Tamamen Özerk karakterizasyonu ve biyolojik oluştururlar kristalleri üzerinden veri toplama

Summary

Burada, otomatik tarama ve veri toplama seçenekleri kullanılabilir bazı sinkrotron beamlines nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır. Bilim adamları göndermek cryocooled örnekleri sinkrotron için ve kırınım özellikleri ekranlı, veri kümeleri toplanan ve işlenmiş ve, mümkün olan yerlerde, bir yapı çözüm yürütülen — tüm insan müdahalesi olmadan.

Abstract

Yüksek-parlaklık röntgen ışınları otomasyon ile birleştiğinde Yapısal Biyoloji bile en zorlu projelerde sinkrotron tabanlı makromoleküllerin x-ışını kristalografisi (MX) beamlines kullanımına yol açmıştır. Ancak, çoğu İmkanları hala deneyler gerçekleştirmek için bir bilim adamı Çekme Makinası varlığını gerektirir. Otomatik beamlines tam otomatik karakterizasyonu ve veri toplama, adanmış yeni nesil kristalleri biyolojik oluştururlar, son zamanlarda geliştirilmiştir. Bu beamlines ilk kristalizasyon denemeler ve/veya kırınım veri kümeleri, çok sayıda topluluğu sonuçlarını beamline kendilerini kontrol zorunda olmayan kullanıcılar ekran yapısal biyologlar için yeni bir araç temsil eder. Burada nasıl bir deney otomatik tarama ve veri toplama, için göstermek nasıl bir deney beamline yapılır, nasıl elde edilen veri kümesi işlenir ve nasıl, mümkün olduğunda, biyolojik makromolekül kristal yapısı çözülmüş olacak.

Introduction

Spesifik proteinlerin üç boyutlu yapısını belirleme Biyolojide çok önemlidir. İşin üzerinden elde edilen bilgi çok biyolojik işlev ve şekil ve özgüllük molekül altında eğitim içerdiği etkin ve/veya bağlayıcı sitelerin bir ışık tutuyor. Çoğu durumda, bu potansiyel mekanizmaları tespit edilecek veya uygun yerde, için eylem sağlar gelişmiş olması tedavi molekülleri. MX yapısal bilgi elde etmek için en sık kullanılan teknik, ama bir performans sorunu iyi diffracting kristalleri elde etmek için en uygun koşullar belirlenmesi. Bu nedenle, kristalizasyon denemeler çok sayıda farklı koşullarda yapılır ve daha sonra kırınım veri toplamak için kullanılacak en iyi kristalleri bulmak için ekranlı. Kristalizasyon denemeler¹ Kur Otomasyonu açıkça bu konuda yardımcı oldu. Ancak, sonraki adımları (yani, kristal montaj, kırınım tarama ve kırınım veri toplama) genellikle el ile bir sürü zaman, çaba ve kaynakları kadar alarak devam etmektedir. Bu nedenle, otomasyon kırınım tarama ve veri toplama zaman ve verimlilik büyük bir kazanç demektir.

MX kırınım tarama ve veri toplama en sık hangi otomasyon kolaylaştırdı büyük ölçüde bu işlem sinkrotron MX beamlines yapılır. Ancak, çoğu durumda, bu bilim adamı bir deney sırasında beamline bulunması veya uzaktan çalıştırmak için gereklidir. Son zamanlarda, tümüyle otomatik MX beamlines yeni nesil gelişmiş²oldu. Burada, kullanıcıların fiziksel olarak veya uzaktan, deneysel bir oturum sırasında bulunması gerekmez. Bu gece, tarama kristaller ve kırınım verilerin toplanması daha az rutin görevleri, harcama tüm gün yerine ve genellikle daha fazla vakit geçirmek için bilim adamları sağlar. Dünyanın ilk tam otomatik beamline ağır otomatik örnek seçimi entegre tesis (MASSIF-1, ID30A-1)^2,3 Avrupa sinkrotron radyasyon tesisi (ESRF), olduğunu. Beamline'nın gonyometre^4,5olarak da davranır bir robot örnek değiştirici ile tandem örnek içeren bir yüksek kapasiteli dewar çalıştığı bir benzersiz örnek ortamına sahiptir. MASSIF-1'dir sabit bir dalga boyu 0.969 çalışan bir tek foton sayma hibrid piksel dedektörü ile⁶, donanımlı bir undulator beamline Å (12,84 keV) yoğun bir röntgen ışını (2 x 10¹² fotonlar/s) ile. Örnek konumundaki ışın boyutu en az 10 µm (yuvarlak kiriş) en fazla 100 µm x 65 µm (yatay dikey kiriş boyutuna göre) arasında ayarlanabilir. Ortalama olarak, beamline işlemek, tamamen otomatik (aşağıya bakınız), 120 kristalleri 24 h moda. Beamline operasyon iş akışları⁷her biri altında eğitim örnekten en iyi olası veri ölçüm sağlamak için akıllı kararlar iş akışında, önceki adımları sonucunu temel alır, bir dizi dayanmaktadır. Özellikle, tek tek bir örnek kırınım özelliklerinin değerlendirilmesi hesap kristal birim ve akı alır ve sağlar, kristal kristal yalnızca en iyi bölgesi sonraki veri için kullanılır röntgen ışını daha büyük nerede koleksiyon. Böylece, kırınım veri kümeleri için simge durumuna küçültülmüş radyasyon hasarı^2,3ile maksimum çözünürlük getirilmiştir. Zorlu veri koleksiyon, her iki yerel ve tek dalga boyu anormal kırınım (SAD) veri toplama için sözde Helisel (çok pozisyonlu) veri toplama stratejileri gibi aynı zamanda kullanılabilir⁸iletişim kurallarıdır.

Kristallerin istenen beamline donanımları standart için uygun bir manyetik örnek mount montaj omurga⁹istenen deneysel parametreleri girmeden, iğne ve tamamen otomatik deneyler MASSIF-1 dahil cryocooling ' kırınım planı ' masa Protein kristalografi beamlines (ISPyB) için¹⁰, MX deneyler, bir örümcek ağı esaslı bilgi yönetim sistemi entegre sisteminde ve örnekler için beamline gönderme. ESRF tüm örnekleri / beamline dan taşıma maliyetlerinin ESRF kullanıcı Office tarafından desteklenen (Ayrıntılar için ESRF¹¹ Web sitesine bakın). MASSIF-1, döngü boyutu üzerinde hiçbir kısıtlamalar konur veya crystal kalite. İçin verilen bir kristal kırınım planı seçerken, kullanıcı varsayılan ayarları kullanabilir veya her örnek için özelleştirilebilir belirli iş akışları arasından seçim. Birkaç önceden programlanmış iş akışları kullanılabilir. MXPressE³ iş akışında örnek içeren döngünün ilk optik merkezleme kullanarak örnek konumunu hizalanır. Sonra X-x-ray tabanlı merkezleme kristalin en iyi bölge için röntgen ışını ortalanır sağlar. Veri toplama stratejileri sonra eEDNA, özellikle hesap kristal birim ve beamline, gerçek zamanlı akışa dikkate alarak online veri analizi X-ray deneyler alanında için eklenti tabanlı uygulamalar geliştirmek için bir çerçeve kullanılarak hesaplanır. Tam kırınım veri kümesi koleksiyonu, bu daha sonra bir dizi otomatik veri işleme boru hatları¹² kullanılarak işlenir ve sonuçları ISPyB içinde muayene ve indirmek için kullanılabilir yapılır. MXPressE SAD³ iş akışı hedef protein kristalleri selenomethionine içeren hedefleniyor ve Se K kenarına MASSIF-1'in işletim enerjidir aslında patlatır. Burada, MXPressE eEDNA veri toplama stratejisi üzgün veri toplama için optimize edilmiştir (yani, yüksek fazlalık ve Bijvoet çiftleri arasında R_birleştirme % 5 altında olduğu yere ayarla çözünürlük ile). Kırınım özellikleri bir dizi kristalleri sonraki veri toplama olmadan ekran için MXScore³ iş akışı analiz kristalleri tam kalite değerlendirilmesi üretmek için kullanılabilir. MXPressI³ iş akışında 180 ° dönüş veri 0.2 ° salınımlar ve başlangıç phi açı ve bir eEDNA strateji tarafından belirlenen çözünürlük kullanarak toplanır. MXPressO ³ iş akışı içine preobserved bir çözünürlük içerir (varsayılan: d_dk = 2 Å). Bir kristalizasyon deneme kaynaklanan kristalleri ilk bir değerlendirmesini yapmak, MXPressM³ iş akışı sunulmaktadır. Bu yüksek doz kafes gerçekleştirir örnek destek hiçbir veri toplama ile en geniş yönünü üzerinden tarama veya merkezleme. Son zamanlarda, iki yeni deneme iş akışları, MXPressP ve MXPressP_SAD, pseudohelical Veri toplamalarını gerçekleştiren uygulanan⁸olmuştur. Tüm iş akışları tüm adımlarını yürütülmesini çevrimiçi ve gerçek zamanlı olarak takip edilebilir kullanıcı, ISPyB tarafından.

İşte tam otomatik bir MX deney MASSIF-1 karşı hazırlıklı olma ve almak ve deneyden kaynaklanan verileri çözümlemek göstermektedir. Örnek olarak, biz insan mitokondriyal glisin bölünme sistem protein H (GCSH) kullanın. Bu lipoic asit içeren protein glisin bölünme sistem glisin bozulması için sorumlu bir parçasıdır. Bu sistem daha fazla P protein, piridoksal fosfat bağımlı glisin dekarboksilaz, T protein, tetrahydrofolate gerektiren bir enzim ve lipoamide dehidrogenaz L protein içerir. GCSH glisin methylamine grup T protein P protein aktarır. H protein kusurları insanlar¹³' te nonketotik hiperglisinemi (NKH) neden olur.

Protocol

Not: Üretim, arıtma ve GCSH kristalleşme ek dosya 1' de açıklanmıştır.

1. kısa tanımı çevrimdışı hazırlık ve kristal montaj

1. Pozisyon bir naylon döngü ya da başka bir kristal montaj desteği zaten bir veya daha fazla kristalleri altında bir omurga pin sabit ve onları yağış çözüm (0,5 M sodyum formiat pH 4.0 + 25 µL protein çözüm 20 µL) dışarı kaldırın.
   1. Crystal(s) çevresinde toplu sıvı mount herhangi bir aşırı sıvı emmek için bir kağıt fitil ile dokunarak kaldırın.
2. Crystal(s) yağış çözüm artı % 30 gliserol içeren cryoprotective çözümünde emmek; ardından, kristal destek ve crystal(s) kaldırın.
   1. Crystal(s) çevresinde toplu sıvı mount herhangi bir aşırı sıvı emmek için bir kağıt fitil ile dokunarak kaldırın.
3. Mount sıvı azot ile dolu bir omurga şişe içine dalma ve saklayın, beraber benzer şekilde hazırlanan, Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı (EMBL) içinde herhangi bir diğer / ESRF değiştirici puck⁹ sıvı azot sıcaklıkta örnekleme.
   Not: beamtime kullanılabilir duruma gelene kadar crystal(s) bu durumda stabildir.

2. talep beamtime MASSIF-1

1. Beamtime (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Applying) adresindeki ESRF ana üzerinde mümkün olduğu kadar erken isteyin.
   Not: ESRF MX beamlines erişim mümkün modları bir dizi vardır. Laboratuvarlar topluca, bir blok ayırma grup (2 yıl için ayrılan beamtime için çanta), bir parçası olarak uygulayabilirsiniz. Grupları tek tek uygulamak isterseniz, onları akran sonra beamlines hızlı erişim sağlayan erişim, haddeleme için uygulayabilirsiniz. Grubun teklifi gözden geçirilecek ve ek bilgi isteyen ESRF Emanet grup tarafından temizlenir. Önerisi kabul edilirse, bir deney numarası ve şifre bildirilecektir. Özel araştırma beamtime satın alarak yapılabilir.
2. Güvenlik (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/SafetyTraining) eğitim online tamamlayın.
3. MASSIF-1 takvim üzerinde kitap beamtime.
   Not: En fazla 50 örnek sahipleri vardiya çözümlenmesi için rezervasyon mümkündür.
4. Bir posta içinde deneyi (http://www.esrf.eu/UsersAndScience/UserGuide/Preparing/new-a-form), ilan etmek A-biçimli ölçülecek olan örnekleri için gerekli güvenlik bilgileri ile birlikte doldurunuz.

3. ISPyB bir kırınım planı oluşturulması

Not: Kırınım planı ISPyB bir örnek için gereken bütün bilgileri tutan ve her örnek için gerçekleştirilen deneme terzi için ek bilgi içerir.

1. ISPyB (https://exi.esrf.fr/) açın.
2. MX deneylerseçin.
3. Deney numarası ve parola ile oturum.
4. Tıklatın Sevk irsaliyesi üzerinde | Ekle yeni ve gerekli bilgileri sağlayın. Kaydet' i tıklatın.
5. Ekle parsel tıklatın ve istenen bilgileri doldurun. Kaydet' i tıklatın.
6. Ardından Ekle kapsayıcı, puck barkod adı olarak vermek ve omurga diskiseçin. Kaydet' i tıklatın.
7. Konteyner sembolü ve Düzenletıklayın ve tercih edilen iş akışı, puck, vb, kristal bulunduğu protein adı gibi gerekli bilgileri örnekleri ile ilgili doldurun.
8. ESRF güvenlik grubu tarafından onaylanmış protein (örneğin, GCSH veya lizozim) seçin.
9. Tek tek her örnek tanımlayacak benzersiz örnek adını girin. İsteğe bağlı olarak PIN barkod taramak mümkündür. Aşağıdaki bilgileri geri kalanı isteğe bağlıdır.
10. İsteğe bağlı bilgileri girin.
    1. Tek tek her örnek için deneme türü girin (örneğin, MXPressE_SAD, PUANIMI veya MXPressO, vs, varsayılan MXPressE) Exp. türü' nün altında. Bu otomatik iş akışı her kristal işlemek için kullanılan tanımlar. GCSH kristal iğneler olduğunu göz önüne alındığında, MXPressPseçin.
    2. Bir alan grubu (örneğin, P1, C2 veya P2₁2₁2₁), biliniyorsa girin. Varsa, bu veri toplama stratejisi hesaplamalar için ve otomatik veri işleme boru hatları kullanılabilir tarafından kullanılacaktır.
    3. İstediğiniz çözünürlüğü girin (varsayılan: d_dk 2.0 Å =). Bu kristal dedektörü mesafe ilk kafes taramaları, karakterizasyonu ve varsayılan veri toplama için tanımlar.
    4. Bu sınırı diffract değil kristalleri tam veri toplama önlemek için istediğiniz eşik (1.5 Å veya 2.3Å gibi) olarak ayarlayýn. Bu veri depolama alanı ve analiz zaman kazanabilirsiniz.
    5. Gerekli bütünlüğü ayarlayın (varsayılan: 0,99). Gerekli çeşitlilik ayarlayın (varsayılan: 4). örnek destek birden fazla kristal içeriyorsa, kristaller çözümlenmesi için maksimum sayısını ayarlayın. Varsayılan değeri 1 veya 5 MXPressP için bu.
    6. Uygun ışın boyutu seçin (varsayılan: 50 µm). Belirli bir değer seçili değilse, X x-ray merkezleme ve veri toplama stratejisi hesaplamalar 50 µm ışın büyüklüğü ile gerçekleştirilecek.
       Not: tam veri kümeleri herhangi bir sonraki toplama sırasında ışın boyutu otomatik olarak adapte.
    7. Alan grubunda, biliniyorsa, zorla alan grubu sütununa koyun. Kristaller (1 varsayılan değeri ile yüksek düşük duyarlılık için 0.5-2.0) radyasyon duyarlılığını ayarla.
11. İsterseniz, tam veri koleksiyon için tahsil edilecek toplam dönüş açısını ayarlayın (varsayılan: eEDNA tarafından belirlenen toplam dönüş açısı).
12. Değerleri kaydedin. Gönderiler için geri' yi tıklatın. ESRF sevkıyata göndertuşuna basın.
13. Sevkiyat Etiketi yazdırabilir ve örnekleri gönderebilirsiniz. Kullanıcılar bir pikap ESRF hesap bilgilerini kullanarak bir kurye ile düzenlemelisiniz.
    Not: (Bkz: https://www.esrf.eu/MXDewarReimbursement) örnekleri sorunsuz dönüşü izin vermek için INCLUDE iade etiketini seçmek çok önemlidir.

4. veri toplama, görüntüleme ve alma

Not: deneme günü, örnekleri MASSIF-1 yüksek kapasite Dewar (HCD) için transfer edilir. Beamline bilim adamları daha sonra kullanıcıların uzaktan takip edilecek veri toplama başlatmak. Her farklı örnek türü için kullanıcıların veri toplama başlandığını bildiren bir e-posta. Yukarıda belirtildiği, tüm iş akışları tüm adımlarını yürütülmesini çevrimiçi ve gerçek zamanlı olarak takip edilmelidir kullanıcı yolu ile ISPyB, hangi sonuçlar görüntülenebilir ve indirilen tarafından.

1. Analiz her örnek için ISPyB (https://exi.esrf.fr/) otomatik denemenin sonuçları inceleyin.
   1. Giriş, parola ve deney numarası kullanarak ve istediğiniz deneysel oturumu ID30A -1 tıklayın.
   2. Tercih edilen (üst puanlı) işlenirken boru hattı (örneğin, el bombası veya XDS_APP) seçin ve doğru alan grubunda en yüksek bütünlüğü ve en yüksek çözünürlük ile En son toplamak sonuçlar ' ı tıklatarak yazılan veri indirme ve, o zaman, indir.
      Not: Tüm mesh, çizgi ve karakterizasyonu için her örnek, /MXPressE_01 adlı bir alt dizin içinde görüntülerdir. ESRF beş ayrı işleme paketi, yani EDNA_proc¹², el bombası¹², XDS_APP¹⁴, autoPROC¹⁵ve XIA2¹⁶otomatik olarak çalışır. Veri tümleştirmesi XDS aramalar üzerinde dayanır XIA2 dışında dayanır. Tüm paketleri de varsa protokolleri phasing SAD kullanılmak üzere veri, anormal bir sinyal, otomatik olarak algılanmasını sağlayan anormal ve nonanomalous modlarında çalışır. Her paket farklı parametreleri ve karar ağaçları, bazı paketleri belirli örnekleri ile daha iyi çalışmasına anlam kullanır. Ancak, bu kaç para olduğu ve olası alan grupları sorumluydu zaman çok sayıda sonuçları için yapmak. Bu nedenle, sonuçları kabaca çözünürlük ve en düşük çözünürlük kabuk, CC(1/2) ve bütünlüğü R_birleştirme gibi diğer kalite ölçümleri göre sıralanır. Bu kullanıcının en iyi veri kümeleri için yol gösterici hedefleniyor, ama tüm olası alan grupları ve sonuçları dikkatle kontrol edilmelidir.
2. Tüm günlük dosyalarını ve birleştirilmemiş XDS_ASCII yer alacak indirilen klasörü açmak. HKL ve birleştirilmiş ve ölçekli .mtz dosyaları.
   Not: faiz veya yakın bir homolog protein yapısını (PDB formatında) ISPyB deneme başlatmak için tarih oldu diye, işlenirken boru hattında ESRF otomatik olarak çalıştır'ı kullanma bu yapı olarak moleküler yerine (MR)-ecek yapmak En iyi çözüm puanlama modelinde arayın. Bay boru hattı sonuçlarını ISPyB içinde görüntülenir ve işlenmiş veri klasörü (örneğin, /data/visitor/mx2112/id30a1/20180711/PROCESSED_DATA/GCSH/GCSH-x5/autoprocessing_GCSH-x5_run1_1/grenades_fastproc/user_nohet.pdb_ bulunabilir. mrpipe_dir /). Burada, son modelinde coot1.pdb ve yansıma veri sidechains.mtz olarak adlandırılır. Boru hattı bir çözüm bulma olasılığını artırmak için hücre (ilkel hücre azaltma) simetri azaltmak unutmayın. Burada durumda, Bay boru hattı çözüm monoclinic hücre (C2) yerine bir Ortorombik hücre (C222₁) yazdı. Moleküler yerine gerçekleştirmek hakkında ayrıntılı bilgi el ile çalıştırmak (için ikinci en iyi skor işlenirken çözüm örneği) Ek dosyalarıdahil.

Representative Results

MXPressP iş akışı ESRF beamline MASSIF-1 tam otomatik olarak, mount, röntgen ışını ortalamak, karakterize ve tam kırınım veri kümeleri bir dizi insan GCSH kristalleri toplamak için kullanıldı. Örnekleri monte edildi ve döngü (şekil 1, sol) inceden inceye gözden geçirmek için bir alan için analiz edilebilir. Kırınım Analizi sonra dört puan veri toplama (şekil 1, sağ) için kristal içinde seçildi. Sonraki otomatik veri analiz boru hatları, Bay çözümünü bulunduğu için yüksek kaliteli veri kümeleri (Tablo 1) vermiştir Bay boru hattı da dahil olmak üzere işleme. İkinci elde edilen veri kümesi ve kullanılan arama modeli tarafından Moleküler değiştirme phasing için uygun olup olmadığını hızlı bir şekilde değerlendirmek kullanıcılar sağlar. Buna ek olarak, ligandlar varlığı, böylece kullanıcı sadece en umut verici veri kümeleri daha ayrıntılı bir çözümleme için odaklanmak için izin karar olabilir. Sonra tek bir iyileştirme döngüsü (şekil 2a) otomatik manuel yapı belirlenmesi MR tarafından bir yüksek kaliteli elektron yoğunluğu harita vermiştir. Bu veri kümesi için çözünürlük Å 1,32, verileri otomatik boru hattı kesilmiş; Ancak, kullanıcılar hala farklı kalite yüksek çözünürlük kabuk (CC_1/2, < I/σ(I) >, R_ölçü) istatistiklere ulaşmak için daha düşük çözünürlükte veri kesmeye karar verebilirler. İnsan GCSH yapısı kristal yapısını sığır protein (3KlR)¹⁶benzemektedir.

Sürekli elektron yoğunluğu N-terminal histidin etiketi dışında tüm amino asit zinciri için görünürdür. İnsan ve sığır GCSH ayırt dört oyuncu değişikliği, üç elektron yoğunluğu (Ile/Val66, Asp/Glu98 ve Leu/Phe149; kolayca tanınır Şekil 2b -d). Bu daha az için elektron yoğunluğu yan zincirinin sadece kısmen esneklik nedeniyle (1e rakam) çözümlenir Asp/Lys125 değişimi için açıktır. Şu anda elde edilen modeli R_iş ve %20,4 ve % 23,8, R_ücretsiz değerleri sırasıyla vardır ve daha fazla otomatik ve manuel model kurma ve daha fazla döngüsü tarafından optimize edilebilir.

	El bombası boru hattı	XDS_APP boru hattı
Veri toplama ve işleme
Kaynak x-ışını / satır kiriş	ESRF / MASSIF-1
Dalga boyu (Å)	0.966
Çözünürlük (Å)	41.88-1,48 (1,53-1,48)	41.86-1,32 (1.39-1,32)
Toplam benzersiz yansımalar	127670 / 28644	177332 / 40134
	(12178 / 2775)	(23772 / 5714)
Dizin oluşturma, ölçekleme ve birleştirme alanı Grup	C222	C2221
Cep boyutları
a, b, c (Å)	42,20, 83.75, 95.85	42.19, 83,72, 95,82
Mosaicity	0,05	0,05
Rbeni (%)	10.0 (110.7)	11.1 (198.2)
< I/σ(I) >	9,6 (1,3)	7,6 (0,7)
CC1/2 (%)	99,7 (53.9)	99,7 (19,1)
Bütünlüğü (%)	99.6 (99.6)	99,5 (98.6)
Çeşitlilik	4.5 (4,4)	4.4 (4,2)
Ön modeli arıtma ve moleküler değiştirme
Phasing için alan grubu	C2	C2221
Cep boyutları
a, b, c (Å)	83.74, 42,18, 95,82	42.19, 83,72, 95,82
α, β, γ (°)	90, 90.03, 90	90, 90, 90
Arama modeli için Bay (PDB)	3KLR	3KLR
Protein molekülleri / ASU	2	1
Protein artıkları	250	125
Riş/Rücretsiz (%) sonra 1 arıtma	24,3 / 26,5	20,4 / 23,8
1 arıtma sonrasında RMSD bağ uzunluğu (Å)	0,01	0,01
1 arıtma sonra RMSD bond açısı (°)	1.2	1.83
Rotamer aykırı (%) sonra 1 arıtma	1,07	4,29
Ramachandran sevdigi/izin/izin verilmeyen (%) sonra 1 arıtma	95.93 / 4.07 / 0	95.12 / 4.88 / 0

Tablo 1: x-ışını kırınım veri toplama, arıtma ve doğrulama istatistik. En yüksek çözünürlük kabuk için değerleri parantez içinde verilmiştir.

Şekil 1: örnek analiz veri toplama önce. (A) tarama kırmızı bir kutuyla gösterilir için seçilen bölge. (B) analiz kırınım görüntülerin bir ısı haritası gösterilir. Dört pozisyon bulunduğu kristal içinde veri toplama için seçildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: elektron yoğunluğu haritaların görsel doğrulama elde arıtma sonra. 1 x r.m.s seviyesi (insan GCSH Leu) (d) Phe149 civarında ve (e), 2 x r.m.s. seviyesi (insan GCSH Ile) (bir) Trp143, (b) Val66 civarında ve (c) Glu98 (insan GCSH nda Asp) ve haritalar konturlu elektron yoğunluğu haritalar konturlu Lys125 (insan GCSH nda Asp). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Tam otomatik beamlines otomatik karakterizasyonu ve veri toplama makromoleküllerin kristalleri varlığı olmadan çok sayıda gelen bir bilim adamı, beamline veya uzaktan, gerekli sağlar. Tümüyle otomatik beamlines kullanarak el ile çalışması için karşılaştırıldığında pek çok avantajı vardır. İçin örnek, merkezleme, otomatik örnek x-ışını mesh temel ve satır tarar, daha kesin insan gözü ile gerçekleştirilen daha termal veya optik etkileri tarafından etkilenmez. Nitekim, bu mesh ve satır taramalar veri toplamak için kullanılacak doğru ışın boyutu belirlemede önemli olan ek veri (yani, kristal ve kristalin bölge diffracting en iyi detaylı boyutları) sağlamak — özellikle küçük kristalleri için ¹⁸— ve genellikle elde edilen kırınım veri kalitesinin bir neden. Ayrıca, kullanıcı tanımlı parametreleri otomatik deneyler kurulumunda yararlanarak, belirli iş akışları adımda en uygun sistem altında eğitim, böylece daha fazla deney başarı oranı en iyi duruma getirme için uygun olabilir.

Birlikte, iş akışları kullanılabilir, beamline (bir takvim [yukarı bakın] kullanan kullanıcılar otomatik olarak zamanlama,) ve MASSIF-1'in tam otomatik yaklaşım kolay erişim sağlar titiz, güvenilirliği yüksek üretilen iş ve zaman kazandıran alarak Klasik uygulamalı MX deneyler ve daha gelişmiş işlemleri ve uygulamaları otomatik iş akışları içine uygulamak için potansiyel alternatif. Yakın gelecekte, kristal haritacılık 3D¹⁹ kristal dehidratasyon deneyler²⁰gibi daha karmaşık protokoller otomatik yapılır iken X-ray, merkezleme doğruluğunu geliştirmek için uygulanacaktır. Bu tamamen özerk veri toplama kötü kristalleri diffracting ve otomatik olarak faz sağlayan çok sayıda tarama en iyi duruma getirme MX, küçük molekül parça ekranlar için yüksek kaliteli veri sağlayan standart bir yöntem olacağını ümit ediliyor Kristal yapıları de novo çözmek için bilgi. Kristalleri²¹otomatik hasat içinde gelişmeler ile birlikte, protein kristal yapısı çözüm imkanı otomatik bir servis olarak iyi bir gerçeklik haline gelebilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beamline MASSIF-1	ESRF
BL21DE3	New England Biolabs	C2527I
chloramphenicol	Roth	3886.1
Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K	Merck Millipore	UFC803024
Dialyzing membrane	Spectrumlabs	132655
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Dnase	Roche	11284932001
DTT	Euromedex	EU0006-B
EDTA- free protease inhibitors	Roche	4,693,159,001
glycerol	VWR Chemicals Prolabo	14388.29T
His-trap HP	GE healthcare	17-5247-01
imidazole	Sigma-Aldrich	56750-500G
IPTG	Euromedex	EU0008-B
LB medium	Sigma-Aldrich	L3022
lipoic acid	Sigma-Aldrich	T5625
loop	Hampton Research	HR8-124
lysozyme	Roche	10 837 059 001
MonoQ 5/50 GL	GE healthcare	17-5166-01
NaCl	Fisher Chemical	S/3160/60
Sonicator vibra cell 75/15	SONICS
SPINE pucks	MiTeGen	SKU: M-CSM003-0001A
Tris base	Euromedex	26-128-3094-B
Sodium Formate	Sigma-Aldrich	1064430500
GCSH purification buffer	20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl
GCSH cryo-protection buffer	0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol
Programs:
MxCube		Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010)	local development
ISPyB	ESRF	Solange Delagenière, Patrice Brenchereau, Ludovic Launer, Alun W. Ashton, Ricardo Leal, Stéphanie Veyrier, José Gabadinho, Elspeth J. Gordon, Samuel D. Jones, Karl Erik Levik, Seán M. McSweeney, Stéphanie Monaco, Max Nanao, Darren Spruce, Olof Svensson, Martin A. Walsh, Gordon A. Leonard; ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography, Bioinformatics, Volume 27, Issue 22, 15 November 2011, Pages 3186-3192, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btr535	local development
MXCube2	ESRF	Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010). De Santis, D., Leonard, G. Notiziario Neutroni e Luce di Sincrotrone,Consiglio Nazionale delle Ricerche. (19), 24-226 (2014).	local development
BES workflow server		Brockhauser, S. et al. The use of workflows in the design and implementation of complex experiments in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (8), 975-984, doi: 10.1107/S090744491201863X (2012).
DOZOR	ESRF	Bourenkov and Popov, unpublished	local development
BLISS beamline control		Guijarro, M. et al. BLISS - Experiments Control for ESRF EBS Beamlines. Proceedings of the 16th Int. Conf. on Accelerator and Large Experimental Control Systems, ICALEPCS2017, Barcelona, Spain. doi: 10.18429/jacow-icalepcs2017-webpl05 (2018).	local development
AUTO processing of images		Monaco, S. et al. Automatic processing of macromolecular crystallography X-ray diffraction data at the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 46 (3), 804-810, doi: 10.1107/S0021889813006195 (2013)	local development
BEST and EDNA		Incardona, M.-F., Bourenkov, G.P., Levik, K., Pieritz, R.A., Popov, A.N., Svensson, O. EDNA : a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (6), 872-879, doi: 10.1107/S0909049509036681 (2009).	local development
CCP4		Winn, M.D. et al. Overview of the CCP 4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 235-242, doi: 10.1107/S0907444910045749 (2011).
Phaser MR		McCoy, A.J., Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C., Read, R.J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40 (4), 658-674, doi: 10.1107/S0021889807021206 (2007).
Coot		Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2126-32 (2004).
refmac5		Murshudov, G.N., Vagin, A.A., Dodson, E.J. Refinement of Macromolecular Structures by the Maximum-Likelihood Method. Acta Crystallographica Section D. 53, 240--255 (1997).
Matthews		Matthews, B.W. Solvent content of protein crystals. Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).