Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

En tripeptid-stabiliserad Nanoemulsion oljesyra

Published: February 27, 2019 doi: 10.3791/59034
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 4,5,6, 1,2,3
1Department of Chemistry, Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women's Health Research Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research, Western Connecticut Health Network

Summary

Det här protokollet beskriver en effektiv metod för att syntetisera en nanoemulsion av en oljesyra acids-platinum(II) konjugat stabiliserad med en lysin-tyrosin-fenylalanin (KYF) tripeptid. De nanoemulsion formerna under milda syntetiska förhållanden via självmontering av KYF och konjugat.

Abstract

Vi beskriver en metod för att producera en nanoemulsion som består av en oljesyra acids-Pt(II) kärna och en lysin-tyrosin-fenylalanin (KYF) beläggning (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE kapslar in Pt(II) på 10 WT %, har en diameter på 107 ± 27 nm och en negativ ytladdning. KYF-Pt-NE är stabil i vattnet och i serum, och är biologiskt aktiva. Konjugationen av en fluorophore till KYF tillåter syntesen av en fluorescerande nanoemulsion som är lämplig för biologiska imaging. Syntesen av nanoemulsion utförs i en vattenlösning miljö och formulären KYF-Pt-NE via självmontering av en kort KYF-peptid och en oljesyra acids-platinum(II) konjugat. Den självmontering process beror på temperaturen av lösningen, molar förhållandet av substratesna, och flödet av substrat tillägg. Avgörande steg omfattar att upprätthålla optimal omrörningshastigheten under syntesen, tillåter tillräckligt med tid för självmontering och pre koncentrera nanoemulsion gradvis i en centrifugal koncentrator.

Introduction

Under de senaste åren har det funnits ett växande intresse för konstruktion av nanopartiklar för biomedicinska tillämpningar som drogen leverans och bioimaging1,2,3,4. Multifunktionellt Nanopartikel-baserade system kräver ofta innehåller flera komponenter inom en formulering. De byggstenar som är baserade på lipider eller polymerer ofta skiljer sig vad gäller deras fysikalisk-kemiska egenskaper samt deras biokompatibilitet och nedbrytbarhet, som i slutändan kan påverka funktionen av nanostruktur1, 5,6. Biologiskt material, till exempel proteiner och peptider, har länge setts som lovande komponenter av multifunktionella nanostrukturer på grund av deras sekvens flexibilitet7,8. Peptider själv montera in mycket beställda Supramolekylär arkitekturer bildar spiralformade band9,10, fibrösa ställningar11,12och många fler, därigenom bereda vägen till byggnad Biomolecule-baserade hybrid nanostrukturer med en bottom-up strategi13.

Peptider har undersökts för tillämpningar inom medicin och bioteknik, särskilt för cancer behandling14 och hjärt-kärlsjukdomar15 samt när det gäller antibiotika utveckling16,17, metabola störningar18, och infektioner19. Det finns över hundra av små-peptide therapeutics genomgår kliniska prövningar20. Peptider är lätt att ändra och snabb att syntetisera till låg kostnad. De är dessutom biologiskt nedbrytbara, vilket avsevärt underlättar deras biologiska och farmaceutiska tillämpningar21,22. Användning av peptider som strukturella komponenter omfattar konstruktion av lyhörd, peptid-baserad nanopartiklar och hydrogel depåer för kontrollerad frisättning23,24,25,26 , 27, peptid-baserad biosensorer28,29,30,31eller bio-elektroniska enheter32,33,34. Ännu viktigare, även korta peptider med två eller tre aminosyror restprodukter som innehåller fenylalanin konstaterades för att vägleda den självmontering bearbetar35,36,37 och skapa stabila emulsioner38 .

Platinabaserade läkemedel, på grund av sin höga effekt, används i många cancer behandlingsregimer, både ensamt och i kombination med andra agenter39,40. Platina föreningar inducerar DNA-skador genom att bilda monoadducts och intrastrand eller interstrand tvärbindningar. Pt-DNA lesioner är erkända av det cellulära maskineriet och, om inte repareras, leda till cellulära apoptos. Den viktigaste mekanismen, som Pt(II) bidrar till cancer celldöd, är hämning av DNA transkription41,42. Fördelarna med platina behandling minskas dock av systemisk toxicitet av Pt(II) som utlöser svåra biverkningar. Detta leder till lägre klinisk dosering av Pt(II)43, vilket ofta resulterar i sub terapeutiska koncentrationer av platina att nå DNA. Som en följd bidrar av DNA-reparation som följer till cancer cellöverlevnad och förvärva Pt(II) motstånd. Platina kemo-motståndet är ett stort problem i cancer behandling och den främsta orsaken till behandling misslyckande44,45.

Vi har utvecklat en stabil nanosystem som kapslar in Pt(II) agenten för att ge en skyddande effekt i systemcirkulationen och minska biverkningar Pt II-inducerad. Systemet bygger på en oljesyra acids-Pt(II) kärna stabiliserad med en KYF-tripeptid att bilda en nanoemulsion (KYF-Pt-NE)46. Byggstenarna i KYF-Pt-NE, aminosyrorna tripeptid samt oljesyrehalt, har i allmänhet som säkra ”(GRAS) status med Food and Drug Administration (FDA). KYF-Pt-NE är beredd med hjälp av en nanoprecipitation metod47. Kort sagt, oljesyra acids-Pt(II) konjugatet löses i ett organiskt lösningsmedel och sedan droppvis till en KYF vattenlösning (figur 1) vid 37 ° C. Lösningen rörs i flera timmar för att tillåta självmontering av den KYF-Pt-NE. Nanoemulsion är koncentrerade till 10 kDa centrifugal koncentratorer och sköljas tre gånger med vatten. Kemisk modifiering av KYF med en fluorophore tillåter syntesen av fluorescerande FITC-KYF-Pt-NE lämplig för biomedicinsk avbildning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Sammanfattning av oljesyra Acids–Platinum(II) konjugatet

  1. Aktivering av cisplatin
    1. Upphäva 50 mg (0.167 mmol) av cisplatin i 4 mL vatten (t.ex. nanopure) vid 60 ° C.
    2. Tillsätt droppvis 55,2 mg (0.325 mmol) AgNO3 i 0,5 mL vatten till lösningen av cisplatin och rör reaktionen för minst 2 h vid 60 ° C. En vit fällning av Granulatfyllda bildar som visar förloppet för reaktionen.
    3. För att avgöra om aktiveringen reaktionen är klar, genomföra testet med 10% HCl för förekomst av gratis Ag+ ion i lösning. Testet bör vara negativa (ingen ytterligare Granulatfyllda fällningen bör bilda).
    4. Centrifugera reaktionsblandningen vid 3 220 x g i 10 minuter och ta bort vita fällningen av Granulatfyllda.
    5. Samla in supernatanten och filtrera den via ett 0,2 mm spruta filter. Testa supernatanten för förekomst av platina genom att använda 2-3 droppar av lösningen via Pasteur-pipett SnCl2 kristaller. Testet är positivt om färgen på koordinaten komplex av tenn med platina är mörkt gul/orange.
    6. Använda supernatanten med aktiverat Pt(II) för det andra steget.
  2. Reaktion av oljesyra med aktiverad Pt(II)
    1. Avbryta 94,2 mg oljesyra (0.333 mmol) i 3 mL vatten vid 60 ° C.
    2. Tillsätt 13,3 mg (0.333 mmol) av NaOH i 1 mL vatten och blanda med lösningen av aktiverade Pt(II) från steg 1,1
    3. Rör reaktionen för 2 h vid 60 ° C och därefter i rumstemperatur över natten. Den rå produkten är en fet brun/gul fällning.
    4. Centrifugera reaktionsblandningen vid 3 220 x g i 10 min och avlägsna supernatanten. Torka den rå produkten vid 25 ° C med en roterande indunstare. Rena produkten genom flera tvättar med acetonitril. Den slutliga färgen av ren oljesyra acids–Pt(II) konjugat är ljusgul.

2. Sammanfattning av KYF-Pt-NE och FITC-märkt Nanoemulsion FITC-KYF-Pt-NE

  1. Syntesen av de KYF-tripeptid och den fluorescently märkt tripeptid FITC-KYF
    1. Syntetisera den KYF använder standard solid-state peptid kemi. Använd följande standard koppling villkor för att fästa varje aminosyra: Wang harts (2,19 mmol), Fmoc skyddade aminosyra (4,38 mmol), 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium tetrafluoroborat (TBTU) (4,38 mmol) och diisopropylethylamine (DIPEA) (8.76 mmol). Lös upp aminosyrorna med TBTU i dimetylformamid (DMF) och DIPEA.
    2. Blötlägg 5,7 g Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alkohol harts (0,382 mekv/g) i 25 mL DMF för 1 h före användning.
    3. Deprotect amine gruppen av aminosyran L-fenylalanin med 15 mL 20% Piperidin/DMF lösning för 5 min, kassera lösningsmedlet och upprepa tvätten med 20 min cykel.
    4. Tvätta kådan för 1 min med följande lösningsmedel: DMF, isopropylalkohol (IPA), DMF, IPA, DMF, IPA, DMF, DMF. Kassera lösningsmedlet efter varje tvätt.
    5. Utför det Kaiser testet för att fastställa förekomsten av gratis NH2 grupp på kådan (se delsteg) och om positiv (harts utsädet är lila), lägga till Fmoc-L-tyrosin aminosyran och utföra kopplingen över natten.
      1. Förbereda Kaiser testlösningar i separata burkar.
      2. Lös upp 5 g av ninhydrin i 100 mL etanol.
      3. Lös upp 80 g av fenol i 20 mL etanol.
      4. Blanda 2 mL av 0,001 M vattenlösning av kaliumcyanid med
        98 mL pyridin.
      5. Lägg 2-3 droppar av varje Kaiser testa lösningar till prov och värm i kokande vatten i 5 min.
    6. Vid framgångsrik koppling av andra aminosyra, utföra testet Kaiser och om negativa fortsätter med deprotection protokoll (steg 2.1.3 till 2.1.5). Upprepa processen med Fmoc-fenylalanin aminosyran.
      1. Vid koppling av alla aminosyror, tvätta kådan för 1 min med 5 mL DMF, IPA, DMF, metanol, diklormetan och dietyleter, efter varje tvätt kassera lösningsmedlet. Spara kådan för vidare bearbetning.
      2. Använd hälften av kådan för nästa steg (2.1.7-2.1.9) för att ändra peptiden med FITC. För att erhålla omodifierade KYF-tripeptid, följ proceduren börjar på 2.1.10.
    7. Ändra den N-terminala aminosyran av KYF KYF-N3 med 6-azidohexanoic syra. I detta syfte blanda 1 g (0,382 mmol) KYF Wang harts och 120,1 mg (0.764 mmol) 6-azidohexanoic syra med 245,2 mg (0.764 mmol) av TBTU och 197,1 mg (1.528 mmol) DIPEA i 30 mL DMF. Rör om reaktionen över natten i rumstemperatur.
    8. Skaffa den KYF-FITC från syntesen av KYF-N3 med propargyl fluorescein via ett klick reaktion. I detta syfte blanda 253 mg (0,097 mmol) av KYF-N3 Wang harts med 3.78 mg (0,019 mmol) av CuI solid, 71,9 mg (0.193 mmol) av propargyl fluorescein och 2,24 mg (0,017 mmol) DIPEA. Reaktionen bör ändra färg från grönt till brunt.
    9. Efter 24 h, tvätta kådan för 1 min växelvis med 5 mL DMF och IPA fem gånger, metanol och vatten tre gånger, DMF och vatten tre gånger, och med diklormetan och dietyleter trefalt. Kassera lösningsmedlet efter varje tvätt.
    10. Klyva den KYF-FITC eller KYF peptid från kådan med en lösning av trifluorättiksyra (TFA) / triisopropylsilane (TIPS) h2O på förhållandet mellan 95/2.5/2.5 över 3 timmar.
    11. Fällningen rå peptiden i en kall dietyleter, tvätta tre gånger med kallt eter, och sedan låta torka under vakuum.
  2. Syntesen av FITC-KYF-stabiliserad nanoemulsion med Pt(II) (FITC-KYF-Pt-NE) och KYF-Pt-NE
    1. Lös 10 mg (0.0126 mmol) av oljesyra acids–Pt(II) konjugat i 1,5 mL isopropanol och plats i en 5 mL spruta.
    2. Placera sprutan med oljesyra acids–Pt(II) konjugat i en sprutpumpen och flödet att 0,1 mL/min.
    3. För att syntetisera de FITC-KYF-Pt-NE, lös 1 mg (0.00105 mmol) av FITC-KYF och 1 mg (0.00219 mmol) KYF (1:2 molar förhållandet av FITC-KYF:KYF) i 20 mL vatten och justera temperaturen av lösningen på 37 ° C. Täcka väggarna i behållaren med aluminiumfolie att undvika fotoblekning av FITC fluorophore. För att syntetisera KYF-Pt-NE, lös 2 mg (0.0044 mmol) av KYF-tripeptid i 20 mL vatten och justera temperaturen av lösningen på 37 ° C.
    4. Lägg till oljesyra acids–Pt(II) konjugatet droppvis till lösningen av FITC-KYF/KYF eller KYF-tripeptid. Utför det här steget under huven.
    5. Rör om lösningen över natten i rumstemperatur att avdunsta organiska lösningsmedel och låta den självmontering av FITC-KYF-Pt-NE eller KYF-Pt-NE.
    6. Koncentrat av FITC-KYF-Pt-NE eller KYF-Pt-NE i en centrifugal koncentrator (10k MWCO), och tvätta tre gånger med 4 mL nanopure vattnet.
    7. Lagra vattenlösningar av KYF-Pt-NE och FITC-KYF-Pt-NE vid 4 ° C.
    8. Analysera för platina innehåll med atomabsorption spektroskopi (AAS), efter tillverkarens guide48.
      1. Förbereda platina standarder i 10% HCl-lösning för kalibreringskurvan (effektiva intervallet för AAS ligger mellan 100 till 1200 ppb (ppb)).
      2. Lös 50 µL KYF-Pt-NE lösning från steg 2.2 i 100 µL av kungsvatten (en blandning 3:1 av koncentrerad saltsyra och salpetersyra) och lämna i rumstemperatur över natten. Tillsätt 850 µL av vatten för att nå ett slutligt provtagningsvolym om 1 mL. Analysera provet använda AAS. Slutliga syra koncentration bör vara 10% i alla analyserade prover.
      3. Spela in läsningen av Pt koncentration i ppb, och beräkna det slutliga platina innehållet i provet (konto för provspädning och Ursprunglig volym av nanoemulsion).

3. confocal avbildning av cellulära upptaget av FITC-KYF-Pt-NE

  1. Utsäde 6 ovariell cancer cellinjer (A2780, CP70, SKOV3, OV90, TOV21G och ES2), in 4 väl-kammare confocal rätter på tätheten av 4,7 x 104 celler per kammare och pre kultur över natten vid 37 ° C.
  2. Efter 24 h, tvätta cellerna trefalt med fosfat buffert saltlösning (PBS) och inkubera med FITC-KYF-Pt-NE i cellodlingsmedium (se steg 6.1 för cell linje specifika detaljer) under 15 minuter vid 37 ° C.
  3. Ta bort mediet efter inkuberingen och tvätta cellerna tre gånger med PBS.
  4. Fixa cellerna med kall metanol för 5 min vid-20 ° C och tvätta tre gånger med 1 mL PBS.
  5. Permeabilize cellerna med 1 mL 0,1% Triton-X för 10 min vid rumstemperatur och tvätta tre gånger med 1 mL PBS.
  6. Inkubera cellerna för 90 min med LAMP1 antikropp konjugerat med Alexa Fluor 647 (1 mL) i 1:50 utspädning i PBS vid rumstemperatur. Nästa, tvätta cellerna 3 gånger med PBS.
  7. Späd DAPI stamlösning (1 mg/mL) 1 mg/ml i PBS. Sedan lägga till 1 mL av den utspädda lösningen i varje kammare och inkubera i 15 min i rumstemperatur. Tvätta cellerna 3 gånger med PBS.
  8. Montera coverslips på en bild genom att använda monteringsmedium.
  9. Bild cellerna genom levande cell confocal Mikroskop vid excitation våglängd på 405 nm, 488 nm och 633 nm. Ange parametrarna upptäckt som följer: lasereffekt från 0,2% och inte mer än 1%, Pinole 1 luftiga enhet, få master 650-750, Digital offset 0.
  10. Öppna bild i bildprogram. Under bilden, Välj grafik och välj Infoga skalstapeln, infoga skalstapeln till bilden.

4. läkemedel Release studier

  1. Genomföra drog release studierna i PBS. Justera pH-värdena av tre PBS buffertar till 7,4, 6,8 och 5,0 respektive.
  2. Späd 5 μL av KYF-Pt-NE i 180 μL av lämpligt pH PBS-bufferten, överföra till 3,5 kDa MWCO mini dialys cup och inkubera vid 37 ° C i PBS.
  3. Ta bort buffert från varje tre mini dialys rör på 2, 4, 6, 24, 48 och 140 h och mätning av platina koncentrationerna av AAS. Förbereda alla prover enligt steg 2.2.8 men anpassa den slutliga volymen av provet till 500 µL.

5. cell kultur metoder

  1. Kultur cell linjer A2780, CP70, SKOV-3, OV-90, TOV - 21G, ES-2 i cellodlingsmedium (DMEM) kompletteras med 10% (A2780, CP70, SKOV-3, ES-2) eller med 15% (TOV - 21G, OV-90) fetalt bovint serum (FBS), med L-glutamin och penicillin/streptomycin. Växer alla celler i en 5% CO2, vatten mättad atmosfär vid 37 ° C.
  2. Seed 3 x 105 celler i varje plattan med 96 brunnar och före kultur över natten för in vitro-inkubering experiment. Förbereda de KYF-Pt-NE, cisplatin och karboplatin lösningarna i vatten. Justera koncentrationen av Pt(II) i KYF-Pt-NE att matcha koncentrationen av karboplatin och cisplatin för varje cellinje. Inkubera i 72 timmar vid 37 ° C.
  3. Efter inkubation, utvärdera cellulära lönsamhet med en kolorimetrisk test (MTT cellproliferation analysen). Kort, ta bort medium och tillsätt 110 μl 10% MTT i medium till varje väl och inkubera i 2 timmar vid 37 ° C. Tillsätt 100 μL tvättmedel till varje brunn sedan och inkubera i 5 h vid 37 ° C.
  4. Kontrollera absorbansen vid 570 nm med hjälp av Plattläsare. Analysera resultatet med hjälp av statistisk analys med Z-test och P-test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representant TEM bild av KYF-Pt-NE tillagade detta protokoll visas i figur 2A. KYF-Pt-NEs är sfäriska i morfologi, väl spridda, och enhetliga i storlek. KYF-Pt-NEs, mätt direkt från tre TEM bilder med ett minimum av 200 mätningar göras, core diameter är 107 ± 27 nm. KYF-Pt-NE, analyseras med dynamisk ljus spektroskopi (DLS), hydrodynamisk diameter befanns vara 240 nm med en polydispertion index på 0,156. Zeta potential för KYF-Pt-NE i vatten bestämdes för tre oberoende synteser med det genomsnittliga värdet av-60.1 mV. Hög omfattning potential indikerar god kolloidal stabilitet av formuleringen och den negativa ytladdning tillskrivs joniserat COO– yta grupper av oljesyra syror. Den isoelektriska punkt av KYF är 8,59, och därför är det positivt laddade vid neutralt pH.

Nanoemulsions förmåga att korsa membranet cellulär undersöktes med hjälp av de fluorescently märkt FITC-KYF-Pt-NE och ovarial cancer cellinjer. Resultaten presenteras i figur 2B. Det kan tydligt ses att FITC-KYF-Pt-NEs (grön) fördelas inom cytosolen men ännu inte var associerade med lysosomer (röd). Detta resultat visar att KYF-Pt-NEs komma in i cellerna och kan fungera som intracellulära drog leveransfordon.

Stabilitet KYF-Pt-NEs och FITC-KYF-Pt-NEs bedömdes med DLS. Diametern på nanoemulsions i vatten mättes under flera månader och resultaten presenteras i figur 3. Båda formuleringarna hydrodynamiska diameter långsamt ökas under 4 månader i lagring, till 320 nm (KYF-Pt-NE) och 240 nm (FITC-KYF-Pt-NE), men nanoskala dimensionerna bevarades. Detta resultat tyder på att den KYF-tripeptid effektivt stabiliserar nanoemulsions över långa tidsperioder.

Pt(II) inkapsling effektivitet och utsläpp från nanoemulsion mättes med AAS. Koncentrationen av Pt(II) i KYF-Pt-NE inrättades för att vara 10 wt.%. Pt(II) släppa från KYF-Pt-NE vid pH 7,4 (fysiologiska), 6,8 (tumörens interstitium)49och 5.0 (endosomal)50 presenteras i figur 4A. Pt(II) frigörs den långsammaste vid pH 7,4 med bara 20,8% av Pt(II) släppt efter 4 h, medan vid pH 6,8 och 5.0 release var 32,8% av och 47,5%, respektive. Samma utveckling fortsatte efter 24 h och efter 6 dagar. Detta resultat visar att Pt(II) release från KYF-Pt-NE är pH-beroende, och det kan vara fördröjd i den systemiska cirkulationen och accelererade när nanoemulsions translocate till tumör.

Den biologiska aktiviteten av KYF-Pt-NE var etablerat in vitro-använder samma ovariell cancer cell linjer liksom de imaging studierna. Cellerna inkuberades med KYF-Pt-NE för 72 h, vid KYF-Pt-NE koncentrationer motsvarande IC50 för varje cellinje. Lönsamhet bedömdes med hjälp av MTT analysen och resultaten jämfördes med enbart celler, KYF-NE, oljesyra acids-Pt(II) konjugat, karboplatin och cisplatin. Resultaten för biologisk aktivitet av KYF-Pt-NE visas i figur 4B. KYF-Pt-NE reducerade livskraft syngena cellinjer A2780 (Pt känslig) och CP70 (Pt resistent) 44,3% och 46,2% respektive. Karboplatin, det kliniskt relevanta analogt, minskade lönsamheten med 18,5% (A2780) och 9,6% (CP70) endast. Samma trend av större KYF-Pt-NE effekt på celldöd observerades över andra cell-linjer samt. Pt(II) känsliga TOV - 21G celler lönsamhet minskade med 55,9% efter inkubation med KYF-Pt-NE, karboplatin resulterade i att sänka livskraften genom bara 16,5%. OV-90-celler med mellanliggande Pt(II) motstånd sänktes livskraft med 55,3% (KYF-Pt-NE) och 23,9% (karboplatin). De två resistenta cancer cellinjer, ES-2 och SKOV-3, visade minskning lönsamhet med 45,9% respektive 54,3%, respektive, för KYF-Pt-NE, och 10,3% (ES-2) och 16,8% (SKOV-3) för karboplatin.

Den biologiska aktiviteten av KYF-Pt-NE jämfört med cisplatin jämfördes också. Cisplatin är Pt II-baserade agent av första generationen som inte längre gynnas i kliniken på grund av dess toxicitet profil51. I två cellinjer, SKOV-3 och TOV - 21G, var livskraft minskningen större med 15% och 40%, respektive, för KYF-Pt-NE än cisplatin. I de återstående cellinjer, aktiviteten av KYF-Pt-NE var jämförbar med cisplatin (A2780, CP70, OV-90), eller lägre något (ES-2). Oljesyra acids-Pt(II) konjugatet konstaterades också vara biologiskt aktiva. Dock visade KYF-Pt-NE högre minskning livskraft än konjugatet i majoriteten av de cellinjer som testas, som visar betydelsen av nanoformulation i Pt(II) verksamhet.

De biologiska tillämpningarna av nanoparticulate system kräver stabilitet i biologiskt relevanta medier, således stabilitet KYF-Pt-NE utvärderades i 20% fetalt bovint serum (FBS) och resultaten presenteras i figur 4 c. Vi upptäckte inga KYF-Pt-NE opsonization i serum efter en dag av inkubation.

Figure 1
Figur 1. Komponenterna i den nanoemulsions (överst) och Schematisk bild av nanoemulsion beredning (nederst). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. TEM bild av KYF-Pt-NE (A) och confocal mikroskopbilder av FITC-KYF-Pt-NE (grön) upptag av äggstockscancer celler (kärnorna är blå och lysosomer är röda) (B). Skala barer är 10 μm. Denna siffra har anpassats med tillstånd från Konjugationens kemi 2018, 29, 2514-2519. 46 upphovsrätt 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Stabilitet KYF-Pt-NE och FITC-KYF-Pt-NE i vatten. Varje punkt representerar medelvärdet och standardavvikelsen för N = 3 och p <0,005. Denna siffra har anpassats med tillstånd från Konjugationens kemi 2018, 29, 2514-2519. 46 upphovsrätt 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. KYF-Pt-NE stabilitet och biologiska aktivitet. (A) Pt(II) release från KYF-Pt-NE i PBS-bufferten på olika pHs (PBS, 37 ° C). Cellulära lönsamhet av olika ovariell cancer cellinjer efter 72 h inkubation med KYF-Pt-NE (B). Varje kolumn representerar medelvärdet och standardavvikelsen för N = 3 och p <0,005. Koncentrationerna är konstant i varje cell fodrar och är som följer: 4.92 mM (A2780), 8,80 mM (CP70), 2.46 mM (TOV - 21G), 9.84 mM (SKOV3), 7.38 mM (ES-2), 19,7 mM (OV-90). Koncentrationen av KYF-Pt-NE och oljesyra acids–Pt(II) konjugat justerades med avseende på Pt(II) innehåll mätt med AAS. Förkortningar: ”Carbpt” – karboplatin; ”KYF-NE” – KYF tripeptid-belagd nanoemulsion; ”KYF-Pt-NE” – KYF tripeptid-belagd nanoemulsion som innehåller Pt(II); Cispt – cisplatin. PT-oljesyra – oljesyra acids–Pt(II) konjugat. (C) KYF-Pt-NE stabilitet i serum. Denna siffra har anpassats med tillstånd från Konjugationens kemi 2018, 29, 2514-2519. 46 upphovsrätt 2018 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiska steg i nanoemulsion syntesen inkluderar justera molar förhållandet av substratesna, bibehållen temperatur och flöde klassar kontroll under oljesyra acids–Pt(II) tillägg, som ger tillräckligt med tid för självmontering och rening av produkten med en centrifugal koncentrator kolumn. Dessa parametrar påverkar storlek och morfologi av KYF-Pt-NE; Det är alltså särskilt viktigt att upprätthålla korrekt molar förhållandet och justera de syntetiska villkor korrekt.

Förhållandet mellan substratesna under nanoemulsion syntesen (steg 3) är avgörande för den självmontering process och avgör den slutliga storleken av produkten. KYF till oljesyra acid-Pt(II) molar förhållandet är 1:3, och den optimala koncentrationen av den KYF tripepide i vatten är 0,2 mM. Organiska lösningsmedel används att upplösa oljesyra acid-Pt(II) konjugatet i steg 3.1 har dessutom vara blandbart med vatten, kompatibel med filtreringssystem, och genom avdunstning enkelt vid rumstemperatur.

En av de kritiska steg är droppvis tillägg av oljesyra acid-Pt(II) konjugatet till KYF lösningen (steg 3,4). Flödet bör inte vara långsammare än 0,1 mL/min och inte snabbare än 0,2 mL/min, eftersom en optimal hastighet kan föranleda utfällning av nanoemulsion. Oljesyra acids–Pt(II) konjugatet bör också läggas till KYF lösningen vid 37 ° C under omrörning blandningen på en uppståndelse tallrik vid 600 rpm. När alla de oljesyra acid-Pt(II) har lagts till, bör lösningen förvaras vid rumstemperatur och omrörning hastigheten minskas till 150 rpm. Steg 3.5 bör utföras vid rumstemperatur. Den optimala tiden för den självmontering av KYF-Pt-NE (steg 3.5) är 24 timmar.

I området i närheten finns det en risk för att produkten kan utlösa medan nanoemulsion är koncentreras pre. Det rekommenderas därför att nanoemulsion vara utspädd med extra vatten innan att vara centrifugeras i en centrifugal koncentrator och snurrade inte snabbare än 2 465 x g. Den utspädda nanoemulsions bör läggas till centrifugal koncentratorn på alikvoter mellan spins, och nanoemulsion ska blandas i filtret innan nästa portion läggs.

Förmågan att bilda nanoemulsions med fettsyror derivat än oljesyra har inte testats och är ännu skall fastställas. Framtida tillämpningar kan omfatta användning av olika peptider för att underlätta den gemensamma församlingen med oljesyra. Oljesyra konjugat med icke-platinum-baserade läkemedel kan också användas som potentiella kärnar ur av nanoemulsions.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inte en intressekonflikt att avslöja.

Acknowledgments

Vi tacksamt erkänna finansiellt stöd från National Cancer Institute, bevilja SC2CA206194. Inga konkurrerande finansiella intressen deklareras.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium
tetrafluoroborate (TBTU)		 ANASPEC INC.: AS-20376 SPPS
4-well chamber confocal dish Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific 154526 For imaging
6-bromohexanoic acid Chem-Impex INT’L INC. 24477 Click modification for peptide
A2780 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Barnstead Nanopure Thermo Fisher D11901 water filtration system
BUCHI rotavapor R-3 Buchi Z568090 For solvent removal and sample drying
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811F For platinum complex separation
Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% Acros Organics 19376-0050 in vitro tests
CP70 Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital Ovarian cancer cell line
Digital water bath VWR 97025-134 For warming up media for cell culture
Dynamic Light Scattering (DLS) Brookhaven Instrument Corporation For nanoparticle size measurments
ES-2 ATCC CRL-1978 ovarian cancer cell line
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% Chem-Impex INT’L INC. 00493 SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), Chem-Impex INT’L INC. 01914 SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% Alfa Aesar H59730 SPPS
HERACELL 150i CO2 incubator Thermo Scientific Fisher incubator
High pressure syringe pump New Era 1010-US For platinum complex addition in nanoparticle synthesis
Hotplate/stirrer VWR 12365-382 For sample stirring and heating
LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) Santa Cruz Biotechnology sc-18821 AF647 For imaging
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Oakwood Chemical 005027 SPPS
Ninhydrin 99% Alfa Aesar A10409 Kaiser test
Oleic acid Chem-Impex INT’L INC. 01421 For platinum complex synthesis
OV90 ATCC CRL-11732 Ovarian cancer cell line
PBS Corning 21-031-CV For cell wash
Permount mounting medium Fisher Chemical SP15-100 For imaging
Phenol Fisher Chemical A92500 Kaiser test
Phosphotungstic acid Fisher Chemical A248-25 negative stain for TEM
Piperidine 99% BTC 219260-2.5L SPPS
Platinum AAS standard soultion Alfa Aesar 88086 1000ug/ml for calibration curve
Propargyl bromide 97% Alfa Aesar L10595 For alkyne modification of fluoresceine
Scientific biological cabinet Thermo Scientific Fisher 1385 Bio-hood for cell culture
Self-Cleaning Vacuum System Welch 2028 Vacuum pump for rotavapor
Silver nitrate Acros Organics 19768-0250 Cisplatin activation
SKOV3 ATCC HTB-77 Ovarian cancer cell line
Sodium hydroxide Fisher Scientific S313-1 For platinum complex synthesis
Tin (II) chloride Sigma Aldrich 208256 Test for Platinum presence
TOV21G ATCC CRL-11730 Ovarian cancer cell line
Trifluoroacetic acid 99% (TFA) Alfa Aesar L06374 SPPS
Triisopropylsilane (TIPS) Chem-Impex INT’L INC. 01966 SPPS
Triton-X Sigma Aldrich T8787-100ML For imaging
Uranine powder 40% Fisher Scientific S25328A For alkyne modification of fluoresceine
Vivaspin 20 (10000 MWCO) Sartorious VS2001 For Nanoparticle wash and condensation
VWR Inverted Microscope VWR 89404-462 For cell culture monitoring

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agrahari, V., Agrahari, V., Mitra, A. K. Nanocarrier fabrication and macromolecule drug delivery: challenges and opportunities. Therapeutic Delivery. 7 (4), 257-278 (2016).
  2. Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Nanoparticles in the clinic. Bioengineering & Translational Medicine. 1 (1), 10-29 (2016).
  3. Peer, D., Karp, J. M., Hong, S., Farokhzad, O. C., Margalit, R., Langer, R. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nature Nanotechnology. 2 (12), 751-760 (2007).
  4. Roy Chowdhury, M., Schumann, C., Bhakta-Guha, D., Guha, G. Cancer nanotheranostics: Strategies, promises and impediments. Biomedicine & Pharmacotherapy. 84, 291-304 (2016).
  5. Jeevanandam, J., Chan, Y. S., Danquah, M. K. Nano-formulations of drugs: Recent developments, impact and challenges. Biochimie. , 99-112 (2016).
  6. Meerum Terwogt, J. M., Groenewegen, G., Pluim, D., Maliepaard, M., Tibben, M. M., Huisman, A., ten Bokkel Huinink, W. W., Schot, M., Welbank, H., Voest, E. E., Beijnen, J. H., Schellens, J. M. Phase I and pharmacokinetic study of SPI-77, a liposomal encapsulated dosage form of cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 49 (3), 201-210 (2002).
  7. Fan, Z., Sun, L., Huang, Y., Wang, Y., Zhang, M. Bioinspired fluorescent dipeptide nanoparticles for targeted cancer cell imaging and real-time monitoring of drug release. Nature Nanotechnology. 11 (4), 388-394 (2016).
  8. Jeong, Y., et al. Enzymatically degradable temperature-sensitive polypeptide as a new in-situ gelling biomaterial. Journal of Controlled Release. 137 (1), 25-30 (2009).
  9. Uesaka, A., et al. Morphology control between twisted ribbon, helical ribbon, and nanotube self-assemblies with his-containing helical peptides in response to pH change. Langmuir. 30 (4), 1022-1028 (2014).
  10. Hwang, W., Marini, D. M., Kamm, R. D., Zhang, S. Supramolecular structure of helical ribbons self-assembled from a B-sheet peptide. Journal of Chemical Physics. 118 (1), 389-397 (2003).
  11. Svobodova, J., et al. Poly(amino acid)-based fibrous scaffolds modified with surface-pendant peptides for cartilage tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 831-842 (2017).
  12. Kumar, V. A., et al. Highly angiogenic peptide nanofibers. ACS Nano. 9 (1), 860-868 (2015).
  13. Romera, D., Couleaud, P., Mejias, S. H., Aires, A., Cortajarena, A. L. Biomolecular templating of functional hybrid nanostructures using repeat protein scaffolds. Biochemical Society Transactions. 43 (5), 825-831 (2015).
  14. Medina, S. H., Schneider, J. P. Cancer cell surface induced peptide folding allows intracellular translocation of drug. Journal of Controlled Release. 209, 317-326 (2015).
  15. Recio, C., Maione, F., Iqbal, A. J., Mascolo, N., De Feo, V. The Potential Therapeutic Application of Peptides and Peptidomimetics in Cardiovascular Disease. Frontiers in Pharmacology. 7, 526 (2016).
  16. McCarthy, K. A., et al. Phage Display of Dynamic Covalent Binding Motifs Enables Facile Development of Targeted Antibiotics. Journal of the American Chemical Society. 140 (19), 6137-6145 (2018).
  17. Lazar, V., et al. Antibiotic-resistant bacteria show widespread collateral sensitivity to antimicrobial peptides. Nature Microbiology. 3 (6), 718-731 (2018).
  18. Czeczor, J. K., McGee, S. L. Emerging roles for the amyloid precursor protein and derived peptides in the regulation of cellular and systemic metabolism. Journal of Neuroendocrinology. 29 (5), (2017).
  19. Branco, M. C., Sigano, D. M., Schneider, J. P. Materials from peptide assembly: towards the treatment of cancer and transmittable disease. Current Opinion in Chemical Biology. 15 (3), 427-434 (2011).
  20. Cheetham, A. G., et al. Targeting Tumors with Small Molecule Peptides. Current Cancer Drug Targets. 16 (6), 489-508 (2016).
  21. Ndinguri, M. W., Solipuram, R., Gambrell, R. P., Aggarwal, S., Hammer, R. P. Peptide targeting of platinum anti-cancer drugs. Bioconjugate Chemistry. 20 (10), 1869-1878 (2009).
  22. Eskandari, S., Guerin, T., Toth, I., Stephenson, R. J. Recent advances in self-assembled peptides: Implications for targeted drug delivery and vaccine engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 110, 169-187 (2017).
  23. Zhou, J., Du, X., Yamagata, N., Xu, B. Enzyme-Instructed Self-Assembly of Small D-Peptides as a Multiple-Step Process for Selectively Killing Cancer Cells. Journal of the American Chemical Society. 138 (11), 3813-3823 (2016).
  24. Sun, J. E., et al. Sustained release of active chemotherapeutics from injectable-solid beta-hairpin peptide hydrogel. Biomaterials Science. 4 (5), 839-848 (2016).
  25. Lock, L. L., Reyes, C. D., Zhang, P., Cui, H. Tuning Cellular Uptake of Molecular Probes by Rational Design of Their Assembly into Supramolecular Nanoprobes. Journal of the American Chemical Society. 138 (10), 3533-3540 (2016).
  26. Kalafatovic, D., Nobis, M., Son, J., Anderson, K. I., Ulijn, R. V. MMP-9 triggered self-assembly of doxorubicin nanofiber depots halts tumor growth. Biomaterials. 98, 192-202 (2016).
  27. Frederix, P. W., et al. Exploring the sequence space for (tri-)peptide self-assembly to design and discover new hydrogels. Nature Chemistry. 7 (1), 30-37 (2015).
  28. Horsley, J. R., et al. Photoswitchable peptide-based 'on-off' biosensor for electrochemical detection and control of protein-protein interactions. Biosensors and Bioelectronics. 118, 188-194 (2018).
  29. Hoyos-Nogues, M., Gil, F. J., Mas-Moruno, C. Antimicrobial Peptides: Powerful Biorecognition Elements to Detect Bacteria in Biosensing Technologies. Molecules. 23 (7), 1683 (2018).
  30. Xiao, X., et al. Advancing Peptide-Based Biorecognition Elements for Biosensors Using in-Silico Evolution. ACS Sensors. 3 (5), 1024-1031 (2018).
  31. Puiu, M., Bala, C. Peptide-based biosensors: From self-assembled interfaces to molecular probes in electrochemical assays. Bioelectrochemistry. 120, 66-75 (2018).
  32. Wang, J., et al. Developing a capillary electrophoresis based method for dynamically monitoring enzyme cleavage activity using quantum dots-peptide assembly. Electrophoresis. 38 (19), 2530-2535 (2017).
  33. Etayash, H., Thundat, T., Kaur, K. Bacterial Detection Using Peptide-Based Platform and Impedance Spectroscopy. Methods in Molecular Biology. 1572, 113-124 (2017).
  34. Handelman, A., Apter, B., Shostak, T., Rosenman, G. Peptide Optical waveguides. Journal of Peptide Science. 23 (2), 95-103 (2017).
  35. Chen, C., Liu, K., Li, J., Yan, X. Functional architectures based on self-assembly of bio-inspired dipeptides: Structure modulation and its photoelectronic applications. Advances in Colloid and Interface Science. 225, 177-193 (2015).
  36. Reddy, S. M., Shanmugam, G. Role of Intramolecular Aromatic pi-pi Interactions in the Self-Assembly of Di-l-Phenylalanine Dipeptide Driven by Intermolecular Interactions: Effect of Alanine Substitution. Chemphyschem. 17 (18), 2897-2907 (2016).
  37. Marchesan, S., et al. Unzipping the role of chirality in nanoscale self-assembly of tripeptide hydrogels. Nanoscale. 4 (21), 6752-6760 (2012).
  38. Scott, G. G., McKnight, P. J., Tuttle, T., Ulijn, R. V. Tripeptide Emulsifiers. Advanced Materials. 28 (7), 1381-1386 (2016).
  39. Galanski, M., Jakupec, M. A., Keppler, B. K. Update of the preclinical situation of anticancer platinum complexes: novel design strategies and innovative analytical approaches. Current Medicinal Chemistry. 12 (18), 2075-2094 (2005).
  40. Wheate, N. J., Walker, S., Craig, G. E., Oun, R. The status of platinum anticancer drugs in the clinic and in clinical trials. Dalton Transactions. 39 (35), 8113-8127 (2010).
  41. Oberoi, H. S., Nukolova, N. V., Kabanov, A. V., Bronich, T. K. Nanocarriers for delivery of platinum anticancer drugs. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (13-14), 1667-1685 (2013).
  42. Fichtinger-Schepman, A. M., van Oosterom, A. T., Lohman, P. H., Berends, F. cis-Diamminedichloroplatinum(II)-induced DNA adducts in peripheral leukocytes from seven cancer patients: quantitative immunochemical detection of the adduct induction and removal after a single dose of cis-diamminedichloroplatinum(II). Cancer Research. 47 (11), 3000-3004 (1987).
  43. Englander, E. W. DNA damage response in peripheral nervous system: coping with cancer therapy-induced DNA lesions. DNA Repair. 12 (8), 685-690 (2013).
  44. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cisplatin resistance. Oncogene. 31 (15), 1869-1883 (2012).
  45. Boeckman, H. J., Trego, K. S., Turchi, J. J. Cisplatin sensitizes cancer cells to ionizing radiation via inhibition of nonhomologous end joining. Molecular Cancer Research. 3 (5), 277-285 (2005).
  46. Dragulska, S. A., et al. Tripeptide-Stabilized Oil-in-Water Nanoemulsion of an Oleic Acids-Platinum(II) Conjugate as an Anticancer Nanomedicine. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2514-2519 (2018).
  47. Martinez Rivas,, J, C., et al. Nanoprecipitation process: From encapsulation to drug delivery. International Journal of Pharmaceutics. 532 (1), 66-81 (2017).
  48. Agilent Technologies. Analytical Methods for Graphite Tube Atomizers, User's Guide Manual, 8th edition. , (2012).
  49. Park, S. Y., et al. A smart polysaccharide/drug conjugate for photodynamic therapy. Angewandte Chemie. 50 (7), 1644-1647 (2011).
  50. Canton, I., Battaglia, G. Endocytosis at the nanoscale. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2718-2739 (2012).
  51. Lokich, J., Anderson, N. Carboplatin versus cisplatin in solid tumors: an analysis of the literature. Annals of Oncology. 9 (1), 13-21 (1998).

Tags

Bioteknik fråga 144 Nanoemulsion oljesyra tripeptid mot cancer therapy biologiska imaging drogen leverans
En tripeptid-stabiliserad Nanoemulsion oljesyra
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., … More

Dragulska, S. A., Wlodarczyk, M. T., Poursharifi, M., Martignetti, J. A., Mieszawska, A. J. A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid. J. Vis. Exp. (144), e59034, doi:10.3791/59034 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter