den højeste opløsning shell er anført i parentes.

Figur 1: prøve analyse før dataindsamling. (A) regionen valgt for scanning vises ved en rød boks. (B) analysen af diffraktion billeder er vist som en zonekort. Fire positioner inden for beliggende krystal blev valgt til dataindsamling. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: visuel validering af electron density kort fremstillet efter raffinement. Electron density kort omrids på 2 x r.m.s. niveau omkring (en) Trp143, (b) Val66 (Ile i human GCSH), og (c) Glu98 (Asp i human GCSH) og kort omrids på 1 x r.m.s niveau omkring (d) Phe149 (Leu i human GCSH) og (e) Lys125 (Asp i human GCSH). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Fuldautomatisk beamlines give automatiseret karakterisering og dataindsamling fra et stort antal makromolekylære krystaller uden tilstedeværelse af en videnskabsmand, enten på beamline eller fjernt, at der kræves. Ved hjælp af helt automatiseret beamlines har mange fordele i forhold til manuel betjening. For eksempel, automatiseret prøven centrering, baseret på X-ray mesh og line scanner, er mere præcise end der udføres med det menneskelige øje som påvirkes den ikke af termisk eller optiske effekter. Ja, disse mesh og linje scanninger give supplerende data (dvs. detaljerede dimensioner af krystal og de bedste diffracting region af krystal), hvilket er vigtigt ved fastsættelsen korrekte beam størrelse skal bruges til indsamling af data — især for små krystaller ¹⁸— og ofte resulterer i en forbedret kvalitet af dataene, opnået diffraktion. Desuden ved at drage fordel af de bruger-definerede parametre i opsætningen af automatiske eksperimenter, kan trin i specifikke arbejdsprocesser skræddersyes passer bedst til system under undersøgelsen, således yderligere optimering eksperiment succesrate.

At tage sammen, pålideligheden af de arbejdsprocesser, der er tilgængelige, enkel adgang til beamline (brugere selv planlægge, ved hjælp af en kalender [se ovenfor]), og den fuldt automatiserede tilgang af MASSIF-1 indeholder en streng, høj overførselshastighed og tidsbesparende alternativ til klassiske hands-on MX eksperimenter og potentiale til at gennemføre mere avancerede procedurer og ansøgninger i automatiske arbejdsprocesser. I den nærmeste fremtid, vil crystal kartografi i 3D¹⁹ gennemføres for at forbedre nøjagtigheden af X-ray centrering, mens mere komplekse protokoller, såsom crystal dehydrering eksperimenter²⁰, vil blive automatiseret. Det er håbet, at fuldt autonome dataindsamling vil blive en standard metode i MX, leverer data af høj kvalitet til små-molekyle fragment skærme, optimere screeningen af stort antal dårligt diffracting krystaller og automatisk give fase oplysninger til at løse krystal strukturer de novo. I kombination med udviklingen i den automatiserede høst af krystaller²¹, muligheden for protein krystal struktur løsning som en automatiseret service kan blive en realitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beamline MASSIF-1	ESRF
BL21DE3	New England Biolabs	C2527I
chloramphenicol	Roth	3886.1
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K	Merck Millipore	UFC803024
Dialyzing membrane	Spectrumlabs	132655
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dnase	Roche	11284932001
DTT	Euromedex	EU0006-B
EDTA- free protease inhibitors	Roche	4,693,159,001
glycerol	VWR Chemicals Prolabo	14388.29T
His-trap HP	GE healthcare	17-5247-01
imidazole	Sigma-Aldrich	56750-500G
IPTG	Euromedex	EU0008-B
LB medium	Sigma-Aldrich	L3022
lipoic acid	Sigma-Aldrich	T5625
loop	Hampton Research	HR8-124
lysozyme	Roche	10 837 059 001
MonoQ 5/50 GL	GE healthcare	17-5166-01
NaCl	Fisher Chemical	S/3160/60
Sonicator vibra cell 75/15	SONICS
SPINE pucks	MiTeGen	SKU: M-CSM003-0001A
Tris base	Euromedex	26-128-3094-B
Sodium Formate	Sigma-Aldrich	1064430500
GCSH purification buffer	20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl
GCSH cryo-protection buffer	0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol
Programs:
MxCube		Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010)	local development
ISPyB	ESRF	Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535	local development
MXCube2	ESRF	Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014).	local development
BES workflow server		Brockhauser, S. et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012).
DOZOR	ESRF	Bourenkov and Popov, unpublished	local development
BLISS beamline control		Guijarro, M. et al. BLISS - Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Spain. doi: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018).	local development
AUTO processing of images		Monaco, S. et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013)	local development
BEST and EDNA		Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009).	local development
CCP4		Winn, M.D. et al. Overview of the CCP 4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011).
Phaser MR		McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007).
Coot		Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004).
refmac5		Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. Acta Crystallographica Section D. 53, 240--255 (1997).
Matthews		Matthews, B.W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).