Helt selvstendig karakterisering og datainnsamling fra krystaller av biologiske makromolekyler

Summary

Her beskriver vi hvordan du bruker den automatiserte screening og postalternativer for datainnsamling tilgjengelig på noen synchrotron beamlines. Forskere sende cryocooled prøver å synchrotron, egenskapene Diffraksjon er vist, datasettene er samlet inn og behandlet og, om mulig, en struktur løsning er utført – alt uten menneskelig inngripen.

Abstract

Høy-glans X-ray bjelker kombinert med automatisering har ført til bruk av synchrotron-baserte macromolecular Røntgenkrystallografi (MX) beamlines for selv de mest utfordrende prosjektene i strukturell biologi. De fleste anlegg krever imidlertid fortsatt tilstedeværelse av en forsker på området for å utføre eksperimenter. En ny generasjon av automatiske beamlines dedikert til helautomatisk karakteristikk av og datainnsamling, krystaller av biologiske makromolekyler har nylig blitt utviklet. Disse beamlines representerer et nytt verktøy for strukturelle biologer til skjermen resultatene av første krystallisering prøvelser og/eller samlingen av store antall Diffraksjon datasett, uten brukere å kontrollere beamline seg selv. Her viser vi hvordan du setter opp et eksperiment for automatisk screening og datainnsamling, hvordan et eksperiment er utført på beamline, hvor de resulterende datasettene er behandlet, og hvordan, når krystallstruktur av den biologiske Makromolekyl er løst.

Introduction

Avgjøre tredimensjonale strukturen i spesifikke proteiner er avgjørende i biologi. Informasjonen som er avledet fra gjør så kaster lys på den biologiske funksjonen og form og spesifisitet av aktiv og/eller bindende områder i molekylet under studien. I mange tilfeller kan dette virkningsmekanismer bestemmes eller, eventuelt, potensielle terapeutiske molekyler utvikles. MX er teknikken brukes vanligvis til å få strukturinformasjon, men en flaskehals bestemmelse av de optimale forholdene å få godt diffracting krystaller. Derfor krystallisering forsøk er gjennomført i mange ulike forhold og er deretter screenet, for å finne de beste krystallene brukes for Diffraksjon datainnsamling. Automatisering av oppsettet av krystallisering forsøk¹ har klart bidratt i denne forbindelse. Men utføres de påfølgende trinnene (dvs. krystall montering, Diffraksjon screening og Diffraksjon datainnsamling) vanligvis manuelt, tar opp mye tid, krefter og ressurser. Automatisering av Diffraksjon screening og datainnsamling, derfor betyr en enorm gevinst og effektivitet.

Diffraksjon screening og datainnsamling i MX utføres ofte på synchrotron MX beamlines som automatisering i stor grad har tilrettelagt denne prosessen. Men i de fleste tilfeller er det nødvendig for vitenskapsmannen finnes på beamline under et eksperiment eller fungere det eksternt. Nylig har en ny generasjon av fullstendig automatisert MX beamlines vært utviklet². Her, trenger brukerne ikke å være tilstede, enten fysisk eller eksternt under en eksperimentell. Dette gjør at forskere til å bruke mer tid på mindre rutineoppgaver, i stedet tilbringe hele dager, og ofte netter, screening krystaller og Diffraksjon datasamling. Verdens første helautomatiske beamline er svært automatisert eksempel integrert Fasilitet for valg (MASSIF-1, ID30A-1)^2,3 på europeiske Synchrotron stråling anlegg (ESRF). Den har et unikt utvalg miljø som en høykapasitets eksempel inneholder dewar opererer i tandem med en robot eksempel veksler som også fungerer som den beamline goniometer^4,5. MASSIVET-1 er en undulator beamline utstyrt med en enkelt-fotonet-telling hybrid pixel detektor⁶, som opererer på en bestemt bølgelengde på 0.969 Å (12.84 keV) med en intens røntgenbilde stråle (2 x 10¹² fotoner/s). Strålen størrelsen på prøveposisjon kan justeres mellom minimum 10 µm (runde strålen) til maksimalt 100 µm x 65 µm (vannrett etter vertikale strålen størrelse). I gjennomsnitt kan av beamline behandle, i en helt automatisk mote (se nedenfor), 120 krystaller i 24. Driften av beamline er basert på en rekke arbeidsflyter⁷hver tar intelligente beslutninger basert på utfallet av trinnene i arbeidsflyten slik måling av best mulig dataene fra prøven under studien. Spesielt evalueringen Diffraksjon kjennetegner en enkelte eksempel tar konto krystall volum og fluks og sikrer, der krystallen er større enn røntgenbilde stråle, at bare den beste regionen krystall brukes for etterfølgende data samling. Diffraksjon datasett er dermed optimalisert for maksimal oppløsning med minimerte stråling skader^2,3. Krevende data samling protokoller som pseudo spiralformede (multi-posisjon) data samling strategier for både innsamling av innfødte og enkelt-bølgelengde uregelrett Diffraksjon (SAD), er også tilgjengelig⁸.

Helt automatisk eksperimenter på MASSIF-1 involverer cryocooling og montering krystaller på en magnetisk eksempel festet passer for ønsket beamline utstyr standard pinnene RYGGRADEN⁹inn ønsket eksperimentelle parameterne i den ' Diffraksjon plan' tabell i integrerte systemet for Protein krystallografi beamlines (ISPyB)¹⁰, en web-basert informasjon styringssystem for MX eksperimenter, og sende prøvene til beamline. På ESRF, alle kostnader for transport av prøvene til/fra beamline støttes av ESRF bruker Office (se nettstedet til ESRF¹¹ for detaljer). I MASSIVET-1, ingen restriksjoner på loop størrelsen eller krystall kvalitet. Når du velger en Diffraksjon plan for en gitt krystall, kan brukeren enten bruke standardinnstillingene eller velg bestemte arbeidsflyter, som kan tilpasses for hvert utvalg. Flere forhåndsprogrammerte arbeidsflyter er tilgjengelige. MXPressE³ i arbeidsflyten justeres først prøve inneholder løkken til prøveposisjon bruker optisk sentrering. Deretter sikrer X-ray-baserte sentrering at den beste delen av krystallen er sentrert av X-ray strålen. Data samling strategier beregnes deretter ved hjelp av eEDNA, et rammeverk for å utvikle plugin-baserte programmer spesielt for online dataanalyse i feltet X-ray eksperimenter tar konto krystall volum og sanntid fluks på beamline. Etter samlingen til en full Diffraksjon datasett, dette behandles deretter bruke en serie med automatisk databehandling rørledninger¹² og resultatene er gjort tilgjengelig for inspeksjon og nedlasting i ISPyB. MXPressE SAD³ arbeidsflyten er rettet mot selenomethionine inneholder krystaller av målet protein og utnytter det faktum at operativsystemet energien i MASSIF-1 er like over Se K kanten. Her MXPressE eEDNA dataene samling strategi er optimalisert for trist datainnsamling (dvs. høyt redundans, og med oppløsning satt til der R_flettingen mellom Bijvoet par er under 5%). Til skjermen Diffraksjon egenskapene for en rekke krystaller uten etterfølgende datainnsamling, kan MXScore³ arbeidsflyten brukes til å produsere en full kvalitetsvurdering av krystallene analysert. MXPressI³ i arbeidsflyten samles 180 ° rotasjon data bruke 0,2 ° svingninger og start phi vinkelen og oppløsningen bestemmes av en eEDNA strategi. MXPressO ³ inneholder en preobserved oppløsning i arbeidsflyten (standard: d_min = 2 Å). For å gjøre en innledende vurdering av krystaller som resulterer fra en krystallisering rettssaken, tilbys MXPressM³ arbeidsflyt. Dette utfører en høy dose mesh avsøke over bredeste retningen for eksempel støtte med ingen datainnsamling eller sentrering. To nye eksperiment arbeidsflyter, MXPressP og MXPressP_SAD, som utfører pseudohelical data samlinger, har nylig vært gjennomført⁸. Av alle trinn i alle arbeidsflyter kan følges online og i sanntid av brukeren, via ISPyB.

Her viser vi hvordan å forberede et helautomatisk MX eksperiment MASSIF-1 og å hente og analysere dataene som følge av eksperimentet. Som et eksempel bruker vi menneskelige mitokondrie glysin cleavage systemet protein H (GCSH). Dette lipoic syre inneholder proteinet er del av glysin cleavage systemet er ansvarlig for nedbrytning av glysin. Denne system inkluderer P protein, en pyridoxal fosfat-avhengige glysin dekarboksylasehemmer, T protein, en tetrahydrofolate-krever enzym og L protein, en lipoamide-dehydrogenase. GCSH overfører gruppen methylamine glysin fra P protein til T protein. Feil i H protein er årsaken til nonketotic hyperglycinemia (NKH) i Human¹³.

Protocol

Merk: Produksjon, rensing og krystallisering av GCSH er beskrevet i supplerende fil 1.

1. kort beskrivelse av frakoblede forberedelse og krystall montering

1. Plasseringen en nylon loop eller en annen krystall montering støtte allerede fast til RYGGRADEN poler under ett eller flere krystaller og løfte dem ut av nedbør løsningen (20 µL av 0,5 M natrium formiat pH 4.0 + 25 µL av protein løsning).
   1. Fjern bulk væsken rundt i crystal(s) ved å berøre fjellet med en papir veke å suge ut overflødig væske.
2. Suge crystal(s) i den cryoprotective løsningen inneholder nedbør løsning og 30% glyserol; deretter fjerne både krystall støtte og crystal(s).
   1. Fjern bulk væsken rundt i crystal(s) ved å berøre fjellet med en papir veke å suge ut overflødig væske.
3. Stupe fjellet i RYGGRADEN ampuller fylt med flytende nitrogen og lagre den, sammen med noen andre krystaller tilsvarende forberedt, i en European Molecular Biology Laboratory (EMBL) / ESRF prøve skifter pucken⁹ flytende nitrogen temperatur.
   Merk: Crystal(s) er stabile i denne tilstanden til beamtime er tilgjengelig.

2. be om beamtime på MASSIF-1

1. Be om beamtime så tidlig som mulig på ESRF hjemmeside (på http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying).
   Merk: Det finnes en rekke mulige moduser av ESRF MX-beamlines. Laboratorier kan bruke kollektivt som en del av en blokk tildeling Group (BAG), har beamtime tildelt 2 år. Hvis grupper vil utligne individuelt, kan de bruke for rullende access, som gir dem rask tilgang til beamlines etter fagfellevurdering. Gruppens forslag er gjennomgått og ryddet av ESRF sikkerhet gruppen som kan be om tilleggsinformasjon. Hvis forslaget er akseptert, vil et eksperiment nummer og passord bli kommunisert. Egne forskningsresultater kan utføres ved å kjøpe beamtime.
2. Fullføre de nødvendige sikkerhets opplæring online (på http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining).
3. Bestill beamtime i MASSIF-1-kalenderen.
   Merk: Det er mulig å bestille opp til maksimalt 50 eksempel holdere til å analysere per skift.
4. Fyll ut et-skjema til å erklære en post-i-eksperiment (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form), sammen med nødvendig sikkerhetsinformasjonen, for prøvene som skal måles.

3. opprette en Diffraksjon plan i ISPyB

Merk: Diffraksjon planen inneholder all informasjon som kreves for et utvalg i ISPyB og kan inneholde tilleggsinformasjon for å skreddersy eksperimentet utføres for hvert utvalg.

1. Åpne ISPyB (på https://exi.esrf.fr/).
2. Velg MX eksperimenter.
3. Logg på med eksperimentet nummer og passord.
4. Klikk på forsendelsen | Legg til ny og gi nødvendig informasjon. Klikk Lagre.
5. Klikk Legg til pakke og fyll ut den forespurte informasjonen. Klikk Lagre.
6. Klikk Legg til beholderen, gi pucken strekkoden som navn og velg RYGGRADEN pucken. Klikk Lagre.
7. Klikk på beholderen symbol og redigere, og fyll ut nødvendig informasjon, som protein navn, arbeidsflyten, crystal posisjon i puck, etc., om prøvene.
8. Velg protein (for eksempel GCSH eller lysozyme) som er godkjent av ESRF sikkerhet.
9. Angi et unikt utvalg navn å identifisere hvert individuelle utvalg. Er det mulig å skanne eventuelt pin strekkoden. Resten av informasjonen nedenfor er valgfrie.
10. Angi valgfrie.
    1. Angi eksperiment for hver enkelt prøve, (dvs. MXPressE_SAD, SCORE eller MXPressO, etc., standard MXPressE) under Exp. Type. Dette definerer hvilke automatisk arbeidsflyt skal brukes til å behandle hver krystall. Gitt at GCSH krystallene er nåler, velg MXPressP.
    2. Angi en plass gruppe (for eksempel P1, C2 eller P2₁2₁2₁), hvis kjent. Hvis dette brukes for databeregninger samling strategi og ved automatisk databehandling rørledningene tilgjengelig.
    3. Angi ønsket oppløsning (standard: d_min = 2.0 Å). Dette definerer krystall-til-detektor avstanden for første maske skanner, karakterisering og standard datainnsamling.
    4. Angi ønsket terskelen oppløsning (for eksempel 1,5 Å eller 2.3Å), for å forhindre innsamling av full datasett fra krystaller som ikke diffract denne grensen. Dette kan spare data lagringen mellomrom og analyse tid.
    5. Angi den nødvendige fullstendigheten (standard: 0,99). Angi nødvendig multiplisiteten (standard: 4). Hvis mer enn én krystall finnes på prøven støtte, sette det maksimale antallet av krystaller som skal analyseres. Standardverdien er 1 eller 5 for MXPressP.
    6. Velge riktig bredde (standard: 50 µm). Hvis en bestemt verdi ikke er valgt, utføres X-ray-sentrering og dataene samling strategi beregninger strålen størrelse på 50 µm.
       Merk: I løpet av eventuelle etterfølgende samling av komplette datasett, strålen størrelsen kan tilpasses automatisk.
    7. Sette i gruppen plass hvis kjent, i kolonnen for tvungen plass-gruppen. Angi stråling-følsomheten av krystallene (0,5-2.0 for lav til høy følsomhet, med en standardverdi på 1).
11. Angi eventuelt totale rotasjonsvinkelen inn for samlingen hele datasettet (standard: totalt rotasjonsvinkelen bestemmes av eEDNA).
12. Lagre verdiene. Klikk på tilbake til forsendelser. Trykk Send levering til ESRF.
13. Skrive ut forsendelsesetiketten og sende prøvene. Brukere bør arrangere henting med en kurer, bruker ESRF kontoinformasjon.
    Merk: Det er svært viktig å velge Inkluder returetikett å tillate sømløs tilbakebetaling av prøver (se https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement).

4. datainnsamling, visning og henting

Merk: Ved eksperimentet, prøver er overført til MASSIF-1 høy kapasitet Dewar (HCD). Beamline forskere deretter starte datainnsamling, som kan følges av brukere eksternt. For hver ulike eksempler mottar en e-post informere dem om at datainnsamling har startet. Som tidligere nevnt, gjennomføring av alle trinn i alle arbeidsflyter kan følges online og i sanntid av den bruker via ISPyB, som kan resultatene vises og lastet ned.

1. For hver prøve analysert, undersøke resultatene av den automatiske eksperimentet i ISPyB (https://exi.esrf.fr/).
   1. Logg på, med eksperimentet antallet og passord, og klikk på ønsket eksperimentelle økten ved ID30A-1.
   2. Velg foretrukket (topp-scoring) autoprocessing rørledningen (for eksempel granater eller XDS_APP) og laste ned data skrevet ut i gruppen riktig plass med høyeste fullstendighet og høyeste oppløsningen ved å klikke på Siste samle resultater og så, Last ned.
      Merk: Alle mesh, linje og karakterisering bilder er i en undermappe for hver prøve, kalt /MXPressE_01. ESRF kjøres automatisk fem separate behandling pakker, nemlig EDNA_proc¹²granater¹², XDS_APP¹⁴, autoPROC¹⁵og XIA2¹⁶. Dataintegrering er basert på XDS, med unntak av XIA2, som er basert på ringer. Alle pakker også kjøres i unormalt og nonanomalous modus, tillater automatisk språkidentifisering for et unormalt signal, hvis den finnes i data, brukes i SAD utfasing protokoller. Hver pakke bruker ulike parametere og beslutningstrær, betyr at noen pakker kjører bedre med visse prøver. Men kan dette gjøre for et stort antall resultater når antall pakker og mulig space grupper er regnskapsføres. Resultatene er derfor rangert basert på oppløsning og andre kvalitet beregninger, som R_flettingen i laveste oppløsning shell, CC(1/2) og fullstendighet. Dette er rettet mot lede brukeren til de beste datasettene, men alle mulige space grupper og resultater bør undersøkes nøye.
2. Pakk ut den nedlastede mappen, som inkluderer alle loggfiler og ikke-sammenslått XDS_ASCII. HKL og flettede og skalert .mtz filer.
   Merk: I tilfelle strukturen (i PDB-format) av interesse eller en nær homolog ble lastet opp til ISPyB i begynnelsen av eksperimentet, autoprocessing rørledningen på ESRF automatisk utfører en molekylær erstatning (MR) bruker denne strukturen som den Søk modellen på best scoring løsning. Resultatene av rørledningen MR vises i ISPyB og finnes i mappen bearbeidet data (for eksempel /data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_ mrpipe_dir /). Her, navnet den siste modellen coot1.pdb og refleksjon data sidechains.mtz. Merk at rørledningen kan redusere symmetri i cellen (primitive celle reduksjon) for å øke sannsynligheten for å finne en løsning. I tilfellet her skrev MR rørledningen løsningen i en monoclinic celle (C2) ikke i en orthorhombic celle (C222₁). Informasjon om hvordan du utfører en molekylær erstatning kjøre manuelt (eksemplifisert for andre mest-scorende autoprocessing løsningen) er inkludert i Supplerende filer.

Representative Results

MXPressP arbeidsflyten ble brukt på ESRF beamline MASSIF-1 til fullstendig automatisk montere, center i røntgenbilde stråle, karakterisere og samle full Diffraksjon datasett fra en rekke krystaller av menneskelig GCSH. Prøvene ble montert og løkken analysert for et område å skanne (figur 1, venstre). Etter analysen Diffraksjon ble fire poeng valgt i krystallen for datainnsamling (figur 1, høyre). Etterfølgende behandling ved automatisert analyse rørledninger, inkludert rørledningen MR, gitt høy kvalitet datasett (tabell 1) for som en MR løsning ble funnet. Sistnevnte lar brukerne raskt vurdere om innhentet datasettet og søk modellen er egnet for innfasing av molekylære erstatning. I tillegg kan tilstedeværelsen av ligander bli dømt, og tillater brukeren å fokusere bare på de mest lovende datasett for videre analyse. Manuell proteinstrukturer av MR gitt et høykvalitets elektron tetthet kart etter en enkelt automatisert raffinement syklus (figur 2a). For dataset kutte automatisert rørledningen dataene på en 1.32 Å oppløsning. brukere kan imidlertid fortsatt bestemme å kutte dataene med en lavere oppløsning på ulik kvalitet statistikk (CC_1/2, < I/σ(I) >, R_tiltak) i høyeste oppløsning skallet. Krystallstruktur av menneskelig GCSH struktur er lik som storfe protein (3KlR)¹⁶.

Kontinuerlig elektron tetthet er synlig for hele aminosyre kjeden, bortsett fra N-terminal histidin koden. Fire erstatninger som skiller menneskelige og storfe GCSH, er tre lett identifiserbare i elektron tetthet (Ile/Val66 Asp/Glu98 og Leu/Phe149; Figur 2b -d). Dette er mindre klart for Asp/Lys125 substitusjon som elektron tettheten av side kjede er bare delvis løst på grunn av fleksibilitet (figur 1e). Nå fått modellen har R_arbeide og R_gratis verdier 20,4% og 23.8%, henholdsvis, og kan være ytterligere optimalisert av ytterligere sykluser av automatiserte og manuelle modell bygning og raffinement.

	GRANATER rørledning	XDS_APP rør
Innsamling og behandling
X-ray kilde / stråle linje	ESRF / MASSIF-1
Bølgelengde (Å)	0.966
Oppløsning (Å)	41.88-1.48 (1,53-1.48)	41.86-1.32 (1.39-1.32)
Totalt/Unique refleksjoner	127670 / 28644	177332 / 40134
	(12178 / 2775)	(23772 / 5714)
Plassen gruppen for indeksering, skalering og sammenslåing	C222	C2221
Cellen dimensjoner
a, b, c (Å)	42,20, 83.75, 95.85	42.19, 83.72, 95,82
Mosaicity	0,05	0,05
Rtiltak (%)	10.0 (110.7)	11.1 (198.2)
< I/σ(I) >	9.6 (1.3)	7.6 (0,7)
CC1/2 (%)	99,7 (53.9)	99,7 (19.1)
Fullstendigheten (%)	99.6 (99.6)	99,5 (98.6)
Mangfold	4.5 (4.4)	4.4 (4.2)
Molekylær erstatning og foreløpige modell raffinement
Plassen gruppen for innfasing	C2	C2221
Cellen dimensjoner
a, b, c (Å)	83.74, 42.18, 95,82	42.19, 83.72, 95,82
Α, Β, Γ (°)	90, 90.03, 90	90, 90, 90
Søk modell for MR (PDB)	3KLR	3KLR
Protein molekyler / ASU	2	1
Protein rester	250	125
Rarbeide/Rgratis (%) etter 1 raffinement	24,3 / 26.5	20.4 / 23.8
RMSD bånd lengde (Å) etter 1 raffinement	0,01	0,01
RMSD bånd vinkel (°) etter 1 raffinement	1.2	1.83
Rotamer avvikende (%) etter 1 raffinement	1,07	4.29
Ramachandran favorisert/tillates/ikke tillates (%) etter 1 raffinement	95.93 / 4.07 / 0	95.12 / 4,88 / 0

Tabell 1: X-ray Diffraksjon data innsamling, raffinement og validering statistikk. Verdiene for høyeste oppløsning skallet er angitt i hakeparenteser.

Figur 1: eksempel analyse før datainnsamlingen. (A) regionen valgt for skanning er vist av en rød boks. (B) analyse av Diffraksjon bilder vises som en varmekart. Fire posisjoner innen ligger krystallen ble valgt for datainnsamling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Visual validering av elektron tetthet kart innhentet etter raffinement. Elektron tetthet kart formet på 2 x r.m.s. nivå rundt (en) Trp143, (b) Val66 (Ile i menneskelig GCSH), og (c) Glu98 (Asp i menneskelig GCSH) og kart formet på 1 x r.m.s nivå rundt (d) Phe149 (Leu i menneskelig GCSH) og (e) Lys125 (Asp i menneskelig GCSH). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Helautomatisk beamlines gir automatisert karakterisering og datainnsamlingen fra et stort antall macromolecular krystaller uten tilstedeværelse forsker, enten på beamline eller eksternt, som krevde. Bruke fullstendig automatisert beamlines har mange fordeler i forhold til manuell drift. For eksempel, automatisert prøven sentrering, basert på X-ray mesh og line skanner, mer presis enn med det menneskelige øyet som påvirkes den ikke av termisk eller optiske effekter. Faktisk disse mesh og line skanner gi ekstra informasjon (dvs. detaljert dimensjoner krystall og best diffracting regionen av crystal) som er viktig å bestemme riktig strålen størrelsen du bruker til datainnsamling-spesielt for små krystaller ¹⁸- og fører ofte til en forbedret kvaliteten på innhentet Diffraksjon dataene. Videre ved å utnytte de brukerdefinerte parameterne i oppsettet automatisk eksperimenter, kan trinnene i bestemte arbeidsflyter skreddersys for å passe systemet under studien, dermed ytterligere optimalisering eksperiment suksessraten.

Tar sammen, påliteligheten av arbeidsflyter tilgjengelig, enkel tilgang til beamline (brukere selv planlegge, bruke en kalender [se ovenfor]), og den helautomatiske tilnærmingen av MASSIF-1 gir et grundig, høy gjennomstrømming og tidsbesparende alternativ til klassisk hands-on MX eksperimenter og potensial til å implementere mer avanserte prosedyrer og programmer i automatisk arbeidsflyter. I nær fremtid, iverksettes crystal kartografi i 3D¹⁹ for å forbedre nøyaktigheten av X-ray sentrering, mens mer komplekse protokoller som krystall dehydrering eksperimenter²⁰, automatisert. Håpet er at fullstendig autonome datainnsamling vil bli en standard metode i MX, gir høy kvalitet data for små molekyl fragment skjermer, optimalisere screening av store antall dårlig diffracting krystaller og automatisk gir fase informasjon å løse krystall strukturer de novo. I kombinasjon med utviklingen i den automatiserte høsting krystaller²¹, muligheten for protein krystall struktur løsning som en automatisert tjeneste kan godt bli en realitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beamline MASSIF-1	ESRF
BL21DE3	New England Biolabs	C2527I
chloramphenicol	Roth	3886.1
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K	Merck Millipore	UFC803024
Dialyzing membrane	Spectrumlabs	132655
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dnase	Roche	11284932001
DTT	Euromedex	EU0006-B
EDTA- free protease inhibitors	Roche	4,693,159,001
glycerol	VWR Chemicals Prolabo	14388.29T
His-trap HP	GE healthcare	17-5247-01
imidazole	Sigma-Aldrich	56750-500G
IPTG	Euromedex	EU0008-B
LB medium	Sigma-Aldrich	L3022
lipoic acid	Sigma-Aldrich	T5625
loop	Hampton Research	HR8-124
lysozyme	Roche	10 837 059 001
MonoQ 5/50 GL	GE healthcare	17-5166-01
NaCl	Fisher Chemical	S/3160/60
Sonicator vibra cell 75/15	SONICS
SPINE pucks	MiTeGen	SKU: M-CSM003-0001A
Tris base	Euromedex	26-128-3094-B
Sodium Formate	Sigma-Aldrich	1064430500
GCSH purification buffer	20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl
GCSH cryo-protection buffer	0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol
Programs:
MxCube		Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010)	local development
ISPyB	ESRF	Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535	local development
MXCube2	ESRF	Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014).	local development
BES workflow server		Brockhauser, S. et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012).
DOZOR	ESRF	Bourenkov and Popov, unpublished	local development
BLISS beamline control		Guijarro, M. et al. BLISS - Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Spain. doi: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018).	local development
AUTO processing of images		Monaco, S. et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013)	local development
BEST and EDNA		Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009).	local development
CCP4		Winn, M.D. et al. Overview of the CCP 4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011).
Phaser MR		McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007).
Coot		Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004).
refmac5		Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. Acta Crystallographica Section D. 53, 240--255 (1997).
Matthews		Matthews, B.W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).