Caractérisation entièrement autonome et collecte de données auprès des cristaux des macromolécules biologiques

Summary

Nous décrivons ici comment utiliser le contrôle automatisé et les possibilités de collecte de données disponibles à certains faisceaux de rayonnement synchrotron. Scientifiques envoyer des échantillons de cryocooled le synchrotron et les propriétés de diffraction sont examinées, les ensembles de données sont collectées et traitées et, si possible, une solution de la structure est réalisée — tout cela sans intervention humaine.

Abstract

Des faisceaux de rayons x de haute-brillance couplés avec l’automation ont conduit à l’utilisation de faisceaux de cristallographie de rayon x macromoléculaire axée sur le rayonnement synchrotron (MX) pour les projets les plus difficiles en biologie structurale. Cependant, la plupart des installations exigent toujours la présence d’un scientifique sur le site à réaliser les expériences. Une nouvelle génération de faisceaux de lumière automatique dédié à la caractérisation automatique d’et collecte de données, cristaux de macromolécules biologiques a récemment été mis au point. Ces faisceaux de lumière représente un nouvel outil pour les biologistes structures à l’écran des résultats des essais de cristallisation initial et/ou de la collection d’un grand nombre d’ensembles de données de diffraction, sans que les utilisateurs ayant à se contrôler à la source de rayonnement. Ici, nous montrons comment mettre en place une expérience de dépistage automatique et la collecte de données, comment une expérience est effectuée à la source de rayonnement, comment sont traités les ensembles de données qui en résulte, et comment, lorsque cela est possible, la structure cristalline de la macromolécule biologique est résolue.

Introduction

Détermination de la structure tridimensionnelle des protéines spécifiques est crucial en biologie. L’information qui est dérivée de la pratique alors jette un éclairage sur la fonction biologique et sur la forme et la spécificité des sites actifs et/ou contraignants dans la molécule à l’étude. Dans de nombreux cas, cela permet d’action visant à déterminer ou, le cas échéant, des mécanismes potentiels des molécules thérapeutiques à développer. MX est la technique la plus couramment utilisée pour obtenir des informations structurales, mais un goulot d’étranglement est de déterminer les conditions optimales pour obtenir des cristaux bien diffractants. Par conséquent, essais de cristallisation sont réalisées dans différentes conditions de nombreuses et sont ensuite examinés, pour trouver les meilleurs cristaux à utiliser pour la collecte de données de diffraction. L’automatisation de l’installation de cristallisation des essais¹ a contribué clairement à cet égard. Toutefois, les étapes ultérieures (c.-à-d., montage de cristal, le criblage de diffraction et collecte de données de diffraction) sont habituellement effectuées manuellement, prendre beaucoup de temps, d’efforts et ressources. L’automatisation de diffraction dépistage et collecte de données, par conséquent, ferait un gain énorme en temps et en efficacité.

Diffraction dépistage et collecte de données en MX est le plus souvent effectuée à rayonnement synchrotron MX au cours de laquelle automation a grandement facilité ce processus. Toutefois, dans la plupart des cas, il est nécessaire au chercheur d’être présent à la source de rayonnement pendant une expérience ou pour commander à distance. Récemment, une nouvelle génération de faisceaux de lumière complètement automatisé MX a été développé². Ici, les utilisateurs n’ont pas à être présent, soit physiquement, soit à distance, lors d’une séance expérimentale. Cela permet aux scientifiques de passer plus de temps sur des tâches moins systématiques, plutôt que de dépenser des journées entières et souvent nuits, de cristaux de dépistage et de collecte des données de diffraction. Première ligne de faisceau entièrement automatisé au monde est le massivement automatisé échantillon sélection Integrated Facility (MASSIF-1, ID30A-1)^2,3 à l’installation européenne de rayonnement Synchrotron (ESRF). Il a un environnement unique échantillon dans lequel une grande capacité contenant de l’échantillon dewar fonctionne en tandem avec un changeur de robotique échantillon qui agit également comme goniomètre^{4,5 de la source de rayonnement}. MASSIF-1 est une source de rayonnement undulator équipé d’un single-photon-comptage hybride pixel détecteur⁶, qui fonctionne à une longueur d’onde fixe de 0,969 Å (12,84 keV) avec un intense faisceau de rayons x (2 x 10¹² photons/s). La taille de faisceau à la position de l’échantillon peut être ajustée entre un minimum de 10 µm (faisceau rond) à un maximum de 100 µm x 65 µm (horizontal selon la taille de faisceau vertical). En moyenne, la source de rayonnement peut traiter, dans un complètement automatique de la mode (voir ci-dessous), 120 cristaux en 24h. L’exploitation de la source de rayonnement est basée sur une série de flux de travail⁷, chacune d'entre elles prenant des décisions intelligentes basées sur les résultats des étapes précédentes dans le flux de travail, afin de mesurer les meilleures données possibles de l’échantillon à l’étude. En particulier, l’évaluation des caractéristiques d’un échantillon individuel diffraction prend en flux et volume cristallin compte et vérifie, où le cristal est plus grand que le faisceau de rayons x, que seulement la meilleure région du cristal est utilisée pour les données suivantes collection. Ensembles de données de diffraction sont, ainsi, optimisés pour une résolution maximale avec rayonnement réduit dommages^2,3. Protocoles de collecte de données exigeants, tels que les stratégies de collecte de pseudo-hélicoïdale (multi-positions) données pour les deux collectes de données natif et simple-longueur d’onde par diffraction anormale (SAD), sont également disponibles⁸.

Des expériences complètement automatiques au MASSIF-1 impliquent cryocooling et les cristaux de montage sur une monture magnétique échantillon adaptée à la norme sur le matériel désiré beamline pins colonne vertébrale⁹, entrer les paramètres expérimentaux souhaités dans la "diffraction plan de ' deposer dans le système intégré pour la cristallographie des protéines beamlines (ISPyB)¹⁰, un système de gestion d’information sur le web pour des expériences de MX et envoyer les échantillons à la source de rayonnement. À l’ESRF, tous les coûts du transport des échantillons vers/depuis la source de rayonnement sont pris en charge par le bureau de l’utilisateur ESRF (voir le site Web de l' ESRF¹¹ pour plus de détails). Au MASSIF-1, aucuns restrictions ne sont placées sur la taille de la boucle ou la qualité du cristal. Lors du choix d’un plan de diffraction pour un cristal donné, l’utilisateur peut utiliser les paramètres par défaut ou choisissez parmi les flux de travail spécifiques, qui peut être personnalisés pour chaque échantillon. Plusieurs flux de travail préprogrammées est disponibles. Dans le workflow de³ MXPressE, la boucle contenant de l’échantillon est d’abord alignée sur la position de l’échantillon à l’aide de centrage optique. Puis, X-ray basé sur le centrage s’assure que la meilleure région du cristal est bien centrée pour le faisceau de rayons x. Stratégies de collecte de données sont ensuite calculées à l’aide d’eEDNA, un cadre pour développer des applications plugin particulier pour l’analyse des données en ligne dans le champ d’expériences de rayons x, en prenant en compte cristal volume et du flux en temps réel à la source de rayonnement. Suite à la collecte d’un ensemble de données complet de diffraction, c’est ensuite traitée à l’aide d’une série de traitement automatique des données pipelines¹² et les résultats sont disponibles pour inspection et téléchargement en ISPyB. Le flux de travail MXPressE SAD³ vise à cristaux sélénométhionine contenant de la protéine cible et exploite le fait que l’énergie d’exploitation du MASSIF-1 est juste au-dessus du bord Se K. Ici, la stratégie de collecte de données d’eEDNA de MXPressE est optimisée pour la collecte de données triste (c.-à-d. haute redondance et avec la résolution prévue où le R_fusion entre Bijvoet paires est inférieure à 5 %). Pour les propriétés de diffraction d’une série de cristaux sans la collecte ultérieure des données de l’écran, le flux de travail MXScore³ peut être utilisé pour produire une évaluation de la qualité complète des cristaux analysés. Dans le workflow de³ MXPressI, 180 ° des données de rotation sont recueillies en utilisant des oscillations de 0,2 ° et l’angle de départ phi et la résolution déterminée par une stratégie d’eEDNA. MXPressO ³ comprend une résolution preobserved dans le workflow (par défaut : d_min = 2 Å). Pour effectuer une évaluation initiale des cristaux résultant d’une cristallisation du procès, le flux de travail MXPressM³ est offert. Cela s’effectue d’un maillage de haut-dose scan sur l’orientation plus large échantillon support avec aucune collecte de données ou de centrage. Récemment, deux nouveaux workflows de l’expérience, MXPressP et MXPressP_SAD, qui effectuent des collectes de données pseudohelical, ont été mis en œuvre⁸. L’exécution de toutes les étapes dans tous les workflows peut être suivie en ligne et en temps réel par l’utilisateur, via ISPyB.

Nous montrons ici comment préparer une expérience entièrement automatisée de MX au MASSIF-1 et comment récupérer et analyser les données issues de l’expérience. À titre d’exemple, nous utilisons la protéine du système glycine mitochondrial humain clivage H (GCSH). Cette protéine de contenant de l’acide lipoïque est partie du système de clivage glycine responsable de la dégradation de la glycine. Ce système comprend la protéine P, une décarboxylase de glycine dépendante de phosphate de pyridoxal, la protéine T, une enzyme nécessitant tétrahydrofolate et la protéine L, une lipoamide déshydrogénase. GCSH transfère le groupe méthylamine de glycine de la protéine P à la protéine T. Défauts de la protéine H sont la cause de non cétosique (NKH) dans les humains¹³.

Protocol

Remarque : La production, la purification et la cristallisation de GCSH sont décrites dans supplémentaire 1 fichier.

1. brève description de la préparation hors ligne et montage de cristal

1. Position une boucle de nylon ou un autre support de montage de cristal déjà fixe à une broche de la colonne vertébrale sous un ou plusieurs cristaux et faire sortir la solution de précipitation (20 µL de 0,5 M sodium formate pH 4.0 + 25 µL de solution protéique).
   1. Retirer le liquide en vrac autour des cristaux en appuyant sur la monture avec une mèche de papier à sucer tout le liquide en excès.
2. Faire tremper les cristaux dans la solution de cryoprotecteur contenant la solution de précipitation plus 30 % de glycérol ; Ensuite, retirez le soutien de cristal et les cristaux.
   1. Retirer le liquide en vrac autour des cristaux en appuyant sur la monture avec une mèche de papier à sucer tout le liquide en excès.
3. Plonger la monture dans la colonne vertébrale dans une cuvette remplie d’azote liquide et le stocker, ainsi que tout autres cristaux de même établi, dans un laboratoire européen de biologie moléculaire (EMBL) / ESRF échantillon changeur puck⁹ à la température de l’azote liquide.
   Remarque : Les cristaux est stables dans cet état jusqu'à ce que le beamtime est disponible.

2. demander une beamtime sur le MASSIF-1

1. Demander beamtime dès que possible sur la page d’accueil de l’ESRF (à http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying).
   Remarque : Il existe un certain nombre de modes possibles de l’accès à l’ESRF MX faisceaux. Les laboratoires peuvent demander collectivement dans le cadre d’un groupe bloc Allocation (sac), d’avoir beamtime alloué pendant 2 ans. Si les groupes souhaitent appliquer individuellement, ils peuvent demander pour rouler des accès, ce qui leur permet un accès rapide à des faisceaux de lumière après examen par les pairs. La proposition du groupe est examinée et autorisée par le groupe de sécurité ESRF qui peuvent demander des détails supplémentaires. Si la proposition est acceptée, une expérience numéro et mot de passe seront communiquées. Recherche exclusive peut être effectuée en achetant des beamtime.
2. Compléter la sécurité exigée formation en ligne (à http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining).
3. Livre beamtime sur le calendrier MASSIF-1.
   Remarque : Il est possible de réserver jusqu'à un maximum de 50 titulaires d’échantillon à analyser par quart de travail.
4. Remplir le A-formulaire pour déclarer une expérience par la poste (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form), ainsi que les informations de sécurité requis, pour les échantillons qui doivent être mesurés.

3. création d’un plan de diffraction en ISPyB

Remarque : Le plan de diffraction détient toutes les informations nécessaires pour obtenir un exemple de ISPyB et peut contenir des informations supplémentaires pour personnaliser l’expérience effectuée pour chaque échantillon.

1. Ouvrez ISPyB (à https://exi.esrf.fr/).
2. Choisir des expériences de MX.
3. Connectez-vous avec le numéro de l’expérience et le mot de passe.
4. Cliquez sur | Ajouter un nouveau et fournir les informations nécessaires. Cliquez sur enregistrer.
5. Cliquez sur Add parcelle et renseignez les informations demandées. Cliquez sur enregistrer.
6. Puis, cliquez sur Add conteneur, donnent le code à barres de rondelle comme nom et choisir la rondelle de la colonne vertébrale. Cliquez sur enregistrer.
7. Cliquez sur le symbole du conteneur et le modifieret renseignez les informations nécessaires, comme le nom de protéine, de flux de travail préféré, position de cristal dans la rondelle, etc., concernant les échantillons.
8. Choisissez la protéine (par exemple, GCSH ou lysozyme) qui a été approuvée par le groupe de sécurité ESRF.
9. Entrez un nom d’échantillon unique pour identifier chaque échantillon individuel. On peut éventuellement scanner le code-barres de broche. Le reste de l’information ci-dessous est facultatif.
10. Entrez les informations facultatives.
    1. Pour chaque échantillon individuel, entrez le type de l’expérience (c'est-à-dire, MXPressE_SAD, SCORE ou MXPressO, etc., par défaut MXPressE) sous Exp. Type. Cela définit quel workflow automatique qui sera utilisé pour traiter chaque cristal. Étant donné que les cristaux GCSH sont des aiguilles, choisissez MXPressP.
    2. Entrer dans un groupe d’espace (par exemple, P1, P2 ou C2₁2₁2₁), si elle est connue. S’il est présent, cela servira pour les calculs de données collection stratégie et par les pipelines de traitement automatique des données disponibles.
    3. Saisissez la résolution souhaitée (par défaut : d_min = 2.0 Å). Ceci définit la distance de cristal-à-détecteur pour les scans de maillage initial, la caractérisation et la collecte de données par défaut.
    4. Réglez la résolution de seuil désirée (par exemple, 1,5 Å ou 2.3Å), pour empêcher la collecte de données complètes des cristaux qui diffracter pas à cette limite. Cela peut sauver heure espace et l’analyse de stockage des données.
    5. Définissez la conformité requise (par défaut : 0,99). Définissez la multiplicité requise (par défaut : 4). si plus d’un cristal est contenu sur le support de l’échantillon, définir le nombre maximal de cristaux à analyser. La valeur par défaut est 1 ou 5 pour MXPressP.
    6. Sélectionnez la taille de faisceau appropriées (par défaut : 50 µm). Si une valeur spécifique n’est pas sélectionnée, le X-ray-centrage et calculs de données collection stratégie seront fera avec une taille de faisceau de 50 µm.
       Remarque : Lors de toute collecte ultérieure des ensembles de données complets, la taille du faisceau sera adaptée automatiquement.
    7. Mettre dans le groupe d’espace, si elle est connue, dans la colonne de groupe d’espace forcé. Régler la sensibilité au rayonnement des cristaux (0,5 – 2,0 de faible à haute sensibilité, avec une valeur par défaut 1).
11. Si vous le souhaitez, régler l’angle de rotation totale à percevoir pour la collection dataset complet (par défaut : l’angle de rotation totale déterminée par eEDNA).
12. Enregistrer les valeurs. Cliquez sur retour à livraison. Appuyez sur envoyer l’expédition à l’ESRF.
13. Imprimer l’étiquette d’expédition et envoyer les échantillons. Les utilisateurs devraient organiser un ramassage avec un service de messagerie, en utilisant les coordonnées de compte ESRF.
    Remarque : Il est très important de sélectionner l' étiquette de retour Include pour permettre le retour sans soudure des échantillons (voir https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement).

4. collecte de données, affichage et récupération

Remarque : Le jour de l’expérience, les échantillons sont transférés à la MASSIF-1 haute capacité Dewar (HCD). Source de rayonnement scientifiques puis lancent la collecte des données, qui peut être suivie à distance par les utilisateurs. Pour chaque type d’échantillon différent, les utilisateurs reçoivent un e-mail les informant que la collecte des données a commencé. Comme mentionné plus haut, l’exécution de toutes les étapes dans tous les workflows peut être suivie en ligne et en temps réel par l’utilisateur via ISPyB, dont les résultats peuvent être lus et téléchargés.

1. Pour chaque échantillon analysé, examiner les résultats de l’expérience automatique en ISPyB (https://exi.esrf.fr/).
   1. Connectez-vous, en utilisant le numéro de l’expérience et le mot de passe et cliquez sur la session expérimentale désirée à ID30A-1.
   2. Sélectionnez le préféré (haut-scoring) autoprocessing pipeline (par exemple, les Grenades ou les XDS_APP) et télécharger les données écrites dans le groupe d’espace correct avec l’exhaustivité plus haute et la plus haute résolution en cliquant sur les Derniers résultats de recueillir et, Ensuite, télécharger.
      Remarque : Toutes les images de filet, ligne et la caractérisation sont dans un sous-répertoire pour chaque échantillon, appelé /MXPressE_01. L’ESRF exécute automatiquement cinq paquets de traitement séparé, à savoir EDNA_proc¹², Grenades,¹², XDS_APP¹⁴, autoPROC¹⁵et XIA2¹⁶. Intégration des données repose sur XDS, à l’exception de XIA2, qui repose sur des cadrans. Tous les colis sont également exécutées en mode anormal et nonanomalous, permettant la détection automatique d’un signal anormal, s’il est présent dans les données, qui serviront au SAD progressive des protocoles. Chaque package utilise différents paramètres et les arbres de décision, ce qui signifie que certains paquets fonctionnent mieux avec certains échantillons. Toutefois, cela peut faire pour un grand nombre de résultats lorsque le nombre de paquets et de groupes d’espace possible est pris en compte. Les résultats sont, par conséquent, classés en fonction environ résolution et d’autres mesures de la qualité, tels que R de_fusion dans la coquille de résolution plus faible, CC(1/2) et l’exhaustivité. Cela vise à guider l’utilisateur pour les meilleurs ensembles de données, mais tous les groupes d’espace possible et les résultats devraient être inspectés attentivement.
2. Dézippez le dossier téléchargé, qui comprendra tous les fichiers journaux et XDS_ASCII non fusionné. HKL et fichiers fusionnés et mis à l’échelle .mtz.
   Remarque : dans le cas où la structure (au format PDB) de la protéine d’intérêt ou un homologue étroit a été transférée à ISPyB au début de l’expérience, le pipeline autoprocessing à ESRF effectue automatiquement un remplacement moléculaire (MR), exécuté à l’aide de cette structure comme le modèle de recherche sur le meilleur score de solution. Les résultats de l’oléoduc de Monsieur sont affichés dans ISPyB et se trouvent dans le dossier de données traitées (par exemple, /data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_ mrpipe_dir /). Ici, le modèle final sera nommé coot1.pdb et le sidechains.mtz de données de réflexion. Notez que le gazoduc pourrait réduire la symétrie de la cellule (réduction de maille primitive) afin d’augmenter la probabilité de trouver une solution. Dans le cas en l’espèce, la conduite de Monsieur a écrit la solution dans une maille monoclinique (C2) plutôt que dans une cellule orthorhombique (C222₁). Détails sur la façon d’effectuer un remplacement moléculaire exécutent manuellement (illustrée pour la deuxième meilleur score autoprocessing solution) sont inclus dans les Fichiers supplémentaires.

Representative Results

Le flux de travail MXPressP a servi à l’ESRF beamline MASSIF-1 à, entièrement automatique, monter, centrer dans le faisceau de rayons x, de caractériser et recueillir des ensembles de données de diffraction complète d’une série de cristaux de GCSH humaine. Les échantillons ont été montés et la boucle analysés pour une superficie de scanner (Figure 1, gauche). Après l’analyse de la diffraction, quatre points ont été sélectionnés au sein du cristal pour la collecte de données (Figure 1, droit). Traitement automatisé de données analyse pipelines, y compris le pipeline de Monsieur, a donné des ensembles de données de haute qualité (tableau 1) qui a trouvé une solution de Monsieur a posteriori. Ce dernier permet aux utilisateurs d’évaluer rapidement si le dataset obtenu et le modèle de recherche utilisés sont appropriés pour l’élimination de remplacement moléculaire. En outre, la présence de ligands peut être jugée, ce qui permet à l’utilisateur de se concentrer uniquement sur les ensembles de données plus prometteurs pour une analyse ultérieure. Détermination de la structure manuelle par Monsieur a donné une carte de densité d’électrons de haute qualité après qu’un seul automatisé cycle de raffinement (Figure 2 a). Pour cet ensemble de données, le pipeline automatisé coupe les données à un 1.32 Å résolution ; Cependant, les utilisateurs peuvent toujours décider de couper les données à une résolution inférieure pour en arriver à des statistiques de qualité différentes (CC_1/2, < valeur >, R_ame) dans la coquille de résolution plus élevée. La structure cristalline de la structure humaine de GCSH est similaire à celle de la protéine bovine (3KlR)¹⁶.

Densité électronique continu est visible pour la chaîne de l’ensemble des acides aminés, en dehors de la balise de histidine N-terminale. Les quatre substitutions qui distinguent GCSH humaine et bovine, trois sont facilement identifiables dans la densité d’électrons (Ile/Val66, Asp/Glu98 et Leu/Phe149 ; Figure 2 b -d). C’est moins clair pour la substitution de Asp/Lys125 pour lesquelles la densité d’électrons de la chaîne latérale n'est que partiellement résolue en raison de la flexibilité (Figure 1e). Le modèle actuellement obtenu a R_travailler et R des valeurs_libres de 20,4 % et 23,8 %, respectivement et peut être encore optimisé par cycles supplémentaires de modélisme automatisées et manuelles et de raffinement.

	Pipeline de GRENADES	Pipeline XDS_APP
Traitement et collecte des données
Source de rayons x / ligne de faisceau	ESRF / MASSIF-1
Longueur d’onde (Å)	0,966
Résolution (Å)	41,88 – 1,48 (1,48 – 1,53)	41,86-1,32 (1,39 – 1,32)
Réflexions de total/Unique	127670 / 28644	177332 / 40134
	(12178 / 2775)	(23772 / 5714)
Groupe d’espace pour l’indexation, la mise à l’échelle et la fusion	C222	C2221
Dimensions de la maille
a, b, c (Å)	42,20, 83,75, 95,85	42.19, 83,72, 95,82
Mosaicity	0.05	0.05
Rame (%)	10.0 (110.7)	11.1 (198,2)
< valeur >	9.6 (1.3)	7.6 (0,7)
CC1/2 (%)	99,7 (53,9)	99,7 (19,1)
Complétude (%)	99,6 (99,6)	99,5 (98,6)
Multiplicité	4.5 (4.4)	4.4 (4.2)
Remplacement moléculaire et le raffinement de modèle préliminaire
Groupe d’espace pour l’élimination	C2	C2221
Dimensions de la maille
a, b, c (Å)	83.74, 42,18, 95,82	42.19, 83,72, 95,82
Α, Β, Γ (°)	90, 90.03, 90	90, 90, 90
Modèle de recherche pour Monsieur (PDB)	3KLR	3KLR
Molécules de protéines / ASU	2	1
Résidus de protéines	250	125
Rtravailler/rgratuit (%) après 1er raffinement	24,3 / 26,5	20,4 / 23,8
Longueur de la liaison RMSD (Å) après 1er raffinement	0,01	0,01
Angle de liaison RMSD (°) après 1er raffinement	1.2	1.83
Rotamère aberrantes (%) après 1er raffinement	1.07	4.29
Richet favorisée/autorisé/refusé (%) après 1er raffinement	95,93 / 4,07 / 0	95,12 / 4.88 / 0

Tableau 1 : statistiques de collection, raffinement et la validation des données diffraction des rayons x. Valeurs pour le shell de résolution plus élevé sont indiquées entre parenthèses.

Figure 1 : analyse avant la collecte des données de l’échantillon. (A) la région sélectionnée pour numérisation est illustré par un cadre rouge. (B) l’analyse des images de diffraction est indiqué comme une carte de chaleur. Quatre positions dans le cristal situé ont été sélectionnées pour la collecte de données. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : validation visuelle des cartes de densité d’électron obtenue après affinement. Cartes de densité d’électron profilés à 2 x niveau r.m.s. autour (un) Trp143, (b) Val66 (Ile de GCSH humaine) et (c), Glu98 (Asp dans GCSH humaine) et cartes profilée à 1 x niveau r.m.s autour (d), Phe149 (Leu en humain GCSH) et (e) Lys125 (Asp dans GCSH humaine). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ces faisceaux entièrement automatique fournit collecte automatisée de données et caractérisation d’un grand nombre de cristaux macromoléculaires sans la présence d’un scientifique, soit à la source de rayonnement ou à distance, soit nécessaire. En utilisant des faisceaux de lumière complètement automatisé présente de nombreux avantages par rapport à commande manuelle. Pour exemple, l’échantillon automatisé de centrage, basé sur la maille de rayons x et ligne scanne, est plus précis que celui effectué à le œil humain, comme il n’est pas affectée par les effets thermiques ou optiques. En effet, ces scans de maille et ligne de fournissent des données supplémentaires (c.-à-d. des dimensions détaillées du cristal et le meilleur diffractant région du cristal) qui sont importantes pour déterminer la taille de faisceau correct à utiliser pour la collecte des données — surtout pour les petits cristaux ¹⁸— et aboutissent souvent à une amélioration de la qualité des données obtenues par diffraction. En outre, en tirant parti des paramètres définis par l’utilisateur dans le paramétrage des expériences automatiques, les étapes de flux de travail spécifique peuvent être adaptés pour répondre au mieux au système à l’étude, optimisant ainsi davantage le taux de réussite d’expérience.

Confondus, la fiabilité des flux de travail disponible, l’accès direct à la source de rayonnement (utilisateurs s’organiser, à l’aide d’un calendrier [voir ci-dessus]) et l’approche entièrement automatisée du MASSIF-1 fournit un rigoureux, haut débit et gagner du temps alternative à la classiques expériences pratiques de MX et susceptibles de mettre en œuvre les procédures les plus avancées et des applications dans les workflows automatiques. Dans un proche avenir, cartographie de cristal en 3D¹⁹ est appliqué pour améliorer la précision de centrage de rayons x, tandis que des protocoles plus complexes, tels que crystal déshydratation expériences²⁰, seront automatisés. Il est à espérer que la collecte de données entièrement autonome deviendra une méthode standard en MX, fournissant des données de haute qualité pour les écrans de fragment de petites molécules, optimiser la projection d’un grand nombre de mal diffractant cristaux et fournissant automatiquement phase informations pour résoudre crystal structures de novo. En combinaison avec l’évolution de la situation dans la récolte automatisée des cristaux²¹, la possibilité d’une solution protéique crystal structure comme un service automatisé pourrait bien devenir une réalité.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beamline MASSIF-1	ESRF
BL21DE3	New England Biolabs	C2527I
chloramphenicol	Roth	3886.1
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K	Merck Millipore	UFC803024
Dialyzing membrane	Spectrumlabs	132655
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dnase	Roche	11284932001
DTT	Euromedex	EU0006-B
EDTA- free protease inhibitors	Roche	4,693,159,001
glycerol	VWR Chemicals Prolabo	14388.29T
His-trap HP	GE healthcare	17-5247-01
imidazole	Sigma-Aldrich	56750-500G
IPTG	Euromedex	EU0008-B
LB medium	Sigma-Aldrich	L3022
lipoic acid	Sigma-Aldrich	T5625
loop	Hampton Research	HR8-124
lysozyme	Roche	10 837 059 001
MonoQ 5/50 GL	GE healthcare	17-5166-01
NaCl	Fisher Chemical	S/3160/60
Sonicator vibra cell 75/15	SONICS
SPINE pucks	MiTeGen	SKU: M-CSM003-0001A
Tris base	Euromedex	26-128-3094-B
Sodium Formate	Sigma-Aldrich	1064430500
GCSH purification buffer	20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl
GCSH cryo-protection buffer	0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol
Programs:
MxCube		Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010)	local development
ISPyB	ESRF	Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535	local development
MXCube2	ESRF	Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014).	local development
BES workflow server		Brockhauser, S. et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012).
DOZOR	ESRF	Bourenkov and Popov, unpublished	local development
BLISS beamline control		Guijarro, M. et al. BLISS - Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Spain. doi: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018).	local development
AUTO processing of images		Monaco, S. et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013)	local development
BEST and EDNA		Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009).	local development
CCP4		Winn, M.D. et al. Overview of the CCP 4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011).
Phaser MR		McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007).
Coot		Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004).
refmac5		Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. Acta Crystallographica Section D. 53, 240--255 (1997).
Matthews		Matthews, B.W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).