Summary
פרוטוקול זה מתאר תפוקת יחיד של שיטות אנליטיות, טכנולוגיות משלימים לשיאה אפיון מלא-זוגי של חומר אורגני טבעי, פרוטאומיקס מיקרוביאלית של מערכות אקולוגיות. גישה זו מאפשרת השוואות חזקים לזיהוי מסלולים מטבוליים והעתקות חשוב המתאר הפקת גז חממה, חיזוי תגובות השינוי הסביבתי.
Abstract
חומר אורגני טבעי (NOM) מורכבת תערובת מורכבת מאוד אלפי תרכובות אורגניות שהוכיח עצמו, מבחינה היסטורית, קשה לאפיין. עם זאת, כדי להבין את הפקדים תרמודינמי, קינטי החממה הפקת גז (פחמן דו-חמצני [CO2] ו- [CH4] מתאן) הנובע הפירוק של NOM, אפיון מולקולרי ברמת בשילוב עם חיידקים פרוטאום ניתוח הכרחי. יתרה מזאת, אקלים ושינויים סביבתיים צפויים perturb הטבעיות, שעשוי להיות מעצבן לאינטרקציות מורכבות המשפיעים על אספקת מצעים חומר אורגני וגם מיקרואורגניזמים ביצוע העתקות. אפיון מולקולרי מפורט של חומר אורגני, מיקרוביאלי פרוטאומיקס, ואת המסלולים המרות שלפיו מפורקת חומר אורגני יהיה צורך לחזות את הכיוון ואת הגודל של ההשפעות של שינויים סביבתיים. מאמר זה מתאר קצב מתודולוגי אפיון מקיף מטבוליט דגימה בודדת על-ידי הזרקה ישירה פורייה המרה יון ציקלוטרון תהודה ספקטרומטר מסה (FTICR-MS), גז כרומטוגרפיה ספקטרומטר מסה (GC-MS), תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה, כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטר מסה (LC-MS), וניתוח פרוטאומיקס. גישה זו גורמת dataset מצוייד במלואו, אשר משפר את אמון סטטיסטי עבור מסיקים מסלולים של פירוק חומר אורגני, ה-CO הנוצרת2 קצב ייצור4 CH, ואת התגובות ההפרעות הסביבה שלהם. במסמך זה אנו מציגים תוצאות החלת בשיטה זו NOM דגימות נאספו מ peatlands; עם זאת, הפרוטוקול חל דוגמה NOM (למשל, כבול, מיוער קרקעות, משקעים ימיים, וכו ').
Introduction
ברחבי העולם, ביצות מוערך להכיל עמוד 529 של פחמן (C), בעיקר בתור C אורגני קבורה כבול פיקדונות1. כיום, peatlands כזה לשמש כיור C נטו, sequestering 29 y Tg ג-1 ב צפון אמריקה לבד1. עם זאת, הפרעה סביבתיים כגון ניקוז, שריפות, הבצורת בטמפרטורות חם ניתן להסיט את הכיור C הזה על-ידי הגברת פירוק חומר אורגני וכתוצאה מכך הפסדים C מוגבר באמצעות גז חממה (פחמן דו-חמצני [CO2] ו 1,לייצור מתאן [CH4])2. שינויי אקלים עשויים לתרום הפסד C אם הטמפרטורות חם או תנאים מייבש לעורר הפירוק C מהר יותר על-ידי מיקרואורגניזמים. לחלופין, טמפרטורות גבוהות יותר אוויר CO2 ריכוזים עשוי לעורר הייצור הראשוני לבודד CO עוד2 בתור פחמן אורגני (OC). באיזו מידה, כמה מהר זה OC מפורקת ואז לתוך CO2 ו- CH4 תלוי הגומלין המורכבים בין סובסטרטים התורם של אלקטרון, הזמינות של אלקטרון acceptors המיקרואורגניזמים לתווך טרנספורמציה. במקרים רבים, המנגנונים אינם מאופיין היטב, ובכך את תגובתם לפליטת הסביבה אינה מוגבלת היטב, עדיין לא ברור מה יהיה התוצאה הסופית של שינוי האקלים על איזון פחמן peatland מערכות אקולוגיות.
האופי המורכב של חומר אורגני טבעי (NOM) הפך אפילו לזהות את תרכובות אורגניות נוכח תערובות NOM קשה מבחינה היסטורית. ההתקדמות האחרונה שיפרנו בגדול את היכולת לאפיין תרכובות באופן מסורתי זה ולהמשיך, במידה מסוימת, להיחשב הסרבן רקבובי או fulvic תרכובות3,4,5. עכשיו הבנו כי רבים של תרכובות אלו זמינים למעשה microbially, עשוי להיות מפורקת אם מקבל אלקטרון מסוף מתאימים (תה) זמין6,7. חישוב מצב חמצון הנומינלי של הפחמן (NOSC) עבור תרכובת מספק מדד של ניבוי הפוטנציאל הפירוק, את התשואה אנרגיה של התה הנדרש. עם זאת, זה דורש אפיון מולקולרי ברמת של חומר אורגני7. NOSC מחושבת על פי נוסחה מולקולרית באמצעות המשוואה הבאה7: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − − 3(#N) 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, כאשר z הוא המטען נטו. NOSC הוא מתואם עם תרמודינמי נהיגה כוח8, שבו תרכובות עם NOSC גבוהה יותר קלים לבזות, בעוד תרכובות עם NOSC נמוך יותר דורשים יותר ויותר אנרגטיים תה כדי להיות מופחת. מתחמים עם NOSC פחות −2 דורשים אנרגיה גבוהה מניבים תה כגון O2, חנקתי או Mnהרביעי, לא יכול להיות מושפל על ידי המתרחשים בדרך כלל נמוך אנרגיה מניבים תה כגון Feהשלישי או חומצה גופרתית7. זהו שיקול חשוב בתנאים אנאוקסיים רטוב נמצאו מקווי מים בהם O2 ואנרגיה גבוהה אחרים מניבים תה נדיר9 , ולכן הם ההשפלה של תרכובות NOSC התחתון בתנאים האלה למה מוגבלת. פרטורבציה סביבתיים יכולים להשפיע על ה תרמודינמי של המערכת האקולוגית באמצעות הידרולוגיה שינויים המשפיעים על O2 (הכי אנרגטית אלקטרון מקבל), שינויים מצעים אורגני אלקטרון acceptors זמין על-ידי ראשי הפקה, ולא במידה קטנה יותר על ידי טמפרטורה. דוגמה חשובה של ההשפעות טמפרטורה במערכות המלחות מתרחשת לגבי החלופה המתרחשת בין homoacetogenesis (קרי, אצטט הפקה של CO2 ו- H2) hydrogenotrophic methanogenesis ( כלומר, CH4 הפקה של CO2 ו- H2). בטמפרטורות נמוכות נראה ש-homoacetogenesis הזה הוא מעט המועדף, בעוד בטמפרטורות חם יותר טובה CH4 ייצור10. אפקט זה טמפרטורה שיש השלכות חשובות על התגובה של מערכות אקולוגיות לשינוי האקלים, כמו CH4 הוא גז חממה הרבה יותר חזק מאשר CO211 ובכך הגדלת הייצור של CH4 -חשבון של CO2 בטמפרטורות חם עשויים לתרום משוב חיובי עם התחממות האקלים.
Peatlands מייצרים כמויות משמעותיות באופן גלובלי של CO2 , CH46באמצעות נשימה מיקרובית של באופן טבעי אורגני משנה. NOSC של סובסטרטים פחמן אורגני קביעת חלקם היחסי של CO2: CH4 המיוצר אשר הוא פרמטר קריטי בגלל גבוה יותר קרינה לאלץ CH4 בהשוואה ל- CO211, אלא גם בגלל מידול המאמצים זיהו את היחס הזה כפרמטר קריטי עבור הערכת השטף C peatlands12. בהיעדרו של אלקטרון מסוף acceptors חוץ CO2, ניתן להראות על ידי אלקטרון איזון כי מצעים אורגני C עם NOSC > 0 רצון לייצר CO2: CH4 > 1, C אורגני עם NOSC = 0 יוצרת CO2 ו- CH4 יחס equimolar, ו C אורגני עם NOSC < 1 יפיק CO2: CH-4 -< 1-13. פירוק של OC ב הטבעיות מתווך על ידי מיקרואורגניזמים, כך גם כאשר השפלה של מתחם מסוים הוא למה ריאלי, זה kinetically מוגבל על ידי הפעילות של אנזימים מיקרוביאלי, בתנאים אנאוקסיים, מאת תרמודינמי הדוחף (קרי, NOSC)7. עד עכשיו זה מאתגר לאפיין באופן מלא את החומר האורגני כי המגוון של תרכובות דורשת טכניקות שונות משלימים עבור האפיון שלהם. התפתחויות אחרונות יש סגר את הפער; באמצעות חבילת בשיטות אנליטיות אנחנו ניתן לנתח את מגוון רחב של תרכובות אורגניות מתן אפיון מולקולרי ברמת, כימות מקרים מסוימים, של מטבוליטים ראשי קטן כמו גלוקוז עד 800 Da פולי-heterocycles. בעבר מולקולות מורכבות גדולים כאלה כבר שאפיינו פשוט כמו כמו ליגנין או דמוי טאנין, בדוי כדי להיות עקשניים. אפיון מולקולרי ברמת, עם זאת, מאפשר חישוב NOSC עבור מולקולות מורכבות גדולה אפילו אלה. ערכים אלה NOSC הן באופן ליניארי בקורלציה עם הכוח המניע תרמודינמי ומאפשר הערכה של איכות חומר אורגני זמין עבור פירוק, אשר במקרים רבים מגלה כי מולקולות מורכבות אלה עשוי למעשה להיות microbially מתכלה אפילו בתנאים אנאוקסיים הקיימות בביצות.
מאז כניסתה של O2 מאפשר חומר אורגני של כמעט כל הערכים NOSC נצפתה באופן טבעי להיות מפורקת, במסמך זה אנו מתמקדים השינויים חומר אורגני ו פרוטאומיקס חיידקים אשר צפויים להיות הנהגים ראשי בביצות (קרי, O מוגבל2) מערכות. עם זאת, כל הטכניקות שבהן נדון ניתן ליישם חומר אורגני של כל המערכת האקולוגית. בדרך כלל, בצובר מדדים המבוססים על אופטי, ניתוחים פלורסצנטיות שימשו להערכת חומר אורגני איכותי3,14. בעת שימוש בצובר מדידות כאלה, עם זאת, הפרטים אינם נשמרים כפי מספר רב של מולקולות מסווגים יחד בתנאים כלליים כמו humics או fulvics. ההגדרות של קטגוריות אלה אינם מוגבל היטב והם, למעשה, עשויים להשתנות אפשרי מחקר כדי לימוד ביצוע השוואות. עוד, מדידות בצובר לא לספק הפירוט מולקולרית הדרושים לחישוב את התרמודינמיקה המסדירים את המערכת, ולכן נופל קצר באמת הערכת איכות חומר אורגני15.
טכניקות בודדים כגון פורייה להפוך יון ציקלוטרון תהודה ספקטרומטר מסה (FTICR-MS), תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה, גז כרומטוגרפיה המוני מסות (GC-MS) ולבצע כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטר מסה (LC-MS) לספק בכזה פירוט ברמה המולקולרית. בעוד כל אחת מהטכניקות הללו מציג את מגבלותיה, הם הביאו את נקודות החוזק שלהם זה ניתן למנף בגישה משולבת כדי להשיג את הפרטים מולקולרית בסדר הכרחי עבור לכימות איכות חומר אורגני במובן תרמודינמי קפדני . GC-MS שימושית לזיהוי מטבוליטים קטן קריטי כי צפויים proximal השפעה על CO2 ו- CH4 הייצור (למשל, גלוקוז, אצטט, וכו '); עם זאת, GC-MS דורש אימות מול תקן ולכן מוגבלת תרכובות ידועות כבר קיים במסד הנתונים מונע זיהוי של תרכובות הרומן. יתר על כן, GC-MS היא טכניקה למחצה איכותי המאפשר הסקה על השינויים בריכוזים יחסית, אבל לא מספק בפועל ריכוז המידע הדרוש לחישוב חינם אנרגיות של גיב לדוגמה. לבסוף GC-MS דורש derivatization של מולקולות לפני ניתוח אשר מגביל את הרזולוציה כדי תרכובות קטן מ- Da ~ 400, כהלים נדיף אובדים במהלך השלב ייבוש.
חד-ממדי (1 ד) 1H למצב נוזלי NMR מאפשרת אפיון כמותי מאוד קטנה מטבוליטים (לרבות מטבוליטים העיקרי משקל מולקולרי קטן שיכללו חומרים נדיפים כמו כהלים, אצטט, אצטון, formate, פירובט, succinate, כבל קצר חומצות שומן, כמו גם מגוון של פחמימות לשמצה נעדר או פרוץ מפעולות שירות מבוססי MS) ריכוזים שלהם הם שימושיים במיוחד לצורך חישוב פרמטרים תרמודינמי. ובכל זאת, כמו GC-MS, 1 י NMR של תערובות מורכבים דורש תקינה יחסית מסד נתונים, ולכן לא לבד לאפשר זיהוי קל של תרכובות הרומן כי צפויים להיות בשפע מורכבות מערכות אקולוגיות טבעיות ומשתנה. בנוסף, NMR רגיש פחות מאשר טכניקות מבוססות MS. לכן, יצירת פרופילים המטבוליט כמותיים מושגת רק מעל 1 מיקרומטר באמצעות NMR מערכות מצויד מקורר הליום קר-הגששים. NMR קצת קר-הגששים מוערך לא נרחב, מלח-סובלניים ולאפשר ניתוח הסביבה תערובת בנוכחות ריכוזי מלח millimolar בשימוש קטנים בקוטר (הקוטר החיצוני < 3 מ מ) מדגם צינורות16. עם זאת, זה סיבוך נוסף של NMR כמויות גבוהות של מתכות פאראמגנטיים ומינרלים (למשל, Fe ו- Mn מעל % wt 1-3), אשר יכול להיות שופע בקרקעות בתוליים, ניתן להרחיב תכונות ספקטרליות, לסבך את הפרשנות של ספקטרום NMR . באמצעות מיצוי מעבדתי (SPE) ניתן עוזרו של פרשנות של NMR והן מבוססות MS מטבולומיקס בשיטות על-ידי הפחתת מלחים מינרליים והגברת איכות ספקטרלי.
FTICR-MS על ידי הזרקה ישירה היא טכניקה רגישה מאוד מסוגלת לאתר עשרות אלפי מטבוליטים של דוגמה אחת, אבל זה לא ללכוד מטבוליטים קטן קריטיים כגון אצטט, פירובט succinate והוא שקשה לחסלם השתמש עבור סוכרים, פחמימות אחרות17, ואינה מספקת מידע כמותי. אולם, בניגוד טכניקות אחרות, FTICR-MS מצטיין זיהוי והקצאת נוסחה מולקולרית תרכובות הרומן, ולכן מזהה את המספר הגדול ביותר של תרכובות מתן מידע מולקולריות יותר מאשר בכל אחת מהטכניקות שתואר אחרים. דבר זה שימושי, כי המידע מולקולרית FTICR-MS (וטכניקות אחרות) יכול לשמש כדי לחשב את NOSC הקשורה הכוח המניע תרמודינמי המסדירים את הסבירות של תגובות מסוימות8 והתעריפים שלהם תחת מסוימים תנאים7. יתר על כן, על ידי צימוד FTICR-MS עם טכניקות הפרדה, כגון LC יחד עם טנדם MS, כמותיים מבניים בר השגה, קיזוז חלק מהחסרונות של טכניקה זו. LC-MS שימושית לזיהוי חומרים דמויי השומנים, אחרים מטבוליטים שאינם מאופיין היטב על ידי כל אחד השיטות האחרות. צימוד LC FTICR-MS או LC-MS עם שברים של אלמונים מסוימים עניין הבהרה מבנית של אספן שבר ואיסוף דו-ממדית (2D) נוזלי המדינה ש-NMR הוא המצב האידיאלי בזיהוי וכימות לא ידוע תרכובות18 ,19. עם זאת, זהו צעד שצורכת שיכול לשמש אם וכאשר הדרושים. לקחו בנפרד, כל אחת מהטכניקות הללו מספקים תמונה שונה של החומר האורגני, על ידי שילוב אותם, נוכל להשיג הבנה מלאה יותר מאשר שימוש בכל אחת מהטכניקות בבידוד.
בעוד השיקולים תרמודינמי להגדיר את האילוצים האולטימטיבי איזה העתקות אפשריים במערכת, פירוק חומר אורגני מתווך על ידי מיקרואורגניזמים שפעילותם אנזים לשלוט שיעורי התגובה. לכן, אני מבין הפקדים פירוק חומר אורגני ובסופו של דבר החממה הפקת גז (CO2 ו- CH4) מן הביצות דורש גישה משולבת טכנולוגיות אפיון פעילות האנזים מיקרוביאלית כמו גם המטבוליטים. במאמר זה, אנו מתארים שיטה להשגת ניתוח מקיף של דוגמה אחת שימוש בגישה סדרתית שתוצאתו ניתוח מלא לזווג. גישה זו מרחיבה על מטבוליט, חלבונים, שומנים בדם החילוץ (MPLex) פרוטוקול שבו פרוטאומיקס היה בשילוב עם GC-MS ו- LC-MS20 כדי לזהות קטנה מטבוליטים, חלבונים ושומנים על-ידי שילוב מידע כמותי מטבוליט ויה NMR וזיהוי של גדול מטבוליטים משניים ויה FTICR-גב' מעט שונה MPLex, אנו מתחילים את הפרוטוקול עם שאיבת מים, ואז השתמש החילוץ רציפים עם ממיסים יותר ויותר לא קוטביים. כל עקירות נעשות על מדגם יחיד אשר חוסך לדוגמה כאשר אמצעי אחסון מוגבל או קשה להשיג, הקטנת השגיאה ניסיוני הציג דרך וריאציה בין aliquots מ מדגם הטרוגנית מטריצות (למשל, אדמה, כבול) או ההבדלים בין תנאי אחסון ומשך.
לבסוף, על-ידי התאמת הניתוחים אום עם פרוטאומיקס ניתוחים של הקהילה מיקרוביאלי, נוכל לבנות רשתות מטבוליות המתארים את המסלולים ואת הפיכתו של פירוק חומר אורגני. זה מאפשר לנו לבדוק היפותזות ספציפיות על איך תשפיע לפליטת למערכת CO האולטימטיבי2 ו- CH4 ייצור באמצעות שינוי של מצעים אורגני זמין, אלקטרון acceptors של הקהילות מיקרוביאלי בתיווכן של תגובות באמצעות הפעילות של אנזימים מזרזים.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לספק תפוקה יחיד פרוטוקול לניתוח מטבוליטים, שומנים, חלבונים מיקרוביאלי מתוך מדגם יחיד ובכך יוצר dataset לזווג מלא לבניית רשתות מטבוליות תוך הגבלת משגיאות אנליטיות .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. רציפים הפקת חומר אורגני בקרקע, משקעים או כבול
- לאסוף את הקרקע, משקעים או כבול ויה גלעון ולחלק ליבות על-פי ההשערה הנבדקת (למשל, עומק). דוגמאות לחנות טפלון מצופה מכולות ומקפיאים ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לפני ניתוח.
הערה: כ- 25 מ ג ג יש צורך עבור פרוטוקול זה. עבור כבול (בדרך כלל 45% C), נדרש 50 מ"ג של כבול מיובשים. ייתכן שיהיה צורך כמויות גדולות יותר של דגימה עבור דגימות אורגניות נמוך כמו הרמות או מינרליים מיוערות קרקעות בהתאם C תוכן (עד 5 גרם). מאחר חילוץ עם ממיסים אורגניים ימשוך כל פוליאתילן גליקול (PEG) לתוך תמציות, אשר תהיה השפעה שלילית על יינון במהלך שלב 2.4, חשוב להימנע ומאפשר דגימות לפנות פלסטיק בשלב כלשהו במהלך איסוף, אחסון או חילוץ. - כאשר מוכן לנתח את הדגימות, ההקפאה יבש על משקל קבוע, ואז לטחון את הדגימות טחנת הכדור במהירות גבוהה באמצעות פלדת אל-חלד טחינת כדורי homogenize ולשבור את כל אגרגטים.
הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור בנקודה זו, החומר המאוחסן ב- 80 ° c - שימוש של אתנול מסוידים מפלדת למעבדות, aliquot 50 מ ג של כל הדגימות מיובשים לתוך מבחנות זכוכית mL 2 בודדים. אלה דוגמאות יחולצו ברצף באמצעות סדרה של ממיסים לחלץ ברציפות מטבוליטים יותר ויותר לא קוטביים כל דגימה. להוסיף 1 מ"ל מים מזוקקים, degassed (H2O) כל דגימה, קאפ הבקבוקונים ומנערים כבר שעתיים על שולחן בשייקר.
- לאחר טלטולים לאפשר את הפתרונות לעמוד בטמפרטורת החדר (RT) למשך 20 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה ב 15,000 x g למשך 30 דקות, decant ולשמור את תגובת שיקוע מכל אחד.
הערה: פתרונות אלו יוזרקו FTICR-MS על ידי הזרקה ישירה. - התנהגות Folch החילוץ21 (הידוע גם MPLEx20) העכשיו מים שאריות שחולצו על ידי וחזור על שלבים 1.3 ו 1.4 החלפת 1 מיליליטר-20 ° C 4:3 כלורופורם: מתנול תערובת למים בשלב 1.3.
התראה: כלורופורם וב מתנול הם גם דליק מאוד וגם רעיל. השתמש ציוד מגן אישי המתאים (עיקרון השוויון הפוליטי) כדי למנוע מגע עם העור ולהימנע להבה פתוחה. - הפרד בזהירות שתי וכתוצאה מכך הממס שכבות, אשר יהיה להבדיל מבחינה ויזואלית, לניתוח נפרד על-ידי FTICR-MS באמצעות הפרדה משפך או פשוט להסיר את השכבה העליונה על ידי זהיר pipetting.
הערה: השבר המכילה כלורופורם יהיו בתחתית בזמן השבר מתנול המכילות פחות צפוף, תהיה על העליונה. - לדלל את תמצית כלורופורם (שלב 1.6) 1:1 בקופסא מתנול ותמצית מים (שלב 1.4) 2:1 ב מתנול כדי לשפר את היעילות יינון (ESI) ספקטרומטריית electrospray עבור FTICR-MS על ידי הזרקה ישירה.
הערה: השבר המכילות מתנול מהשלב 1.7 אינו צריך להיות מדולל בהמשך מתנול. השכבה מתנול ינוהל על ידי הזרקה ישירה על FTICR-MS.
ניתוח 2.FTICR-MS
- לכייל את ספקטרומטר FTICR בהזרקת ישירות µL 100 של פתרון כוונון (ראה טבלה של חומרים) המתפרסות על-פני מגוון המונית של 100-1,300 Da לתוך FTICR-MS.
- להכין תקן Suwannee נהר Fulvic חומצה (ראה טבלה של חומרים) על-ידי ביצוע פתרון 1 מ ג-1 מ ל מים מסוננים הנדסה גנטית ולאחר מכן דילול הפתרון המתקבל 20 מ"ל µg-1 ב מתנול.
- ישיר להזריק µL 23 של הפתרון הסופי למקור ESI מצמידים את ספקטרומטר FTICR באמצעות מזרק משאבה להגדיר קצב זרימה של μL 3.0 דקות-1. הגדר המחט מתח +4.4 kV, Q1 עד 150 מ'/z ו זכוכית נימי ב- 180 מעלות צלזיוס. לבדוק ספקטרה הנוצרת באמצעות ניתוח תוכנה (ראה טבלה של חומרים) כדי לאשר את איכות הנתונים.
- להשתמש HPLC כיתה מתנול לפני הפעלת דוגמאות וברחבי הדגימה כדי לפקח דחויים. מציג 23 μL של כל תמצית באמצעות הזרקה ישירה למקור ESI מצמידים את ספקטרומטר FTICR באמצעות מזרק משאבה להגדיר קצב זרימה של μL 3.0 דקות-1. הגדר המחט מתח +4.4 kV, Q1 עד 150 מ'/z ו זכוכית נימי ב- 180 מעלות צלזיוס.
- שינוי הזמן הצטברות יון (IAT) עבור כל דגימה או קבוצה של דגימות להביא בחשבון את הוריאציה C ריכוז. ערכים אופייניים הם בין 0.1 עד 0.3 סריקות ס' 144 לאסוף עבור כל דגימה, ממוצע הסריקות ולאחר מכן נהל של כיול פנימי באמצעות CH2 הומולוגיים (קרי, ההפרדה Da 14) בסדרה.
הערה: לאחר ניתוח FTICR-MS, ההחלטה שניתן יהיה לשלב גם את המים, מתנול חילוץ שברים על מנת לייעל את הפעולות הנותרות או השברים יכול להישמר נפרד לכל אורך השלבים הבאים. היתרונות והחסרונות של כל גישה מתוארים באריכות הדיון. אם כך חולטים מים ועלים מתנול, חילוץ שברים. - יבש תמציות באמצעות רכז ולשמור את השארית של תמציות (~ 1 מ"ל) עוקבות GC-MS (מים, מתנול או מים + מתנול), LC-MS (כלורופורם) וניתוח NMR (מים + מתנול).
הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות בשלב זה, לאחסן את החומר ב-20 ° C.
3. FTICR-MS עיבוד נתונים
- שיתוף יישר כל רשימות שיא לדוגמה עבור כל הנתונים (dataset) להפחית משמרות המוני לתקנן שיא הקצאות באמצעות תוכנת Formularity22 לפני ההקצאה נוסחה.
- להשתמש בתוכנה Formularity22 להקצאת נוסחה מולקולרית באמצעות אות יחס רעש גדול מ- 7, מסה המדידה שגיאה < 1 ppm, ומאפשר C, H, O, N, S ו- P שיתופם של כל הרכיבים האחרים.
- אם מספר נוסחאות המועמד מוחזרות עבור מסה נתונה (בתדירות גבוהה מעל 500 Da) להטיל אילוצים עקבית עם החומר להיות שנדגמו. לדוגמה, אילוצים טיפוסי כבול, כוללות: שגיאה המוני הנמוך, המספר הנמוך ביותר של heteroatoms (N, S, P), כאשר נוכח, P חייבים להיות מחמצנים (קרי, חייב להיות לפחות 4 O אטומים עבור כל אטום P בנוסחה).
4. כימי Derivatization עבור GC-MS
- להכין דוגמאות בקרה הריק הקסאן HPLC-כיתה ב- GC-MS תעשיה בקבוקונים23. להמיס 100 מ"ג חומצות שומן מתיל אסטרים (FAMEs: C8 - C28) זמן השמירה תערובת סטנדרטי µL 200 של הקסאן.
- כדי להגן על קבוצות קרבוניל, להוסיף 20 μL של 30 מ"ג מ ל-1 methoxyamine הידרוכלוריד בפירידין לכל אחד מתנול תמציות ומים תמציות (או תמציות מתנול משולב/מים אם משתמש) שלב 2.6, ריקים, תהילה כיול דגימות23. חותם צלוחיות עם כובעים.
התראה: פירידין הוא גם רעיל מאוד וגם דליק. ללבוש את עיקרון השוויון הפוליטי המתאים כדי למנוע העור או קשר עין ולהימנע להבה פתוחה. בנוסף, פירידין volatilizes ב RT גרימת זיהום האוויר מזיקים. עובד רק רווחים מאוורר היטב תחת ברדס fume. - המערבולת שואבת עבור 20 תמציות Sonicate ס' 60 s. לאחר מכן, דגירה תמציות ומפרידה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות ב 100 x g.
הערה: כמות מוגזמת של פחמימות או מלחי יכול לגרום מטבוליטים crystalize לאחר מיובשת למטה. Sonicating את הדגימות יסייע לשקם מטבוליטים crystalized לתוך הכימית derivatizing. - לאחר דגירה, להוסיף μL 80 של N-מתיל - N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide עם trimethylchlorosilane 1% על כל דגימה, המערבולת שואבת עבור 20 תמציות Sonicate ס' 60 s דגירה תמציות שוב צנטריפוגה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ב 100 x g.
- תמציות מגניב כדי RT (20-24 מעלות צלזיוס), ואז להעביר לתוך מבחנות תעשיה GC-MS.
5. GC-MS ניתוח
- מנגינה, לכייל MS לפי המלצות הספק (ראה טבלה של חומרים) לפני ניתוח כדי לוודא המכונה לקרוא נתונים MS כראוי. בדוק כי לחץ גז הליום הוא בטווח הרגישות שצוין.
- נפרד מטבוליטים קוטבי ב GC עמודה (30 m × 0.25 מ מ × 0.25 μm). הגדר את פרוטוקול טמפרטורת התנור כדלקמן: (1) הראשונית בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה, כבש (2) 325 מעלות בקצב של 10 ° C דקות-1, ו- (3) להחזיק ב 325 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- לנתח תמציות באמצעות GC מצמידים פאול יחיד גב' סט הזרקת יציאת טמפרטורה קבועה 250 מעלות צלזיוס מזריקים μL 1 של כל תמצית derivatized במצב splitless.
6. עיבוד נתונים GC-MS
- בדוק את כל קבצי הנתונים כדי לוודא כי הם נתפסו כראוי. שימו לב משמרות אפשריות לגבי השמירה תקן פנימי פעמים ועוצמות כדי לוודא את זה כי הנתונים נלכד בעקביות לאורך כל הניתוח.
- להמיר את תבנית הנתונים של ספק MS ספציפי תבנית MS כללי אם יש צורך. הנתונים הגולמיים לעבד קבצים באמצעות MetaboliteDetector24 כיול השמירה במדדים המבוססים על הסטנדרטים פנימי תהילה. לאחר יישור טיימס השמירה של כל קבצי הנתונים, להמשיך עם deconvolution ולבסוף מטבוליט זיהוי על ידי התאמת מדדים השמירה ו- GC-MS ספקטרה נגד ספריה מטבוליט קוטב FiehnLib25.
- הצלבת הנותרים לא מזוהה מטבוליטים נגד הספרייה NIST14 GC-MS באמצעות התאמת ספקטרלי. אמת ההזדהויות בנפרד כדי לחסל ההזדהויות שווא ולהפחית שגיאות deconvolution.
7. נוזל המדינה NMR ניתוח
- לדלל את שארית המים תמציות (~ 300 µL) ב- 10% (vol/כרך) עם תקן פנימי 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 5 מ מ. לחלופין, לשלב מים, מתנול מחלצת שלב 1 אז resubstitute במים. . בעשותם כך אולם, חלק תרכובות נדיפות יאבדו במהלך השלב להקפיא ייבוש. אמצעי אחסון מדגם הסופי טיפוסי הם בטווח 180-300 µL.
- להעביר את התערובת לתוך צינור זכוכית בורוסיליקט NMR של הקוטר החיצוני (יתר) באיכות גבוהה 3 מ מ.
- לאסוף את הספקטרום באמצעות של ספקטרומטר NMR (אידיאלי לפחות 600 MHz) מצוידים עם 5 מ מ תהודה טריפל מלח-סובלנית החללית קר ואת מגבר קדם קר-פחמן.
- לאסוף ספקטרה 1H 1D באמצעות 1 י גרעיני Overhauser אפקט ספקטרוסקופיה (NOESY) presaturation ניסוי ב 298 K עם 4 s רכישת זמן, עיכוב המיחזור s 1.5, נקודות מורכבים 65,536 סריקות 512.
- לאסוף 2D 1H -13C heteronuclear יחיד-קוונטית קורלציה (HSQC) 1H -1H המתאם הכולל (TOCSY) ספקטרה לעזור בנתינת מטבוליטים ואימות.
- לעבד, להקצות ולאחר ניתוח הספקטרום באמצעות NMR ניתוח תוכנה (ראה טבלה של חומרים) לכמת עוצמות ביחס תקן פנימי. לזהות מטבוליטים על ידי התאמת מידע shift, J-מצמד ועוצמה כימיים בדגימות נגד הספרייה.
הערה: הספרייה משופרת נוספת על ידי מטבוליט יישוב מותאם אישית ותקני מטבוליט תוספות שבוצעו על בסיס קבוע. הפרוטוקול ניתן להשהות בשלב זה, לאחסן את החומר ב-20 ° C.
8. LC-MS Lipidomics ניתוח
- Rewet את תמצית כלורופורם יבשים נוצר במהלך שלב 2.5 עם 200 μL של מתנול.
- מזריקים μL 10 של כל תמצית לתוך כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים אולטרה מצמידים ספקטרומטר מסה Orbitrap באמצעות שלב הפוכה טעונה היברידית משטח עמודה (3.0 מ מ × 150 מ מ × 1.7 μm גודל החלקיקים). הגדר הדרגתי 34-מין (נייד שלב א': acetonitrile/H2O (40:60) המכילה 10 מ מ אמוניום אצטט; נייד שלב ב': acetonitrile/אלכוהול איזופרופיל (10:90) המכילה 10 מ מ אמוניום אצטט) בספיקה של 250 µL לדקה שימוש שליליות וחיוביות יינון המצבים עם אנרגיה גבוהה התנגשות דיסוציאציה, התנגשות המושרה דיסוציאציה.
התראה: Acetonitrile היא העין, עור, ו מגרה בדרכי הנשימה. ללבוש את עיקרון השוויון הפוליטי המתאים. בנוסף, acetonitrile הוא דליק. אל תאפשר ליצור קשר עם סוכני חמצון, גזים רעילים עשויים להיווצר במהלך הצריבה. - להעלות את קבצי הנתונים הגולמיים של LC-MS/MS לנוזל יחד עם קובץ היעד (כלומר, רשימת המינים השומנים > 25,000) עבור מצב יינון בהתאמה (חיובי או שלילי). לעבד את קובץ raw. לאמת באופן ידני את ההזדהויות וכתוצאה מכך על-ידי בדיקת ספקטרום MS/MS נוכחות יונים אבחון, אם ישים, התאמת שבר יונים (למשל, שרשראות acyl השומן), הפרדת איזוטרופי, המוני ppm שגיאה של סימנים מקדימים את, את משך הזמן. לייצא וכתוצאה מכך רשימת ליפידים בביטחון מזוהה בתור קובץ .tsv.
הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות בשלב זה ולאחסן את החומר ב-20 ° C.
9. פרוטאומיקס ניתוח
- תמצית חלבונים על פי פרוטוקול MPLEx20 מהשארית השלב מתנול הנובע שלב 2.4, על ידי נטילת התמצית עם 20 פעמים נפח תמצית של מתנול נוספים קר (-20 ° C).
- השתמש של 1 מ"ל/50 מ"ג מבוסס-סיליקה sorbent (ראה טבלה של חומרים) לעמודות סי18 SPE תנאי עם 3 מ ל מתנול, 2 מ ל 0.1% חומצה trifluoroacetic (TFA) מים, ואחריו התוספת של החילוץ מ שלב 9.1 בקצב לא יותר מ 1 mL/min.
- בעקבות התוספת של המדגם, לשטוף את העמודה עם 4 מ של מים 95:4.9:0.1: acetonitrile:TFA, ואז אפשר להתייבש. הצב צינור אוסף 1.5 mL תחת העמודה SPE ולאחר elute את הדגימה עם 1 מ"ל של 80:19.9:0.1 מתנול: מים: TFA.
- תתרכז תמציות כדי µL 100 תחת ואקום בסיוע להקפיא מייבש, ואז למדוד ריכוז החלבון על ידי bicinchoninic חומצה (BCA) assay ערכי צבע מוחלטים26 באורך-גל של 562 ננומטר.
- צנטריפוגה תמציות ב 10,000 g x 10 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע וכתוצאה מכך ויבש בגדר שנותרו תחת ואקום במשך 5 דק Resuspend בגדר חלבון במים כדי ריכוז סופי של פפטיד 0.1 µg לכל µL.
- להוסיף dithiothreitol ריכוז הסופי של 5 מ מ, דגירה ב 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות Dilute 10-fold עם 100 מ מ NH4HCO3מ' 8 אוריאה פתרון דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 h בנוכחות 1 מ"מ CaCl2 טריפסין חזירי-1:50 אנזים לחלבון יחס.
הערה: פרוטוקול ניתן להשהות בשלב זה ולאחסן חומרים ב-20 ° C. - תמציות נפרד באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית באמצעות של שיפוע מעריכית של חומצה פורמית 0.1% מים שלב ניידים (א), חומצה פורמית 0.1% בשלב נייד acetonitrile (ב)-10 kpsi ו- nL 500 דקות-1.
- מציגים את eluent שנוצר לתוך מצמידים ESI ספקטרומטר מסה איסוף ספקטרה מ- 400-2,000 מ'/z עם רזולוציה 100,000- מ/z 400 בספקטרומטר מסה Orbitrap מלכודת יונים ליניארי (LTQ).
- להמיר קבצי RAW ספקטרה לתבנית mzML באמצעות msConvert או ProteoWizard לקבל את כל הפרמטרים ברירת המחדל. השתמש בכלי החיפוש מסד נתונים אוניברסלי MSGFPlus לחפש proteomes שנוצר מול מסד נתונים חלבון יישוב של רצפי חלבונים החזוי של הגנום metagenome רלוונטי מורכבים.
- צרף מזהמים הנפוצים (למשל, טריפסין, קרטין, אלבומין) והסר כל רצפי חלבונים המשוכפלת בדיוק כדי לשפר את הסטטיסטיקה פפטיד-כדי-מסה-ספקטרום התאמה. הערכת התוצאות ההסתברות ספקטרלי MSGF שנוצר כדי לקבוע איזו תחרות פפטיד-כדי-מסה-ספקטרום הוא הטוב ביותר. השתמש בערך Q-MSGFPlus כדי לסנן את הערימה הנתונים כולה 1% גילוי שקר דרג (פד).
10. גליקומיקס ניתוח ובניית רשת מטבולית
- בצע הידור כל נוסחה מולקולרית של המטבוליט, לזהות בשלבים 3, 6, 7 ו- 8 לתוך מסד נתונים יחיד של מטבוליטים נוכח הדגימות. משלבים מטבוליטים אלה עם המספרים אנזים הנציבות (EC) או קג הומולוגיה (KO) של אנזימים שזוהו בשלב 9. חפש את הנתונים (dataset) משולב במסד הנתונים27 קג, מסלולים מטבוליים סעיף.
- באופן ידני להעריך תוצאות לזהות מסלולים הסביר ביותר ולשלב אותם למודל מטבולית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנו לבצע את הפרוטוקול המתואר ניתוח משלימים, בהשוואה כבול עם עומק לביצה S1 באתר אשוחית, Peatlands תגובה תחת שינוי סביבות (אשוחית) במינסוטה, ארה ב. תוצאות אלו מושווים לאלו שקיבלו והטראגי, הפן משוודיה הצפוני כדי להראות כמה אתרים עשויים להשתנות בפעילויות מטבוליט של אנזים. זיהינו אנזימים 3,312 בניתוח פרוטאומיקס. ניתוח של פעילות אנזימים עם עומק מגלה כי מספר אנזימים מסרב בחדות בין 15 ס מ 45 ס"מ לביצה אשוחית (איור 1).
בעוד התוצאות פרוטאומיקס מצביעות על אילו חלבונים באים לידי ביטוי, הנתונים מטבולית להראות אילו תגובות באמת מתרחשים. בסך הכל, זיהינו 67,040 מטבוליטים (כולל שומנים) בכל הדגימות כבול משילוב של FTICR-MS, NMR, GC-MS, וניתוחים LC-MS. אלה, היינו יכולים להקצות נוסחה מולקולרית 15,385 תרכובות (איור 2). הנתונים המשולבים מטבולית מתפרשת על מגוון של הברית חמצון, גושים, ושיעורי מורכבים.
זה בדרך כלל הוא מדמיין באמצעות דיאגרמת ון Krevelen בו היחס אטומי H/C של נוסחת מזוהה מותוות נגד שלהם יחס-אטומיים O/C28. כללנו מימד נוסף לתבנית 2D אופייני, המתארים את NOSC על-ידי צבע קידוד הסמלים המייצגים הנוסחה בודדים (איור 3 ו- 4 באיור). עם הגדלת עומק לביצה אשוחית, יש עלייה במספר הכולל של מטבוליטים משניים גדולה המזוהה על-ידי FTICR-MS, בפרט מאוד מרוכז (השמאלי התחתון של העלילה ואן Krevelen), מוקשה נוסחות (למעלה של העלילה) (איור 4 ). מעל תהומות אותו יש ירידה במספר של תרכובות אנרגטי מאוד קטן המזוהה על-ידי GC-MS, ליפידים (איור 5). זה יכול להציע כי ליפידים של מטבוליטים קטן צורכים ב כבול השטח לפני שהגיע המעמקים עמוק או כי פירוק בבתי כבול עמוק מהירים יותר על פני השטח כך תרכובות advecting כלפי מטה במהירות צורכים. הבחנה בין השערות מתחרות שתי אלה דורש הבנה ברמת התהליך של C רכיבה על אופניים באתר. כזו הבנה ברמת התהליך ניתן להשיג רק על ידי צימוד datasets גליקומיקס, פרוטאומיקס. אנו מצליחים לעשות זאת על-ידי הצלב-אימות FTICR-MS, GC-MS, משולב LC-MS, NMR זיהו מטבוליטים מול מסד הנתונים קג. בעשותו כן, אנו מוצאים כי תרכובות זיהינו הם מעורבים מסלולים מטבוליים משותפים כגון חומצה tricarboxylic (TCA) מחזור, גליקוליזה מטבוליזם. מאז מטבוליטים בודדים יכולים להיות מעורבים מספר אישור מסלולים עם האנזימים מגבירה את האמון שלנו הקצאת מסלולים (איור 6).
באמצעות מיפוי זה אנו מוצאים ראיות של חילוף החומרים סוכרוז, עמילן כבול פני השטח, בעוד במעמקים עמוק פירובט ומוצרים אחרים תסיסה לבנות (איור 6). תוצאות אלו הם עקביים עם ההנחה הראשונה כי סוכרים אחרים מטבוליטים אנרגטי הם השפיל ב כבול פני השטח, ואינם מגיעים המעמקים כבול עמוק יותר. כפי שניתן לראות באיור5, סוכר (NOSC = 0) וחומצות אמינו (0 < NOSC < 1) צורכים ב כבול פני השטח, תוך ליפידים (-2 < NOSC <-1) מופיעים לצבור עם עומק. זה עקבי עם ציפיות בהתבסס על ערכי NOSC כי תרכובות NOSC גבוהה יותר הם יותר בקלות מפורק בזמן תרכובות NOSC התחתון מתעקש מאוד אנאירובית (קרי, תה-מוגבלת) בתנאים של כבול מהסבא. גישה זו גם בהצלחה מבדיל בין סוגי אדמה של סביבות שונות. לדוגמה, חומר אורגני בקרקע מ boreal peatland נראה שונה מאלכוהול מאשר והטראגי peatland, כמו גם בתוך fen, הביצות בתוך אזור קפואה. תוצאות אלה הן בקנה אחד עם מחקר קודם הראה הבדלים גאוכימיה האתר בין אלה בתי גידול29, רומז גאוכימיה באתר הזה יש השפעה גדולה על השפלה מיקרוביאלית של C מתחת לאדמה.
איור 1 : ניתוח פרוטאומיקס מציין ריבוד העומק חזקה במספר אנזימים. ברים מציינים ממוצעים וציין קווי שגיאה אחת סטיית התקן של abundances. הדבר מצביע על כי מיקרואורגניזמים הם הפעילים ביותר על גבי המשטח כבול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : מספר תרכובות המזוהה על-ידי כל טכניקה משטח כבול (< 30 ס מ) של כל גידול, כמו גם את אמצע (45 ס מ), כבול עמוק (87 ס מ) מן אשוחית לביצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : תרשים ואן Krevelen (אטומי H/C לעומת O/C של כל אחד מזוהה נוסחה מולקולרית) על פני השטח (15 ס מ) אשוחית בביצה עומק כדי להדגים את הכיסוי של תרכובות מאופיין על ידי כל טכניקה. FTICR-MS מאפשר לנו לזהות את המספר הגדול ביותר של תרכובות (במעגלים קטנים), בעוד GC-MS (משולשים) שטוב הבחנה וזיהוי סוכרים (H/C = 2 ו- O/C = 1). ספקטרוסקופיה NMR (ריבועים) מספק מידע כמותי על תרכובות אנרגטית חשובה כגון סוכרים, חומצות אמינו, פירובט, וכו '. LC-MS (יהלומים) מספק מידע על שומנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : תרשים ואן Krevelen (אטומי H/C לעומת O/C של כל אחד מזוהה נוסחה מולקולרית) עבור העמוק (87 ס"מ) אשוחית בביצה עומק כדי להדגים את הכיסוי של תרכובות מאופיין על ידי כל טכניקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : השבר היחסי של מחלקות כימיות שונות זיהו ויה טכניקות שונות בעומקים שונים. ברים מותוות כמו ממוצעים עבור כל סטיית תקן עומק אחד ±. הלימודים המותווים כוללים חומצות אמינו sphingolipids (Cer), glycerophosphocholines (PC), phosphoethanolamines (PE), diacylclyceroltrihomoserine (DGTSA), diacylglycerol (DG), triacylglycerols (TG), סוכרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : שילוב של תוצאות כדי ליצור רשת מטבולית. עומק הפצות של מטבוליטים המזוהה על-ידי NMR () ו- GC-MS (b), מפושטת מטבולית (c) מופיעה מפה מספר נבחר של המרות מזוהה-אשוחית הביצות. . הקופסאות הירוקות מצביעות על מטבוליטים לירידה עם עומק, חום תיבות מציינות מטבוליטים המגבירים עם עומק. חיצים חיבור ירוקים מציינים אנזים שזוהתה שלנו dataset המתווכות השינוי המוצע (אנזים EC מספרים הצביע לצד חצים). חיצים חיבור אפורים מציינים המרות שעבורו אנזימים לא אותרו ב- dataset שלנו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יחיד-התפוקה, זרם מצמידים במלואו ניתוח שימוש כדי לאפיין מטבוליטים, את פרוטאום מספק תובנות מסלולים מאת C איזה רכיבה על אופניים היא היווצרותן של מערכת אקולוגית מורכבת. אדמה, כבול הן מטריצות הטרוגנית, לכן, אחד הצעדים הקריטיים של שיטה זו מתרחשת בשלבים המוקדמים ביותר להבטיח כי ההתחלה כבול או אדמה החומר הוא מאוד הומוגנית. עדיף לטחון את הדגימה גם אגרגטים יכול להפחית את יעילות החילוץ. . זה בעיה מסוימת עבור צבורים ותנאי קרקעות עם C נמוך ואת התוכן מינרלים גבוהה שיחייבו את השימוש מטחנה נירוסטה הכדור כדי שלמאחה homogenize כי הטרוגניות המרחבי של קרקעות, כבול בתוך אתר נסיוני עשויה להיות גבוהה, משכפל ביולוגי מומלץ מאוד.
שיטה זו משתמשת ממיסים 3: מים, מתנול, כלורופורם, ואשר הטיה סוגי תרכובות ניתן לחלץ. בעקרון, זו שיטת החילוץ רציפים צריך solubilize תרכובות המכסים מגוון רחב קוטביות. עם זאת, אלה ממיסים לא הממוטבות חילוץ מתחמי דשן אורגני מינרלי או קומפלקסים מאוד מיוצב. אם תרכובות כגון עניין, ממיסים קשים כגון חומצות חזקות ובסיסים עדיפים, אך חריפות יותר בתהליכי כריה יכול לשנות את הכימיה של הדגימות. שילוב כזה ממיסים בסוף הרצף החילוץ יכול למזער את האפקט הזה. בנוסף, כלורופורם בטל קליני חשוב אדמה, כבול בקטריאלי פתוגנים ויראליים, ואת אחרים פתוגניים גורמי מחלות ביולוגיים על ידי המסת שומנים קרום התא. לפיכך, שילוב כלורופורם בפרוטוקול החילוץ יקטין את הסיכונים המעורבים בלימודי ביולוגיה של דגימות שעשויות להיות נגוע על ידי פתוגנים מאזורים שונים בעולם. אם ישנן דאגות לגבי תאי חיידקים מתים, פסולת או חלקיקים לאחר החילוץ, סינון תמציות דרך מסנן סיבי זכוכית 0.2 µm מומלץ.
כדי לייעל את התהליך, את המים ואת מתנול תמציות יכול להיות משולב לניתוח GC-MS במהלך שלב 4.1. עם זאת, תמציות אלה חייב להשאר מופרדים לניתוח FTICR-MS עקב בעיות יעילות יינון עם מקור ESI. היתרון שבהפעלת תמצית המשולב ב- GC-MS הוא יותר מטבוליטים (המכסים מגוון גדול יותר של קוטביות) יזוהו. החיסרון של שילוב של תמציות בשלב זה הוא אחד הגדולים מטבוליטים חשובים בעיבוד מיקרוביאלית של חומר אורגני מתנול. עקבות של מתנול יישאר תמיד בדוגמת משולב, גם לאחר ייבוש, אז אם מתנול הוא מטבוליט של עניין, תמצית מים יש להפעיל בנפרד. יש פקדים טוב עם analytes לא יעזור גם בזיהוי זיהום פוטנציאליים הדגימות.
בשלב 7.1 של הכנת תמציות לניתוח NMR, כמו הניתוח של GC-MS, גם את תמצית מים לבד או בשילוב המים, ניתן להשתמש במתנול תמציות. החסרונות של עושה את זה דומים לאלה לספור בפיסקה הקודמת. היתרון של שילוב תמציות מתנול ומים הוא חלק מטבוליטים פחות קוטב זה הם solubilized של השבר מתנול יזוהו. עם זאת, בגלל השלב להקפיא ייבוש, תרכובות נדיפות יותר רבים יאבדו. זהו חיסרון מסוים אם לכימות חומצות שומן נדיפות הוא מרכיב קריטי של הניסוי.
בהליך זה לזיהוי פרוטאומיקס, פפטידים tryptic באופן מלא רק פעילות חיפוש, ובכך אנדוגני peptidase, יהיה חסר במקור fragmentations. מצד שני, מתיונין מחמצנים עשויים להיחשב כמו שינוי post-translational עבור המועמדים פפטיד כמו שינוי זה בדרך כלל מתרחשת במהלך דגימה עיבוד וטיפול. כימות של אנזימים באמצעות פפטיד • תנאי אזורי יכול להיעשות, אבל מההיקף של פרויקט זה.
התפתחויות אחרונות רבים הניתוח של NOM ופרמטרים מיקרוביאלי מספקים שפע של טכניקות להבנת C אורגני רכיבה על אופניים. על ידי שילוב שיטות אלה ב פרוטוקול מפושטת יחיד, אנו משיגים נוף הרומן של התהליכים המתרחשים. צימוד הניתוח פרוטאומיקס עם הניתוחים מטבולית מספק ראיות המאמת כי תגובת מתרחש בעצם משכנעות. לבד מטבולית ניתוח מוגבל בכך מודיע לנו אילו מטבוליטים גבוה או נמוך ריכוז בהשוואות בין אתרים או אחרי אפקט הטיפול, אך אינם יכולים להבחין הגורמים לשינויים אלה. לדוגמה, זיהינו הפוחתת ריכוזי סוכר עם עומק לביצה, אך ללא מידע זה לא ברור הירידה עם עומק תשומות איטי או מהיר השפלה כבול עמוק. ניתוח של פרוטאום וביטוי אנזים הפוחתת עם עומק מאפשר לנו לדחות את ההשערה השנייה. אלא התוצאות שלנו הם עקביים עם סוכר מהירה השפלה תשומות המגביל השטח כבול למעמקים עמוק יותר. תובנות אלו מסוים הם רק אפשרי כאשר כל הטכניקות נחשבות במשולב כפי כל אחד מהם מספק ייחודי, אבל קריטי פיסת C רכיבה על אופניים פאזל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות ג'יי. פי Chanton במקום Kostka, קולטון ועותרת לקבלת סיוע עם איסוף דגימות כבול. חלקים של עבודה זו נערכו במעבדה סביבתיים מולקולרית מדעי, DOE Office של המשתמש מתקן מדעי בחסות את Office הביולוגיים ואת המחקר הסביבתי. PNNL מופעל על ידי Battelle על האלמונית תחת חוזה דה-AC05-76RL01830. עבודה זו נתמכה על ידי משרד האנרגיה האמריקני, משרד המדע, המחקר הביולוגי של משרד איכות הסביבה (מענקים: דה-AC05-00OR22725, דה-SC0004632, DESC0010580, דה-SC0012088 ו- DE-SC0014416).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| methoxyamine hydrochloride | Sigma Aldrich | 226904 | derivitization agent |
| 5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe | Bruker | instrumentation | |
| capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) | Agilent | AG19091S-433 | instrumentation |
| reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size) | ThermoFisher | instrumentation | |
| 2 mL glass vials | VWR International | 46610-722 | sample vials |
| autosampler vials | VWR International | 97055-324; 9467671 | sample vials |
| Chloroform | VWR International | JT9174-3 | solvent |
| Ethanol | VWR International | BDH67002.400 | solvent |
| methanol | VWR International | BDH85681.400 | solvent |
| pyridine | VWR International | BDH67007.400 | solvent |
| 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 | Sigma Aldrich | 178837 | standard |
| C8-C24 fatty acid methyl ester | Sigma Aldrich | CRM18918 | standard |
| N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide | Sigma Aldrich | 24589-78-4 | standard |
| Suwanee River Fulvic Acid standard | International Humic Substances Society | 2S101F | standard |
| trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 89595 | standard |
| Tuning Solution | Agilent | ||
| FTICR-MS analysis software | Bruker | Compass DataAnalysis 4.1 | |
| Formularity Software | Pacific Northwest National Laboratory | Formularity | available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity |
| GC-MS | Agilent | Agilent GC 7890A with MSD 5975C | |
| silica-based sorbent | Phenomenex (Torrance, CA) | Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK) | |
| NMR TUBE 3MM 8 150 CS5 | VWR International | KT897820-0008 | NMR tube |
| Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer | Varian Inova | Varian Direct Drive 600-MHz | NMR spectrometer |
| Chenomx NMR Suite 8.3 | Chenomx | Chenomx NMR Suite | NMR software |
| ultra-performance liquid chromatograph | waters | Aquity UPLC H | liquid chromatograph |
| Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer | ThermoFisher | Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos | mass spectrometer |
References
- Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. The carbon balance of North American wetlands. Wetlands. 26 (4), 889-916 (2006).
- Wilson, R. M., et al. Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone permafrost. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (2), 387-404 (2017).
- Broder, T., Knorr, K. H., Biester, H. Changes in dissolved organic matter quality in a peatland and forest headwater stream as a function of seasonality and hydrologic conditions. Hydrology and Earth System Sciences. 21 (4), 2035-2051 (2017).
- Ejarque, E., et al. Quality and reactivity of dissolved organic matter in a Mediterranean river across hydrological and spatial gradients. Science of The Total Environment. 599, 1802-1812 (2017).
- Valenzuela, E. I., et al. Anaerobic methane oxidation driven by microbial reduction of natural organic matter in a tropical wetland. Applied and Environmental Microbiology. 83 (11), e00645-e00617 (2017).
- Lehmann, J., Kleber, M. The contentious nature of soil organic matter. Nature. 528 (7580), 60-68 (2015).
- Keiluweit, M., Nico, P. S., Kleber, M., Fendorf, S. Are oxygen limitations under recognized regulators of organic carbon turnover in upland soils? Biogeochemistry. 127 (2-3), 157-171 (2016).
- LaRowe, D. E., Van Cappellen, P. Degradation of natural organic matter: A thermodynamic analysis. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75 (8), 2030-2042 (2011).
- Wilson, R. M., et al. Hydrogenation of organic matter as a terminal electron sink sustains high CO2: CH4 production ratios during anaerobic decomposition. Organic Geochemistry. 112, 22-32 (2017).
- Ye, R., Jin, Q., Bohannan, B., Keller, J. K., Bridgham, S. D. Homoacetogenesis: A potentially underappreciated carbon pathway in peatlands. Soil Biology and Biochemistry. 68, 385-391 (2014).
- Neubauer, S. C., Megonigal, J. P. Moving beyond global warming potentials to quantify the climatic role of ecosystems. Ecosystems. 18 (6), 1000-1013 (2015).
- Ma, S., et al. Data-Constrained Projections of Methane Fluxes in a Northern Minnesota Peatland in Response to Elevated CO2 and Warming. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (11), 2841-2861 (2017).
- Conrad, R. Contribution of hydrogen to methane production and control of hydrogen concentrations in methanogenic soils and sediments. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Ecology. 28 (3), 193-202 (1999).
- Cunada, C. L., Lesack, L. F. W., Tank, S. E. Seasonal dynamics of dissolved methane in lakes of the Mackenzie Delta and the role of carbon substrate quality. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123 (2), 591-609 (2018).
- Wilson, R. M., Tfaily, M. M. Advanced molecular techniques provide new rigorous tools for characterizing organic matter quality in complex systems. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123 (6), 1790-1795 (2018).
- Borton, M. A., et al. Coupled laboratory and field investigations resolve microbial interactions that underpin persistence in hydraulically fractured shales. Proceedingsof the National Academy of Sciences. 115 (28), E6585-E6659 (2018).
- Tang, K., Page, J. S., Smith, R. D. Charge competition and the linear dynamic range of detection in electrospray ionization mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 15 (10), 1416-1423 (2004).
- Boiteau, R. M., et al. Structure Elucidation of Unknown Metabolites in Metabolomics by Combined NMR and MS/MS Prediction. Metabolites. 8 (1), 8 (2018).
- Walker, L. R., et al. Unambiguous Metabolite Identification in High-throughput Metabolomics by Hybrid 1DNMR/ESI MS Approach. Magnetic Resonance in Chemistry. 54 (12), 998-1003 (2016).
- Nicora, C. D., Burnum-Johnson, K. E., Nakayasu, E. S., Casey, C. P., White III, R. A., Roy Chowdhury, T., Kyle, J. E., Kim, Y. M., Smith, R. D., Metz, T. O., Jansson, J. K., Baker, E. S. The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples. J. Vis. Exp. (135), e57343 (2018).
- Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. Extraction of fatty acid. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
- Tolic, N., et al. Formularity: software for automated formula assignment of natural and other organic matter from ultrahigh-resolution mass spectra. Analytical Chemistry. 89 (23), 12659-12665 (2017).
- Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Frontiers in microbiology. 6, 209 (2015).
- Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical Chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
- Kind, T., et al. FiehnLib: mass spectral and retention index libraries for metabolomics based on quadrupole and time-of-flight gas chromatography/mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (24), 10038-10048 (2009).
- Kyle, J. E., et al. LIQUID: an-open source software for identifying lipids in LC-MS/MS-based lipidomics data. Bioinformatics. 33 (11), 1744-1746 (2017).
- Kanehisa, M. Enzyme annotation and metabolic reconstruction using KEGG. Protein Function Prediction: Methods and Protocols. 1611, 135-145 (2017).
- Van Krevelen, D. W. Graphical-statistical method for the study of structure and reaction processes of coal. Fuel. 29, 269-284 (1950).
- Hodgkins, S. B., et al. Changes in peat chemistry associated with permafrost thaw increase greenhouse gas production. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (16), 5819-5824 (2014).
