Summary
यहां, हम वर्णन कैसे स्वचालित स्क्रीनिंग और डेटा संग्रह कुछ सिंक्रोट्रॉन beamlines पर उपलब्ध विकल्पों का उपयोग करने के लिए । वैज्ञानिकों synchrotron करने के लिए cryocooled नमूने भेजने के लिए, और विवर्तन संपत्तियों की जांच कर रहे हैं, डेटा सेट एकत्र और संसाधित कर रहे हैं और, जहां संभव हो, एक संरचना समाधान बाहर किया जाता है-सभी मानव हस्तक्षेप के बिना.
Abstract
उच्च-प्रतिभा एक्स-रे बीम स्वचालन के साथ मिलकर संरचनात्मक जीव विज्ञान में भी सबसे चुनौतीपूर्ण परियोजनाओं के लिए synchrotron आधारित macromolecular एक्स-रे क्रिस्टलग्राफी (MX) beamlines का उपयोग करने के लिए नेतृत्व किया है । हालांकि, अधिकांश सुविधाएं अभी भी साइट पर एक वैज्ञानिक की उपस्थिति के लिए प्रयोग करने की आवश्यकता है । एक नई पीढ़ी के स्वचालित रूप से स्वचालित लक्षण वर्णन के लिए समर्पित है, और डेटा संग्रह से, जैविक अणुओं के क्रिस्टल हाल ही में विकसित किया गया है । ये बीएमलाइंस संरचनात्मक जीव विज्ञानियों के लिए एक नए उपकरण का प्रतिनिधित्व करने के लिए प्रारंभिक क्रिस्टलीकरण परीक्षण के परिणाम स्क्रीन और/या विवर्तन डेटा सेट की बड़ी संख्या का संग्रह, उपयोगकर्ताओं को खुद beamlines नियंत्रण रखने के बिना । यहां हम बताएंगे कि कैसे स्थापित करने के लिए एक प्रयोग के लिए स्वचालित स्क्रीनिंग और डेटा संग्रह, कैसे एक प्रयोग beamline पर प्रदर्शन किया है, कैसे परिणामी डेटा सेट संसाधित कर रहे हैं, और कैसे, जब संभव हो, जैविक मैक्रोमोलेक्यूल के क्रिस्टल संरचना हल है ।
Introduction
विशिष्ट प्रोटीन की त्रि-आयामी संरचना का निर्धारण जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण है । ऐसा करने से प्राप्त जानकारी जैविक प्रकार्य पर प्रकाश डालता है तथा अध्ययन के अधीन अणु में निहित सक्रिय तथा/अथवा बाध्यकारी स्थलों की आकृति एवं विशिष्टता पर । कई मामलों में, यह निर्धारित करने के लिए कार्रवाई के तंत्र की अनुमति देता है या, जहां उपयुक्त, संभावित चिकित्सीय अणुओं को विकसित किया जाना है । एमएक्स सबसे अधिक संरचनात्मक जानकारी प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया तकनीक है, लेकिन एक अड़चन इष्टतम शर्तों के दृढ़ संकल्प को अच्छी तरह से प्राप्त करने के लिए-diffracting क्रिस्टल है । इसलिए, क्रिस्टलीकरण परीक्षण कई विभिंन स्थितियों में किया जाता है और फिर जांच कर रहे हैं, के लिए सबसे अच्छा क्रिस्टल को खोजने के लिए विवर्तन डेटा संग्रह के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । क्रिस्टलीकरण परीक्षण1 की स्थापना के स्वचालन इस संबंध में स्पष्ट रूप से मदद की है । हालांकि, बाद के कदम (यानी, क्रिस्टल बढ़ते, विवर्तन स्क्रीनिंग, और विवर्तन डेटा संग्रह) आमतौर पर मैंयुअल रूप से बाहर किया जाता है, समय, प्रयास, और संसाधनों का एक बहुत ले । इसलिए, द्विवर्तन स्क्रीनिंग और डेटा संग्रह के स्वचालन का मतलब समय और कुशलता में एक विशाल लाभ होगा ।
diffraction स्क्रीनिंग और एमएक्स में डेटा संग्रह सबसे अधिक बार सिंक्रोट्रॉन एमएक्स beamlines पर किया जाता है, जिस पर स्वचालन काफी हद तक इस प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाया है. हालांकि, ज्यादातर मामलों में, यह वैज्ञानिक के लिए आवश्यक है एक प्रयोग के दौरान बीएमलाइन पर मौजूद हो या इसे दूर से संचालित । हाल ही में, पूरी तरह से स्वचालित एमएक्स बीएमलाइंस की एक नई पीढ़ी विकसित किया गया है2। यहां, उपयोगकर्ताओं को या तो शारीरिक रूप से या दूर से, एक प्रयोगात्मक सत्र के दौरान उपस्थित होने की जरूरत नहीं है । यह वैज्ञानिकों कम नियमित कार्यों पर अधिक समय बिताने के बजाय पूरे दिन खर्च करने की अनुमति देता है, और अक्सर रातों, क्रिस्टल स्क्रीनिंग और द्विवर्तन डेटा एकत्रित । दुनिया की पहली पूरी तरह से स्वचालित बीएमलाइन है व्यापक स्वचालित नमूना चयन एकीकृत सुविधा (मैसिफ-1, ID30A-1)2,3 यूरोपीय synchrotron विकिरण सुविधा (esrf) पर. यह एक अनूठा नमूना वातावरण है जिसमें एक उच्च क्षमता के नमूने युक्त देवर एक रोबोट नमूना परिवर्तक के साथ मिलकर काम करता है, जो बीएमलाइन के गोनियोमीटर4,5के रूप में भी कार्य करता है । मैसिफ-1 एक एकल-photon के साथ सुसज्जित एक अनड्यूलेटर बीएमलाइन है-संकर पिक्सेल डिटेक्टर6, कि ०.९६९ Å की एक निश्चित तरंग दैर्ध्य पर संचालित (१२.८४ कीव) एक तीव्र एक्स-रे बीम के साथ (2 X 1012 फोटॉनों/ प्रतिदर्श की स्थिति में बीम का आकार न्यूनतम 10 माइक्रोमीटर (गोल बीम) से अधिकतम १०० μm x ६५ μm (ऊर्ध्वाधर बीम आकार से क्षैतिज) के बीच समायोजित किया जा सकता है । औसत पर, बीमलाइन एक पूरी तरह से स्वचालित फैशन में, प्रक्रिया कर सकते हैं (नीचे देखें), 24 में १२० क्रिस्टल एच । बीएमलाइन का संचालन वर्कफ़्लोज़7की एक श्रृंखला पर आधारित है, जिसमें से प्रत्येक, कार्यप्रवाह में पिछले चरणों के परिणाम के आधार पर बुद्धिमान निर्णय लेता है, ताकि अध्ययन के अंतर्गत नमूने से सर्वोत्तम संभव डेटा का माप सुनिश्चित किया जा सके. विशेष रूप से, एक व्यक्ति के नमूने के द्विवर्तन विशेषताओं के मूल्यांकन खाते क्रिस्टल की मात्रा और प्रवाह में लेता है और सुनिश्चित करता है, जहां क्रिस्टल एक्स-रे बीम से बड़ा है, कि केवल क्रिस्टल का सबसे अच्छा क्षेत्र बाद के डेटा के लिए प्रयोग किया जाता है संग्रह. विवर्तन डेटा सेट, इस प्रकार, ंयूनतम विकिरण क्षति2,3के साथ अधिकतम संकल्प के लिए अनुकूलित कर रहे हैं । डेटा संग्रह प्रोटोकॉल, जैसे कि छद्म-कुंडलिनी (बहु-स्थिति) डेटा संग्रह कार्यनीतियां, दोनों के लिए मूल और एकल-तरंगदैर्घ्य असंगत द्विवर्तन (SAD) डेटा संग्रह, की मांग भी8उपलब्ध हैं ।
पूरी तरह से स्वचालित प्रयोगों पर massif-1 शामिल cryocooling और एक चुंबकीय नमूना वांछित बीमलाइन उपकरण मानक पिन स्पाइन9के लिए उपयुक्त माउंट पर क्रिस्टल बढ़ते, ' विवर्तन में वांछित प्रयोगात्मक मापदंडों में प्रवेश प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी बीएमलाइंस (ISPyB)10, एमएक्स प्रयोगों के लिए एक वेब आधारित सूचना प्रबंधन प्रणाली के लिए एकीकृत प्रणाली में योजना ' तालिका, और बीएमलाइन के लिए नमूने भेजने. ईएसआरएफ में, बीएमलाइन के लिए/से नमूनों के परिवहन की सभी लागतों का ईएसआरएफ प्रयोक्ता कार्यालय द्वारा समर्थन किया जाता है (विवरण के लिए ईएसआरएफ11 की वेबसाइट देखें) । मैसिफ-1 पर, कोई प्रतिबंध लूप आकार या क्रिस्टल गुणवत्ता पर रखा जाता है । किसी दिए गए क्रिस्टल के लिए कोई डिफ़क्शन योजना चुनते समय, उपयोगकर्ता या तो डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स का उपयोग कर सकता है या विशिष्ट वर्कफ़्लोज़ में से चुन सकते हैं, जिसे प्रत्येक नमूने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. कई preprogrammed वर्कफ़्लोज़ उपलब्ध हैं । Mxpresse3 वर्कफ़्लो में, नमूना-युक्त लूप पहले ऑप्टिकल centering का उपयोग कर नमूना स्थिति के लिए संरेखित है । फिर, एक्स-रे आधारित केंद्रित सुनिश्चित करता है कि क्रिस्टल का सबसे अच्छा क्षेत्र एक्स-रे बीम करने के लिए केंद्रित है । डेटा संग्रह रणनीतियों तो eEDNA, विशेष रूप से एक्स-रे प्रयोगों क्षेत्र में ऑनलाइन डेटा विश्लेषण के लिए प्लगइन आधारित अनुप्रयोगों के विकास के लिए एक ढांचे का उपयोग कर की गणना कर रहे हैं, खाते क्रिस्टल मात्रा और beamline पर वास्तविक समय प्रवाह में ले । एक पूर्ण विवर्तन डेटा सेट के संग्रह के बाद, यह तो स्वचालित डेटा प्रसंस्करण पाइपलाइनों की एक श्रृंखला का उपयोग कर संसाधित किया जाता है12 और परिणाम निरीक्षण और ispyb में डाउनलोड के लिए उपलब्ध कराया जाता है । Mxpresse SAD3 कार्यप्रवाह लक्ष्य प्रोटीन के क्रिस्टल युक्त सेलेमेथियोनिन के उद्देश्य से है और इस तथ्य का दोहन करता है कि मैसिफ के ऑपरेटिंग ऊर्जा-1 बस एसई कश्मीर एज से ऊपर है । यहां, MXPressE eEDNA डेटा संग्रह रणनीति उदास डेटा संग्रह के लिए अनुकूलित है (यानी, उच्च अतिरेक, और संकल्प के साथ जहां Bijvoet जोड़े के बीच आरविलय 5% से नीचे है सेट के साथ) । क्रमिक डेटा संग्रह के बिना क्रिस्टल की एक श्रृंखला के विवर्तन गुण स्क्रीन करने के लिए, mxscore3 कार्यप्रवाह का विश्लेषण क्रिस्टल का एक पूर्ण गुणवत्ता मूल्यांकन का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । mxpressi3 कार्यप्रवाह में, रोटेशन डेटा के १८० ° ०.२ ° दोलनों का उपयोग कर एकत्र कर रहे हैं और शुरू phi कोण और एक eedna रणनीति द्वारा निर्धारित संकल्प का उपयोग कर. Mxpresso 3 में कार्यप्रवाह (डिफ़ॉल्ट: dMin = 2 Å) में पूर्वस्वीकार्य रिज़ॉल्यूशन शामिल होता है । क्रिस्टलीकरण परीक्षण से उत्पन्न क्रिस्टल का प्रारंभिक मूल्यांकन करने के लिए, Mxpressm3 कार्यप्रवाह की पेशकश की है । यह कोई डेटा संग्रह या centering के साथ नमूना समर्थन के व्यापक अभिविंयास पर एक उच्च खुराक जाल स्कैन करता है । हाल ही में, दो नए प्रयोग वर्कफ़्लोज़, Mxpressp और mxpressp_sad, जो स्यूडोहेल्कल डेटा संग्रह करते हैं,8लागू किए गए हैं । सभी वर्कफ़्लोज़ में सभी चरणों का निष्पादन ऑनलाइन और रीयल-टाइम में उपयोगकर्ता द्वारा, ISPyB द्वारा फ़ॉलो किया जा सकता है.
यहाँ हम MASSIF-1 पर एक पूरी तरह से स्वचालित MX प्रयोग तैयार करने के लिए कैसे दिखाने के लिए और कैसे प्राप्त करने और प्रयोग से उत्पन्न डेटा का विश्लेषण करने के लिए कैसे. उदाहरण के तौर पर हम ह्यूमन माइटोकोड्रियल ग्लाइसिन क्लीवेज सिस्टम प्रोटीन एच (GCSH) का इस्तेमाल करते हैं । यह लिपोइक अम्ल युक्त प्रोटीन ग्लाइसिन क्लीवेज प्रणाली का हिस्सा है जो ग्लाइसिन के क्षरण के लिए उत्तरदायी है । इस प्रणाली के अलावा पी प्रोटीन, एक pyridoxal फॉस्फेट निर्भर ग्लाइसिन decarboxylase, टी प्रोटीन, एक tetrahydrofolate की आवश्यकता एंजाइम, और एल प्रोटीन, एक लिपोएमाइड डिहाइड्रोजनेज शामिल हैं । gcsh टी प्रोटीन के लिए पी प्रोटीन से ग्लाइसिन के methylamine समूह स्थानांतरण । ज प्रोटीन में दोष मानवों में होने वाले नॉनकीटिक हाइपरग्लाइसिनेमिया (NKH) के कारण होते हैं13.
Protocol
नोट:, उत्पादन, शुद्धि, और GCSH के क्रिस्टलीकरण अनुपूरक फ़ाइल 1में वर्णित हैं ।
1. ऑफलाइन तैयारी और क्रिस्टल बढ़ते का संक्षिप्त विवरण
- एक नायलॉन पाश या एक और क्रिस्टल बढ़ते समर्थन पहले से ही एक या एक से अधिक क्रिस्टल के तहत एक रीढ़ की हड्डी पिन करने के लिए निर्धारित स्थिति और उन्हें वर्षा समाधान से बाहर उठा (20 μl की ०.५ मीटर सोडियम फोरमेट पीएच ४.० + 25 μl प्रोटीन समाधान).
- किसी भी अतिरिक्त तरल चूसना करने के लिए एक कागज बाती के साथ माउंट छू द्वारा क्रिस्टल (एस) के आसपास थोक तरल निकालें ।
- क्रिस्टल (s) के लिए वर्षा समाधान प्लस 30% ग्लिसरोल युक्त cryoprotective समाधान में सोख; उसके बाद, क्रिस्टल समर्थन और क्रिस्टल (s) निकालें ।
- किसी भी अतिरिक्त तरल चूसना करने के लिए एक कागज बाती के साथ माउंट छू द्वारा क्रिस्टल (एस) के आसपास थोक तरल निकालें ।
- तरल नाइट्रोजन से भरा एक रीढ़ की शीशी में माउंट डुबकी और यह दुकान, किसी भी अन्य क्रिस्टल के साथ इसी तरह तैयार, एक यूरोपीय आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशाला में (EMBL)/esrf नमूना परिवर्तक पक9 तरल नाइट्रोजन के तापमान पर.
नोट: क्रिस्टल (s) इस स्थिति में स्थिर है जब तक beamtime उपलब्ध है ।
2. मैसिफ-1 पर beamtime का अनुरोध
- ESRF मुखपृष्ठ पर (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying पर) के रूप में जल्दी संभव के रूप में beamtime अनुरोध ।
नोट: ESRF MX बीएमलाइंस तक पहुँच के संभावित मोड के एक नंबर रहे हैं. प्रयोगशालाओं एक ब्लॉक आवंटन समूह (बैग) के भाग के रूप में सामूहिक रूप से लागू कर सकते हैं, के लिए 2 साल के लिए आवंटित beamtime है । यदि समूह व्यक्तिगत रूप से लागू करना चाहते हैं, तो वे रोलिंग एक्सेस के लिए आवेदन कर सकते हैं, जो सहकर्मी की समीक्षा के बाद उंहें तेजी से पहुंच की अनुमति देता है । समूह के प्रस्ताव की समीक्षा की जाएगी और ईएसआरएफ सुरक्षा समूह द्वारा मंजूरी दी जाएगी जो अतिरिक्त विवरणों का अनुरोध कर सकता है । यदि प्रस्ताव स्वीकार कर लिया जाता है, तो एक प्रयोग संख्या और पासवर्ड की सूचना दी जाएगी । मालिकाना अनुसंधान beamtime खरीद द्वारा किया जा सकता है । - आवश्यक सुरक्षा प्रशिक्षण ऑनलाइन (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining पर) पूरा करें ।
- मैसिफ-1 कैलेंडर पर पुस्तक beamtime ।
नोट: यह ५० नमूना धारकों की एक अधिकतम करने के लिए बुक करने के लिए शिफ्ट प्रति विश्लेषण किया जा करने के लिए संभव है. - एक मेल-में प्रयोग (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form) की घोषणा करने के लिए एक फार्म भरें, आवश्यक सुरक्षा जानकारी के साथ, नमूने है कि मापा जा करने के लिए कर रहे हैं ।
3. ISPyB में एक द्विवर्तन योजना का निर्माण
नोट: विवर्तन योजना ispyb में किसी नमूने के लिए आवश्यक सभी जानकारी रखती है और प्रत्येक नमूने के लिए निष्पादित किए जाने वाले प्रयोग को अनुकूलित करने के लिए अतिरिक्त जानकारी शामिल कर सकती है ।
- खुला ISPyB (https://exi.esrf.fr/पर) ।
- MX प्रयोगचुनें.
- प्रयोग संख्या और पासवर्ड के साथ लॉग इन करें ।
- शिपमेंट पर क्लिक करें । नया जोड़ें और आवश्यक जानकारी प्रदान करें । सहेजेंक्लिककरें ।
- पार्सल जोड़ें क्लिक करें और अनुरोधित जानकारी भरें । सहेजेंक्लिककरें ।
- फिर, कंटेनर जोड़ेंक्लिक करें, डिस्क बारकोड को नाम के रूप में दें, और स्पाइन पकचुनें । सहेजेंक्लिककरें ।
- कंटेनर प्रतीक पर क्लिक करें और संपादित, और आवश्यक जानकारी में भरने, प्रोटीन नाम, पसंदीदा कार्यप्रवाह, डिस्क में क्रिस्टल स्थिति, आदि नमूनों के विषय की तरह ।
- (उदाहरण के लिए, GCSH या lysozyme) प्रोटीन है कि ESRF सुरक्षा समूह द्वारा अनुमोदित किया गया है चुनें ।
- प्रत्येक व्यक्तिगत नमूने को पहचानने के लिए एक अनंय नमूना नाम दर्ज करें । यह वैकल्पिक पिन बारकोड स्कैन करने के लिए संभव है । नीचे दी गई जानकारी के बाकी वैकल्पिक है ।
- वैकल्पिक जानकारी दर्ज करें ।
- प्रत्येक व्यक्तिगत नमूना के लिए, Exp. typeके अंतर्गत प्रयोग प्रकार (यानी, MXPRESSE_SAD, स्कोर, या MXPressO, आदि, डिफ़ॉल्ट Mxpresso) दर्ज करें । यह परिभाषित करता है कि प्रत्येक क्रिस्टल को संसाधित करने के लिए कौन-सा स्वचालित कार्यप्रवाह उपयोग किया जाएगा. यह देखते हुए कि GCSH क्रिस्टल सुई रहे हैं, Mxpresspचुनें ।
- यदि ज्ञात हो, तो एक रिक्ति समूह (उदाहरण के लिए, P1, C2, या P212121) दर्ज करें । यदि वर्तमान में, यह डेटा संग्रह रणनीति गणना के लिए और स्वत: डेटा प्रसंस्करण पाइपलाइनों उपलब्ध द्वारा इस्तेमाल किया जाएगा ।
- इच्छित रिज़ॉल्यूशन दर्ज करें (डिफ़ॉल्ट: dmin = २.० Å). यह प्रारंभिक मेष स्कैन, लक्षण वर्णन, और डिफ़ॉल्ट डेटा संग्रह के लिए क्रिस्टल-से-डिटेक्टर दूरी निर्धारित करता है ।
- इच्छित थ्रेशोल्ड रिज़ॉल्यूशन सेट करें (उदाहरण के लिए, १.५ Å या 2.3 Å), क्रिस्टल से पूर्ण डेटासेट के संग्रह को रोकने के लिए जो इस सीमा तक diffract नहीं है. यह डेटा संग्रहण स्थान और विश्लेषण समय सहेज सकता है ।
- आवश्यक पूर्णता सेट करें (डिफ़ॉल्ट: ०.९९) । आवश्यक बहुलता सेट करें (डिफ़ॉल्ट: 4) । एक से अधिक क्रिस्टल नमूना समर्थन पर निहित है, तो विश्लेषण किया जा करने के लिए क्रिस्टल की अधिकतम संख्या सेट करें । डिफ़ॉल्ट मान 1 या 5 MXPressP के लिए है ।
- उचित बीम आकार का चयन करें (डिफ़ॉल्ट: ५० μm) । यदि कोई विशिष्ट मान चयनित नहीं है, तो X-ray-centering और डेटा संग्रह कार्यनीति परिकलन ५० μm की बीम आकार के साथ निष्पादित किए जाएँगे.
नोट: पूर्ण डेटा सेट के किसी भी बाद के संग्रह के दौरान, बीम आकार स्वचालित रूप से अनुकूलित किया जाएगा । - अंतरिक्ष समूह में रखो, अगर जाना जाता है, मजबूर अंतरिक्ष समूह कॉलम में । विकिरण-क्रिस्टल की संवेदनशीलता सेट करें (0.5 – 2.0 उच्च संवेदनशीलता के लिए कम करने के लिए, 1 के एक डिफ़ॉल्ट मान के साथ).
- यदि वांछित, पूर्ण dataset संग्रह (डिफ़ॉल्ट: कुल रोटेशन eEDNA द्वारा निर्धारित कोण) के लिए एकत्र किया जा करने के लिए कुल रोटेशन कोण सेट करें ।
- मान सहेजें । लदान के लिए वापसीपर क्लिक करें । ESRF को भेजें शिपमेंटदबाएँ.
- शिपिंग लेबल मुद्रित करें और नमूने भेजें । उपयोगकर्ताओं को एक कूरियर के साथ एक पिक की व्यवस्था, ESRF खाता विवरण का उपयोग करना चाहिए ।
नोट: यह बहुत महत्वपूर्ण है का चयन करने के लिए वापसी लेबल शामिल नमूनों की निर्बाध वापसी की अनुमति देने के लिए (https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement देखें) ।
4. डेटा संग्रह, देखने, और पुनर्प्राप्ति
नोट: प्रयोग के दिन नमूनों को मैसिफ-1 उच्च क्षमता वाले देवरी (HCD) में स्थानांतरित किया जाता है । बीएमलाइन वैज्ञानिकों ने फिर डेटा कलेक्शन लॉन्च किया, जिसे दूर से यूजर्स फॉलो कर सकते हैं । प्रत्येक भिंन नमूना प्रकार के लिए उपयोगकर्ता एक ई-मेल प्राप्त करते है जो उंहें सूचित करता है कि डेटा संग्रह प्रारंभ हो गया है । जैसा कि पहले उल्लेख किया, सभी वर्कफ़्लोज़ में सभी चरणों का निष्पादन ऑनलाइन और रीयल-टाइम में उपयोगकर्ता द्वारा ispyb के माध्यम से, जिससे परिणाम देखे और डाउनलोड किए जा सकते हैं, का अनुसरण कर सकते हैं ।
- प्रत्येक नमूने के विश्लेषण के लिए, ISPyB (https://exi.esrf.fr/) में स्वत: प्रयोग के परिणामों की जांच करें ।
- प्रयोग नंबर और पासवर्ड का प्रयोग करते हुए लॉग इन करें, और ID30A-1पर वांछित प्रयोगात्मक सत्र पर क्लिक करे ।
- पसंदीदा (शीर्ष स्कोरिंग) autoprocessing पाइपलाइन का चयन करें (उदाहरण के लिए, हथगोले या XDS_APP) और पिछले इकट्ठा परिणामों पर क्लिक करके उच्चतम पूर्णता और उच्चतम संकल्प के साथ सही अंतरिक्ष समूह में बाहर लिखा डेटा डाउनलोड और, उसके बाद, डाउनलोड करें।
नोट: सभी जाल, रेखा, और लक्षण वर्णन छवियों प्रत्येक नमूने के लिए एक उपनिर्देशिका में हैं, कहा जाता है/ ESRF स्वचालित रूप से पांच अलग प्रसंस्करण संकुल चलाता है, अर्थात् EDNA_proc12, हथगोले12, xds_app14, AUTOPROC15, और XIA216। डेटा एकीकरण XDS, XIA2, जो डायल पर आधारित है के अपवाद के साथ पर आधारित है । सभी संकुल भी असंगत और nonअसंगत मोड में चला रहे हैं, एक असंगत संकेत का स्वत: पता लगाने की अनुमति, यदि डेटा में मौजूद है, उदास चरणबद्ध प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जाएगा । प्रत्येक पैकेज अलग पैरामीटर और निर्णय पेड़ का उपयोग करता है, जिसका अर्थ है कि कुछ संकुल कुछ नमूनों के साथ बेहतर चलाते हैं । हालांकि, यह परिणामों की एक बड़ी संख्या के लिए कर सकते है जब संकुल और संभव अंतरिक्ष समूहों की संख्या के लिए जिंमेदार है । इसलिए परिणाम, रिज़ॉल्यूशन और अन्य गुणवत्ता मीट्रिक पर मोटे तौर पर आधारित होते हैं, जैसे कि Rमर्ज सबसे कम रिज़ॉल्यूशन शेल, CC (1/2) और पूर्णता में. यह सबसे अच्छा डेटा सेट करने के लिए उपयोगकर्ता मार्गदर्शक के उद्देश्य से है, लेकिन सभी संभव अंतरिक्ष समूहों और परिणाम ध्यान से निरीक्षण किया जाना चाहिए.
- डाउनलोड किए गए फ़ोल्डर को खोलना, जिसमें सभी लॉग फ़ाइलें और अनमर्ज XDS_ASCII शामिल होंगे । HKL और विलय और स्केल. mtz फ़ाइलें ।
नोट: मामले में संरचना (PDB प्रारूप में) ब्याज या एक करीबी homolog के प्रोटीन के प्रयोग के शुरू में ISPyB पर अपलोड किया गया था, ESRF पर autoprocessing पाइपलाइन स्वचालित रूप से एक आणविक प्रतिस्थापन प्रदर्शन करेंगे (MR) इस संरचना का उपयोग कर के रूप में चलाने सर्वश्रेष्ठ स्कोरिंग समाधान पर खोज मॉडल । MR पाइपलाइन के परिणाम ISPyB में प्रदर्शित किए जाते हैं और संसाधित डेटा फ़ोल्डर में ढूँढा जा सकता (उदाहरण के लिए,/Data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/processed_data/gcsh/gcsh-x5/autoprocessing_ Gcsh-x5_run1_1/grenades_fastproc/User_nohet.pdb_ mrpipe_dir/). यहां, अंतिम मॉडल coot1. pdb और प्रतिबिंब डेटा sidechains. mtz नाम दिया जाएगा । ध्यान दें कि पाइपलाइन कोशिका की सममिति को कम कर सकती है (आदिम कोशिका न्यूनीकरण) ताकि समाधान ढूंढने की संभावना बढ़ सके । यहां मामले में, श्री पाइप लाइन एक मोनोक्लिनिक सेल (C2) में समाधान के बजाय एक विषमलंबाक्ष सेल (C2221) में लिखा था । कैसे एक आणविक प्रतिस्थापन चलाने के लिए मैंयुअल रूप से (दूसरा सबसे अच्छा स्कोरिंग autoprocessing समाधान के लिए उदाहरण के लिए) अनुपूरक फ़ाइलोंमें शामिल है पर विवरण ।
Representative Results
mxpressp कार्यप्रवाह esrf बीमलाइन मैसिफ-1 में इस्तेमाल किया गया था, पूरी तरह से स्वचालित रूप से, माउंट, एक्स-रे बीम में केंद्र, लक्षण वर्णन, और मानव gcsh के क्रिस्टल की एक श्रृंखला से पूर्ण डिफक्शन डेटा सेट इकट्ठा. नमूने घुड़सवार थे और पाश एक क्षेत्र के लिए स्कैन करने के लिए विश्लेषण (चित्रा 1, बाएँ). द्विवर्तन विश्लेषण के बाद, डेटा संग्रह के लिए क्रिस्टल के भीतर चार बिंदुओं का चयन किया गया (चित्र 1, दाएं) । श्री पाइप लाइन सहित स्वचालित डेटा विश्लेषण पाइपलाइनों के बाद प्रसंस्करण, उच्च गुणवत्ता वाले डेटासेट (तालिका 1) जिसके लिए एक MR समाधान पाया गया था उपज । उत्तरार्द्ध उपयोगकर्ताओं को तेजी से मूल्यांकन करने की अनुमति देता है कि प्राप्त डेटासेट और प्रयुक्त खोज मॉडल आणविक प्रतिस्थापन द्वारा चरणबद्ध करने के लिए उपयुक्त हैं. इसके अलावा, लाइगैंडों की उपस्थिति का ंयाय किया जा सकता है, इस प्रकार उपयोगकर्ता को अनुमति देने के लिए केवल और अधिक विश्लेषण के लिए सबसे होनहार डेटासेट पर ध्यान केंद्रित । श्री द्वारा मैनुअल संरचना निर्धारण एक स्वचालित शोधन चक्र (चित्रा 2a) के बाद एक उच्च गुणवत्ता वाले इलेक्ट्रॉन घनत्व नक्शा उपज । इस डेटासेट के लिए, स्वचालित पाइपलाइन ने डेटा को १.३२ Å रिज़ॉल्यूशन में काटा; हालांकि, उपयोगकर्ता अभी भी उच्चतम रिज़ॉल्यूशन शेल में विभिंन गुणवत्ता सांख्यिकी (CC1/2, < i/σ (I) >, Rरहत) पर पहुंचने के लिए कम रिज़ॉल्यूशन पर डेटा काटने का निर्णय ले सकते हैं । मानव GCSH संरचना की क्रिस्टल संरचना बोवाइन प्रोटीन (3KlR)16के समान है ।
सतत इलेक्ट्रॉन घनत्व एन-टर्मिनल हिस्टीडीन टैग के अलावा पूरे अमीनो एसिड श्रृंखला के लिए दिखाई देता है । चार प्रतिस्थापन है कि मानव और गोजातीय GCSH भेद, तीन इलेक्ट्रॉन घनत्व में आसानी से पहचाने जाने योग्य है (Ile/Val66, एएसपी/Glu98, और Leu/Phe149; चित्र 2b -डी) । यह Asp/Lys125 प्रतिस्थापन के लिए कम स्पष्ट है जिसके लिए पक्ष शृंखला का इलेक्ट्रॉन घनत्व केवल लचीलेपन के कारण आंशिक रूप से हल हो जाता है (चित्र 1e) । वर्तमान में प्राप्त मॉडल आरकाम और आर २०.४% और २३.८% केमुक्त मूल्यों, क्रमशः है, और आगे स्वचालित और मैनुअल मॉडल के निर्माण और शोधन के आगे चक्र द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है ।
हथगोले पाइपलाइन | XDS_APP पाइपलाइन | |
डेटा संग्रह और संसाधन | ||
एक्स-रे स्रोत/बीम लाइन | ESRF/मैसिफ-1 | |
तरंगदैर्घ्य (Å) | ०.९६६ | |
रिज़ॉल्यूशन (Å) | ४१.८८ – १.४८ (१.५३ – १.४८) | ४१.८६-१.३२ (१.३९ – १.३२) |
Total/अनोखा प्रतिबिंब | १२७६७०/२८६४४ | १७७३३२/४०१३४ |
(१२१७८/२७७५) | (२३७७२/५७१४) | |
अनुक्रमण, स्केलिंग और मर्ज करने के लिए रिक्ति समूह | C222 | C2221 |
कक्ष आयाम | ||
ए, बी, सी (Å यि) | ४२.२०, ८३.७५, ९५.८५ | ४२.१९, ८३.७२, 95, 82 |
मोसाइसिटी | ०.०५ | ०.०५ |
आररहत (%) | १०.० (११०.७) | ११.१ (१९८.२) |
< i/σ (i) > | ९.६ (१.३) | ७.६ (०.७) |
सीसी1/2 (%) | ९९.७ (५३.९) | ९९.७ (१९.१) |
पूर्णता (%) | ९९.६ (९९.६) | ९९.५ (९८.६) |
बहुलता | ४.५ (४.४) | ४.४ (४.२) |
आण्विक प्रतिस्थापन और प्रारंभिक मॉडल शोधन | ||
चरणबद्ध के लिए अंतरिक्ष समूह | C2 | C2221 |
कक्ष आयाम | ||
ए, बी, सी (Å यि) | ८३.७४, ४२.१८, ९५.८२ | ४२.१९, ८३.७२, 95, 82 |
α, β, γ (°) | ९०, ९०.०३, ९० | ९०, ९०, ९० |
MR (PDB) के लिए खोज मॉडल | 3KLR | 3KLR |
प्रोटीन अणु आसू/ | 2 | 1 |
प्रोटीन अवशेष | २५० | १२५ |
Rकार्य/rनि: शुल्क (%) 1 शोधन के बाद | २४.३/२६.५ | २०.४/२३.८ |
1 शोधन के बाद RMSD बॉण्ड लंबाई (Å) | ०.०१ | ०.०१ |
RMSD बॉण्ड कोण (°) 1 शोधन के बाद | १.२ | १.८३ |
रोटामर आऊटलियर (%) 1 शोधन के बाद | १.०७ | ४.२९ |
तहकीकात के रूपमें/अनुमत/अस्वीकृत (%) 1 शोधन के बाद | ९५.९३/४.०७/0/ | ९५.१२/४.८८/0/ |
तालिका 1: X-ray का डेटा संग्रह, परिशोधन, और मांयता आंकड़े । उच्चतम रिज़ॉल्यूशन शेल के लिए मान कोष्ठक में दिए गए हैं ।
चित्रा 1: नमूना विश्लेषण से पहले डेटा संग्रह । (क) स्कैनिंग के लिए चयनित क्षेत्र एक लाल बॉक्स द्वारा दिखाया गया है । (ख) द्विवर्तन प्रतिबिंबों के विश्लेषण को ऊष्मा मानचित्र के रूप में दर्शाया गया है । स्थित क्रिस्टल के भीतर चार पदों का चयन डेटा संग्रह के लिए किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 2: परिशोधन के बाद प्राप्त इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्रों का दृश्य सत्यापन । इलेक्ट्रॉन घनत्व मैप्स 2x r.m.s. स्तर पर चारों ओर (क) Trp143, (ख) VAL66 (मानव Gcsh में Ile), और (ग) Glu98 (मानव gcsh में एएसपी) और नक्शे 1x आर. एम. एस स्तर पर चारों ओर (d) Phe149 (मानव gcsh में leu) और (ई) Lys125 (मानव GCSH में एएसपी) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
पूरी तरह से स्वचालित beamlines एक वैज्ञानिक की उपस्थिति के बिना macromolecular क्रिस्टल की बड़ी संख्या से स्वचालित लक्षण वर्णन और डेटा संग्रह प्रदान करते हैं, या तो beamlines पर या दूर से, आवश्यक जा रहा है. पूरी तरह से स्वचालित beamlines का उपयोग मैनुअल आपरेशन की तुलना में कई फायदे हैं । उदाहरण के लिए, एक्स-रे जाल और लाइन स्कैन के आधार पर स्वचालित नमूना centering, कि यह थर्मल या ऑप्टिकल प्रभाव से प्रभावित नहीं है के रूप में मानव आंख के साथ प्रदर्शन से अधिक सटीक है. वास्तव में, इन जाल और लाइन स्कैन अतिरिक्त डेटा प्रदान (यानी, क्रिस्टल के विस्तृत आयामों और सबसे अच्छा क्रिस्टल के डिफफ्रैक्टिंग क्षेत्र) जो डेटा संग्रह के लिए उपयोग करने के लिए सही बीम आकार का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण हैं-विशेष रूप से छोटे क्रिस्टल के लिए 18— और अक्सर प्राप्त किए गए विवर्तन डेटा की एक बेहतर गुणवत्ता में परिणाम । इसके अलावा, स्वत: प्रयोगों के सेटअप में उपयोगकर्ता परिभाषित मापदंडों का लाभ लेने के द्वारा, विशिष्ट कार्यप्रवाह में कदम सबसे अच्छा अध्ययन के तहत प्रणाली के अनुरूप हो सकता है, इस प्रकार आगे प्रयोग सफलता की दर को अनुकूलित ।
एक साथ लेना, उपलब्ध वर्कफ़्लोज़ की विश्वसनीयता, सीधी पहुंच (उपयोगकर्ता स्वयं-शेड्यूल, एक कैलेंडर का उपयोग करते हुए [ऊपर देखें]), और मैसिफ-1 की पूरी तरह से स्वचालित प्रकिया एक कठोर, उच्च थ्र्पुट प्रदान करता है, और समय की बचत शास्त्रीय हाथों के लिए वैकल्पिक-MX प्रयोगों पर और अधिक उन्नत प्रक्रियाओं और अनुप्रयोगों को स्वचालित वर्कफ़्लोज़ में कार्यान्वित करने की क्षमता. निकट भविष्य में, 3 डी19 में क्रिस्टल मानचित्रकला एक्स-रे centering की सटीकता में सुधार करने के लिए लागू किया जाएगा, जबकि अधिक जटिल प्रोटोकॉल, जैसे क्रिस्टल निर्जलीकरण प्रयोगों20, स्वचालित हो जाएगा. यह आशा की जाती है कि पूरी तरह से स्वायत्त डेटा संग्रह एमएक्स में एक मानक विधि बन जाएगा, छोटे अणु टुकड़ा स्क्रीन के लिए उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्रदान करने, खराब diffracting क्रिस्टल की बड़ी संख्या की स्क्रीनिंग का अनुकूलन और स्वचालित रूप से चरण प्रदान जानकारी क्रिस्टल संरचनाओं de novo हल करने के लिए । क्रिस्टल21के स्वचालित संचयन में विकास के साथ संयोजन में, एक स्वचालित सेवा के रूप में प्रोटीन क्रिस्टल संरचना समाधान की संभावना अच्छी तरह से एक वास्तविकता बन सकता है ।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक beamtime के लिए ESRF धंयवाद ।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Beamline MASSIF-1 | ESRF | ||
BL21DE3 | New England Biolabs | C2527I | |
chloramphenicol | Roth | 3886.1 | |
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K | Merck Millipore | UFC803024 | |
Dialyzing membrane | Spectrumlabs | 132655 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Dnase | Roche | 11284932001 | |
DTT | Euromedex | EU0006-B | |
EDTA- free protease inhibitors | Roche | 4,693,159,001 | |
glycerol | VWR Chemicals Prolabo | 14388.29T | |
His-trap HP | GE healthcare | 17-5247-01 | |
imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-500G | |
IPTG | Euromedex | EU0008-B | |
LB medium | Sigma-Aldrich | L3022 | |
lipoic acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
loop | Hampton Research | HR8-124 | |
lysozyme | Roche | 10 837 059 001 | |
MonoQ 5/50 GL | GE healthcare | 17-5166-01 | |
NaCl | Fisher Chemical | S/3160/60 | |
Sonicator vibra cell 75/15 | SONICS | ||
SPINE pucks | MiTeGen | SKU: M-CSM003-0001A | |
Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B | |
Sodium Formate | Sigma-Aldrich | 1064430500 | |
GCSH purification buffer | 20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl | ||
GCSH cryo-protection buffer | 0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol | ||
Programs: | |||
MxCube | Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010) | local development | |
ISPyB | ESRF | Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535 | local development |
MXCube2 | ESRF | Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014). | local development |
BES workflow server | Brockhauser, S. et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012). | ||
DOZOR | ESRF | Bourenkov and Popov, unpublished | local development |
BLISS beamline control | Guijarro, M. et al. BLISS - Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Spain. doi: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018). | local development | |
AUTO processing of images | Monaco, S. et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013) | local development | |
BEST and EDNA | Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009). | local development | |
CCP4 | Winn, M.D. et al. Overview of the CCP 4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011). | ||
Phaser MR | McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007). | ||
Coot | Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004). | ||
refmac5 | Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. Acta Crystallographica Section D. 53, 240--255 (1997). | ||
Matthews | Matthews, B.W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968). |
References
- Hui, R., Edwards, A. High-throughput protein crystallization. Journal of Structural Biology. 142 (1), 154-161 (2003).
- Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
- Svensson, O., Malbet-Monaco, S., Popov, A., Nurizzo, D., Bowler, M. W. Fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (8), 1757-1767 (2015).
- Cipriani, F., et al. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68, 1393-1399 (2012).
- Nurizzo, D., et al. RoboDiff: combining a sample changer and goniometer for highly automated macromolecular crystallography experiments. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (8), 966-975 (2016).
- Bowler, M. W., Svensson, O., Nurizzo, D. Fully automatic macromolecular crystallography: the impact of MASSIF-1 on the optimum acquisition and quality of data. Crystallography Reviews. 22 (4), 233-249 (2016).
- Brockhauser, S., et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984 (2012).
- Svensson, O., Gilski, M., Nurizzo, D., Bowler, M. W. Multi-position data collection and dynamic beam sizing: recent improvements to the automatic data-collection algorithms on MASSIF-1. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 74, 433-440 (2018).
- Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).
- Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
- ESRF. Structural Biology samples: how to organise the transport of reimbursed dewars. , Available from: http://www.esrf.fr/MXDewarReimbursement (2018).
- Monaco, S., et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810 (2013).
- Kikuchi, G., Motokawa, Y., Yoshida, T., Hiraga, K. Glycine cleavage system: reaction mechanism, physiological significance, and hyperglycinemia. Proceedings of the Japan Academy. Series B, Physical and Biological Sciences. 84 (7), 246-263 (2008).
- Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S. XDSAPP2.0. Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 1085-1092 (2016).
- Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).
- Winter, G. xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
- Higashiura, A., et al. High-resolution X-ray crystal structure of bovine H-protein at 0.88 Å resolution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (6), 698-708 (2010).
- Sanishvili, R., et al. A 7 µm mini-beam improves diffraction data from small or imperfect crystals of macromolecules. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 64 (4), 425-435 (2008).
- Bowler, M. W., et al. Diffraction cartography: applying microbeams to macromolecular crystallography sample evaluation and data collection. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (8), 855-864 (2010).
- Bowler, M. W., et al. Automation and Experience of Controlled Crystal Dehydration: Results from the European Synchrotron HC1 Collaboration. Crystal Growth & Design. 15 (3), 1043-1054 (2015).
- Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).