איסוף נתונים מקריסטלים של מקרומולקולות ביולוגיות ואפיון עצמאית לחלוטין

Summary

כאן, אנו נתאר כיצד להשתמש את הסינון האוטומטי ואת אפשרויות של איסוף נתונים זמינים ב beamlines סינכרוטרון מסוימים. מדענים לשלוח דוגמאות cryocooled סינכרוטרון, ואת המאפיינים עקיפה מוקרנים, ערכות הנתונים נאספים וכוח עיבוד ומתבצע, במידת האפשר, פתרון מבנה — כל זאת ללא התערבות אנושית.

Abstract

קרני רנטגן גבוהה-זוהר יחד עם אוטומציה הובילו השימוש beamlines מבוססי סינכרוטרון macromolecular קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן (MX) אפילו הפרוייקטים המאתגרים ביותר בביולוגיה מבנית. עם זאת, רוב מתקני עדיין דורשים את הנוכחות של מדען באתר כדי לבצע את הניסויים. דור חדש של beamlines אוטומטיות המוקדש באופן אוטומטי לחלוטין אפיון, איסוף נתונים, גבישים של מקרומולקולות ביולוגיות פותחה לאחרונה. Beamlines אלה מייצגים כלי חדש לביולוגים מבניים למסך את התוצאות של ניסויים התגבשות ראשונית ו/או האוסף של מספר גדול של ערכות נתונים עקיפה, ללא צורך לשלוט על הפרעות לקרן החלקיקים עצמם משתמשים. הנה אנחנו מראים כיצד להגדיר ניסוי סינון אוטומטי, איסוף נתונים, כיצד ניסוי זה ביצע את הפרעות לקרן החלקיקים, כמה ערכות הנתונים וכתוצאה מכך מעובדים, איך, במידת האפשר, מבנה גבישי של מקרומולקולה הביולוגי נפתרה.

Introduction

קביעת מבנה תלת ממדי של חלבונים ספציפיים חיוני בביולוגיה. המידע נגזרת עושה אז שופך אור על הפונקציה ביולוגי ועל את הצורה וספציפיות של אתרים פעיל ו/או מחייב הכלול המולקולה שנבחנה. במקרים רבים, זה מאפשר מנגנון פעולה כדי לקבוע או, במידת הצורך, פוטנציאל מולקולות טיפולית שפותחה. MX הטכניקה הנפוץ ביותר להשיג מידע מבניים, אבל צוואר בקבוק הוא קביעת התנאים אופטימליים כדי להשיג גבישים diffracting היטב. לכן, התגבשות ניסויים מבוצעים בתנאים שונים רבים, ואז מוקרנים למציאת הקריסטלים הטוב ביותר לשימוש עבור איסוף נתונים עקיפה. האוטומציה של ההתקנה של התגבשות ניסויים¹ בבירור עזר בהקשר זה. עם זאת, והשלבים הבאים (קרי, קריסטל הרכבה, הקרנה עקיפה, וגם איסוף נתוני דיפרקציה) בדרך כלל מתבצעות באופן ידני, לוקח הרבה זמן, מאמצים ומשאבים. האוטומציה של ההקרנה עקיפה ואיסוף נתונים, לפיכך, פירושו רווח עצום של זמן ויעילות.

ההקרנה עקיפה ואיסוף נתונים ב- MX מתבצע לרוב ב beamlines סינכרוטרון MX שבו אוטומציה הנחתה במידה רבה את התהליך הזה. עם זאת, ברוב המקרים, זה הכרחי עבור המדען להיות נוכח הפרעות לקרן החלקיקים במהלך ניסוי או להפעיל את זה מרחוק. לאחרונה, דור חדש של beamlines MX אוטומטי לגמרי כבר מפותחת². כאן, המשתמשים לא צריך להיות נוכח, פיזית או מרחוק, במהלך מפגש ניסיוני. זה מאפשר למדענים מבזבז יותר זמן על פחות משימות שגרתיות, במקום לבלות ימים כולו, ולעתים קרובות לילות והקרנה קריסטלים איסוף נתונים עקיפה. הראשון אוטומטית לחלוטין הפרעות לקרן החלקיקים בעולם היא מאסיבית אוטומטי מדגם הבחירה משולב מתקן (MASSIF-1, ID30A-1)^2,3 -מתקן קרינה סינכרוטרון האירופית (ESRF). יש סביבה ייחודית מדגם בהם דיואר לדוגמה, המכיל קיבולת גבוהה פועלת במשולב עם מחליף רובוטי מדגם שפועל גם של הפרעות לקרן החלקיקים מד זווית^4,5. מאסיף-1 הוא הפרעות לקרן החלקיקים undulator, מצויד יחיד-פוטון-סופר היברידית פיקסל גלאי⁶, הפועלת על אורך גל קבוע של 0.969 Å (12.84 קוו) עם קרן רנטגן (2 x 10¹² פוטונים/s) אינטנסיבי. ניתן להתאים את גודל קרן במיקום מדגם בין מינימום של 10 מיקרומטר (קרן עגול) למקסימום של מיקרומטר x 65 100 מיקרומטר (אופקי לפי גודל קרן אנכי). בממוצע, הפרעות לקרן החלקיקים ניתן לעבד, באופן אוטומטי לחלוטין אופנה קריסטלים 120 (ראה להלן), ב- 24 שעות. המבצע של הפרעות לקרן החלקיקים מבוססת על סדרה של זרימות עבודה⁷, שכל אחד מהם לוקח החלטות נבונות בהתבסס על התוצאה של השלבים הקודמים בזרימת העבודה, על מנת להבטיח את המדידה של הנתונים אפשרי בצורה הטובה ביותר מכל המדגם במחקר. בפרט, הערכת המאפיינים עקיפה של דוגמה אישית לוקח בחשבון קריסטל נפח, שטף, ומבטיח, איפה הקריסטל הוא גדול יותר מאשר קרן רנטגן, כי רק האזור הטוב ביותר של הגביש משמש עבור הנתונים הבאים אוסף. ערכות נתונים עקיפה, לפיכך, אופטימיזציה עבור הרזולוציה המרבית עם קרינה ממוזער נזק^2,3. תובעניים פרוטוקולים אוסף נתונים, כגון אסטרטגיות אוסף מדומים לוליינית (multi-position) נתונים עבור אוסף נתונים הן מקומיים והן יחיד באורך הגל חריגה עקיפה (SAD) הינם גם זמינים⁸.

ניסויים אוטומטי לחלוטין על היונגפראו-1 כרוכים cryocooling, הרכבה הקריסטלים על הר מגנטי מדגם מתאים תקן הציוד הרצוי הפרעות לקרן החלקיקים פינס עמוד השדרה⁹, הזנת הפרמטרים הרצויים ניסיוני ' עקיפה תוכנית ' שולחן במערכת משולב beamlines (ISPyB) חלבון קריסטלוגרפיה¹⁰, מערכת ניהול מידע מבוססות web לניסויים MX, ושליחת הדגימות הפרעות לקרן החלקיקים. -ESRF, כל העלויות של התחבורה של הדגימות של הפרעות לקרן החלקיקים ואליה נתמכים על ידי המשרד משתמש ESRF (ראה באתר האינטרנט של ה ESRF¹¹ לפרטים). ב מאסיף-1, אין הגבלות על גודל לולאה או קריסטל איכות. בעת בחירת תוכנית עקיפה גביש נתון, המשתמש באפשרותך להשתמש בהגדרות ברירת המחדל או לבחור זרימות עבודה מסוימות, אשר יכול להיות מותאם אישית עבור כל דגימה. מספר זרימות עבודה מתוכנת מראש הינם זמינים. בזרימת העבודה של³ MXPressE, הלולאה לדוגמה, המכיל מיושר קודם מיקום הדגימה באמצעות מרכוז אופטי. לאחר מכן, מבוססת על קרני X מרכוז מבטיחה כי האזור הטוב ביותר של הגביש ממורכזת על הקורה צילום רנטגן. אסטרטגיות אוסף נתונים מחושבים ואז באמצעות eEDNA, מסגרת לפיתוח יישומים מבוססי-תוסף במיוחד עבור ניתוח נתונים מקוון בתחום הניסויים רנטגן, לתוך חשבון קריסטל ונפח שטף בזמן אמת-הפרעות לקרן החלקיקים. בעקבות האוסף של ערכת נתונים מלא עקיפה, אז זה מעובד באמצעות סדרה של עיבוד נתונים אוטומטי צינורות¹² , התוצאות הופכים לזמינים עבור הורדה, בדיקה ב- ISPyB. MXPressE סאד³ זרימת העבודה מכוונת לגבישים selenomethionine של החלבון היעד, מנצלת את העובדה האנרגיה ההפעלה של מאסיף-1 הוא מעט מעל קצה Se K. . כאן, האסטרטגיה אוסף נתונים eEDNA MXPressE ממוטב עבור איסוף נתונים עצוב (קרי, גבוהה יתירות, ועם הרזולוציה מוגדר איפה R_מיזוג בין זוגות Bijvoet להלן 5%). למסך את המאפיינים עקיפה של סדרה של גבישים ללא איסוף נתונים עוקבות, שזרימת העבודה³ MXScoreיכול לשמש כדי לייצר הערכה באיכות מלאה של הקריסטלים מנותח. בזרימת העבודה של³ MXPressI, 180 מעלות של סיבוב נתונים נאספים באמצעות תנודות 0.2 ° ושימוש הזווית פי המוצא ואת הרזולוציה נקבע על ידי אסטרטגיית eEDNA. MXPressO ³ כוללת רזולוציה preobserved לתוך זרימת העבודה (ברירת מחדל: d_דקות = 2 Å). כדי לבצע הערכה ראשונית של הקריסטלים הנובע התגבשות הניסיון, מוצע שזרימת העבודה³ MXPressM. זה מבצע רשת שינוי במינון גבוה לסרוק הכיוון הרחב ביותר של מדגם תמיכה באיסוף נתונים אין או מרכוז. לאחרונה, זרימות שני ניסוי חדש, MXPressP , MXPressP_SAD, ואשר לבצע אוספי נתונים pseudohelical, היו מיושמים⁸. ניתן בעקבות הביצוע של כל השלבים כל זרימות העבודה באינטרנט, בזמן אמת על-ידי המשתמש, באמצעות ISPyB.

הנה אנחנו מראים כיצד להכין את ניסוי ה-MX אוטומטית לחלוטין על היונגפראו-1 וכיצד לאחזר ולנתח את הנתונים הנובעים הניסוי. לדוגמה, אנו משתמשים אנושיים גליצין מיטוכונדריאלי המחשוף מערכת חלבונים H (GCSH). חלבון זה המכיל חומצה ליפואית היא חלק ממערכת המחשוף גליצין אחראי על ההשפלה של גליצין. מערכת זו נוספת כוללת החלבון P decarboxylase תלויי-פוספט גליצין pyridoxal, החלבון T, אנזים הדורשים tetrahydrofolate, החלבון L, lipoamide דהידרוגנאז. GCSH מעבירה את הקבוצה מתילאמין של גליצין של החלבון P החלבון T. פגמים החלבון H הם הגורם nonketotic hyperglycinemia (NKH) בני¹³.

Protocol

הערה: הייצור, טיהור, התגבשות GCSH מתוארים 1 קובץ משלים.

1. תיאור קצר של קריסטל הרכבה והכנה מנותק

1. מיקום לולאת ניילון או תמיכה נוספת של הרכבה קריסטל כבר קבוע כדי סיכה עמוד השדרה תחת אחת או יותר קריסטלים והרם אותם מחוץ הפתרון משקעים (20 µL של 0.5 M נתרן formate pH 4.0 + 25 µL של חלבון פתרון).
   1. להסיר את הנוזל בתפזורת סביב crystal(s) על-ידי נגיעה ההר עם הפתיל נייר למצוץ את הנוזל העודף.
2. להשרות את crystal(s) הפתרון cryoprotective המכיל את המשקעים פתרון בתוספת 30% גליצרול; לאחר מכן, להסיר את התמיכה קריסטל והן את crystal(s).
   1. להסיר את הנוזל בתפזורת סביב crystal(s) על-ידי נגיעה ההר עם הפתיל נייר למצוץ את הנוזל העודף.
3. חיסול ההר לתוך בקבוקון עמוד השדרה מלא עם חנקן נוזלי, לאחסן, יחד עם כל קריסטלים אחרים שהוכנו באופן דומה, ב האירופי לביולוגיה מולקולרית מעבדה (EMBL) / ESRF לטעום פאק מחליף⁹ בטמפרטורת חנקן נוזלי.
   הערה: crystal(s) יציבים במצב זה עד beamtime זמין.

2. מבקש beamtime על היונגפראו-1

1. לבקש beamtime מוקדם ככל האפשר בדף הבית ESRF (-http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying).
   הערה: ישנם מספר המצבים האפשריים של גישה beamlines ESRF MX. מעבדות ניתן להחיל באופן קולקטיבי כחלק של בלוק הקצאת קבוצה (שקית), יש beamtime שהוקצה עבור 2 שנים. אם קבוצות רוצה להחיל בנפרד, הם יכולים להחיל עבור מתגלגל גישה, דבר המאפשר גישה מהירה beamlines לאחר ביקורת עמיתים. ההצעה של הקבוצה שנסקרו ופריט ע י קבוצת בטיחות ESRF מי רשאי לבקש פרטים נוספים. אם ההצעה תתקבל, הניסוי מספר והסיסמה שיועבר. מחקר קניינית יכול להתבצע על ידי רכישת beamtime.
2. להשלים את הבטיחות הנדרשים כדי האימונים באינטרנט (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining).
3. הזמנת beamtime על לוח השנה מאסיף-1.
   הערה: זה אפשרי להזמין עד מקסימום של 50 מחזיקי הדגימה כדי להיות מנותח לפי משמרת.
4. מלאו את טופס להכריז על ניסוי בדואר (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form), יחד עם המידע הבטיחות הנדרשים, על הדגימות שעומדים ניתן למדוד.

3. יצירת תוכנית עקיפה ISPyB

הערה: התוכנית עקיפה מחזיקה את כל המידע הדרוש עבור מדגם ב ISPyB והוא יכול להכיל פרטים נוספים כדי להתאים את הניסוי לבצע עבור כל דגימה.

1. פתח ISPyB (ב https://exi.esrf.fr/).
2. בחרו ' MX ניסויים.
3. התחברו עם הניסוי מספר ואת הסיסמה.
4. לחץ על משלוח | הוסף חדש לספק את המידע הדרוש. לחץ על שמור.
5. לחץ על הוסף חבילה ומלא המידע המבוקש. לחץ על שמור.
6. לאחר מכן, לחץ על הוסף מיכל, לתת את הברקוד פאק כשם ובחרו ' פאק עמוד השדרה. לחץ על שמור.
7. לחץ על סמל מיכל, לערוך, ומלא המידע הדרוש, כמו חלבון שם, זרימת עבודה מועדפת, קריסטל בעמדה הדיסקוס, וכו ', בנוגע הדגימות.
8. בחר את החלבון (לדוגמה, GCSH או ליזוזים), אשר אושרה על ידי הקבוצה בטיחות ESRF.
9. הזן שם ייחודי כדי לזהות כל דגימה בודדת. זה אפשרי באופן אופציונלי לסרוק את הברקוד pin. שאר המידע שלהלן הוא אופציונלי.
10. הזן את המידע האופציונלי.
    1. עבור כל דגימה בודדת, הזן את סוג הניסוי (קרי, MXPressE_SAD, ניקוד או MXPressO, וכו ', ברירת המחדל MXPressE) תחת סוג הוצאה. זה מגדיר זרימת עבודה אוטומטית אשר ישמש כדי לעבד כל קריסטל. בהתחשב בכך הקריסטלים GCSH הן מחטים, לבחור MXPressP.
    2. הזן קבוצת מרחב (לדוגמה, P1, P2 או C2₁2₁2₁), אם ידוע. במקרה כזה, זה ישמש לחישוב אסטרטגיה אוסף נתונים ועל -ידי צינורות עיבוד נתונים אוטומטי זמין.
    3. הזן את הרזולוציה הרצויה (ברירת מחדל: d_דקות = 2.0 Å). אפשרות זו מגדירה את המרחק קריסטל-כדי-גלאי עבור רשת הראשונית סריקות, אפיון, איסוף הנתונים המוגדר כברירת מחדל.
    4. הגדרת רזולוציה הסף הרצויה (לדוגמה, 1.5 Å או 2.3Å), כדי למנוע האוסף של מלא datasets מקריסטלים אשר מכמותה לפי מגבלה זו. זה באפשרותך לחסוך זמן מרחב וניתוח של אחסון נתונים.
    5. הגדר את שלמות התרגום הנדרש (ברירת מחדל: 0.99). הגדר הריבוי הנדרש (ברירת מחדל: 4). אם אחד או יותר קריסטל מוכל על התמיכה לדוגמה, להגדיר את המספר המירבי של גבישים כדי להיות מנותח. ערך ברירת המחדל הוא 1 או 5 עבור MXPressP.
    6. בחר את גודל הקרן המתאימה (ברירת מחדל: 50 מיקרומטר). אם ערך מסוים לא נבחרה, X-ray-מרכוז, לחישובי אסטרטגיה אוסף נתונים יבוצעו עם קרן בגודל של 50 מיקרומטר.
       הערה: במהלך כל איסוף עוקבות של ערכות נתונים מלאה, גודל קרן תותאם באופן אוטומטי.
    7. לשים בקבוצה החלל, אם ידוע, בעמודה קבוצה שטח בכפייה. הגדר את הקרינה-הרגישות של הקריסטלים (0.5 – 2.0 רגישות נמוך עד גבוה, עם ערך ברירת מחדל של 1).
11. אם רצונך בכך, לקבוע את זווית הסיבוב הכולל להיות שנאספו עבור אוסף הנתונים (dataset) מלא (ברירת מחדל: זווית הסיבוב הכולל שנקבע על-ידי eEDNA).
12. שמור את הערכים. לחץ על חזור אל משלוחים. לחץ על שלח המשלוח ל- ESRF.
13. להדפיס את התווית משלוח ולשלוח את הדגימות. המשתמשים צריכים לארגן טנדר עם שליח, באמצעות פרטי חשבון ESRF.
    הערה: חשוב מאוד לבחור תווית החזרה כלול לאפשר את החזרת חלקה של דגימות (ראו https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement).

4. איסוף נתונים, צפייה ואחזור

הערה: ביום של הניסוי, דגימות מועברים אל היונגפראו-1 גבוהה קיבולת דיואר (HCD). הפרעות לקרן החלקיקים מדענים ההשקה אז איסוף הנתונים, אשר יכול לבוא המשתמשים מרחוק. עבור כל סוג דגימה שונים משתמשים לקבל הודעת דואר אלקטרוני המיידעת אותם כי החלה איסוף הנתונים. כאמור, ניתן בעקבות הביצוע של כל השלבים כל זרימות העבודה באינטרנט, בזמן אמת על ידי המשתמש באמצעות ISPyB, שממנו התוצאות יכול להיות לצפייה ולהורדה.

1. עבור כל דגימה לבדיקה, לבחון את התוצאות של הניסוי אוטומטית ב ISPyB (https://exi.esrf.fr/).
   1. היכנס, עם ניסוי מספר וסיסמה, ולחץ על ההפעלה הניסיונית הרצוי ב- ID30A-1.
   2. בחר המועדפת (בעל ניקוד העליון) עיבוד אוטומטי צינור (לדוגמה, ' רימונים ' או ' XDS_APP '), להוריד את הנתונים לפלט בקבוצה השטח הנכון עם השלמות הגבוהה ביותר ואת הרזולוציה הגבוהה ביותר על ידי לחיצה על תוצאות איסוף האחרון , לאחר מכן, הורד.
      הערה: כל התמונות רשת שינוי ', ' קו, אפיון הן בספריית משנה עבור כל דגימה, שנקרא /MXPressE_01. ESRF יפעיל באופן אוטומטי חמש חבילות עיבוד נפרדות, כלומר EDNA_proc¹², רימונים¹², XDS_APP¹⁴, autoPROC¹⁵, ו XIA2¹⁶. שילוב נתונים מבוסס על XDS, למעט XIA2, אשר מבוססת על החוגה. כל החבילות הן להפעיל מצבי חריגות ו- nonanomalous, המאפשר את הגילוי האוטומטי של אות חריג, אם נוכח הנתונים, כדי לשמש סאד בהדרגה פרוטוקולים. כל חבילה משתמש פרמטרים שונים, עצי החלטה, כלומר כי כמה חבילות לרוץ טוב יותר עם דוגמאות מסוימות. עם זאת, הדבר עשוי להפוך עבור מספר גדול של תוצאות כאשר מספר חבילות וקבוצות שטח אפשרי מהצהוב. התוצאות, לכן, מדורגים בהתאם בערך הרזולוציה ואת מדדי איכות נוספים, כגון R_מיזוג מעטפת ברזולוציה הנמוכה ביותר, CC(1/2) ולאחר השלמות. וזה מכוון מנחה את המשתמש אל ערכות הנתונים הטוב ביותר, אבל כל מקום אפשרי קבוצות ותוצאות צריך להיבדק בקפידה.
2. לפתוח את תיקיית שהורדו, אשר יכלול את כל קבצי יומן רישום של XDS_ASCII שלא מוזג. HKL וקבצים .mtz הממוזג, שקנה המידה שלה השתנה.
   הערה: במקרה המבנה (בפורמט PDB) של החלבון מעניינים או של homolog קרוב הועלה אל ISPyB בתחילת הניסוי, צינור עיבוד אוטומטי-ESRF באופן אוטומטי יבצע תחליף מולקולרית (MR) להפעיל אותו באמצעות את המבנה הידוע חיפוש מודל על הטוב ביותר הניקוד פתרון. התוצאות של הצינור מר מוצגים ב- ISPyB, ניתן למצוא את תיקיית הנתונים מעובדים (לדוגמה, /data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_ mrpipe_dir /). . הנה, הדגם הסופי תיקרא coot1.pdb ו- sidechains.mtz נתונים של השתקפות. שימו לב כי הצינור עשוי להפחית את הסימטריה של התא (תא פרימיטיבי הפחתת) כדי להגביר את הסבירות של מציאת פתרון. במקרה כאן, הצינור מר כתב את הפתרון באופן המונוקלינית תא (C2) ולא תא האורתורומבית (C222₁). פרטים על איך לבצע תחליף מולקולרית להפעיל באופן ידני (דוגמה עבור הפתרון השני הבקיע ביותר עיבוד אוטומטי) כולל הקבצים המשלימים.

Representative Results

זרימת העבודה MXPressP שימשה ב הפרעות לקרן החלקיקים ESRF מאסיף-1, באופן מלא באופן אוטומטי, הר, במרכז קרן רנטגן, לאפיין, ולאסוף עקיפה מלא ערכות נתונים מסידרה של גבישים של האדם GCSH. הדגימות רכוב וניתח הלולאה עבור אזור לסרוק (איור 1, משמאל). לאחר הניתוח של עקיפה, נבחרו ארבע נקודות בתוך הקריסטל עבור איסוף נתונים (איור 1, ימינה). עיבוד על ידי צינורות ניתוח נתונים אוטומטיים, כולל צינור מר, הניב datasets באיכות גבוהה (טבלה 1) שנמצא פתרון מר עוקבות. האחרון מאפשר למשתמשים במהירות להעריך אם את ערכת הנתונים שהושג ודגם משומשים חיפוש מתאימים בהדרגה על ידי החלפת מולקולרית. בנוסף, הנוכחות של ליגנדים יכולה להישפט, וכך מאפשר למשתמש להתמקד רק datasets המבטיחים ביותר לצורך ניתוח נוסף. מכשור לקביעת קשיות ומבנה ידנית על ידי מר הניב מפת צפיפות אלקטרונים באיכות גבוהה לאחר יחיד אוטומטית עידון מחזור (איור 2 א). בשביל זה dataset, הצינור אוטומטית חותכים את הנתונים 1.32 רזולוציה; עם זאת, משתמשים יכולים עדיין מחליט לוותר על הנתונים ברזולוציה נמוכה יותר להגיע בסטטיסטיקות איכות שונים (CC_1/2, < I/σ(I) >, R_אותי) במעטפת ברזולוציה הגבוהה ביותר. למבנה הגבישי של מבנה GCSH האנושי דומה לזה של ה-שור חלבון (3KlR)¹⁶.

צפיפות אלקטרונים רציפה היא גלויה, שרשרת חומצות אמיניות שלם, מלבד התג היסטידין N-מסוף. ארבעה התחליפים להבדיל GCSH שור ואנושי, של שלוש הן ולהמציא צפיפות אלקטרונים (Ile/Val66, Asp/Glu98 ו- Leu/Phe149; איור 2b -d). . זה פחות ברור עבור ההחלפה Asp/Lys125 אשר צפיפות אלקטרונים של שרשרת הצד נפתרה באופן חלקי בלבד בשל גמישות (איור 1e). המודל שהושג כיום יש R_לעבוד , ערכי R_חינם 20.4% ו- 23.8%, בהתאמה, ניתן למטב עוד יותר על ידי מחזורים נוספים של בניית מודל אוטומטיות וידניות, עידון.

	צינור רימונים	צינור XDS_APP
איסוף נתונים ועיבוד
רנטגן מקור / קרן קו	ESRF / מאסיף-1
אורך הגל (Å)	0.966
רזולוציה (Å)	41.88 – 1.48 (1.53-1.48)	41.86-1.32 (1.39 – 1.32)
סה כ/Unique השתקפויות	127670 / 28644	177332 / 40134
	(12178 / 2775)	(23772 / 5714)
חבורת סימטריות מרחבית עבור יצירת אינדקס, שינוי קנה מידה של ומיזוג	C222	C2221
מידות תא
א, ב, ג ()	42.20, 83.75, 95.85	42.19, 83.72, 95,82
Mosaicity	0.05	0.05
Rאותי (%)	10.0 (110.7)	11.1 (198.2)
< I/σ(I) >	9.6 (1.3)	7.6 (0.7)
סמ ק1/2 (%)	99.7 (53.9)	99.7 (19.1)
השלמות (%)	99.6 (99.6)	99.5 (98.6)
ריבוי	4.5 (4.4)	4.4 (4.2)
החלפת מולקולרית ועידון דגם ראשוני
חבורת סימטריות מרחבית עבור בהדרגה	C2	C2221
מידות תא
א, ב, ג ()	83.74, 42.18, 95.82	42.19, 83.72, 95,82
Α, Β, Γ (°)	90, 90.03, 90	90, 90, 90
חיפוש מודל עבור מר (PDB)	3KLR	3KLR
מולקולות חלבון / ASU	2	1
חלבון שאריות	250	125
Rלעבוד/Rחינם (%) לאחר עידון 1	24.3 / 26.5	20.4 / 23.8
אורך הקשר RMSD (Å) לאחר עידון 1	0.01	0.01
RMSD בונד זווית (°) לאחר עידון 1	1.2	1.83
חריג חשוד טעות Rotamer (%) לאחר עידון 1	1.07	4.29
Ramachandran מועדפים/מותר/אסור (%) לאחר עידון 1	95.93 / 4.07 / 0	95.12 / 4.88 / 0

טבלה 1: קרני רנטגן נתונים אוסף עידון, אימות נתונים סטטיסטיים- הערכים עבור המעטפת ברזולוציה הגבוהה ביותר ניתנת בסוגריים מרובעים.

איור 1: לטעום ניתוח לפני איסוף נתונים- (א) האזור שנבחר עבור סריקה מוצג בתיבה אדומה. (B) הניתוח של תמונות דיפרקציה מוצגת כמפה חום. ארבע עמדות בתוך הקריסטל ממוקם נבחרו עבור איסוף נתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: אימות חזותי של מפות צפיפות אלקטרונים שהושג לאחר עידון. מפות צפיפות אלקטרונים מתאר ב 2-רמת r.m.s. סביב () Trp143, (b) Val66 (Ile ב GCSH אנושי), ו- (ג) Glu98 (Asp ב GCSH האנושי) ומפות מתאר ב 1-רמת לר מסביב (d) Phe149 (Leu ב GCSH האנושי) ו- (e) Lys125 (Asp ב GCSH האנושי). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

Beamlines אוטומטי לחלוטין לספק אוטומטיות האפיון ואיסוף נתונים ממספרים גדולים של גבישים macromolecular ללא הנוכחות של מדען, את הפרעות לקרן החלקיקים או מרחוק, ונדרשת. שימוש beamlines אוטומטי לגמרי יש יתרונות רבים בהשוואה באופן ידני. לדוגמה, המדגם אוטומטיות מרכוז, המבוססת על רשת הרנטגן, קו סורק, יותר מדויק מאשר לבצע עם העין האנושית כמו זה אינו מושפע אפקטים תרמיים או אופטי. ואכן, אלה סריקות רשת וקו לספק נתונים נוספים (קרי, מידות מפורטת של הקריסטל ואת הטוב ביותר diffracting אזור של הגביש) אשר חשובים בקביעת גודל קרן הנכון כדי להשתמש עבור אוסף נתוני — במיוחד עבור גבישים קטנים ¹⁸— לעיתים קרובות לגרום גם שיפור איכות הנתונים עקיפה שהושג. יתר על כן, על ידי ניצול של הפרמטרים המוגדרים על-ידי המשתמש בכיוונון של ניסויים אוטומטיים, התפורות השלבים בזרימות עבודה ספציפיים ולביצועי המערכת שנבחנה, ובכך נוספים מיטוב שיעור ההצלחה בניסוי.

לוקחים ביחד, האמינות של זרימות העבודה זמין, גישה ישירה של הפרעות לקרן החלקיקים (משתמשים עצמית תזמון, באמצעות לוח שנה [ראה לעיל]), ואת הגישה אוטומטית לחלוטין של מאסיף-1 מספק קפדני, תפוקה גבוהה, ואת לחיסכון בזמן אלטרנטיבה קלאסית ניסויים MX על הידיים ואת הפוטנציאל ליישם נהלים ויישומים מתקדמים יותר לתוך זרימות עבודה אוטומטיות. בעתיד הקרוב, קרטוגרפיה קריסטל תלת-ממד¹⁹ תיושם כדי לשפר את הדיוק של רנטגן מרכוז, בעוד בפרוטוקולים מורכבים יותר, כגון קריסטל התייבשות ניסויים²⁰, יתבצע באופן אוטומטי. יש לקוות כי איסוף נתונים עצמאי לחלוטין תהפוך שיטה סטנדרטית ב- MX, אספקת נתונים באיכות גבוהה עבור מסכי מולקולה קטנה פרגמנט, אופטימיזציה של ההקרנה של מספרים גדולים של לקוי diffracting קריסטלים ולספק אוטומטית שלב מידע לפתור קריסטל מבנים de novo. בשילוב עם ההתפתחויות קציר אוטומטיות של גבישים²¹, האפשרות של חלבון קריסטל מבנה הפתרון כשירות אוטומטית יכול גם להפוך למציאות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beamline MASSIF-1	ESRF
BL21DE3	New England Biolabs	C2527I
chloramphenicol	Roth	3886.1
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K	Merck Millipore	UFC803024
Dialyzing membrane	Spectrumlabs	132655
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dnase	Roche	11284932001
DTT	Euromedex	EU0006-B
EDTA- free protease inhibitors	Roche	4,693,159,001
glycerol	VWR Chemicals Prolabo	14388.29T
His-trap HP	GE healthcare	17-5247-01
imidazole	Sigma-Aldrich	56750-500G
IPTG	Euromedex	EU0008-B
LB medium	Sigma-Aldrich	L3022
lipoic acid	Sigma-Aldrich	T5625
loop	Hampton Research	HR8-124
lysozyme	Roche	10 837 059 001
MonoQ 5/50 GL	GE healthcare	17-5166-01
NaCl	Fisher Chemical	S/3160/60
Sonicator vibra cell 75/15	SONICS
SPINE pucks	MiTeGen	SKU: M-CSM003-0001A
Tris base	Euromedex	26-128-3094-B
Sodium Formate	Sigma-Aldrich	1064430500
GCSH purification buffer	20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl
GCSH cryo-protection buffer	0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol
Programs:
MxCube		Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010)	local development
ISPyB	ESRF	Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535	local development
MXCube2	ESRF	Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014).	local development
BES workflow server		Brockhauser, S. et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012).
DOZOR	ESRF	Bourenkov and Popov, unpublished	local development
BLISS beamline control		Guijarro, M. et al. BLISS - Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Spain. doi: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018).	local development
AUTO processing of images		Monaco, S. et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013)	local development
BEST and EDNA		Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009).	local development
CCP4		Winn, M.D. et al. Overview of the CCP 4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011).
Phaser MR		McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007).
Coot		Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004).
refmac5		Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. Acta Crystallographica Section D. 53, 240--255 (1997).
Matthews		Matthews, B.W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).