Raccolta di dati dai cristalli delle macromolecole biologiche e completamente autonoma caratterizzazione

Summary

Qui, descriviamo come utilizzare lo screening automatizzato e opzioni di raccolta di dati disponibili presso alcune beamlines di sincrotrone. Scienziati inviare campioni di cryocooled per il sincrotrone e le proprietà di diffrazione sono selezionate, gli insiemi di dati sono raccolti e trattati e, ove possibile, una soluzione di struttura avviene — tutto senza intervento umano.

Abstract

Fasci di raggi x ad alta brillantezza, accoppiati con l'automazione hanno portato all'utilizzo di base di sincrotrone cristallografia macromolecolare (MX) beamlines per anche i progetti più impegnativi in biologia strutturale. Tuttavia, la maggior parte delle strutture ancora richiedono la presenza di uno scienziato in loco per eseguire gli esperimenti. Una nuova generazione di beamlines automatizzato dedicato alla caratterizzazione completamente automatico e della raccolta dati, cristalli di macromolecole biologiche recentemente è stato sviluppato. Questi beamlines rappresentano un nuovo strumento per i biologi strutturali selezionare i risultati di prove di cristallizzazione iniziale e/o la raccolta di un gran numero di insiemi di dati di diffrazione, senza dover controllare la beamline stessi utenti. Qui vi mostriamo come impostare un esperimento per screening automatico e raccolta di dati, come un esperimento viene eseguito presso la beamline, come i set di dati risultanti vengono elaborati, e come, quando possibile, la struttura di cristallo della macromolecola biologica è risolto.

Introduction

Determinazione della struttura tridimensionale delle proteine specifiche è fondamentale in biologia. Le informazioni che derivano dal fare così gettano luce sulla funzione biologica e la forma e la specificità dei siti attivi e/o vincolanti contenute nella molecola oggetto di studio. In molti casi, questo consente meccanismi di azione per essere determinata o, se del caso, potenziali molecole terapeutiche per essere sviluppato. MX è la tecnica più comunemente utilizzata per ottenere informazioni strutturali, ma un collo di bottiglia è la determinazione delle condizioni ottimali per ottenere cristalli ben diffrangano. Pertanto, prove di cristallizzazione sono svolte in numerose condizioni diverse e sono quindi sottoposti a screening, per trovare i migliori cristalli da utilizzare per la raccolta di dati di diffrazione. L'automazione dell'installazione di cristallizzazione prove¹ chiaramente ha aiutato in questo senso. Tuttavia, i passaggi successivi (cioè, montaggio di cristallo, lo screening di diffrazione e raccolta di dati di diffrazione) sono solitamente effettuati manualmente, prendendo un sacco di tempo, energie e risorse. L'automazione della raccolta di screening e dati di diffrazione significherebbe, quindi, un enorme guadagno in tempo e di efficienza.

Collezione di screening e dati di diffrazione in MX avviene più spesso a sincrotrone MX beamlines in cui automazione in gran parte ha facilitato questo processo. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, è necessario per lo scienziato di essere presenti presso la beamline durante un esperimento o di utilizzarlo in modalità remota. Recentemente, una nuova generazione di beamlines MX completamente automatizzato è stato sviluppato². Qui, gli utenti non devono essere presenti, sia fisicamente che in remoto, durante una sessione sperimentale. Questo permette agli scienziati di dedicare più tempo alla meno compiti di routine, piuttosto che trascorrere intere giornate e spesso notti, cristalli di selezione e raccolta dei dati di diffrazione. Prima beamline completamente automatizzata del mondo è il massicciamente automatizzato campione selezione Integrated Facility (MASSIF-1, ID30A-1)^2,3 presso la European Synchrotron Radiation Facility (ESRF). Ha un ambiente unico esempio in cui un dewar contenente campione ad alta capacità opera in tandem con un autocampionatore robotico che funge anche da goniometro^{4,5 della beamline}. MASSIF-1 è un ondulatore beamline dotato di un single-photon-counting ibrido pixel detector⁶, che opera a una lunghezza d'onda fissa di 0,969 Å (12,84 keV) con un intenso fascio di raggi x (2 x 10¹² fotoni/s). Le dimensioni di larghezza in corrispondenza della posizione del campione possono essere regolata tra un minimo di 10 µm (fascio rotondo) ad un massimo di 100 µm x 65 µm (orizzontale di dimensioni del fascio verticale). In media, la beamline può elaborare, in modo completamente automatico di moda (Vedi sotto), 120 cristalli in 24h. Il funzionamento della beamline si basa su una serie di flussi di lavoro⁷, ognuno dei quali prende decisioni intelligenti sulla base del risultato di precedenti passaggi del flusso di lavoro, per garantire la misura ai migliori dati possibili dal campione in studio. In particolare, la valutazione delle caratteristiche di un singolo campione diffrazione prende in flusso e volume di cristallo conto e garantisce, dove il cristallo è più grande il fascio di raggi x, che solo la migliore regione del cristallo è usata per i dati successivi collezione. Insiemi di dati di diffrazione sono, così, ottimizzati per la massima risoluzione con radiazioni ridotto al minimo danno^2,3. Protocolli di raccolta di dati complessi, quali strategie di raccolta dati di pseudo-elicoidale (multi-posizione) per la raccolta di dati sia nativo e singolo-lunghezza d'onda anomala diffrazione (SAD), sono inoltre disponibili⁸.

Coinvolgono gli esperimenti completamente automatici al massiccio-1 cryocooling e i cristalli di montaggio su un Monte campione magnetico adatto per la desiderata beamline dotazione standard pin spina dorsale⁹, immettere i parametri desiderati sperimentali nella ' diffrazione piano ' tabella del sistema integrato per la cristallografia di proteine beamlines (ISPyB)¹⁰, un sistema di gestione di informazioni basate su web per esperimenti di MX e l'invio di campioni per la beamline. Presso l'ESRF, tutti i costi del trasporto dei campioni da/per la beamline sono supportati dall'ufficio utente ESRF (Vedi il sito Web dell' ESRF¹¹ per dettagli). Al massiccio-1, non esistono restrizioni sulla dimensione ciclo o qualità di cristallo. Quando si sceglie un piano di diffrazione per un determinato cristallo, l'utente può utilizzare le impostazioni predefinite o scegliere tra flussi di lavoro specifici, che possono essere personalizzati per ogni campione. Diversi flussi di lavoro preprogrammati sono disponibili. Nel flusso di lavoro di³ di MXPressE, il ciclo campione contenente prima è allineato a quella campione utilizzando centraggio ottico. Quindi, basata sul X-ray centratura assicura che la migliore regione del cristallo è centrata per il fascio di raggi x. Strategie di raccolta dati vengono quindi calcolate utilizzando eEDNA, un framework per lo sviluppo di applicazioni basate su plugin soprattutto per analisi dati online nel campo di esperimenti di raggi x, tenendo conto cristallo volume e il flusso in tempo reale presso la beamline. In seguito alla raccolta di un set di dati di diffrazione completo, questo viene elaborato utilizzando una serie di pipeline di elaborazione dei dati automatica¹² e i risultati sono resi disponibili per l'ispezione e il download in ISPyB. Il flusso di lavoro di³ MXPressE SADè puntato su cristalli di selenometionina-contenente della proteina dell'obiettivo e sfrutta il fatto che l'energia operativa del MASSIF-1 è appena sopra il bordo Se K. Qui, la strategia di raccolta dei dati di MXPressE eEDNA è ottimizzata per la raccolta dati triste (cioè, alta ridondanza e con la risoluzione impostata a dove il R_Unione tra coppie di Bijvoet è inferiore al 5%). Per schermare le proprietà di diffrazione di una serie di cristalli senza raccolta dati successivi, il flusso di lavoro di MXScore³ consente di produrre una valutazione completa qualità dei cristalli analizzati. Del flusso di lavoro di MXPressI³ , 180 ° di dati di rotazione vengono raccolti utilizzando le oscillazioni 0,2 ° e l'angolo iniziale di phi e la risoluzione determinata da una strategia di eEDNA. MXPressO ³ include una risoluzione preobserved nel flusso di lavoro (impostazione predefinita: d_min = 2 Å). Per effettuare una valutazione iniziale dei cristalli risultanti da un processo di cristallizzazione, viene offerto il flusso di lavoro di MXPressM³ . Questo esegue una maglia della alto-dose la scansione sull'orientamento più ampia del supporto del campione con nessuna raccolta di dati o di centraggio. Recentemente, due nuovi flussi di esperimento, MXPressP e MXPressP_SAD, che consentono di eseguire raccolte di dati pseudohelical, sono state implementate⁸. L'esecuzione di tutti i passaggi in tutti i flussi di lavoro possa essere seguito online e in tempo reale dall'utente, tramite ISPyB.

Qui vi mostriamo come preparare un esperimento MX completamente automatizzato al MASSIF-1 e come recuperare e analizzare i dati risultanti dall'esperimento. Ad esempio, utilizziamo proteine di glicina mitocondriale umano fenditura sistema H (GCSH). Questa proteina contenente dell'acido lipoico è parte del sistema di fenditura della glicina responsabile della degradazione di glicina. Questo sistema inoltre include la proteina P, una decarbossilasi di piridossal fosfato dipendente dalla glicina, la proteina T, un enzima che richiede tetraidrofolato e la proteina di L, una deficit di lipoamide deidrogenasi. GCSH trasferisce il gruppo di metilammina di glicina dalla proteina P alla proteina T. Difetti nella proteina H sono la causa di hyperglycinemia nonketotic (NKH) in esseri umani¹³.

Protocol

Nota: La produzione, purificazione e cristallizzazione di GCSH sono descritti nel File supplementari 1.

1. breve descrizione della preparazione non in linea e montaggio di cristallo

1. Posizione un ciclo di nylon o un altro supporto di montaggio di cristallo già fissato un pin della spina dorsale sotto uno o più cristalli e sollevarli dalla soluzione di precipitazione (20 µ l di 0,5 M sodio formiato pH 4.0 + 25 µ l di soluzione della proteina).
   1. Rimuovere il liquido alla rinfusa intorno il crystal(s) toccando il Monte con uno stoppino di carta da succhiare il liquido in eccesso.
2. Immergere il crystal(s) nella soluzione Crioprotettivi contenente la soluzione di precipitazione più 30% glicerolo; quindi, rimuovere il crystal(s) e il supporto di cristallo.
   1. Rimuovere il liquido alla rinfusa intorno il crystal(s) toccando il Monte con uno stoppino di carta da succhiare il liquido in eccesso.
3. Immergere il Monte in una fiala di colonna vertebrale riempita con azoto liquido e memorizzarlo, insieme a eventuali altri cristalli preparati allo stesso modo, in un laboratorio europeo di biologia molecolare (EMBL) / ESRF campione changer puck⁹ alla temperatura dell'azoto liquido.
   Nota: I crystal(s) sono stabili in questa condizione fino a quando la valutazione è disponibile.

2. richiesta di valutazione sul MASSIF-1

1. Richiesta valutazione più presto possibile sulla homepage ESRF (presso http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying).
   Nota: Ci sono una serie di possibili modalità di accesso per il beamlines ESRF MX. Laboratori possono applicare collettivamente come parte di un blocco allocazione gruppo (borsa), per avere la valutazione assegnata per 2 anni. Se gruppi desiderano applicare individualmente, essi possono richiedere accesso, che permette loro di raggiungere rapidamente il beamlines dopo revisione tra pari di rotolamento. La proposta del gruppo sarà riesaminata e liquidata con il gruppo di sicurezza di ESRF che possono richiedere ulteriori dettagli. Se la proposta viene accettata, un esperimento numero e password saranno comunicati. Ricerca proprietaria può essere eseguita con l'acquisto di valutazione.
2. Completare la sicurezza necessaria formazione online (presso http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining).
3. Valutazione libro sul calendario MASSIF-1.
   Nota: È possibile prenotare fino a un massimo di 50 supporti del campione da analizzare per ogni turno.
4. Riempire l' un-forma per dichiarare un esperimento di mail-in (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form), insieme alle informazioni di sicurezza richiesti, per i campioni che devono essere calcolati.

3. creazione di un piano di diffrazione in ISPyB

Nota: Il piano di diffrazione contiene tutte le informazioni necessari per un campione in ISPyB e può contenere informazioni aggiuntive per personalizzare l'esperimento effettuato per ciascun campione.

1. Aprire ISPyB (a https://exi.esrf.fr/).
2. Scegliere MX esperimenti.
3. Effettuare il login con il numero di esperimento e la password.
4. Fare clic su spedizione | Aggiungi nuovo e fornire le informazioni necessarie. Fare clic su Salva.
5. Fare clic su Aggiungi pacco e compilare le informazioni richieste. Fare clic su Salva.
6. Quindi, fare clic su Aggiungi contenitore, dare il codice a barre puck come nome e scegliere il disco della colonna vertebrale. Fare clic su Salva.
7. Fare clic sul simbolo del contenitore ed Edite compilare le informazioni necessarie, come il nome della proteina, flusso di lavoro preferito, posizione di cristallo nel puck, ecc., sui campioni.
8. Scegliere la proteina (ad esempio, GCSH o lisozima) che è stata approvata dal gruppo di sicurezza ESRF.
9. Immettere un nome di campione unico per identificare ogni singolo campione. È possibile facoltativamente eseguire la scansione del codice a barre pin. Il resto delle informazioni qui sotto è opzionale.
10. Immettere le informazioni facoltative.
    1. Per ogni singolo campione, immettere il tipo di esperimento (cioè, MXPressE_SAD, punteggio o MXPressO, ecc., impostazione predefinita MXPressE) sotto Tipo EXP. Questo definisce quale flusso di lavoro automatico che verrà utilizzato per elaborare ogni cristallo. Dato che i cristalli GCSH sono aghi, scegliere MXPressP.
    2. Inserire un gruppo di spazio (ad esempio, P1, C2 o P2₁2₁2₁), se noto. Se presente, questo verrà utilizzato per i calcoli di strategia di raccolta dati e della pipeline di elaborazione automatica dei dati disponibili.
    3. Specificate la risoluzione desiderata (impostazione predefinita: d_min = 2.0 Å). Questo definisce la distanza al rivelatore di cristallo per la mesh iniziale scansioni, la caratterizzazione e la raccolta di dati predefinito.
    4. Impostare la risoluzione di soglia desiderato (ad esempio, 1,5 Å o 2.3Å), per impedire la raccolta di set di dati completo da cristalli che diffrangono non a questo limite. Questo può risparmiare tempo di analisi e spazio di immagazzinamento dati.
    5. Impostare la necessaria completezza (impostazione predefinita: 0,99). Impostare la molteplicità richiesta (default: 4). se più di un cristallo è contenuto il supporto del campione, impostare il numero massimo di cristalli per essere analizzati. Il valore predefinito è 1 o 5 per MXPressP.
    6. Selezionare il formato appropriato fascio (default: 50 µm). Se un valore specifico non è selezionato, la X-ray-centraggio e calcoli di strategia di raccolta dei dati verranno eseguiti con un fascio di 50 µm.
       Nota: Durante qualsiasi successiva raccolta del set di dati completi, le dimensioni del fascio verranno adattata automaticamente.
    7. Mettere nel gruppo spazio, se noto, nella colonna gruppo spazio forzato. Impostare la sensibilità di radiazione dei cristalli (0,5 – 2,0 per bassa ad alta sensibilità, con un valore predefinito pari a 1).
11. Se lo si desidera, impostare l'angolo di rotazione totale da raccogliere per la raccolta di set di dati completo (impostazione predefinita: l'angolo di rotazione totale determinato dal eEDNA).
12. Salvare i valori. Fare clic su restituire alle spedizioni. Premere il pulsante Invia della spedizione a ESRF.
13. Stampare l'etichetta di spedizione e inviare i campioni. Gli utenti dovrebbero organizzare un ritiro con un corriere, utilizzando i dettagli dell'account ESRF.
    Nota: È molto importante selezionare Includi etichetta di ritorno per consentire il ritorno senza giunte di campioni (Vedi https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement).

4. raccolta dei dati, la visualizzazione e recupero

Nota: Il giorno dell'esperimento, i campioni sono trasferiti per il massiccio-1 alta capacità Dewar (HCD). Gli scienziati beamline quindi lanciare la raccolta di dati, che possa essere seguita dagli utenti in remoto. Per ogni tipo di campione diverso gli utenti riceveranno una e-mail che li informa che è stata avviata la raccolta dei dati. Come detto in precedenza, l'esecuzione di tutti i passaggi in tutti i flussi di lavoro possa essere seguito online e in tempo reale con l'utente tramite ISPyB, da cui i risultati possono essere visualizzati e scaricati.

1. Per ogni campione analizzato, esaminare i risultati dell'esperimento automatico in ISPyB (https://exi.esrf.fr/).
   1. Login, utilizzando il numero di esperimento e la password e cliccare sulla sessione sperimentale desiderata a ID30A-1.
   2. Selezionare il preferito (massimi) autoprocessing pipeline (ad esempio, granate o XDS_APP) e scaricare i dati scritti nel gruppo corretto spazio con la massima completezza e massima risoluzione cliccando sul Raccogliere gli ultimi risultati e, quindi, scaricare.
      Nota: Tutte le immagini di mesh, linea e caratterizzazione sono in una sottodirectory per ogni campione, chiamato /MXPressE_01. L'ESRF esegue automaticamente cinque pacchetti di elaborazione separata, vale a dire EDNA_proc¹², granate¹², XDS_APP¹⁴, procedura automatica¹⁵e XIA2¹⁶. Integrazione dei dati si basa su XDS, ad eccezione di XIA2, che si basa sui quadranti. Tutti i pacchetti vengono anche eseguiti in modalità anomala e nonanomalous, che consente il rilevamento automatico di un segnale anomalo, se presenti nei dati, da utilizzarsi in SAD phasing protocolli. Ogni pacchetto utilizza diversi parametri e alberi di decisione, che significa che alcuni pacchetti eseguire meglio con determinati campioni. Tuttavia, questo può rendere per un gran numero di risultati quando il numero di pacchetti e i gruppi di spazio possibile è contabilizzato. I risultati sono, pertanto, classificati in base all'incirca sulla risoluzione e altri parametri di qualità, ad esempio R_Unione nella minima risoluzione shell, CC(1/2) e completezza. Questo è volto a guidare l'utente verso il miglior set di dati, ma tutti i gruppi di spazio possibile e risultati dovrebbero essere controllati con attenzione.
2. Decomprimere la cartella scaricata, che comprenderà tutti i file di registro e non unita XDS_ASCII. HKL e unite e in scala .mtz file.
   Nota: nel caso in cui la struttura (in formato PDB) della proteina di interesse o di uno stretto omologo è stata caricata su ISPyB all'inizio dell'esperimento, la pipeline di autoprocessing ESRF eseguirà automaticamente una sostituzione molecolare (MR) eseguita utilizzando questa struttura come il modello di ricerca la migliore soluzione di punteggio. I risultati della pipeline MR sono visualizzati in ISPyB e possono essere trovati nella cartella dati elaborati (ad esempio, /data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_ mrpipe_dir /). Qui, il modello finale sarà denominato coot1.pdb e il sidechains.mtz di dati di riflessione. Si noti che la pipeline potrebbe ridurre la simmetria della cella (riduzione delle cellule primitive) al fine di aumentare la probabilità di trovare una soluzione. Nel caso di specie, la pipeline di Signor ha scritto la soluzione in una cella monoclina (C2) piuttosto che in una cella ortorombica (C222₁). Dettagli su come eseguire una sostituzione molecolare eseguire manualmente (esemplificata per la seconda soluzione migliore-punteggio autoprocessing) sono inclusi nei File supplementari.

Representative Results

Il flusso di lavoro di MXPressP è stato utilizzato presso la beamline ESRF MASSIF-1 a, completamente automatico, montare, centro del fascio di raggi x, caratterizzare e raccogliere set di dati completo diffrazione da una serie di cristalli di GCSH umana. I campioni sono stati montati e il ciclo analizzati per un'area di scansione (Figura 1, sinistra). Dopo l'analisi di diffrazione, quattro punti sono stati selezionati all'interno del cristallo per la raccolta dati (Figura 1, a destra). Successiva elaborazione in condotte di analisi automatica dei dati, tra cui la pipeline di MR, ha reso i DataSet di alta qualità (tabella 1) per cui è stata trovata una soluzione onorevole. Quest'ultimo permette agli utenti di valutare rapidamente se il dataset ottenuto e il modello di ricerca utilizzate sono adatte per l'eliminazione da sostituzione molecolare. Inoltre, la presenza di ligandi possa essere giudicata, permettendo così all'utente di concentrarsi solo sui set di dati più promettenti per ulteriori analisi. Determinazione della struttura manuale da MR ha prodotto una mappa di densità dell'elettrone di alta qualità dopo automatizzato di un singolo ciclo di raffinatezza (Figura 2a). Per questo set di dati, la pipeline automatizzata taglia i dati a un 1.32 Å risoluzione; Tuttavia, gli utenti possono ancora decidere di tagliare i dati a una risoluzione inferiore per arrivare alle statistiche di diversa qualità (CC_1/2, < I/σ(I) >, R_meas) in shell risoluzione più alta. La struttura di cristallo della umana GCSH struttura è simile a quella della proteina bovina (3KlR)¹⁶.

Densità dell'elettrone continuo è visibile per la catena intera dell'amminoacido, a parte il tag di istidina N-terminale. Delle quattro sostituzioni che contraddistinguono GCSH umane e bovine, tre sono facilmente identificabili in densità dell'elettrone (Ile/Val66, Asp/Glu98 e Leu/Phe149; Figura 2b -d). Questo è meno chiaro per la sostituzione di Asp/Lys125 per il quale la densità dell'elettrone della catena laterale è solo parzialmente risolto grazie alla flessibilità (Figura 1e). Il modello attualmente ottenuto ha R_lavorare e R valori_gratuito del 20,4% e il 23,8%, rispettivamente e può essere ulteriormente ottimizzato da ulteriori cicli di compilazione del modello automatizzati e manuali e raffinatezza.

	Pipeline di granate	Pipeline di XDS_APP
Raccolta ed elaborazione dati
Sorgente di raggi x / fascio di linea	ESRF / MASSICCIO-1
Lunghezza d'onda (Å)	0.966
Risoluzione (Å)	41,88 – 1,48 (1.53 – 1,48)	41,86-1.32 (1.39 – 1,32)
Totale/Unique riflessioni	127670 / 28644	177332 / 40134
	(12178 / 2775)	(23772 / 5714)
Gruppo spaziale per l'indicizzazione, la scala e la fusione	C222	C2221
Dimensioni della cella
a, b, c (Å)	42,20, 83.75, 95,85	42.19, 83.72, 95,82
Mosaicity	0.05	0.05
Rmeas (%)	10.0 (110,7)	11.1 (198,2)
< I/σ(I) >	9.6 (1,3)	7.6 (0,7)
CC1/2 (%)	99.7 (53,9)	99.7 (19,1)
Completezza (%)	99,6 (99,6)	99,5 (98,6)
Molteplicità	4.5 (4,4)	4.4 (4,2)
Sostituzione molecolare e raffinatezza modello preliminare
Gruppo spaziale per l'eliminazione	C2	C2221
Dimensioni della cella
a, b, c (Å)	83.74, 42,18, 95,82	42.19, 83.72, 95,82
Α, Β, Γ (°)	90, 90.03, 90	90, 90, 90
Modello di ricerca per MR (PDB)	3KLR	3KLR
Molecole di proteina / ASU	2	1
Residui della proteina	250	125
Rlavoro/rgratis (%) Dopo un affinamento di 1 °	24,3 / 26,5	20,4 / 23,8
Lunghezza di legame RMSD (Å) dopo un affinamento di 1 °	0,01	0,01
Angolo di legame RMSD (°) dopo un affinamento di 1 °	1.2	1.83
Rotameri outlier (%) Dopo un affinamento di 1 °	1.07	4,29
Ramachandran ha favorito/consentiti/non consentiti (%) Dopo un affinamento di 1 °	95,93 / 4.07 / 0	95.12 / 4.88 / 0

Tabella 1: statistiche collezione, la raffinatezza e la convalida dei dati di diffrazione di raggi x. I valori per la shell di risoluzione più alta sono indicati tra parentesi.

Figura 1: analisi prima di raccolta dei dati di esempio. (A) la regione selezionata per scansione è indicata da un riquadro rosso. (B) l'analisi delle immagini di diffrazione è riportata come una mappa di calore. Quattro posizioni all'interno del cristallo trovano sono stati selezionati per la raccolta dati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: convalida Visual di mappe di densità elettronica ottenuta dopo raffinatezza. Mappe di densità elettronica sagomate sul livello r.m.s intorno (un) Trp143, (b), Val66 (Ile in GCSH umano) e (c), Glu98 (Asp in GCSH umano): 2x e mappe sagomato sul 1 x livello r.m.s intorno (d), Phe149 (Leu in umano GCSH) e (e) Lys125 (Asp in GCSH umano). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Completamente automatico beamlines fornire raccolta automatizzata di caratterizzazione e dati da un gran numero di cristalli macromolecolari senza la presenza di uno scienziato, o presso la beamline o da remoto, sia necessario. Utilizzando beamlines completamente automatizzato ha molti vantaggi rispetto al funzionamento manuale. Per esempio, l'esempio automatizzata di centraggio, basato sulla maglia di raggi x e linea scansioni, è più preciso di quello eseguito con l'occhio umano come non è influenzato dagli effetti termici o ottici. Infatti, queste scansioni mesh e linea forniscono dati aggiuntivi (vale a dire le dimensioni dettagliate del cristallo e la migliore diffracting regione del cristallo) che sono importanti per determinare la dimensione corretta larghezza da utilizzare per la raccolta dati — soprattutto per piccoli cristalli ¹⁸— e spesso si traducono in un miglioramento della qualità dei dati ottenuti diffrazione. Inoltre, sfruttando i parametri definiti dall'utente nell'impostazione degli esperimenti automatici, i passaggi in flussi di lavoro specifici possono essere adattati per soddisfare meglio il sistema in fase di studio, ottimizzando ulteriormente il tasso di successo di esperimento.

Insieme, prendendo l'affidabilità dei flussi di lavoro disponibili, l'accesso diretto ad beamline (utenti self-pianificare, utilizzando un calendario [vedi sopra]) e l'approccio completamente automatico del MASSIF-1 fornisce una rigorosa, ad alta produttività e risparmio di tempo alternativa ai classici esperimenti pratici di MX e il potenziale per implementare le più avanzate procedure e applicazioni nei flussi di lavoro automatici. Nel prossimo futuro, cartografia di cristallo in 3D¹⁹ sarà applicata per migliorare la precisione di centratura dei raggi x, mentre protocolli più complessi, ad esempio crystal disidratazione esperimenti²⁰, saranno automatizzati. Si spera che la raccolta dati completamente autonoma diventerà un metodo standard in MX, fornendo dati di alta qualità per gli schermi della piccolo-molecola frammento, la proiezione di un gran numero di mal diffracting cristalli e fornendo automaticamente la fase di ottimizzazione informazioni per risolvere crystal structures de novo. In combinazione con gli sviluppi nella raccolta automatizzata di cristalli²¹, la possibilità di soluzione di struttura di cristallo della proteina come un servizio automatizzato potrebbe diventare una realtà.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beamline MASSIF-1	ESRF
BL21DE3	New England Biolabs	C2527I
chloramphenicol	Roth	3886.1
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K	Merck Millipore	UFC803024
Dialyzing membrane	Spectrumlabs	132655
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dnase	Roche	11284932001
DTT	Euromedex	EU0006-B
EDTA- free protease inhibitors	Roche	4,693,159,001
glycerol	VWR Chemicals Prolabo	14388.29T
His-trap HP	GE healthcare	17-5247-01
imidazole	Sigma-Aldrich	56750-500G
IPTG	Euromedex	EU0008-B
LB medium	Sigma-Aldrich	L3022
lipoic acid	Sigma-Aldrich	T5625
loop	Hampton Research	HR8-124
lysozyme	Roche	10 837 059 001
MonoQ 5/50 GL	GE healthcare	17-5166-01
NaCl	Fisher Chemical	S/3160/60
Sonicator vibra cell 75/15	SONICS
SPINE pucks	MiTeGen	SKU: M-CSM003-0001A
Tris base	Euromedex	26-128-3094-B
Sodium Formate	Sigma-Aldrich	1064430500
GCSH purification buffer	20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl
GCSH cryo-protection buffer	0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol
Programs:
MxCube		Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010)	local development
ISPyB	ESRF	Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535	local development
MXCube2	ESRF	Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014).	local development
BES workflow server		Brockhauser, S. et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012).
DOZOR	ESRF	Bourenkov and Popov, unpublished	local development
BLISS beamline control		Guijarro, M. et al. BLISS - Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Spain. doi: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018).	local development
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BEST and EDNA		Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009).	local development
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Coot		Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004).
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Matthews		Matthews, B.W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).