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Immunology and Infection

चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी कोशिकाओं के लिए एक वास्तविक समय शक्ति परख ठोस और हेमेटोलॉजिकल कैंसर कोशिकाओं को लक्षित

Published: November 12, 2019 doi: 10.3791/59033
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 1,3, 1, 1, 1, 2
1ACEA Biosciences, Inc, 2ProMab Biotechnologies. Inc, 3ACEA Therapeutics

Summary

हम तरल और ठोस ट्यूमर कोशिकाओं को लक्षित करने वाले चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर टी कोशिकाओं की शक्ति का मूल्यांकन करने के लिए विट्रो साइटोलिसिस परख प्रणाली में एक मात्रात्मक वास्तविक समय का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल को अन्य प्रतिरक्षा प्रभावक कोशिकाओं के साथ-साथ संयोजन उपचार का आकलन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।

Abstract

कैंसर के लिए चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) टी-सेल थेरेपी ने प्रतिरोधी और रिफ्रैक्टरी हेमेटोलॉजिकल घातक घातक घातक के लिए महत्वपूर्ण नैदानिक लाभ हासिल किया है जैसे बचपन तीव्र लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया। वर्तमान में अन्य हेमेटोलॉजिकल कैंसर के अलावा ठोस ट्यूमर के लिए इस होनहार चिकित्सा का विस्तार करने के प्रयास चल रहे हैं । यहां, हम ठोस और तरल ट्यूमर कोशिकाओं पर अद्वितीय या तरजीही अभिव्यक्ति के साथ एंटीजन को लक्षित शक्तिशाली कार टी कोशिकाओं के विकास और उत्पादन का वर्णन करते हैं। इन कार टी कोशिकाओं की इन विट्रो शक्ति का मूल्यांकन वास्तविक समय में अत्यधिक संवेदनशील बाधा आधारित xCELLigence परख का उपयोग करके किया जाता है। विशेष रूप से, कार टी कोशिकाओं की इन विट्रो शक्ति पर ग्लूकोकॉर्टिकोइड-प्रेरित ट्यूमर परिगलन कारक रिसेप्टर (टीएनएफआर) से संबंधित प्रोटीन (जीआईटीआर) जैसे विभिन्न कोस्टिमुलरी सिग्नलिंग डोमेन के प्रभाव की जांच की जाती है। इस रिपोर्ट में प्रोटोकॉल शामिल हैं: लेंटिवायरल जीन ट्रांसड्यूक्शन का उपयोग करके प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के लिए कार टी कोशिकाओं का सृजन करना, कार टी कोशिकाओं का विस्तार करना, कार अभिव्यक्ति को मान्य करना, और xCELLigence शक्ति परख ों को चलाना और विश्लेषण करना।

Introduction

हाल के वर्षों में, कार टी-सेल थेरेपी रिलेप्स्ड और रिफ्रैक्टरी हेमेटोपोइटिक द्रोह के लिए कैंसर इम्यूनोथेरेपी में सबसे प्रमुख सफलताओं में से एक रही है। हाल ही में अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) के अनुमोदन के साथ CD19 के अनुमोदन-तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया के लिए कार टी कोशिकाओं का निर्देश दिया, गैर हॉगकिन लिंफोमा, और बड़े बी-सेल लिंफोमा को फैलाना, और बी-सेल परिपक्वता एंटीजन (BCMA) के लिए सफलता चिकित्सा का पदनाम- कई मायलोमा के लिए कार टी कोशिकाओं का निर्देश दिया गया है, इस तकनीक ने वैज्ञानिक समुदाय में बहुत उत्साह पैदा किया है और दुनिया भर मेंकईबुनियादी, लागू और नैदानिक अध्ययनों को शह दी है1,2,3, 4,5. 2019 के जनवरी में, नैदानिक परीक्षण डेटाबेस (clinicaltrials.gov) में 700 से अधिक नैदानिक परीक्षण पंजीकृत किए गए थे; इन परीक्षणों के बारे में ४५० या तो शुरू करने के बारे में थे या सक्रिय रूप से रोगियों की भर्ती कर रहे थे । अधिकांश नैदानिक परीक्षण हेमेटोलॉजिकल घातक क्षमताओं पर केंद्रित हैं, और सीडी 19 के अलावा सीडी 20, सीडी22 और बीसीएमए को लक्षित करने वाली कार टी कोशिकाओं का उपयोग करने वाले नैदानिक परीक्षण6,7भी चल रहे हैं। जबकि परीक्षणों के अधिकांश ऑटोलोगस कार टी सेल थेरेपी का उपयोग कर रहे हैं, उनमें से एक महत्वपूर्ण संख्या भी एलोजेनिक कार टी कोशिकाओं8,9,10की उपयोगिता की खोज कर रहे हैं । हेमेटोलॉजिकल घातक के साथ आशाजनक परिणामों के बावजूद, ठोस ट्यूमर को लक्षित करने के लिए कार टी कोशिकाओं का उपयोग कई कारणों से क्लिनिक में बहुत अधिक कठिन साबित हुआ है, जिसमें ट्यूमर में विशेष रूप से व्यक्त किए गए अच्छे लक्ष्यों की कमी तक सीमित नहीं है, ठोस ट्यूमर और ट्यूमर "एस्केप" की विषमता, और कठिनाई है कि कार टी कोशिकाओं ट्यूमर माइक्रोएनवायरन 11,12,14, 14, 15.ठोस ट्यूमर विशिष्ट कार टी कोशिकाओं के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण जरूरत है जो प्रभावकारिता के लिए इन बाधाओं को दूर कर सकते है और "लक्ष्य पर ट्यूमर" विषाक्तता की समस्या । जबकि इन विट्रो और वीवो दृष्टिकोणों की एक भीड़ कार टी कोशिकाओं के डिजाइन और परीक्षण में आवश्यक है, एक मजबूत और भविष्य कहनेवाला इन विट्रो शक्ति परख प्राथमिक महत्व16,17का है।

कार टी कोशिकाओं की शक्ति का आकलन करने के लिए, विभिन्न इन विट्रो विधियों को विकसित किया गया है। सामान्य तौर पर, इन शक्ति परखों को दो व्यापक श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है जो इस बात पर निर्भर करता है कि क्या वे(i)सीधे लक्ष्य ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ कार टी कोशिकाओं की साइटोलिटिक गतिविधि को मापते हैं, या(ii)सरोगेट मार्कर जैसे साइटोकिन्स को मापते हैं जो कार टी कोशिकाओं द्वारा जारी किए जाते हैं क्योंकि वे लक्ष्य कोशिकाओं को मारते हैं। साइटोलिटिक गतिविधि को मापने वाली तकनीकों में क्रोमियम-51 रिलीज परख (सीआरए)18,इमेजिंग-आधारित परख शामिल हैं जो फ्लोरोसेंट जांच19,20का उपयोग करके लक्षित कोशिकाओं के एपोप्टोसिस को मापते हैं, और साइटोमेट्री परख ों का उपयोग करते हैं जो अपोप्टोटिक लक्ष्य कोशिकाओं का पता लगाते हैं21। इन परखों में, कार टी कोशिकाओं को आम तौर पर लक्ष्य कोशिकाओं के साथ सह-संस्कारी किया जाता है जिन्हें रेडियोधर्मी या फ्लोरोसेंट जांच के साथ पूर्व-लेबल किया गया है, जिसके बाद उचित माप होता है। हालांकि यह लंबे समय से अपनी संवेदनशीलता के कारण क्षेत्र में सोने के मानक माना जाता रहा है, सीआरए कुछ कमियां है । सबसे पहले, यह एक एंडपॉइंट परख है और गतिज जानकारी प्रदान नहीं करता है। दूसरा, लक्ष्य कोशिकाओं को क्रोमियम-51 के साथ लेबल करने की आवश्यकता होती है जो कोशिकाओं से बाहर निकलजाती है और पृष्ठभूमि शोर22को काफी बढ़ा सकती है। अंत में, इसके लिए रेडियोधर्मी कचरे की उचित सावधानियां और निपटान की आवश्यकता होती है । वैकल्पिक परख, जो शक्ति के संकेत के रूप में लक्ष्य कोशिकाओं के साथ कार टी-सेल इंटरैक्शन के उपउत्पादों को मापते हैं, में कार टी कोशिकाओं द्वारा जारी विभिन्न साइटोकिन्स की मात्रा शामिल है, जो या तो प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित तरीकों या एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरतुला परख का उपयोग करते हैं। एक बार फिर, ये एंडपॉइंट परख हैं जो एक निश्चित समय बिंदु पर साइटोकिन्स की संचयी रिहाई को मापते हैं और इस प्रकार, जरूरी नहीं कि कार टी कोशिकाओं की वास्तविक साइटोलिटिक गतिविधि को प्रतिबिंबित करें।

जब एक शक्ति परख विकसित, विशेष रूप से एक है कि एक सेल के लिए रिलीज मापदंड को परिभाषित करता है इस तरह के एक कार टी सेल के रूप में चिकित्सा आधारित है, यह महत्वपूर्ण है कि परख ंयूनतम जोड़तोड़ और हाथ पर समय शामिल है क्योंकि हर बातचीत एक और चर है कि के लिए जिंमेदार है और समग्र मजबूती और परख की निरंतरता कम कर सकते हैं । इसके अलावा, ट्यूमर कोशिकाओं के साथ कार टी कोशिकाओं की बातचीत एक गतिशील प्रक्रिया है, और इन गतिशील बातचीत के बारे में जानकारी प्रदान करना, जैसे साइटोलिसिस की दर, शक्ति मूल्यांकन के लिए प्राथमिक महत्व का है। इन मानदंडों को ध्यान में रखते हुए, हमने कार टी कोशिकाओं के लिए एक लेबल-मुक्त गतिज शक्ति परख विकसित किया जो xCELLigence वास्तविक समय सेल विश्लेषण (RTCA) मंच का उपयोग करता है। xCELLigence विशेष माइक्रोटिटर प्लेटों (ई-प्लेट्स) का उपयोग करता है जिसमें प्रत्येक कुएं के नीचे में एम्बेडेड सोने के बायोसेंसर होते हैं। या तो अनुयायी ठोस ट्यूमर कोशिकाओं, या तरल कैंसर कोशिकाओं है कि विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर सीमित किया गया है के साथ काम कर रहे, इन बायोसेंसर वास्तविक समय कार टी सेल में निगरानी लक्ष्य सेल संख्या, सेल आकार, सेल सब्सट्रेट लगाव शक्ति में परिवर्तन प्रेरित, और सेल सेल बातचीत (यानी बाधा समारोह)17,23,24,25,26,27,28। कार्यप्रवाह सरल है और इसमें लक्ष्य कोशिकाओं को ई-प्लेटों के कुओं में बोना शामिल है, जिसके बाद कार टी कोशिकाओं को विभिन्न प्रभावक-से-लक्ष्य अनुपात(चित्रा 1)पर जोड़ना शामिल है। बाद में, चूंकि बायोसेंसर लगातार लक्ष्य कोशिकाओं की व्यवहार्यता की निगरानी करते हैं, डेटा स्वचालित रूप से वास्तविक समय में प्रदर्शित होता है।

पिछले 15 वर्षों में xCELLigence परख प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं, टी कोशिकाओं, कार टी कोशिकाओं, चेकपॉइंट अवरोधकों, द्विविशिष्ट एंटीबॉडी, कैंसररोधी वायरस, और कुछ संयोजन चिकित्सा17,29,30,31,32,33,34की शक्ति का आकलन करने के लिए मान्य किया गया है। हाल ही में, xCELLigence शक्ति परख का मूल्यांकन टी-सेल रिसेप्टर (टीसीआर) -इंजीनियर टी-सेल35के निर्माण के लिए किया गया था। यहां हम नैदानिक उपचारों में ठोस ट्यूमर और तरल ट्यूमर को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन की गई कार टी कोशिकाओं की इन विट्रो शक्ति का मूल्यांकन करने के लिए आरटीसीए प्रणाली को नियोजित करने की रिपोर्ट करते हैं।

Protocol

1. कार-एन्कोडिंग लेंटिवायरस की पीढ़ी

नोट: एक बार विशिष्ट कार टी-सेल प्लाज्मिड निर्माण पूरा हो जाने के बाद (सीडी47 और अन्य), लेंटिवायरल सीएआर मानक प्रक्रिया द्वारा उत्पन्न होते हैं, 293 एफटी कोशिकाओं, एक लेंटिवायरल पैकेजिंग मिश्रण, और ट्रांसफेक्शन एजेंटों (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके29वर्णित हैं। इसके बाद, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार लेंटिवायरल आरएनए राशि को मापकर वायरस टिटर निर्धारित करने के लिए मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-पीसीआर) किट और एक थर्मल साइकिलर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करें। यह महत्वपूर्ण है कि सभी लेंटिवायरल प्रक्रियाओं को सुरक्षा आवश्यकताओं का कड़ाई से पालन किया जाए ।

  1. बीज 15 x 106 HEK293FT कोशिकाओं में Dulbecco संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) और एक आर्द्र 5% सीओ2 इनक्यूबेटर के अंदर एक १५० मिमी पकवान में ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर कोशिकाओं को इनक्यूबेट ।
  2. ट्रांसफेक्शन कॉम्प्लेक्स के साथ दो 15 एमएएल ट्यूब तैयार करें। पहली ट्यूब में ट्रांसफेक्शन कमजोर पड़ने वाले समाधान के 2.5 मिलीग्राम में लेंटिवायरल वेक्टर प्लाज्मिड डीएनए (5 μg) और लेंटिवायरल पैकेजिंग मिक्स (22.5 μg) शामिल हैं। दूसरी ट्यूब में ट्रांसफेक्शन कमजोर पड़ने वाले समाधान के 2.5 mL में ट्रांसफेक्शन रिएजेंट का 82.5 माइक्रोन होता है (सामग्री की तालिकादेखें)।
  3. ट्यूब 1 की सामग्री को ट्यूब 2 में पिलेट करें, और मिश्रण को 15 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  4. ट्यूब ड्रॉपवाइज की सामग्री को HEK293FT कोशिकाओं की डिश में स्थानांतरित करें और एक आर्द्र 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नमूना इनक्यूबेट करें।
  5. अगले दिन, मौजूदा माध्यम को ताजा डीएमईएम संस्कृति माध्यम के 19 मिलील के साथ बदलें और 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्र 5% सीओ2 इनक्यूबेटर के अंदर रात भर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करना जारी रखें।
  6. डिश से मीडियम को 50 मिलीआर सेंट्रलाइज ट्यूब में ट्रांसफर करें। ट्यूब को वायरस युक्त माध्यम के साथ फ्रिज में रखें।
  7. उपरोक्त प्रक्रिया दोहराएं, ताजा डीएमईएम जोड़ें और 1 दिन के बाद इसे फिर से एकत्र करें।
  8. मीडिया के दो संग्रहों को एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए 2,000 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रलाइज करें।
  9. लेंटिवायरस युक्त अधिकांश को अल्ट्राक्लियर सेंट्रलाइज ट्यूब पर स्थानांतरित करें। एक न्यूनतम मात्रा छोड़ दें, के बारे में 1 mL, अतिशयोक्ति के लिए गोली जो कोशिकाओं और/
  10. अल्ट्रासेंट्रिकफ्यूज ने 4 डिग्री सेल्सियस पर 100 00 00 0 0 0 0 0 ग्राम के लिए 110,000 x ग्राम पर स्पष्ट किया।
  11. अधिनायक को ध्यान से निकालें और धीरे-धीरे ट्यूब बॉटम में वायरस पैलेट में डीएमईएम माध्यम के 100 माइक्रोन जोड़ें। ट्यूब को बर्फ पर 15 min के लिए छोड़ दें। समाधान को धीरे-धीरे मिलाएं और लेंटिवायरस समाधान को प्रीचिलेड बाँझ ट्यूबों में बहा दें। इन वायरस स्टॉक ट्यूबों को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
  12. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार लेंटिवायरस के टिटर को निर्धारित करने के लिए मात्रात्मक आरटी-पीसीआर किट का उपयोग करें, जो लेंटिवायरल आरएनए को निकालता है और उपाय करता है।

2. कार टी कोशिकाओं का उत्पादन और विस्तार

  1. सीडी 3/सीडी28-लेपित माइक्रोमोतियों की समान संख्या के साथ कार टी-सेल माध्यम के 1 मिलील में पहले जमे हुए मानव PBMCs (लगभग 1 x 106 से 2 x 106 कोशिकाओं) को सक्रिय करें (सामग्री की तालिकादेखें) और 24 एच के लिए आर्द्र5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  2. बर्फ पर लेंटिवायरस स्टॉक का एक एलिकोट गल।
  3. ट्रांसड्यूक्शन के 1 μL जोड़ें कोशिकाओं और मिश्रण के साथ अच्छी तरह से एजेंट में वृद्धि।
  4. 5:1 के संक्रमण (MOI) की बहुलता पर कोशिकाओं में लेंटिवायरस जोड़ें और धीरे-धीरे मिलाएं। अगले दिन, इस कदम को दोहराएं (पहले ट्रांसड्यूक्शन के बाद 24 घंटे)।
  5. हर 2-3 दिनों में टी सेल ग्रोथ की निगरानी करें। 1 x 106 से 2 x 106 कोशिकाओं/mL के घनत्व पर कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए और अधिक ताजा कार टी सेल माध्यम जोड़ें ।
  6. ठंड समाधान का उपयोग करके एक मानक प्रोटोकॉल के साथ कार टी कोशिकाओं को फ्रीज करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
  7. गल कार टी कोशिकाओं को एक मानक विधि का उपयोग कर और उन्हें परख के लिए लागू करने से पहले आईएल-2 (३०० इकाइयों/mL) के साथ के बारे में ~2-4 घंटे के लिए कार टी सेल माध्यम में preculture ।

3. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा कार अभिव्यक्ति का पता लगाना

  1. 3 x 105 कार टी कोशिकाओं और गैर transduced टी कोशिकाओं को दो अलग 1.5 mL माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों के लिए स्थानांतरित करें।
  2. 2 मिन के लिए 300 x ग्राम पर ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें और 200 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें- सक्रिय सेल छंटाई (FACS) बफर जिसमें 1% मानव सीरम होता है।
  3. दो 5 mL पॉलीस्टीरिन FACS ट्यूबों में सेल समाधान के 100 μL और 5 मिन के लिए बर्फ पर ट्यूबों रखने के लिए।
  4. प्रत्येक कोशिका प्रकार की एक ट्यूब में बायोटिनेटेड बकरी एंटी-माउस एफ (एबी')2 के 1 माइक्रोन जोड़ें। फिर, प्रत्येक सेल प्रकार की दूसरी ट्यूब में पीई-लेबल एंटी टैग एंटीबॉडी (सामग्री की तालिकादेखें) के 2 माइक्रोन जोड़ें। अच्छी तरह से मिलाएं और उन्हें 30 मिन के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
  5. प्रत्येक ट्यूब में FACS बफर के 3 mL के साथ कोशिकाओं को धोने और 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र; अधिनेतऔर भंवर को बहुत संक्षेप में त्यागदें या अवशिष्ट तरल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए ट्यूबों को संक्षेप में हिलाएं।
  6. प्रत्येक ट्यूब पर एपीसी एंटी-सीडी 3 और 7-एएडी एंटीबॉडी समाधान (सामग्री की तालिकादेखें) के 2 माइक्रोन जोड़ें। एंटी-एफ (एबी)2 एबी के साथ दाग कोशिकाओं की ट्यूब में, पीई लेबल स्ट्रेप्टाविडिन के 1 μL जोड़ें। संक्षेप में मिलाएं और 30 और मिन के लिए बर्फ पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
  7. कोशिकाओं को फिर से धोने के लिए FACS बफर का उपयोग करें जैसा कि चरण 3.5 में वर्णित है और प्रत्येक ट्यूब में एफएसीएस बफर का अतिरिक्त 200 माइक्रोन जोड़ें।
  8. एक आगे तितर बितर बनाम पक्ष तितर बितर साजिश में टी कोशिकाओं पर पहले गेटिंग द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करें और फिर एक सीडी 3 बनाम 7-AAD साजिश में लाइव कोशिकाओं (7-AAD-नकारात्मक) पर गेटिंग । अंतिम चरण एंटी-टैग, एंटी-एससीएफवी या एंटी-एफ (एबी))2 बनाम सीडी 3 का विश्लेषण करना है।

4. रियल टाइम साइटोलिसिस शक्ति परख

नोट: निर्माता की अनुशंसित शर्तों के अनुसार आरटीसीए परख करें। संक्षेप में, पहली थाली ई प्लेट के कुओं में लक्ष्य कोशिकाओं, अगले दिन कार टी कोशिकाओं के अलावा के बाद । लक्ष्य कोशिकाओं के खिलाफ कार टी कोशिकाओं की साइटोलिसिस गतिविधि वास्तविक समय में निगरानी की जाती है। टी कोशिकाओं और नकली ट्रांसड्यूड टी कोशिकाओं (मॉक कार टी कोशिकाओं) नकारात्मक प्रभावक सेल नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल अनुयायी ट्यूमर सेल लाइनों के लिए एक इन विट्रो वास्तविक समय साइटोलिसिस शक्ति परख का वर्णन करता है।

  1. xCELLigence ई-प्लेट के प्रत्येक कुएं में लक्ष्य सेल संस्कृति माध्यम के 100 μL जोड़ें, xCELLigence साधन के अंदर थाली जगह है, और एक पृष्ठभूमि पढ़ने ले लो । फिर, सेल सीडिंग के लिए ई-प्लेट को ऊतक संस्कृति हुड में स्थानांतरित करें।
  2. संस्कृति डिवाइस से लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करने के लिए एक मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करें। फिर कोशिकाओं को 15 मिलील अपकेंद्रित्र ट्यूब पर स्थानांतरित करें और 15 मीटर तक ताजा संस्कृति माध्यम जोड़ें। 200 x ग्रामपर 5 मिन के लिए केंद्रीकरण द्वारा कोशिकाओं को गोली मार । अधिनायक को त्यागें, ताजा माध्यम के 5 mL जोड़ें, और सेल गोली को धीरे से फिर से निलंबित करने के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें। हीमोसाइटोमीटर और माइक्रोस्कोप का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं के घनत्व की गणना करें।
  3. सेल घनत्व को उचित रूप से समायोजित करें और फिर ई-प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन के 100 एल जोड़ें। लक्ष्य सेल संख्या आम तौर पर लगभग १०,००० कोशिकाओं/अच्छी तरह से अनुयायी सेल लाइनों (BxPC3, वाघेला-CD19, और SKOV3), या ३०,००० कोशिकाओं के लिए है/
  4. 30 मिन के लिए कमरे के तापमान पर ई-प्लेट की समतुल्य कोशिकाओं को कुएं के तल पर समान रूप से बसने की अनुमति देने के लिए (यह महत्वपूर्ण है; इस कदम को न छोड़ें) ।
  5. सेल संस्कृति इनक्यूबेटर के अंदर xCELLigence साधन में ई-प्लेट रखें और बाधा को मापने के लिए शुरू, सेल सूचकांक बनाम समय के रूप में प्रदर्शित, स्वचालित रूप से हर 15 घर ।
  6. अगले दिन, प्रभावकार कार टी कोशिकाओं को तैयार करें। उचित नियंत्रण तैयार करना सुनिश्चित करें (यानी, मॉक कार टी कोशिकाएं, गैर-ट्रांसड्यूड कंट्रोल टी कोशिकाएं, और/या असंबंधित कार टी कोशिकाएं) समय से पहले यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी कोशिकाएं एक ही समय में तैयार हैं । प्रभावक कोशिकाओं और नियंत्रण कोशिकाओं को उचित घनत्व में समायोजित करें, और वांछित ई: टी अनुपात सुनिश्चित करने के लिए धारावाहिक कमजोरपड़ तैयार करें जब चरण 9 में प्रत्येक कुएं में 100 माइक्रोन को जोड़ा जाएगा।
  7. xCELLigence डेटा अधिग्रहण को थामने और एक सेल संस्कृति हुड के लिए इनक्यूबेटर से ई प्लेट लाने के लिए ।
  8. प्रत्येक कुएं से मध्यम के 100 μL निकालें। प्रत्येक कुएं में अवशिष्ट माध्यम की मात्रा अब 100 माइक्रोन है।
  9. वांछित ई:टी अनुपात प्राप्त करने के लिए धारावाहिक पतला प्रभावकार कार टी कोशिकाओं या अन्य नियंत्रण कोशिकाओं (यानी मॉक कार टी कोशिकाओं) के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  10. 30 मिन के लिए कमरे के तापमान पर ई-प्लेट को व्यवस्थित करें ताकि प्रभावक कोशिकाओं को व्यवस्थित करने की अनुमति दी जा सके, और फिर ई-प्लेट को xCELLigence साधन में वापस रखें। डेटा अधिग्रहण फिर से शुरू करें।
  11. यदि ऐसा वांछित है, तो प्रमुख समय बिंदुओं पर xCELLigence डेटा अधिग्रहण को रोका जा सकता है और प्लेट को हटा दिया जा सकता है ताकि छोटे नमूनों को एकत्र करने के लिए ऑर्थोगोनल परखों (यानी, एलिसा या फ्लो साइटोमेट्री द्वारा साइटोकिन उत्पादन को मापने) द्वारा विश्लेषण किया जा सके।
  12. EGFR-GITR-CD3 कार टी सेल प्रयोग में, एक एलिसा किट के साथ INFο उपज उपाय (निर्माता के निर्देशों का पालन करें; सामग्री की तालिकादेखें) ।
    तरल कैंसर के उपयोग के बारे में ध्यान दें: अप्रतिम हेमेटोलॉजिकल कैंसर कोशिकाओं के परीक्षण के लिए, कोशिकाओं को जोड़ने से पहले ई-प्लेट के कुएं पहले एक एंटीबॉडी के साथ लेपित होते हैं जो कैंसर कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त किए जाने वाले एंटीजन के लिए विशिष्ट होता है। राजी बी सेल लाइन के लिए एंटी-सीडी40 के आधार पर एक टेदरिंग रिएजेंट का उपयोग किया जाता है (सामग्री की मेजमें तरल ट्यूमर हत्या परख किट देखें)। नीचे प्लेट कोटिंग के लिए प्रक्रिया है:
  13. 4 μg/mL की एकाग्रता के लिए तेदरी बफर के साथ टेथरिंग रिएजेंट (विरोधी सीडी40) को पतला करें।
  14. एक ऊतक संस्कृति हुड के अंदर काम करना, ई-प्लेट के प्रत्येक कुएं में पतला टेदरिंग रिएजेंट के 50 μL जोड़ें। ई-प्लेट को कमरे के तापमान पर या 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में छोड़ दें।
  15. टेदरिंग रिएजेंट निकालें और ई-प्लेट को वॉश बफर के साथ कम से कम 2x धो लें। इस बिंदु पर, ई-प्लेट राजी लक्ष्य कोशिकाओं (३०,००० कोशिकाओं/अच्छी तरह से बोने के लिए तैयार है) ।
  16. बाकी प्रक्रिया को करने के लिए चरण 4.1 (ऊपर) के साथ जारी रखें।

Representative Results

कार लेंटिवायरस तैयारी और कार टी सेल पीढ़ी और शक्ति मूल्यांकन
कार लेंटिवायरस तैयारी के टिटर निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक मात्रात्मक आरटी-पीसीआर किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके निर्धारित किए गए थे। टिट्रेशन प्रोटोकॉल ने पहले वायरस आरएनए निकाला और फिर लेंटिवायरल आरएनए कॉपी नंबर मापा, जिसमें संक्रामक वायरल कणों की मात्रा का संकेत दिया गया । उपरोक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करके १ १५० मिमी पकवान से उत्पन्नवायरस का टिटर आमतौर पर 10 9-1010 वायरल प्रतियां/mL के बीच होता है । चित्रा 2ए प्रतिनिधि मात्रात्मक पीसीआर परिणाम से आरटी-पीसीआर साइकिल नंबर बनाम सिग्नल स्ट्रेंथ दिखाता है। एक बार वायरस की गुणवत्ता संतुष्ट थी, जब टिटर 1 x 108 pfu/mL से बड़ा था, यह बाद में टी सेल ट्रांसड्यूक्शन के लिए नीचे जम गया था । कार टी कोशिकाओं के बाद लेंटिवायरस के साथ ट्रांसड्यू किया गया, टी कोशिकाओं को एक अतिरिक्त 12-14 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया गया, 1 x 106 से 2 x 106 कोशिकाओं/mL के आसपास उनके घनत्व को बनाए रखने । कार टी कोशिकाओं को तो विरोधी ScFv विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ एक बहाव आवेदन या नीचे फ्रीज से पहले एक प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग कर जांच की गई । एक अच्छा प्रतिनिधि बैच परिणाम चित्रा 2बीमें दिखाया गया है । एक एंटी-एससीएफवी एंटीबॉडी का उपयोग करना, कार टी कोशिकाओं के बारे में 50% सकारात्मक दाग (Q2 50.6% बनाम टी कोशिकाओं 1%), टी कोशिकाओं के बारे में 50% में कार की अभिव्यक्ति का संकेत है. इसके बाद, आरटीसीए शक्ति परख साइटोलिसिस दृढ़ संकल्प के लिए प्रदर्शन किया गया था इससे पहले कि कार टी कोशिकाओं के प्रत्येक बैच नीचे जमे हुए और भविष्य के आवेदन के लिए तैयार था । कार टी सेल डिजाइन, पीढ़ी, और मूल्यांकन प्रक्रिया के एक चक्र के बारे में 1 महीने लग गए ।

CD22-CAR टी कोशिकाओं द्वारा राजी लिंफोमा बी कोशिकाओं की हत्या
एंटी-सीडी40 लिक्विड ट्यूमर टेदरिंग किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग 3 7 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए ई-प्लेट को कोट करने के लिए 4 μg/mL की एकाग्रता पर किया गया था। टेदरिंग बफर के साथ कुओं को धोने के बाद, बी-सेल लिंफोमा कोशिकाओं को ई-प्लेट में 30,000 कोशिकाओं/अच्छी तरह से घनत्व पर जोड़ा गया था। कोशिकाओं को 30 min के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति देने के बाद ई-प्लेट xCELLigence साधन के अंदर वापस रखा गया था, और बाधा रीडिंग तुरंत शुरू किया गया ताकि सेल लगाव और प्रसार पर कब्जा करने के लिए । अगले दिन, या तो CD22-CAR टी कोशिकाओं, नकली कार टी कोशिकाओं, या untransduced टी कोशिकाओं को जोड़ा गया । चित्रा 3में, सभी सेल प्रकारों के लिए 10:1 का ई:टी अनुपात उपयोग किया गया था। CD22-पॉजिटिव राजी कोशिकाओं, CD22-कार टी कोशिकाओं के साथ इलाज नकारात्मक नियंत्रण (untransduced टी कोशिकाओं और नकली कार टी कोशिकाओं) की तुलना में महत्वपूर्ण हत्या (हरी ट्रेस) प्रदर्शित किया ।

CD47-कार टी कोशिकाओं द्वारा अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं की प्रभावी हत्या
सीडी47 इम्यूनोग्लोबुलिन सुपरफैमिली की ट्रांसम्मेम्ब्रेन सतह ग्लाइकोप्रोटीन है। एक पूर्णांक से जुड़े प्रोटीन के रूप में, यह हेमेटोलॉजिकल कैंसर (ल्यूकेमिया, लिंफोमा, और मल्टीपल मायलोमा) और ठोस कैंसर (जैसे ओवेरियन, छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर, अग्नाशय, ग्लियोब्लास्टोमा) और अन्य प्रकार के कैंसर36,37में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है। CD47 को मैक्रोफेज के लिए एक डू-नॉट-ईट-मी सिग्नल के रूप में भी जाना जाता है, जिसने इसे कुछ कैंसर में संभावित चिकित्सीय लक्ष्य बना दिया है। CD47-CAR टी कोशिकाओं का उत्पादन और BxPC3 अग्नाशय के कैंसर की कोशिकाओं जो CD47३८,३९के उच्च स्तर को व्यक्त के खिलाफ परीक्षण किया गया । BxPC3 कोशिकाओं को 1 दिन में ई-प्लेट में १०,००० कोशिकाओं/अच्छी तरह से एक घनत्व पर वरीयता प्राप्त थे । वास्तविक समय की निगरानी से पता चला है कि इन कोशिकाओं को 16 घंटे के बाद प्रवाह तक पहुंच गया । इस समय बिंदु पर, कार टी कोशिकाओं को 10:1(चित्रा 4ए)के ई: टी अनुपात में जोड़ा गया था । नॉनट्रांसड्यूसटी सेल्स और मॉक कार टी सेल्स जैसी कंट्रोल इफेक्टर सेल्स भी जोड़ी गईं । परिणाम स्पष्ट रूप से पता चलता है कि CD47-कार टी कोशिकाओं को चुनिंदा लक्ष्य BxPC3 कोशिकाओं29को मार डालो । इसके अलावा, चित्रा 4बी से पता चलता है कि बाधा संकेत जब CD47-कार टी कोशिकाओं को एक खाली अच्छी तरह से जोड़ा जाता है काफी हद तक लक्ष्य BxPC3 कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न बाधा संकेत से कम है । अकेले CD47-CAR T कोशिकाओं के साथ कुओं से सेल सूचकांक मूल्य ०.१४ की अधिकतम पहुंच गया, जो केवल मध्यम अकेले (०.०२) से संकेत से थोड़ा अधिक है । यह इंगित करता है कि इस विषम हत्या परख में, बाधा संकेत लगभग विशेष रूप से लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं से प्राप्त होता है ।

जीआईटीआर डोमेन द्वारा कार टी कोशिकाओं का महंगाीकरण
जब एक EGFR-GITR-CD3 कार में व्यक्त की, GITR costimulatory डोमेन पहले EGFR-सकारात्मक SKOV3 कैंसर कोशिकाओं की हत्या को बढ़ाने के लिए, लेकिन EGFR-नकारात्मक MCF-7 कैंसर कोशिकाओं30नहीं की हत्या को बढ़ाने की सूचना दी थी । जीआईटीआर डोमेन की भूमिका को बेहतर ढंग से स्पष्ट करने के लिए, कार पूर्ण लंबाई वाले जीआईटीआर डोमेन, या डोमेन के हटाए गए या पुनर्व्यवस्थित संस्करणों वाले निर्माण, कार टी कोशिकाओं(चित्र 5ए)को सक्रिय करने की क्षमता के लिए उत्पन्न और परीक्षण किया गया था। चित्रा 5बी, सी में xCELLigence डेटा से पता चलता है कि जीआईटीआर सहउत्तेजक डोमेन मूल कार निर्माण के साथ मनाए जाने वाले ईजीएफआर-सकारात्मक लक्ष्य कोशिकाओं की कार टी सेल हत्या को बढ़ाता है जिसमें जीआईटीआर डोमेन का अभाव है। इसके अलावा, जीआईटीआर डोमेन (अमीनो एसिड 184-193) से 10 अमीनो एसिड हटाने से इस उत्तेजक गतिविधि को समाप्त कर दिया। इसके विपरीत, कार निर्माण के भीतर जीआईटीआर डोमेन की सापेक्ष स्थिति को पुनर्व्यवस्थित करना इसकी उत्तेजक क्षमताओं के लिए कम हानिकारक साबित हुआ। एंड पॉइंट डेटा का उपयोग करके, टी-सेल सक्रियण के किराए के रूप में IFNο उत्पादन ने जीआईटीआर डोमेन(चित्रा 5बी)की उत्तेजक गतिविधि का भी प्रदर्शन किया। अंत बिंदु डेटा के विपरीत जो एक मात्र "स्नैप शॉट" है, xCELLigence साधन की निरंतर बाधा प्रोफ़ाइल स्पष्ट रूप से विभिन्न उपचार(चित्रा 5सी)की हत्या काइनेटिक्स में सूक्ष्म अंतर को रोशन करती है। यहां प्राप्त परिणाम30वीवो अध्ययन में उन लोगों के अनुरूप हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: xCELLigence वास्तविक समय सेल विश्लेषण (RTCA) प्रणाली प्रभावक कोशिकाओं द्वारा लक्ष्य कोशिकाओं की हत्या का पता लगाता है । लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ कार टी प्रभावक कोशिकाओं की हत्या गतिविधि को मापने के लिए तीन मुख्य गर्भाधान कदम हैं । चरण 1: लक्ष्य कोशिकाओं (यानी, ट्यूमर कोशिकाओं) को ई-प्लेट के कुएं में बीज करें। कोशिकाएं गोल्ड बायोसेंसर माइक्रोइलेक्ट्रोड से जुड़ी होती हैं और यह इलेक्ट्रोड के बीच इलेक्ट्रिक करंट के प्रवाह को बाधित करती है । इस बाधा मूल्य को मापा जाता है और सेल इंडेक्स नामक एक यूनिटलेस पैरामीटर के रूप में प्लॉट किया जाता है। कोशिकाओं के बढ़ने के साथ ही सेल इंडेक्स मूल्य बढ़ता है और कोशिकाएं संगम का रुख करते हुए एक पठार तक पहुंचती हैं । चरण 2: प्रभावक कोशिकाएं- अअनुयायी प्रतिरक्षा कोशिकाएं- बाद में जोड़े जाते हैं। क्योंकि ये कोशिकाएं सोने के माइक्रोइलेक्ट्रोड का पालन नहीं करती हैं, इसलिए ये सीधे तौर पर बाधा परिवर्तन का कारण नहीं बनती हैं। चरण 3: यदि प्रभावक कोशिकाएं लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं पर हमला करती हैं, तो ट्यूमर कोशिकाओं का विनाश समय के साथ सेल इंडेक्स में कमी से परिलक्षित होता है। प्रभावक कोशिकाओं की इस साइटोलिटिक गतिविधि, या प्रभावक कोशिकाओं की शक्ति, संवेदनशीलता और सटीक निगरानी की जा सकती है। xCELLigence प्रणाली से बाधा डेटा के निरंतर अधिग्रहण वास्तविक समय कई शर्तों के लिए गतिज विश्लेषण एक साथ हत्या सक्षम बनाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: लेंटिवायरस का टिटर निर्धारण और कार टी कोशिकाओं का प्रवाह साइटोमेट्री मूल्यांकन। (A)लेंटिवायरल टिटर दृढ़ संकल्प। विभिन्न रंग लाइनें चक्र संख्या बनाम डेल्टा आरएन कम चक्र संख्या के लिए प्रतिनिधि नमूने हैं जो नमूनों में मौजूद वायरस आरएनए टेम्पलेट की अपेक्षाकृत उच्च मात्रा का संकेत देते हैं। (ख)ट्रांसड्यूक्शन के बाद, कार टी कोशिकाओं को 2 x 106 कोशिकाओं/mL से कम के घनत्व पर सुसंस्कृत और बनाए रखा गया था और फिर प्रवाह विश्लेषण के अधीन किया गया था । वाई-एक्सिसटी कोशिकाओं के लिए धुंधला को दर्शाता है, जिसमें Q1 और Q2 क्षेत्रों में सकारात्मक मूल्य परिलक्षित होते हैं। दोनों नमूने टी कोशिकाओं के लिए 100% सकारात्मक हैं। कार एससीएफवी की अभिव्यक्ति एक एससीएफवी-विशिष्ट एबी(एक्स-एक्सिस)का उपयोग करके निर्धारित की जाती है। परिणाम से पता चलता है कि टी कोशिकाओं के 50% से अधिक CD22-CAR टी कोशिकाओं में scFv सकारात्मक हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: राजी बर्किट की लिंफोमा कोशिकाओं के खिलाफ CD22-CAR टी कोशिकाओं की गतिशीलता की हत्या । जबकि लाल वक्र अकेले राजी कोशिकाओं है, हरे वक्र सीडी 22-कार टी कोशिकाओं के साथ इलाज राजी कोशिकाओं है । गुलाबी और नीले घटता क्रमशः नकली कार टी सेल उपचार और nontransduced टी सेल उपचार कर रहे हैं । ई: टी अनुपात 10:1 है । त्रुटि सलाखों के मानक विचलन कर रहे हैं। आसान प्रदर्शन के लिए 2 घंटे के अंतराल पर समय पैमाना स्थापित किया जाता है, हालांकि अधिक डेटा अंक उपलब्ध हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: अग्नाशय ठोस ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ CD47-कार टी कोशिकाओं की प्रभावकारिता। (A)गुलाबी लक्ष्य BxPC3 कोशिकाओं को अकेले है, जबकि लाल CD47-कार टी कोशिकाओं के साथ BxPC3 है जोड़ा । ग्रीन नॉनट्रांसड्यूस टी कोशिकाओं के अलावा के साथ BxPC3 है, और नीला नकली कार टी कोशिकाओं के साथ है । ई: टी अनुपात 10:1 है । (ख)एक ही सेटिंग में, लाल खाली है (लक्ष्य कोशिकाओं की कमी) CD47-कार टी कोशिकाओं के साथ नियंत्रण कुओं केवल और हरे रंग ही माध्यम है । त्रुटि सलाखों के मानक विचलन कर रहे हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: जीआईटीआर डोमेन EGFR-positive ट्यूमर सेल लाइनों के खिलाफ कार टी सेल साइटोटॉक्सिक गतिविधि बढ़ जाती है । (A)विभिन्न कार का निर्माण। (ख)4 घंटे (बाएं) और 24 घंटे (मध्य) में विभिन्न कार निर्माणों के लिए % साइटोलिसिस के बार भूखंड। 24 घंटे में IFNο उत्पादन दाईं ओर दिखाया गया है। (ग)सभी निर्माणों के लिए निरंतर हत्या मूल्यांकन। ब्लैक वक्र केवल BxPC3 अंडाशय कैंसर कोशिकाओं का विकास वक्र है। हरे वक्र लक्ष्य कोशिकाओं टी कोशिकाओं के साथ ही इलाज किया है, ब्लू वक्र मॉक कार टी कोशिकाओं के साथ इलाज लक्ष्य कोशिकाओं है, लाल वक्र लक्ष्य ईजीएफआर-GITR-CD3-CAR T कोशिकाओं के साथ इलाज कोशिकाओं है, गुलाबी वक्र लक्ष्य ईजीएफआर-1GITR-CD3-CAR T कोशिकाओं के साथ इलाज कोशिकाओं है, और भूरे रंग की वक्र लक्ष्य कोशिकाओं EGFR-CD3-GITR-कार टी कोशिकाओं के साथ इलाज किया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर्स एक बाह्य एकल-श्रृंखला चर खंड (एससीएफवी क्षेत्र), एक काज क्षेत्र, एक ट्रांसम्मेब्रेन क्षेत्र, और टीसीआर सिग्नलिंग डोमेन से बना एक साइटोप्लाज्मिक डोमेन और सीडी 28 और OX4011,40जैसे रिसेप्टर्स से अतिरिक्त सहउत्तेजक डोमेन से बना मल्टीडोमेन प्रोटीन हैं। सुरक्षित, चयनात्मक और प्रभावोत्पादक सीएआर डिजाइन करने के लिए, यह जरूरी है कि सीएआर के डिजाइन में विभिन्न क्रमपरिवर्तनों को इन विट्रो शक्ति परखों और अंततः पशु मॉडल का उपयोग करके अच्छी तरह से परीक्षण किया जाए। इस अध्ययन में, हमने एक प्रोटोकॉल और कार्यप्रवाह प्रदान किया है कि कैसे एक वास्तविक समय में विट्रो शक्ति परख प्रभावोत्पादक सीएआरएस के डिजाइन को सूचित कर सकता है।

किसी भी प्रकार की शक्ति परख को डिजाइन करने में, विशेष रूप से विनिर्माण उद्देश्यों के लिए, यह जरूरी है कि परख संवेदनशील, मजबूत, सुसंगत हो, और संभव के रूप में कार्रवाई के तंत्र के करीबहो । वास्तविक समय शक्ति परख यहां वर्णित कार टी सेल की साइटोलिटिक गतिविधि को मापने के बजाय साइटोकिन रिलीज के रूप में एक किराए मार्कर का उपयोग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । महत्वपूर्ण बात, परख के लिए कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए परख प्लेट (ई-प्लेट) और अनुशंसित मीडिया के अलावा अन्य रंगों या अभिकर्मकों जैसे किसी भी अतिरिक्त घटकों की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अतिरिक्त, परख अति संवेदनशील है और अन्य लेबल आधारित परख42,43,44की तुलना में अत्यधिक प्रजनन योग्य डेटा प्रदान करता है। इसके अलावा, xCELLigence परख बहुत कम प्रभावक से लक्ष्य अनुपात का उपयोग करने के लिए उत्तरदायी है जो विशिष्ट साइटोलिसिस के मूल्यांकन के लिए आदर्श है।

xCELLigence प्रणाली के लचीलेपन और उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए, हमने दो ट्यूमर प्रकारों पर ध्यान केंद्रित किया है, अर्थात् हेमेटोलॉजिकल मूल और ठोस ट्यूमर के ट्यूमर। CD22-निर्देशित कार टी कोशिकाओं की शक्ति का आकलन करने के लिए, राजी कोशिकाओं (यानी, एक बी-सेल लिंफोमा सेल लाइन) को एंटी-सीडी40 एंटीबॉडी का उपयोग करके ई-प्लेटों में सीमित किया गया था। ई-प्लेटों के नीचे तक राजी कोशिकाओं के टेदरिंग के परिणामस्वरूप एक बाधा संकेत होता है जो कुएं में राजी कोशिकाओं की व्यवहार्यता और संख्या को दर्शाता है। सीडी 22-कार टी कोशिकाओं को जोडऩे के बाद, राजी कोशिकाओं को चुनिंदा रूप से एक समय और प्रभावक-निर्भर तरीके से मारा जाता है, जिसका समापन बाधा संकेत में समय-निर्भर कमी में होता है। बाधा में गिरावट साइटोलिसिस या राजी कोशिकाओं की व्यवहार्यता की हानि का प्रतीक है17। एंटीबॉडी का उपयोग करके इस चयनात्मक टेथरिंग दृष्टिकोण को अन्य तरल ट्यूमर सेल लाइनों तक बढ़ाया जा सकता है। हेमेटोलॉजिकल मूल की ट्यूमर सेल लाइनों का उपयोग करने के लिए एक वैकल्पिक रणनीति अनुयायी कैंसर कोशिकाओं का उपयोग करना है जो वाला कोशिकाओं में व्यक्त सीडी 19 जैसे ट्यूमर एंटीजन को स्थिर रूप से व्यक्त करने के लिए इंजीनियर हैं। इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि माता-पिता वाला कोशिकाएं आसानी से उपलब्ध हैं और विशिष्टता के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग की जा सकती हैं। इस तरह के एक दृष्टिकोण पहले से ही चो-CD22 बनाम चो कोशिकाओं और चो-BCMAs बनाम चो कोशिकाओं29के साथ मान्य किया गया है । इस तरह के विभिन्न दृष्टिकोणों का उपयोग करके, कार टी-सेल डिजाइन और प्रभावकारिता का आसानी से परीक्षण किया जा सकता है। xCELLigence परख स्वाभाविक रूप से लचीला है, और परख की स्थिति को अधिकतम लगभग शारीरिक स्थितियों के लिए समायोजित किया जा सकता है।

शक्ति परख हम यहां वर्णित का एक प्रमुख लाभ यह है कि यह एक सरल कार्यात्मक परख है और आनुवंशिक इंजीनियरिंग तकनीकों के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है एक उच्च थ्रूपुट फैशन में इष्टतम और प्रभावोत्पादक CARs डिजाइन । जैसा कि ईजीएफआर-पॉजिटिव कैंसर कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन की गई कार टी कोशिकाओं के लिए यहां दिखाया गया था, परख का उपयोग विभिन्न कार निर्माण/म्यूटेंट की सापेक्ष गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, हमने दिखाया कि जब जीआईटीआर डोमेन सीडी 3 डोमेन के ऊपर स्थित होता है तो यह सीडी 3 डोमेन के डाउनस्ट्रीम स्थित होने की तुलना में अधिक मजबूत साइटोलिटिक गतिविधि दिखाता है।

यद्यपि यह वीवो कार टी सेल गतिविधि में पूरी तरह से सहसंबंधित नहीं है, इन विट्रो साइटोकिन रिलीज को ऐतिहासिक रूप से कार टी सेल शक्ति के उपाय के रूप में उपयोग किया गया है। हालांकि xCELLigence आधारित शक्ति परख यहां वर्णित सेल के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विनिर्माण के दौरान या नैदानिक आवेदन के लिए जारी किया जा रहा से पहले, कितनी अच्छी तरह इन परिणामों के साथ vivo प्रभावकारिता में सहसंबंधित अभी तक नहीं किया गया है स्थापित. वीवो प्रभावकारिता में कई कारकों और चरों पर निर्भर करता है जिन्हें इन विट्रो परख के भीतर पुनर्कापित नहीं किया जा सकता है। इस तरह के चर में शामिल हैं: ट्यूमर की साइट के लिए कार टी कोशिकाओं की होमिंग, उत्तेजना और कार टी सेल की सक्रियता और रोगी के भीतर जारी रखने की क्षमता, और ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंटल । आगे शोधन के साथ xCELLigence परख इन जटिल प्रक्रियाओं में से कुछ मॉडलिंग में सक्षम हो सकता है ।

यहां प्रदान किया गया प्रोटोकॉल सबसे अनुयायी कैंसर सेल लाइनों और तरल ट्यूमर सेल लाइनों में से कुछ पर लागू होता है । हालांकि, ट्यूमर प्रकारों और चरणों की जटिलता के कारण प्राथमिक कैंसर कोशिकाओं जैसे नैदानिक नमूनों का आगे परीक्षण और अनुकूलित करने की आवश्यकता होती है। यह निश्चित रूप से ध्यान देने योग्य है कि इन विट्रो शक्ति परख प्रणाली यहां वर्णित कैंसर सेल लाइनों का उपयोग करता है केवल कार टी कोशिकाओं की संभावित गतिविधि को प्रतिबिंबित करने के लायक है । मानव शरीर के अंदर असली ट्यूमर की स्थिति बहुत अधिक जटिल है, खासकर जब एक ठोस ट्यूमर को लक्षित किया जाता है, गतिशील ट्यूमर पर्यावरण और विकास के कारण। इसलिए, शक्ति मूल्यांकन परिणाम कार टी कोशिकाओं की नैदानिक प्रभावकारिता में बहुत अच्छी तरह से अनुवाद नहीं कर सकता है।

संक्षेप में, प्रस्तुत बाधा आधारित xCELLigence मंच समय की एक विस्तारित अवधि के लिए सेल हत्या की लेबल मुक्त निगरानी की अनुमति देता है, अर्थात् 10 दिनों तक । डेटा संग्रह के लिए इतने लंबे लौकिक पैमाने के लिए यह क्षमता अन्य परखों से प्रौद्योगिकी में अंतर करती है जो वर्तमान में उपयोग में हैं और जिन्हें समय बिंदु संग्रह और श्रमसाध्य नमूना हेरफेर के लिए कई प्रयोगात्मक प्रतिकृतिस्थापित करने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, प्रभावक प्रतिरक्षा कोशिकाओं का न्यूनतम संकेत योगदान डेटा विश्लेषण को सरल बनाता है। सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से डेटा को संसाधित कर सकता है और उपयोगी मापदंडों जैसे साइटोलिसिस, केटी50 आदि का प्रतिशत उत्पन्न कर सकता है। प्रौद्योगिकी पहले से ही उच्च संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया है (ई के साथ: 1:20 के रूप में कम के रूप में टी अनुपात) और एक बड़ी गतिशील रेंज (ई: 20:1 से 1:20 अनुपात के साथ), जो आसानी से अंय assays के साथ प्राप्त नहीं है । कुल मिलाकर, इस तकनीक के कार्यान्वयन को उच्च थ्रूपुट पैमाने पर अधिक सटीक डेटा विश्लेषण की अनुमति देनी चाहिए जो कार टी-सेल एजेंटों के विकास को बढ़ाएगा, क्षेत्र को बहुत अधिक गति से आगे बढ़ाएगा।

Disclosures

लेखक कार टी-सेल विकास और संबद्ध शक्ति परखों में अनुसंधान करते हैं जो क्रमशः प्रोमाब बायोटेक्नोलॉजीज और एसीईए बायोसाइंसेज के व्यावसायिक हित हैं। हालांकि, यह वैज्ञानिक ज्ञान के प्रसार को बढ़ाने के JoVE के मिशन के लेखकों के पालन में परिवर्तन नहीं करता है । इस प्रकाशन की शर्तों की समीक्षा की गई है और प्रोमाब बायोटेक्नोलॉजीज और एसीईए बायोसाइंसेज द्वारा अनुसंधान की अपनी नीति के अनुसार अनुमोदित किया गया है।

Acknowledgments

लेखक इस अध्ययन में उपयोग किए गए अभिकर्मकों और उपकरणों को प्रदान करने के लिए प्रोमाब बायोटेक्नोलॉजीज और एसीईए बायोसाइंसेज का धन्यवाद करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-AAD Biolegend 420404
Anti-CD40, liquid tumor killing assay kit ACEA Biosciences 8100005
anti-human F(ab')2 Jackson Immunoresearch laboratories. 109-116-088
APC anti-CD3 Biolegend 317318
Assay medium RPMI1640 life technologies.Corp 11875-093
CAR-T cell frozen solution CryostorCS10 Stemcell technologies #07930
CAR-T cell medium from ProMab AIM-V+300IFU/ml IL-2 12055-091
CD3/CD28 coated microbeads, Dynabeads Thermofisher 11131D
DMEM GElifesciences.com SH30243.02
FACS buffer Promab made
FBS Lonza.com 14-503F
HEK293FT Thermo Fisher R70007
INFg ELISA kit Thermo Fisher
Lentiviral Packaging Mix System Biosciences VP100
Lenti-X quantitative RT-PCR titration kit (Clontech) Takara 631235
Promab medium for target cells Varied with cell lines
Real time Cellular Analyer ACEA Biosciences
Thermal cycler Thermo Fisher
Transduction enhance agent, Virus Transduction Enhancer (Alstem) Transplus, Alstem V020
Transfection dilution solution, Opti-MEM Thermo Fisher
Transfection reagent, NanoFect reagent Alstem NF100

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References

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