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Bioengineering

Nanoemulsione Tripeptide-stabilizzato di acido oleico

Published: February 27, 2019 doi: 10.3791/59034
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 4,5,6, 1,2,3
1Department of Chemistry, Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women's Health Research Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research, Western Connecticut Health Network

Summary

Questo protocollo descrive un metodo efficiente per sintetizzare una Nanoemulsione di un coniugato acido oleico acids-platinum(II) stabilizzato con un tripeptide di lisina-tirosina-fenilalanina (KYF). Le forme di Nanoemulsione in condizioni blande sintetiche tramite auto-assemblaggio del KYF e il coniugato.

Abstract

Descriviamo un metodo per produrre una Nanoemulsione composto da un nucleo di acids-Pt(II) acido oleico e un rivestimento (KYF) di lisina-tirosina-fenilalanina (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE incapsula PT al 10% in peso, ha un diametro di 107 ± 27 nm e una carica negativa di superficie. KYF-Pt-NE è stabile in acqua e in siero ed è biologicamente attivo. La coniugazione di un fluoroforo di KYF permette la sintesi di una Nanoemulsione fluorescente che è adatto per l'imaging biologico. La sintesi del Nanoemulsione viene eseguita in un ambiente acquoso e le forme di KYF-Pt-NE via auto-assemblaggio di un peptide KYF breve e un coniugato acido oleico acids-platinum(II). L'auto-assemblaggio processo dipende la temperatura della soluzione, il rapporto molare dei substrati e la portata dell'aggiunta del substrato. Passi fondamentali includono mantenendo il tasso ottimale di agitazione durante la sintesi, permettendo un tempo sufficiente per l'auto-assemblaggio e pre-concentrando la Nanoemulsione gradualmente in un concentratore centrifugo.

Introduction

Negli ultimi anni, c'è stato un crescente interesse nell'ingegneria di nanoparticelle per applicazioni biomedicali come consegna della droga e bioimmagini1,2,3,4. La multifunzionalità dei sistemi basati su nanoparticelle richiede spesso incorporando più componenti all'interno di una formulazione. I mattoni che si basano sui lipidi o polimeri spesso differiscono in termini di loro proprietà fisico-chimiche nonché loro biocompatibilità e biodegradabilità, che alla fine potrebbe influenzare la funzione della nanostruttura1, 5,6. Materiali biologicamente derivate, quali proteine e peptidi, hanno da tempo riconosciute come promettente componenti di nanostrutture multifunzionale a causa della loro sequenza flessibilità7,8. Peptidi assemblarsi in architetture supramolecolari altamente ordinate formando elicoidale nastri9,10, impalcature fibroso11,12e molti altri, aprendo così la strada alla costruzione nanostrutture ibride basate su biomolecole utilizzando un ascendente approccio13.

Peptidi sono stati esplorati per applicazioni in medicina e biotecnologia, soprattutto per la terapia anticancro14 e malattie cardiovascolari15 anche per quanto riguarda lo sviluppo antibiotico16,17, metabolica disturbi18e infezioni19. Ci sono oltre un centinaio di piccole-peptide terapeutica in fase di test clinici20. Peptidi sono facili da modificare e veloce di sintetizzare a basso costo. Inoltre, sono biodegradabili, che facilita notevolmente il loro applicazioni biologiche e farmaceutiche21,22. L'utilizzo di peptidi come componenti strutturali comprende l'ingegneria di nanoparticelle reattive, peptidici e idrogel depositi per rilascio controllato23,24,25,26 , 27, biosensori peptidici28,29,30,31o dispositivi bio-elettroniche32,33,34. Cosa importante, sono stati trovati anche brevi peptidi con due o tre residui dell'amminoacido che includono fenilalanina per guidare l'auto-assemblaggio elabora35,36,37 e creare emulsioni stabilizzate38 .

Farmaci a base di platino, a causa della loro alta efficacia, sono utilizzati in molti regimi di trattamento del cancro, sia da solo che in combinazione con altri agenti39,40. Composti del platino inducono danni al DNA formando legami incrociati monoadducts e intrastrand o interstrand. Le lesioni di Pt-DNA sono riconosciute dal macchinario cellulare e, se non riparato, portano all'apoptosi cellulare. Il meccanismo più importante, che contribuisce alla morte della cellula tumorale, PT è l'inibizione della trascrizione del DNA41,42. Tuttavia, i benefici della terapia di platino sono diminuiti di tossicità sistemica di PT che provoca gravi effetti collaterali. Questo porta a più basso dosaggio clinica di PT43, che si traduce spesso in concentrazioni sub-terapeutiche di platino raggiungendo il DNA. Di conseguenza, la riparazione del DNA che segue contribuisce alla sopravvivenza della cellula tumorale e l'acquisizione di resistenza Pt. La chemio-resistenza del platino è un problema importante nella terapia anticancro e la causa principale del trattamento fallimento44,45.

Abbiamo sviluppato una stabile irraggiungibili che incapsula l'agente PT al fine di fornire un effetto di schermatura nella circolazione sistemica e per diminuire gli effetti collaterali indotti da Pt II. Il sistema si basa su un nucleo di acido oleico acids-Pt(II) stabilizzato con un tripeptide KYF per formare una Nanoemulsione (KYF-Pt-NE)46. Gli elementi costitutivi di KYF-Pt-NE, gli aminoacidi del tripeptide, come pure l'acido oleico, hanno lo status di generalmente riconosciuti come sicuri (GRAS) con la Food and Drug Administration (FDA). KYF-Pt-NE viene preparato utilizzando un metodo di nanoprecipitazione47. In breve, il coniugato acids-Pt(II) oleico è disciolto in un solvente organico e quindi aggiunto goccia a goccia di una soluzione acquosa di KYF (Figura 1) a 37 ° C. La soluzione è agitata per diverse ore consentire l'auto-assemblaggio di KYF-Pt-NE. La Nanoemulsione è concentrata in 10 kDa concentratori centrifughi e lavati tre volte con acqua. La modificazione chimica di KYF con un fluoroforo permette la sintesi di fluorescente FITC-KYF-Pt-NE adatto per imaging biomedico.

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Protocol

1. sintesi del coniugato acido oleico Acids–Platinum(II)

  1. Attivazione di cisplatino
    1. Sospendere 50 mg (0.167 mmol) di cisplatino in 4 mL di acqua (ad es., nanopure) a 60 ° C.
    2. Aggiungere goccia a goccia 55,2 mg (0.325 mmol) di AgNO3 in 0,5 mL di acqua per la soluzione di cisplatino e mescolare la reazione per almeno 2 h a 60 ° C. Il precipitato bianco di AgCl formerà che indica l'avanzamento della reazione.
    3. Per determinare se la reazione di attivazione è stata completata, eseguire il test con 10% HCl per la presenza dello ione di Ag+ libero in soluzione. Il test dovrebbe essere negativo (nessun precipitato di AgCl ulteriore dovrebbe formare).
    4. Centrifugare la miscela di reazione a 3.220 x g per 10 min e rimuovere il precipitato bianco di AgCl.
    5. Raccogliere il surnatante e filtrarlo attraverso un filtro di siringa di 0,2 mm. Testare il surnatante per la presenza di platino applicando 2-3 gocce della soluzione tramite pipetta Pasteur a SnCl2 cristalli. Il test è positivo se il colore del complesso delle coordinate di stagno con platino è giallo/arancione scuro.
    6. Utilizzare il surnatante con PT attivato per il secondo passaggio.
  2. Reazione dell'acido oleico con PT attivato
    1. Sospendere 94,2 mg di acido oleico (0.333 mmol) in 3 mL di acqua a 60 ° C.
    2. Aggiungere 13,3 mg (0.333 mmol) di NaOH in 1 mL di acqua e mescolare con la soluzione di PT attivato dal passaggio 1.1
    3. Mescolare la reazione per 2 h a 60 ° C e successivamente a temperatura ambiente durante la notte. Il prodotto grezzo è un precipitato oleoso di giallo/marrone.
    4. Centrifugare la miscela di reazione a 3.220 x g per 10 min e rimuovere il surnatante. Asciugare il prodotto grezzo a 25 ° C, utilizzando un evaporatore rotante. Purificare il prodotto di diversi lavaggi con acetonitrile. Il colore finale di acids–Pt(II) acido oleico puro coniugato è giallo pallido.

2. sintesi di KYF-Pt-NE e la FITC-labeled Nanoemulsione FITC-KYF-Pt-NE

  1. Sintesi del tripeptide KYF e il tripeptide fluorescente contrassegnati FITC-KYF
    1. Sintetizzare il KYF utilizzando chimica standard del peptide a stato solido. Utilizzare il seguente standard condizioni di accoppiamento per collegare ogni amminoacido: Wang resina (2,19 mmol), Fmoc protetto amminoacido (4.38 mmol), 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium tetrafluoroborate (TBTU) (4.38 mmol) e diisopropylethylamine (DIPEA) (8.76 mmol). Sciogliere gli aminoacidi con TBTU in dimetilformammide (DMF) e DIPEA.
    2. Immergere 5,7 g di resina di Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol (0,382 meq/g) in 25 mL di DMF per 1 h prima dell'uso.
    3. DEPROTECT il gruppo amminico dell'aminoacido L-fenilalanina con 15 mL di soluzione al 20% piperidina/DMF per 5 min, scartare il solvente e ripetere il lavaggio con ciclo di 20 min.
    4. Lavare la resina per 1 min con i seguenti solventi: DMF, alcool isopropilico (IPA), DMF, IPA, DMF, IPA, DMF, DMF. Eliminare il solvente dopo ogni lavaggio.
    5. Eseguire il test di Kaiser per determinare la presenza di gruppo di2 NH libero sulla resina (Vedi passaggi secondari) e se positivo (il seme di resina è viola), aggiungere l'aminoacido Fmoc-L-tirosina ed eseguire l'accoppiamento durante la notte.
      1. Preparare Kaiser soluzioni di test in bottiglie separate.
      2. Sciogliere 5 g di ninidrina in 100 mL di etanolo.
      3. Sciogliere 80 g di fenolo in 20 mL di etanolo.
      4. Mescolare 2 mL di soluzione acquosa 0,001 M di cianuro di potassio con
        98 mL di piridina.
      5. Aggiungere 2-3 gocce di ogni Kaiser testare soluzioni campione e calore in acqua bollente per 5 min.
    6. All'accoppiamento riuscito del secondo amminoacido, eseguire il test di Kaiser e se negativo procede con protocollo deprotezione (passaggi 2.1.3 per 2.1.5). Ripetere il processo con l'aminoacido Fmoc-fenilalanina.
      1. Al accoppiamento di tutti gli aminoacidi, lavare la resina per 1 min con 5 mL di DMF, IPA, DMF, metanolo, diclorometano ed etere etilico, dopo ogni lavaggio scartare il solvente. Salvare la resina per l'ulteriore elaborazione.
      2. Utilizzare la metà della resina per i passaggi successivi (2.1.7-2.1.9) per modificare il peptide con FITC. Per ottenere non modificato KYF tripeptide, seguire la procedura a partire da 2.1.10.
    7. Modificare l'amminoacido N-terminale di KYF KYF-N3 con acido 6-azidohexanoic. A tal fine, mescolare 1 g (0,382 mmol) di KYF Wang resina e 120,1 mg (0.764 mmol) di acido 6-azidohexanoic con 245,2 mg (0.764 mmol) di TBTU e mg 197,1 (1.528 mmol) di DIPEA in 30 mL di DMF. Mescolare la reazione durante la notte a temperatura ambiente.
    8. Ottenere il KYF-FITC dalla sintesi di KYF-N3 con fluoresceina propargile tramite una reazione di clic. A tal fine, è necessario mescolare 253 mg (0.097 mmol) di KYF-N3 Wang resina con 3,78 mg (0,019 mmol) di CuI tinta, 71,9 mg (0.193 mmol) di fluorescina propargile e 2,24 mg (0,017 mmol) di DIPEA. La reazione dovrebbe cambiare colore da verde a marrone.
    9. Dopo 24 h, lavare la resina per 1 min in alternanza con 5 mL di DMF e IPA cinque volte, acqua tre volte, DMF, metanolo e acqua tre volte e con diclorometano ed etere etilico tre volte. Eliminare il solvente dopo ogni lavaggio.
    10. Fendere il KYF-FITC o KYF peptide dalla resina con una soluzione di acido trifluoroacetico (TFA) / triisopropylsilane (TIPS) / h2O al rapporto di 95/2.5/2.5 oltre 3 ore.
    11. Precipitare il peptide grezzo in un freddo etere etilico, lavare tre volte con etere freddo e quindi asciugare sotto il vuoto.
  2. Sintesi di Nanoemulsione FITC-KYF-stabilizzato con PT (FITC-KYF-Pt-NE) e KYF-Pt-NE
    1. Sciogliere 10 mg (0.0126 mmol) di acido oleico acids–Pt(II) coniugato in 1,5 mL di isopropanolo e posto in una siringa da 5 mL.
    2. Inserire la siringa con acido oleico acids–Pt(II) coniugato in una pompa a siringa e impostare il flusso a 0,1 mL/min.
    3. Al fine di sintetizzare la FITC-KYF-Pt-NE, sciogliere 1 mg (0.00105 mmol) di FITC-KYF e 1 mg (0.00219 mmol) di KYF (rapporto molare 1:2 di FITC-KYF:KYF) in 20 mL di acqua e regolare la temperatura della soluzione a 37 ° C. Ricoprono le pareti del contenitore con carta stagnola per evitare photobleaching del fluoroforo FITC. Per sintetizzare il KYF-Pt-NE, sciogliere 2 mg (0.0044 mmol) di tripeptide KYF in 20 mL di acqua e regolare la temperatura della soluzione a 37 ° C.
    4. Aggiungere il coniugato acido oleico acids–Pt(II) goccia a goccia la soluzione di FITC-KYF/KYF o KYF tripeptide. Eseguire questo passaggio sotto il cofano.
    5. Agitare la soluzione durante la notte a temperatura ambiente per far evaporare i solventi organici e per consentire l'auto-assemblaggio di FITC-KYF-Pt-NE o KYF-Pt-Nefi
    6. Concentrare la FITC-KYF-Pt-NE o KYF-Pt-NE in un concentratore centrifugo (10K MWCO) e lavare tre volte con 4 mL di acqua nanopure.
    7. Memorizzare le soluzioni acquose di KYF-Pt-NE e FITC-KYF-Pt-NE a 4 ° C.
    8. Analizzare per platino contenuto mediante spettroscopia di assorbimento atomico (AAS), seguito guida48 del produttore.
      1. Preparare gli standard platino in soluzione di HCl 10% per la curva di taratura (gamma efficace per AAS è tra 100 a 1.200 ppb (parti per miliardo)).
      2. Sciogliere 50 µ l di soluzione di KYF-Pt-NE da passo 2.2 in 100 µ l di acqua regia (una miscela 3:1 di acido cloridrico concentrato e acido nitrico) e lasciare a temperatura ambiente per una notte. Aggiungere 850 µ l di acqua per raggiungere un volume di campione finale di 1 mL. Analizzare il campione utilizzando AAS. La concentrazione di acido finale dovrebbe essere il 10% in tutti i campioni analizzati.
      3. Registrare la lettura della concentrazione di Pt in ppb e calcolare il contenuto di platino finale del campione (l'account per la diluizione del campione e volume iniziale di Nanoemulsione).

3. confocale Imaging di assorbimento cellulare di FITC-KYF-Pt-NE

  1. 6 linee cellulari di cancro ovarico (A2780, CP70, SKOV3, OV90, TOV21G ed ES2), di semi in 4 piatti confocale pozzo-camera alla densità di 4.7 x 104 cellule per camera e pre-cultura durante la notte a 37 ° C.
  2. Dopo 24 h, lavare le cellule tre volte con soluzione salina tampone fosfato (PBS) e incubare con FITC-KYF-Pt-NE nel mezzo di coltura cellulare (Vedi punto 6.1 per cella linea dettagli specifici) per 15 min a 37 ° C.
  3. Dopo l'incubazione, rimuovere il supporto e lavare le cellule tre volte con PBS.
  4. Fissare le cellule con metanolo freddo per 5 min a-20 ° C e lavare tre volte con 1 mL di PBS.
  5. Permeabilize le cellule con 1 mL di 0.1% Triton-X per 10 min a temperatura ambiente e lavare tre volte con 1 mL di PBS.
  6. Incubare le cellule per 90 min con LAMP1 anticorpo coniugato con Alexa Fluor 647 (1 mL) alle 01:50 diluizione in PBS a temperatura ambiente. Successivamente, lavare le cellule 3 volte con PBS.
  7. Diluire la soluzione di riserva DAPI (1 mg/mL) a 1 mg/mL in PBS. Aggiungere 1 mL della soluzione diluita per ogni camera, quindi incubare per 15 min a temperatura ambiente. Lavare le cellule 3 volte con PBS.
  8. Montare le lamelle su una diapositiva utilizzando il mezzo di montaggio.
  9. Immagine le celle utilizzando il microscopio confocale cellule vive a lunghezza d'onda di eccitazione di 405 nm, 488 nm e 633 nm. Impostare i parametri di rilevamento come segue: potere del laser da 0,2% e non più di 1%, Pinole 1 ariose unità, guadagno master 650-750, offset digitale 0.
  10. Aprire l'immagine nel software di imaging. In immagine visualizzata, selezionare grafica e selezionare Inserisci barra della scala, inserire la barra di scala per l'immagine.

4. drug Release studi

  1. Effettuare gli studi di rilascio del farmaco in PBS. Regolare i valori di pH di tre buffer di PBS a 7,4, 6.8 e 5.0 rispettivamente.
  2. Diluire 5 μL di KYF-Pt-NE in 180 μL di tampone PBS pH appropriato, trasferimento a 3,5 tazza di dialisi mini MWCO kDa e incubare a 37 ° C in PBS.
  3. Rimuovere il tampone da ogni tre tubi di dialisi mini a 2, 4, 6, 24, 48 e 140 h e misurare le concentrazioni di platino di AAS. Preparare tutti i campioni secondo passo 2.2.8 ma regolare il volume finale del campione a 500 µ l.

5. metodi di coltura cellulare

  1. Linee cellulari di cultura A2780, CP70, SKOV-3, OV-90, TOV - 21G, ES-2 nel medium di coltura cellulare (DMEM) completati con 10% (A2780, CP70, SKOV-3, ES-2) o con 15% (TOV - 21G, OV-90) siero bovino fetale (FBS), con L-Glutammina e penicillina/streptomicina. Crescere in tutte le cellule in un 5% di CO2, atmosfera satura di acqua a 37 ° C.
  2. Cellule di seme 3 x 105 in ogni piastra a 96 pozzetti e pre-cultura durante la notte per gli esperimenti in vitro di incubazione. Preparare le soluzioni KYF-Pt-NE, cisplatino e carboplatino in acqua. Regolare la concentrazione di PT in KYF-Pt-NE per abbinare la concentrazione di carboplatino e cisplatino per ogni linea cellulare. Incubare per 72 ore a 37 ° C.
  3. Dopo l'incubazione, valutare la vitalità cellulare utilizzando un saggio colorimetrico (il saggio di proliferazione delle cellule di MTT). Brevemente, rimuovere il mezzo e aggiungere 110 μL di 10% MTT in mezzo ad ogni pozzetto ed incubare per 2 ore a 37 ° C. Quindi aggiungere detersivo di 100 μL in ogni pozzetto e incubare per 5 h a 37 ° C.
  4. Verifica l'assorbanza a 570 nm utilizzando il lettore di piastre. Analizzare i risultati usando l'analisi statistica con Z-test e P-test.

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Representative Results

Immagine rappresentante TEM di KYF-Pt-NE preparato usando questo protocollo è mostrato nella Figura 2A. KYF-Pt-NEs sono sferici in morfologia, ben dispersero e di dimensioni uniformi. Il diametro del nucleo di KYF-Pt-NEs, misurata direttamente da tre immagini TEM con un minimo di 200 misure effettuate, è 107 ± 27 nm. Il diametro idrodinamico di KYF-Pt-NE, analizzato usando la spettroscopia luce dinamica (DLS), è stato trovato per essere 240 nm con un indice di polidispersione di 0.156. Il potenziale Zeta di KYF-Pt-NE in acqua è stato determinato per tre sintesi indipendenti con il valore medio di-60.1 mV. L'alta grandezza del potenziale indica buona stabilità colloidale della formulazione, e la carica negativa di superficie è attribuita a ionizzato COO– superficie gruppi di acidi oleici. Il punto isoelettrico di KYF è 8,59, e pertanto esso è caricato positivamente a pH neutro.

Le nanoemulsioni la capacità di attraversare la membrana cellulare è stata esaminata utilizzando linee cellulari del cancro ovarico e FITC-KYF-Pt-NE fluorescente contrassegnati. I risultati sono presentati in Figura 2B. Può essere visto chiaramente che il FITC-KYF-Pt-NEs (verde) è distribuito all'interno del citosol, ma non sono stati ancora associato con i lisosomi (rosso). Questo risultato dimostra che KYF-Pt-NEs entrare nelle cellule e può servire come veicolo di consegna di droga intracellulare.

La stabilità di KYF-Pt-en e FITC-KYF-Pt-NEs è stata valutata con le liste di distribuzione. Il diametro di nanoemulsioni in acqua è stato misurato durante parecchi mesi ed i risultati sono presentati nella Figura 3. Il diametro idrodinamico di entrambe le formulazioni aumentata lentamente durante i 4 mesi in deposito, a 320 nm (KYF-Pt-NE) e 240 nm (FITC-KYF-Pt-NE), ma le dimensioni su scala nanometrica sono state conservate. Questo risultato suggerisce che il tripeptide KYF stabilizza nanoemulsioni per lunghi periodi di tempo.

L'efficienza di incapsulamento di PT e rilascio dalla Nanoemulsione sono stati misurati con AAS. La concentrazione di PT in KYF-Pt-NE è stata creata per essere wt.% 10. Rilasciare il PT da KYF-Pt-NE a pH 7,4 (fisiologico), 6,8 (interstizio del tumore)49e 5.0 (endosomal)50 è presentato in Figura 4A. Il rilascio di PT è il più lento a pH 7.4 con solo il 20,8% di PT rilasciato dopo 4 h, mentre a pH 6.8 e 5.0 il rilascio era 32,8% di e 47,5%, rispettivamente. La stessa tendenza ha continuato dopo 24 h e dopo 6 giorni. Questo risultato indica che PT rilascio da KYF-Pt-NE è dipendente dal pH, e può essere ritardata nella circolazione sistemica e accelerato una volta le nanoemulsioni traslocano in tumore.

L'attività biologica di KYF-Pt-NE è stato stabilito in vitro utilizzando le stesse linee cellulari di cancro ovarico come in studi di formazione immagine. Le cellule sono state incubate con KYF-Pt-NE per 72 h, alle concentrazioni di KYF-Pt-NE corrispondente IC50 per ogni linea cellulare. La redditività è stata valutata usando l'analisi MTT e i risultati sono stati confrontati solo celle, KYF-NE, oleico acids-Pt(II) coniugato, carboplatino e cisplatino. I risultati dell'attività biologica di KYF-Pt-NE sono mostrati in Figura 4B. KYF-Pt-NE ha ridotto l'attuabilità delle linee cellulari isogeniche A2780 (Pt sensibile) e CP70 (Pt resistente) di 44,3% e 46,2% rispettivamente. Carboplatino, l'analogo clinicamente rilevante, ha fatto diminuire l'attuabilità di 18,5% (A2780) ed il 9,6% (CP70) solo. La stessa tendenza di maggiore effetto di KYF-Pt-NE sulla morte delle cellule è stata osservata in altre linee cellulari pure. La vitalità delle cellule TOV - 21G sensibile PT è stato ridotto da 55,9% dopo incubazione con KYF-Pt-NE, mentre carboplatino ha provocato abbassando la vitalità di soli 16,5%. In cellule di OV-90 con la resistenza intermedia PT, la redditività è stata abbassata di 55,3% (KYF-Pt-NE) e del 23,9% (carboplatino). Due linee cellulari di cancro resistenti, ES-2 e SKOV-3, hanno mostrato riduzione nell'attuabilità del 45,9% e del 54,3%, rispettivamente, per KYF-Pt-NE e 10,3% (ES-2) e del 16,8% (SKOV-3) per carboplatino.

L'attività biologica di KYF-Pt-NE contro cisplatino è stato confrontato anche. Il cisplatino è l'agente basato su Pt II di prima generazione che non è favorita in clinica a causa della sua tossicità profilo51. In due linee cellulari, SKOV-3 e TOV - 21G, la riduzione di vitalità era maggiore del 15% e 40%, rispettivamente, per KYF-Pt-NE rispetto per cisplatino. Nelle rimanenti linee cellulari, l'attività di KYF-Pt-NE era paragonabile al cisplatino (A2780, CP70, OV-90), o leggermente inferiore (ES-2). Il coniugato di oleico acids-Pt(II) inoltre è stato trovato per essere biologicamente attivi. Tuttavia, KYF-Pt-NE hanno mostrato riduzione maggiore redditività rispetto il coniugato nella maggioranza delle linee cellulari testati, che indica il significato di nanoformulation nell'attività di PT.

Le applicazioni biologiche di nanoparticolato sistemi richiedono stabilità nei media biologicamente rilevanti, così la stabilità di KYF-Pt-NE è stata valutata in 20% siero bovino fetale (FBS) e i risultati sono presentati in Figura 4. Abbiamo non rilevato alcuna evidenza di opsonizzazione KYF-Pt-NE nel siero dopo un giorno di incubazione.

Figure 1
Figura 1. I componenti del nanoemulsioni (in alto) e schema della preparazione Nanoemulsione (in basso). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Immagine TEM di KYF-Pt-NE (A) e immagini al microscopio confocale dell'assorbimento di FITC-KYF-Pt-NE (verde) di cellule tumorali ovariche (nuclei sono blu e i lisosomi sono di colore rossi) (B). Barre della scala sono 10 μm. Questa figura è stata adattata con il permesso di Bioconjugate chimica 2018, 29, 2514-2519. 46 copyright 2018 American Chemical Society. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Stabilità di KYF-Pt-NE e FITC-KYF-Pt-NE in acqua. Ogni punto rappresenta la media e la deviazione standard di N = 3 e p <0,005. Questa figura è stata adattata con il permesso di Bioconjugate chimica 2018, 29, 2514-2519. 46 copyright 2018 American Chemical Society. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4. Stabilità di KYF-Pt-NE e l'attività biologica. PT (A) rilasciare da KYF-Pt-NE in tampone PBS alle diverse pHs (PBS, 37 ° C). Vitalità cellulare di linee cellulari differenti del cancro ovarico dopo 72 h di incubazione con KYF-Pt-NE (B). Ogni colonna rappresenta la media e la deviazione standard di N = 3 e p <0,005. Le concentrazioni sono costanti in ogni linea cellulare e sono come segue: 4,92 mM (A2780), 8.80 mM (CP70), 2,46 mM (TOV - 21G), 9,84 mM (SKOV3), mM 7,38 (ES-2), 19.7 mM (OV-90). La concentrazione di KYF-Pt-NE e oleico acids–Pt(II) coniugato era regolata rispetto al contenuto di PT misurato di AAS. Abbreviazioni: "Carbpt" – carboplatino; "KYF-NE" – KYF Nanoemulsione tripeptide-rivestito; "KYF-Pt-NE" – KYF rivestite con tripeptide Nanoemulsione contenente PT; Pierocarletti – cisplatino; PT-oleico-oleico acids–Pt(II) coniugato. (C) stabilità di KYF-Pt-NE nel siero. Questa figura è stata adattata con il permesso di Bioconjugate chimica 2018, 29, 2514-2519. 46 copyright 2018 American Chemical Society. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Fasi critiche nella sintesi Nanoemulsione includono il rapporto molare dei substrati di regolazione, mantenendo il controllo di tasso di flusso e temperatura durante l'aggiunta di acido oleico acids–Pt(II), fornire tempo sufficiente per l'auto-assemblaggio e purificare il prodotto utilizzando un colonna di concentratore centrifugo. Questi parametri influenzano le dimensioni e la morfologia di KYF-Pt-NE; Pertanto, è particolarmente importante mantenere il corretto rapporto molare e regolare correttamente le condizioni sintetiche.

Il rapporto dei substrati durante la sintesi Nanoemulsione (passaggio 3) è cruciale per l'auto-assemblaggio processo e determina le dimensioni finali del prodotto. KYF al rapporto molare acido oleico acid-Pt(II) è 1:3, e la concentrazione ottimale del tripepide KYF in acqua è di 0,2 mM. Inoltre, il solvente organico utilizzato per sciogliere il coniugato acido oleico acid-Pt(II) al punto 3.1 deve essere miscibile con acqua, compatibile con il sistema di filtrazione ed evaporativo facilmente a temperatura ambiente.

Una delle fasi critiche è l'aggiunta goccia a goccia del coniugato acido oleico acid-Pt(II) alla soluzione di KYF (punto 3.4). Il flusso non dovrebbe essere più lento rispetto a 0,1 mL/min e non più veloce di 0,2 mL/min, perché una velocità sub-ottima può indurre la precipitazione della Nanoemulsione. Anche, il coniugato di oleico acids–Pt(II) deve essere aggiunto alla soluzione di KYF a 37 ° C, mescolando il composto su un piatto di mescolare a 600 giri/min. Dopo aver aggiunto tutti i acid-Pt(II) di acido oleico, la soluzione dovrebbe essere tenuta a temperatura ambiente e della velocità dell'agitatore ridotto a 150 giri/min. Passo 3.5 deve essere effettuata a temperatura ambiente. Il momento ottimale per l'auto-assemblaggio di KYF-Pt-NE (passo 3.5) è 24 ore.

C'è il rischio che il prodotto può precipitare mentre la Nanoemulsione è pre-concentrazione. Pertanto, è consigliabile che la Nanoemulsione essere diluito con acqua supplementare prima di essere centrifugati in un concentratore centrifugo e filata non più veloce di 2.465 x g. Le nanoemulsioni diluito devono essere aggiunto al concentratore centrifugo alle aliquote tra spin e la Nanoemulsione deve essere miscelati nel filtro prima che la parte successiva è aggiunto.

La capacità di forma nanoemulsioni con derivati di acidi grassi diversi da acido oleico non è stata testata e deve ancora essere determinato. Future applicazioni possono includere l'uso di diversi peptidi per facilitare co-l'assemblaggio con acido oleico. Inoltre, l'acido oleico coniugati con farmaci a base di platino possono essere utilizzati come potenziali nuclei di nanoemulsioni.

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Disclosures

Gli autori non hanno un conflitto di interessi di divulgare.

Acknowledgments

Noi riconosciamo con gratitudine il sostegno finanziario dal National Cancer Institute, concedere SC2CA206194. Concorrenti interessi finanziari non vengono dichiarati.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
tetrafluoroborate (TBTU)		 ANASPEC INC.: AS-20376 SPPS
4-well chamber confocal dish Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific 154526 For imaging
6-bromohexanoic acid Chem-Impex INT’L INC. 24477 Click modification for peptide
A2780 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Barnstead Nanopure Thermo Fisher D11901 water filtration system
BUCHI rotavapor R-3 Buchi Z568090 For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811F For platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% Acros Organics 19376-0050 in vitro tests
CP70 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Digital water bath VWR 97025-134 For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS) Brookhaven Instrument Corporation For nanoparticle size measurments
ES-2 ATCC CRL-1978 ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% Chem-Impex INT’L INC. 00493 SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), Chem-Impex INT’L INC. 01914 SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% Alfa Aesar H59730 SPPS
HERACELL 150i CO2 incubator Thermo Scientific Fisher incubator
High pressure syringe pump New Era 1010-US For platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrer VWR 12365-382 For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) Santa Cruz Biotechnology sc-18821 AF647 For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Oakwood Chemical 005027 SPPS
Ninhydrin 99% Alfa Aesar A10409 Kaiser test
Oleic acid Chem-Impex INT’L INC. 01421 For platinum complex synthesis
OV90 ATCC CRL-11732 Ovarian cancer cell line
PBS Corning 21-031-CV For cell wash
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-100 For imaging
Phenol Fisher Chemical A92500 Kaiser test
Phosphotungstic acid Fisher Chemical A248-25 negative stain for TEM
Piperidine 99% BTC 219260-2.5L SPPS
Platinum AAS standard soultion Alfa Aesar 88086 1000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97% Alfa Aesar L10595 For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinet Thermo Scientific Fisher 1385 Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum System Welch 2028 Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrate Acros Organics 19768-0250 Cisplatin activation
SKOV3 ATCC HTB-77 Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxide Fisher Scientific S313-1 For platinum complex synthesis
Tin (II) chloride Sigma Aldrich 208256 Test for Platinum presence
TOV21G ATCC CRL-11730 Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) Alfa Aesar L06374 SPPS
Triisopropylsilane (TIPS) Chem-Impex INT’L INC. 01966 SPPS
Triton-X Sigma Aldrich T8787-100ML For imaging
Uranine powder 40% Fisher Scientific S25328A For alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO) Sartorious VS2001 For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted Microscope VWR 89404-462 For cell culture monitoring

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