Helt självständigt karakterisering och datainsamling från kristaller av biologiska makromolekyler

Summary

Här, beskriver vi hur du använder automatiserade screening och data insamling alternativ som är tillgängliga på vissa synkrotron linjer. Forskare skicka cryocooled prover till synchrotron, och egenskaperna diffraktion screenas, datauppsättningar samlas in och bearbetas och, om möjligt, en struktur lösning utförs — allt utan mänsklig inblandning.

Abstract

Hög-briljans röntgen strålar tillsammans med automation har lett till användning av synkrotron-baserade Makromolekylär röntgenkristallografi (MX) linjer för även de mest utmanande projekten inom strukturbiologi. De flesta anläggningar kräver dock fortfarande närvaron av en forskare på plats att utföra experimenten. En ny generation av automatiska linjer tillägnad helautomatisk karakterisering av, och insamling av data från, kristaller av biologiska makromolekyler har nyligen utvecklats. Dessa linjer representerar ett nytt verktyg för strukturella biologer att skärmen resultaten av inledande kristallisering prövningar och insamling av stora mängder diffraktion datauppsättningar, utan användare behöva kontrollera beamline sig själva. Här visar vi hur du ställer in ett experiment för automatisk screening och datainsamling, hur ett experiment utförs på beamline, hur de resulterande datamängder behandlas, och hur, när det är möjligt kristallstrukturen i den biologiska makromolekyl är löst.

Introduction

Bestämma den tredimensionella strukturen av specifika proteiner är avgörande i biologi. Den information som härleds från gör så belyser på biologiska funktion och form och specificitet av aktiv och/eller bindande platser som ingår i molekylen under studien. I många fall, detta tillåter verkningsmekanismer att bestämmas eller, i förekommande fall potentiella terapeutiska molekyler att utvecklas. MX är den teknik som vanligast att få strukturell information, men en flaskhals är bestämning av optimala förutsättningar att få väl diffracting kristaller. Därför kristallisering prövningar utförs under många olika förhållanden och screenas sedan, för att hitta de bästa kristallerna som ska användas för diffraktion datainsamling. Automatisering av inställningen av kristallisering prövningar¹ har tydligt hjälpt i detta avseende. Men är de efterföljande stegen (dvs crystal montering, diffraktion screening och diffraktion datainsamling) vanligtvis utförs manuellt, tar upp mycket tid, ansträngning och resurser. Automatisering av diffraktion screening och datainsamling skulle därför innebära en enorm vinst i tid och effektivitet.

Diffraktion screening och datainsamling i MX utförs oftast vid synkrotron MX linjer där automation har i hög grad underlättat denna process. I de flesta fall är det dock nödvändigt för forskaren att närvara vid beamline under ett experiment eller att driva det distans. Nyligen har en ny generation av helt automatiserad MX linjer varit utvecklade². Här, behöver användarna inte vara närvarande, antingen fysiskt eller på distans, under en experimentell session. Detta tillåter forskare att spendera mer tid på mindre rutinuppgifter, snarare än att spendera hela dagar, och ofta nätter, screening kristaller och diffraktion datainsamling. Världens första helautomatiska beamline är kraftigt automatiserad prov urval integrerad anläggning (MASSIF-1, ID30A-1)^2,3 på Europeiska Synchrotron Radiation Facility (ESRF). Den har en unik prov miljö där en hög kapacitet prov-innehållande dewar driver parallellt med en robotic provväxlare som också fungerar som den beamline's goniometer^4,5. MASSIVET-1 är en undulator beamline utrustad med en enda-fotonräknande hybrid pixel detektor⁶, som fungerar vid en fast våglängd på 0.969 Å (12,84 keV) med en intensiv X-ray balk (2 x 10¹² fotoner/s). Beam storleken på provposition kan justeras mellan minst 10 µm (runda ljuskäglan) till högst 100 µm 65 µm (horisontell av lodräta balken storlek). I genomsnitt kan beamline process, i en helt automatisk mode (se nedan), 120 kristaller i 24 h. Driften av beamline är baserad på en serie av arbetsflöden⁷, varje som tar intelligenta beslut baserat på resultatet av föregående steg i arbetsflödet för att säkerställa att mätningen av den bästa möjliga datan från provet under studien. Särskilt utvärderingen av diffraktion egenskaper enskilda prov tar in i konto crystal volym och flux och säkerställer, där kristallen är större än röntgen balken, att endast den bästa regionen i kristallen används för efterföljande data Collection. Diffraktion datauppsättningar, således optimeras för maximal upplösning med minimerade strålning skada^2,3. Krävande uppgifter samling protokoll, till exempel pseudo spiralformade (multi position) data collection strategier för både infödda och singel-våglängd avvikande diffraktion (SAD) datainsamling, är också tillgängliga⁸.

Helt automatisk experiment MASSIF-1 innebär cryocooling och montering kristaller på en magnetisk prov fäste passar för önskad beamline utrustning standard stift RYGGRADEN⁹, ange de experimentella parametrarna i den ' diffraktion plan' bord i det integrerade systemet för röntgenkristallografi linjer (ISPyB)¹⁰, ett webbaserat ledningssystem för MX experiment, och skicka proverna till beamline. Vid ESRF, alla kostnader för transport av proverna från beamline som stöds av ESRF användaren kontoret (se webbplatsen för ESRF¹¹ för detaljer). MASSIF-1, är inga restriktioner på loop storlek eller kristall kvalitet. När du väljer en diffraktion plan för en given kristall, kan användaren antingen använda standardinställningarna eller välja från särskilda arbetsflöden, som kan anpassas för varje prov. Det finns flera förprogrammerade arbetsflöden. I MXPressE³ arbetsflödet justeras först prov-innehållande slingan till provposition med hjälp av optiska centrering. Sedan säkerställer X-stråle-baserade centrering att den bästa regionen i kristallen är centrerad till röntgen balken. Strategier för insamling av data beräknas sedan med eEDNA, en ram för att utveckla plugin-baserade program speciellt för online dataanalys i fältet röntgen experiment med hänsyn till konto crystal volym och realtid flux på beamline. Efter insamling av en full diffraktion datamängd, detta sedan bearbetas med hjälp av en serie av automatisk databehandling rörledningar¹² och resultaten görs tillgängliga för inspektion och ladda ner i ISPyB. MXPressE SAD³ arbetsflödet syftar selenometionin som innehåller kristaller av Målproteinet och utnyttjar det faktum att den operativa energin av MASSIF-1 är strax ovanför kanten Se K. Här, i MXPressE eEDNA data collection strategin är optimerad för SORGLIGT datainsamling (dvs hög redundans, och med resolutionen där R_kopplingen mellan Bijvoet par är under 5%). Skärm diffraktion egenskaperna för en serie av kristaller utan efterföljande datainsamling, kan MXScore³ arbetsflödet användas att producera en fullständig bedömning av kristaller analyseras. I MXPressI³ arbetsflödet samlas 180 ° rotation data in med 0.2 ° svängningar och använda start phi vinkeln och den resolution som bestäms av en eEDNA strategi. MXPressO ³ innehåller en preobserved upplösning i arbetsflödet (standard: d_min = 2 Å). För att göra en första bedömning av kristallerna som härrör från en rättegång kristallisering, erbjuds MXPressM³ arbetsflödet. Detta utför en hög dos mesh scanna över provet stöd med ingen datainsamling bredaste orientering eller centrering. Två nya experiment arbetsflöden, MXPressP och MXPressP_SAD, som utför pseudohelical datainsamlingar, har nyligen varit genomförda⁸. Utförandet av alla steg i alla arbetsflöden kan följas online och i realtid av användaren, via ISPyB.

Här visar vi hur du förbereder en helt automatiserad MX experiment MASSIF-1 och hur man hämta och analysera data från experimentet. Som exempel använder vi människors mitokondrie glycin klyvning system protein H (GCSH). Detta lipoic syra-innehållande protein är en del av glycin klyvning systemet ansvarar för degraderingen av glycin. Detta system ytterligare omfattar det P-proteinet, en pyridoxal fosfat-beroende glycin dekarboxylas, proteinet T, en tetrahydrofolat-kräver enzymet och proteinet L, en lipoamide-dehydrogenas. GCSH överför metylamin gruppen av glycin från proteinet P till T-proteinet. Defekter i H proteinet är orsaken till nonketotic hyperglycinemia (NKH) i människor¹³.

Protocol

Obs: Produktion, rening och kristallisation av GCSH beskrivs i kompletterande fil 1.

1. kortfattad beskrivning av offline förberedelse och crystal montering

1. Ställning en nylon-slinga eller ett annat crystal montering stöd redan fast en RYGGRAD pin under en eller flera kristaller och lyfta dem ur nederbörd lösningen (20 µL av 0,5 M natrium formate pH 4.0 + 25 µL protein lösning).
   1. Ta bort bulk vätskan runt crystal(s) genom att trycka på fästet med en papper veke att suga av någon överflödig vätska.
2. Blöt crystal(s) i den cryoprotective lösning som innehåller den nederbörd lösning plus 30% glycerol; ta sedan bort både crystal stöd och crystal(s).
   1. Ta bort bulk vätskan runt crystal(s) genom att trycka på fästet med en papper veke att suga av någon överflödig vätska.
3. Störta fästet i en RYGGRAD injektionsflaskan fylld med flytande kväve och lagra det, tillsammans med eventuella andra kristaller på samma sätt beredda, i en europeisk Molecular Biology Laboratory (EMBL) / ESRF urval växlare pucken⁹ på flytande kväve temperatur.
   Obs: Crystal(s) är stabila i detta tillstånd tills beamtime finns.

2. begär beamtime på MASSIF-1

1. Begära beamtime så tidigt som möjligt på ESRF hemsida (på http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying).
   Obs: Det finns ett antal möjliga lägen för tillgång till den ESRF MX linjer. Laboratorier kan gäller kollektivt som en del av ett Block fördelning grupp (väska), har beamtime tilldelats för 2 år. Om grupper vill ansöka individuellt, kan de ansöka om rullande åtkomst, vilket ger dem snabb tillgång till linjer efter referentgranskning. Gruppens förslag granskas och rensas av gruppen ESRF säkerhet som kan begära ytterligare information. Om förslaget godkänns, kommer en experiment-nummer och lösenord att meddelas. Egen forskning kan utföras genom att köpa beamtime.
2. Slutföra den nödvändiga säkerhetsutbildning online (på http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining).
3. Boka beamtime i MASSIF-1 kalendern.
   Obs: Det är möjligt att boka upp till maximalt 50 prov innehavare ska analyseras per skift.
4. Fyll i ett-formulär att deklarera ett post-i experiment (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form), tillsammans med nödvändiga säkerhetsinformation, för de prover som ska mätas.

3. skapande av en diffraktion plan i ISPyB

Obs: Diffraktion planen håller all information som behövs för ett prov i ISPyB och kan innehålla ytterligare information för att skräddarsy experimentet utförs för varje prov.

1. Öppna ISPyB (vid https://exi.esrf.fr/).
2. Välj MX experiment.
3. Logga in med det experiment nummer och lösenord.
4. Klicka på leverans | Lägg till ny och tillhandahålla nödvändig information. Klicka på Spara.
5. Klicka på Lägg till skifte och fyll i den begärda informationen. Klicka på Spara.
6. Klicka sedan på Lägg till behållare, ge pucken streckkoden som namn och välja RYGGRADEN pucken. Klicka på Spara.
7. Klicka på behållaren symbol och Redigera, och fyll i nödvändig information, som protein namn, önskat arbetsflöde, crystal position i puck, etc., om proverna.
8. Välj det protein (till exempel GCSH eller lysozym) som har godkänts av gruppen ESRF säkerhet.
9. Ange ett unikt prov namn som identifierar varje enskilda prov. Det är möjligt att alternativt Skanna streckkoden pin. Resten av informationen nedan är valfritt.
10. Ange valfri information.
    1. För varje enskilt prov, ange experiment (dvs, MXPressE_SAD, poäng eller MXPressO, etc., standard MXPressE) under Exp. typ. Detta definierar som automatiskt arbetsflöde används för att bearbeta varje kristall. Med tanke på att GCSH kristallerna är nålar, välja MXPressP.
    2. Ange en plats (till exempel P1, C2 eller P2₁2₁2₁), om känt. Om närvarande, används detta för data collection strategi beräkningar och genom automatisk databehandling rörledningarna tillgängliga.
    3. Anger önskad upplösning (standard: d_min = 2.0 Å). Detta definierar crystal-till-detector avståndet för den ursprungliga mesh skanningar, karakterisering och standard datainsamling.
    4. Ställ in önskat tröskelvärde upplösningen (till exempel 1,5 Å eller 2.3Å), att förhindra insamlingen av full datamängder från kristaller som inte gravering till denna gräns. Detta kan spara data lagring utrymme och analys tid.
    5. Ange obligatoriska fullständighet (standard: 0,99). Ange den nödvändiga mångfalden (standard: 4). om mer än en crystal ingår prov stöd, ange det maximala antalet kristaller analyseras. Standardvärdet är 1 eller 5 för MXPressP.
    6. Välj lämplig beam storlek (standard: 50 µm). Om ett specifikt värde inte är markerad, kommer den X-stråle-centrering och data insamling strategi beräkningar att utföras med en balk med storleken 50 µm.
       Obs: Under någon insamling av data set, beam storlek anpassas automatiskt.
    7. Sätta i utrymmegruppen om känd, i kolumnen tvingad utrymme grupp. Ställa in strålning-känsligheten kristaller (0,5 – 2,0 för låg till hög känslighet, med ett standardvärde på 1).
11. Om så önskas, ange totala rotationsvinkeln samlas för samlingen full datamängd (standard: totala rotationsvinkeln bestäms av eEDNA).
12. Spara värdena. Klicka på återgå till transporter. Tryck på Skicka försändelsen till ESRF.
13. Skriv ut fraktetiketten och skicka proverna. Användare bör ordna en pickup med en courier, med de ESRF kontouppgifterna.
    Obs: Det är mycket viktigt att välja Inkludera returetikett att tillåta sömlös återlämnande av prover (se https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement).

4. data insamling, visning och hämtning

Obs: På dagen av experimentet, prov överförs till MASSIF-1 hög kapacitet Dewar (HCD). Beamline forskare sedan starta datainsamlingen, som kan följas av användare distans. För varje Provtyp av olika får användare ett e-postmeddelande som informerar dem om att datainsamlingen har startat. Som tidigare nämnts, utförandet av alla steg i alla arbetsflöden kan följas online och i realtid av den användare via ISPyB, där resultaten kan visas och laddas ner.

1. För varje prov som analyseras, undersöka resultatet av det automatiska experimentet i ISPyB (https://exi.esrf.fr/).
   1. Logga in, med hjälp av experiment nummer och lösenord, och klicka på den önska experimentella sessionen på ID30A-1.
   2. Välj önskad (topp-scoring) autoprocessing rörledningen (till exempel granater eller XDS_APP) och hämta de data som skrivs ut i utrymmegruppen rätt med högsta upplösning och högsta fullständighet genom att klicka på Senaste samla resultat och, sedan Hämta.
      Obs: Alla mesh, linje och karakterisering bilder är i en underkatalog för varje prov, kallas /MXPressE_01. ESRF körs automatiskt fem separata bearbetning paket, nämligen EDNA_proc¹², granater¹², XDS_APP¹⁴, autoPROC¹⁵och XIA2¹⁶. Dataintegration är baserad på XDS, med undantag för XIA2, som bygger på RATTARNA. Alla paket är också köra i avvikande och nonanomalous lägen, möjliggör automatisk identifiering av en avvikande signal, om den finns i data, för att användas i SAD fasa protokoll. Varje paket använder olika parametrar och beslutsträd, vilket innebär att vissa paket körs bättre med vissa prover. Detta kan dock göra för ett stort antal resultat när antalet paket och möjliga Utrymmegrupper redovisas. Resultatet är, därför rankas baserat ungefär på upplösning och andra mätningar av kvalitet, såsom R_sammanfoga i den lägsta upplösning shell, CC(1/2) och fullständighet. Syftet är att vägleda användaren till bästa datauppsättningar, men alla möjliga Utrymmegrupper och resultat ska inspekteras noggrant.
2. Packa upp den nedladdade mappen, som kommer att omfatta alla loggfiler och separata XDS_ASCII. HST och sammanslagna och trappade .mtz filer.
   Obs: om strukturen (i PDB-format) av proteinet av intresse eller en nära homolog laddades upp till ISPyB i början av experimentet, rörledningen autoprocessing vid ESRF kommer att automatiskt utföra en molekylär ersättning (MR) körs med denna struktur som de Sök modell på bästa scoring lösning. Resultaten av rörledningen herr visas i ISPyB och kan hittas i mappen bearbetade data (till exempel /data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_ mrpipe_dir /). Den slutliga modellen namnges här, coot1.pdb och den speglar data sidechains.mtz. Observera att rörledningen kan minska symmetrin av cellen (primitiva cellen minskning) för att öka sannolikheten för att finna en lösning. I det här fallet skrev rörledningen herr ut lösningen i en monoklina cell (C2) snarare än i en Ortorombiska cell (C222₁). Detaljer om hur du utför en molekylär ersättning köra manuellt (exemplifierade för andra bäst scoring autoprocessing lösningen) ingår i den Kompletterande filer.

Representative Results

MXPressP arbetsflödet användes på den ESRF beamline MASSIF-1 till, helt automatiskt, montera, center i röntgen balken, karakterisera och samla full diffraktion datamängder från en serie av kristaller av mänskliga GCSH. Proverna var monterade och slingan analyseras för ett område att skanna (figur 1, vänster). Efter den diffraktion analysen valdes fyra punkter inom kristallen för datainsamling (figur 1, högra). Efterföljande bearbetning genom automatiserad analys datapipelines, inklusive herr rörledningen, gav hög kvalitet datamängder (tabell 1) för vilket en herr lösning hittades. Det senare tillåter användare att snabbt utvärdera om erhållna datamängden och Använd söka modellen är lämplig för utfasning av molekylär ersättning. Dessutom kan förekomsten av ligander bedömas, vilket tillåter användaren att bara fokusera på de mest lovande datamängderna för vidare analys. Manuell strukturbestämning av Herr gav en hög kvalitet elektron densitet karta efter en enda automatiserad förfining cykel (figur 2a). För denna datamängd klippa rörledningen automatiserad data på en 1,32 Å upplösning; användare kan dock fortfarande besluta att sänka data på en lägre upplösning för att komma fram till olika kvalitetsstatistik (CC_1/2, < I/σ(I) >, R_meas) i högsta upplösning shell. Kristallstrukturen av mänskliga GCSH struktur är liknande den av bovint protein (3KlR)¹⁶.

Kontinuerlig elektrontätheten är synlig för kedjan hela aminosyra, bortsett från N-terminala histidin etiketten. Av fyra substitutioner som skiljer människor och nötkreatur GCSH, är tre lätt identifierbara i elektrontätheten (Ile/Val66, Asp/Glu98 och Leu/Phe149; Figur 2b -d). Detta är mindre klar för Asp/Lys125 substitution som elektrontätheten av sidokedjan löses endast delvis på grund av flexibilitet (figur 1e). För närvarande erhållna modellen har R_arbeta och R_gratis värdena 20,4% och 23,8%, respektive, och ytterligare kan optimeras genom ytterligare cykler av automatiserade och manuella modellbygge och förfining.

	GRANATER pipeline	XDS_APP pipeline
Insamling och bearbetning
Röntga källa / helljus linje	ESRF / MASSIF-1
Våglängd (Å)	0,966
Upplösning (Å)	41.88 – 1,48 (1,53-1,48)	41,86-1.32 (1,39 – 1,32)
Totalt/Unique reflektioner	127670 / 28644	177332 / 40134
	(12178 / 2775)	(23772 / 5714)
Utrymmegruppen för indexering, skalning och sammanslagning	C222	C2221
Cell dimensioner
a, b, c (Å)	42,20, 83,75, 95.85	42.19, 83,72, 95,82
Mosaicity	0,05	0,05
Rmeas (%)	10,0 (110,7)	11.1 (198,2)
< I/σ(I) >	9,6 (1.3)	7,6 (0,7)
CC1/2 (%)	99,7 (53,9)	99,7 (19,1)
Fullständighet (%)	99,6 (99,6)	99,5 (98,6)
Multiplicity	4.5 (4.4)	4.4 (4.2)
Molekylär ersättning och preliminär modell förfining
Utrymmegruppen för utfasning	C2	C2221
Cell dimensioner
a, b, c (Å)	83.74, 42.18, 95,82	42.19, 83,72, 95,82
Α, Β, Γ (°)	90, 90.03, 90	90, 90, 90
Sök modell för herr (PDB)	3KLR	3KLR
Proteinmolekyler / ASU	2	1
Protein rester	250	125
Rarbeta/rgratis (%) efter 1: a förfining	24,3 / 26,5	20,4 / 23,8
RMSD bond längd (Å) efter 1: a förfining	0,01	0,01
RMSD bond vinkel (°) efter 1: a förfining	1.2	1,83
Rotamer avvikare (%) efter 1: a förfining	1,07	4.29
Ramachandran gynnade / / inaktiveras (%) efter 1: a förfining	95.93 / 4,07 / 0	95.12 / 4,88 / 0

Tabell 1: röntgendiffraktion data insamling, förfining och validering statistik. Värdena för högsta upplösning skalet anges inom parentes.

Figur 1: prov analys innan datainsamling. (A) regionen valt för skanning visas av en röd ruta. (B) analys av diffraktion bilder visas som en intensitetskarta. Fyra positioner inom ligger kristallen valdes för datainsamling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: visuell validering av elektronen täthet kartor erhålls efter förfiningen. Elektronen täthet kartor Konturskurna vid 2 x nivå r.m.s. runt (en) Trp143, (b), Val66 (Ile i mänskliga GCSH) och (c), Glu98 (Asp i mänskliga GCSH) och kartor Konturskurna på 1 x r.m.s nivå runt (d), Phe149 (Leu i mänskliga GCSH) och (e) Lys125 (Asp i mänskliga GCSH). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Helautomatiska linjer ger automatiserad karakterisering och datainsamling från stort antal makromolekylära kristaller utan närvaro av en vetenskapsman, antingen på beamline eller distans, krävs. Med helt automatiserad linjer har många fördelar jämfört med manuell drift. För exempel, automatiserade provet centrering, baserat på röntgen mesh och line File, är mer precisa än som utförs med det mänskliga ögat som påverkas det inte av termisk eller optiska effekter. Faktiskt, dessa mesh och linje skanningar ger ytterligare data (dvs. detaljerade mått av kristallen och bästa diffracting regionen av kristallen) som är viktiga för att fastställa rätt beam storlek att använda för datainsamling – särskilt för små kristaller ¹⁸— och leder ofta till en förbättrad kvalitet av erhållna diffraktion data. Dessutom, genom att utnyttja de användardefinierade parametrarna vid installation av automatisk experiment, stegen i särskilda arbetsflöden kan skräddarsys för att bäst passa systemet under studien, således ytterligare optimera experiment framgång.

Ta tillsammans, tillförlitligheten i arbetsflödena som är tillgängliga, enkel tillgång till beamline (användare själv tidsplanera, använda en kalender [se ovan]), och den helautomatiska strategin i MASSIF-1 ger en rigorös, hög genomströmning och tidsbesparande alternativ till klassisk praktiska MX experiment och potential att genomföra mer avancerade förfaranden och program till automatiska arbetsflöden. Inom en snar framtid, kommer crystal kartografi i 3D¹⁹ att genomföras för att förbättra noggrannheten i röntgen centrering, medan mer komplexa protokoll, såsom crystal uttorkning experiment²⁰, kommer att vara automatiserad. Förhoppningen är att helt självständigt datainsamling kommer att bli en standardmetod i MX, som tillhandahåller högkvalitativa data för små-molekylen fragment skärmar, optimera screening av stort antal dåligt diffracting kristaller och automatiskt tillhandahålla fas information för att lösa crystal strukturer de novo. I kombination med utvecklingen i den automatiserade skörden av kristaller²¹, möjligheten att protein kristall struktur lösning som en automatiserad tjänst kan väl bli en verklighet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beamline MASSIF-1	ESRF
BL21DE3	New England Biolabs	C2527I
chloramphenicol	Roth	3886.1
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K	Merck Millipore	UFC803024
Dialyzing membrane	Spectrumlabs	132655
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dnase	Roche	11284932001
DTT	Euromedex	EU0006-B
EDTA- free protease inhibitors	Roche	4,693,159,001
glycerol	VWR Chemicals Prolabo	14388.29T
His-trap HP	GE healthcare	17-5247-01
imidazole	Sigma-Aldrich	56750-500G
IPTG	Euromedex	EU0008-B
LB medium	Sigma-Aldrich	L3022
lipoic acid	Sigma-Aldrich	T5625
loop	Hampton Research	HR8-124
lysozyme	Roche	10 837 059 001
MonoQ 5/50 GL	GE healthcare	17-5166-01
NaCl	Fisher Chemical	S/3160/60
Sonicator vibra cell 75/15	SONICS
SPINE pucks	MiTeGen	SKU: M-CSM003-0001A
Tris base	Euromedex	26-128-3094-B
Sodium Formate	Sigma-Aldrich	1064430500
GCSH purification buffer	20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl
GCSH cryo-protection buffer	0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol
Programs:
MxCube		Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010)	local development
ISPyB	ESRF	Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535	local development
MXCube2	ESRF	Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014).	local development
BES workflow server		Brockhauser, S. et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012).
DOZOR	ESRF	Bourenkov and Popov, unpublished	local development
BLISS beamline control		Guijarro, M. et al. BLISS - Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Spain. doi: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018).	local development
AUTO processing of images		Monaco, S. et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013)	local development
BEST and EDNA		Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009).	local development
CCP4		Winn, M.D. et al. Overview of the CCP 4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011).
Phaser MR		McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007).
Coot		Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004).
refmac5		Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. Acta Crystallographica Section D. 53, 240--255 (1997).
Matthews		Matthews, B.W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).