Summary
Dieses Protokoll beschreibt einen einzigen Durchsatz für ergänzende analytische und Omics Techniken, die ihren Höhepunkt in einer voll gepaart Charakterisierung von natürlichen organischen Stoffen und mikrobielle Proteomics in verschiedenen Ökosystemen. Dieser Ansatz ermöglicht die robuste Vergleiche zur Identifizierung von Stoffwechselwegen und Transformationen für Treibhausgasproduktion Beschreibung und Vorhersage Reaktionen auf Veränderungen der Umwelt wichtig.
Abstract
Natürliche organischer Substanz (NOM) besteht aus eine hochkomplexe Mischung aus Tausenden von organischen Verbindungen, die in der Vergangenheit zur Charakterisierung schwierig erwiesen. Jedoch gekoppelt um die thermodynamischen und kinetischen Steuerelemente auf (Kohlendioxid [CO2] und [CH4] Methan) Treibhausgasproduktion infolge der Zersetzung des NOM zu verstehen, eine Charakterisierung molekularer Ebene mit mikrobiellen Proteom-Analyse ist notwendig. Darüber hinaus sollen Klima- und Umweltveränderungen natürlicher Ökosysteme, potenziell stören komplexe Interaktionen, die Einfluss auf die Versorgung mit organischer Substrate und die Mikroorganismen die Transformationen durchführen, lassen. Eine detaillierte molekulare Charakterisierung der organischen Substanz, mikrobielle Proteomics und die Wege und Transformationen, die durch die organischer Substanz zersetzt ist werden die Richtung und das Ausmaß der Auswirkungen von Veränderungen der Umwelt vorherzusagen. Dieser Artikel beschreibt einen methodischen Durchsatz für umfassende Metabolit Charakterisierung in einer einzigen Probe durch direkte Injektion Fourier Transform Ion Zyklotron Resonanz Massenspektrometrie (FTICR-MS), Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) Kernresonanzspektroskopie (NMR), Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) und Proteomics Analysen. Das Ergebnis ist ein vollständig gepaart Dataset, das verbessert die statistische Zuverlässigkeit für Wege der Abbau organischer Materie, die sich daraus ergebenden CO2 und CH4 Produktionsraten und ihre Antworten auf ökologische Störung ableiten. Hier präsentieren wir die Ergebnisse der Anwendung dieser Methode auf NOM Proben aus Mooren; das Protokoll ist jedoch für jede NOM-Probe (z. B. Torf, bewaldeten Böden, marinen Sedimenten, etc.).
Introduction
Weltweit sind Feuchtgebiete schätzungsweise 529 Pg Kohlenstoff (C), enthalten meist als organischen C in Torf Einlagen1begraben. Derzeit wirken solche Mooren als Netto C Senke, Sequestrierung 29 Tg C y-1 in Nordamerika allein1. Jedoch kann ökologische Störungen wie Entwässerung, Brände, Dürre und wärmeren Temperaturen diese C-Senke durch Erhöhung der Abbau organischer Materie, was zu erhöhten C Verluste über Treibhausgas aufgehoben (Kohlendioxid [CO2] und [CH-4] Methan) Produktion1,2. Klimawandel kann zu C beitragen, wenn wärmere Temperaturen oder trockener Bedingungen schneller C Zersetzung durch Mikroorganismen stimuliert. Alternativ können höhere Temperaturen und Luftkonzentrationen CO2 Primärproduktion um mehr CO2 als organischem Kohlenstoff (OC) absondern stimulieren. In welchem Umfang und wie schnell diese OC ist dann zerlegt in CO2 und CH4 hängt die komplexen Wechselwirkungen zwischen Elektron Spender Substrate, die Verfügbarkeit von Elektronen-Akzeptoren und die Mikroorganismen, die vermitteln die Diese Transformation. In vielen Fällen die Mechanismen sind nicht gut charakterisierten, damit ihre Reaktion auf ökologische Störungen ist nicht gut eingeschränkt und es bleibt unklar, was das Ergebnis des Klimawandels auf die Kohlenstoffbilanz in Mooren Ökosysteme.
Die komplexe Natur der natürlichen organischen Substanz (NOM) hat sogar die organischen Verbindungen im NOM Mischungen historisch schwierig zu identifizieren. Die jüngsten Fortschritte haben unsere Fähigkeit, Verbindungen, traditionell zu charakterisieren und zu einem gewissen Grad als widerspenstige Huminsäuren oder Fulvinsäuren Verbindungen3,4,5angesehen werden, weiterhin verbessert. Wir verstehen jetzt, dass viele dieser Verbindungen eigentlich mikrobiell verfügbar sind und zerlegt werden, können wenn eine geeignete terminal Elektronen-Akzeptor (Tee) zur Verfügung6,7 erfolgt. Berechnung der nominellen Oxidationsstufe des Kohlenstoffs (NOSC) für eine Verbindung bietet eine Metrik für die Vorhersage des Potenzials für die Zersetzung und die Energieausbeute des Tees erforderlich. Es erfordert jedoch eine Charakterisierung molekularer Ebene der organischen Substanz7. NOSC errechnet sich aus der Summenformel über die folgende Gleichung7: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, wo z der Nettoladung ist. NOSC korreliert mit der thermodynamischen treibende Kraft8, wobei Verbindungen mit höheren NOSC leichter sind zu verschlechtern, während Verbindungen mit niedriger NOSC bedürfen zu ihrer zunehmend energetische Tees reduziert werden. Verbindungen mit weniger als −2 NOSC erfordern eine hohe Energie Gewinnung Tees wie O2, Nitrat oder MnIV, und kann nicht abgebaut werden, durch die häufig auftretenden niedriger Energie Gewinnung Teesorten wie FeIII oder Sulfat-7. Dies ist ein wichtiger Aspekt in den aufgeweichten anoxischen Bedingungen in Feuchtgebiete, wo O2 und andere hochenergetische nachgeben Tees knapp9 sind und deshalb der Abbau von niedrigeren NOSC Verbindungen unter diesen Bedingungen thermodynamisch begrenzt. Ökologische Störung beeinflussen den thermodynamischen Zustand des Ökosystems durch hydrologische Veränderungen, die Einfluss auf O2 (die energiereichsten Elektronen-Akzeptor), Veränderungen der organischen Substraten und Elektronen-Akzeptoren zur Verfügung gestellt, von primären Produktion, und in geringerem Maße von der Temperatur. Ein wichtiges Beispiel für die Temperatureffekte in Feuchtgebieten Systemen tritt in Bezug auf die Trade-off zwischen Homoacetogenesis (d.h., Acetat-Produktion von CO2 und H2) und Hydrogenotrophic () Methanogenese tritt d. h., CH4 Produktion von CO2 und H2). Bei niedrigen Temperaturen scheint es, dass Homoacetogenesis etwas begünstigt wird, während wärmere Temperaturen CH4 Produktion10bevorzugen. Diese Temperatur kann wichtige Implikationen für die Reaktion von Ökosystemen zu wechselnden Klima, wirken wie CH4 Treibhausgas ist viel stärker als CO211 und damit Steigerung der Produktion von CH4 auf Kosten des CO2 bei wärmeren Temperaturen kann auf ein positives Feedback mit Erwärmung des Klimas beitragen.
Mooren produzieren weltweit bedeutende Mengen von CO2 und CH46über mikrobielle Atmung von natürlich vorkommendem organische Materie. Die NOSC der organischen Kohlenstoff Substrate bestimmt den relativen Anteil der CO2: CH4 hergestellt, was ein kritischer Parameter aufgrund der höheren Strahlungsantriebs CH4 im Vergleich zu CO211, sondern auch, weil Modellierung Bemühungen haben dieses Verhältnis als ein kritischer Parameter für die Schätzung der C Flussmittel in Mooren12identifiziert. In Abwesenheit von terminal Elektronen Akzeptoren als CO2, es kann durch Elektron Balance gezeigt werden, dass Bio C Substrate mit NOSC > 0 wird CO-2produzieren: CH4 > 1, Bio C mit NOSC = 0 produziert CO2 und CH4 in äquimolaren Verhältnis und Bio C mit NOSC erzeugt < 1 CO2: CH4 < 113. Zersetzung von OC in natürlichen Ökosystemen wird durch Mikroorganismen, vermittelt, so dass auch beim Abbau eines bestimmten Stoffes thermodynamisch möglich ist, es kinetisch durch die Aktivität der mikrobiellen Enzyme und unter anoxischen Bedingungen von begrenzt ist die thermodynamische Antriebskraft (d.h.NOSC)7. Bis jetzt hat es schwierig, um die organische Substanz vollständig zu charakterisieren, da die Vielfalt der Verbindungen, die verschiedenen komplementäre Techniken für deren Charakterisierung erfordert. Die jüngsten Fortschritte haben die Lücke geschlossen; mit einer Suite von analytischen Techniken können wir eine Vielzahl von organischen Verbindungen, die Bereitstellung von Charakterisierung molekularer Ebene und in einigen Fällen Quantifizierung von kleinen primären Metaboliten wie Glukose bis zu 800 Da Poly-Heterozyklen analysieren. Zuvor würde so große komplexe Moleküle einfach als Lignin-ähnliche oder Tannin-Like und angenommenen widerspenstigen gewesen zu sein geprägt haben. Charakterisierung der molekularen Ebene, ermöglicht jedoch die Berechnung der NOSC für selbst diese große komplexe Moleküle. Diese NOSC Werte sind linear korreliert mit der thermodynamischen Motor ermöglicht eine Beurteilung der Qualität von organischem Material zur Zersetzung, die in vielen Fällen zeigt, dass diese komplexe Moleküle tatsächlich mikrobiell sein kann abbaubare auch unter anoxischen Bedingungen, die in den Feuchtgebieten herrschen.
Seit Einführung von O2 organischen Substanz von fast allen natürlich NOSC Beobachtungswerte zerlegt werden kann, konzentrieren hier wir uns auf Veränderungen in der organischen Substanz und mikrobielle Proteomics Haupttreiber im Feuchtgebiet (d. h., sein dürften begrenzte O2) Systeme. Jedoch können die Techniken, die wir besprechen auf organischer Substanz aus jedem Ökosystem angewendet werden. Allgemein, Bulk Messungen basierend auf optischen und Fluoreszenz-Analysen wurden verwendet, um organische Substanz Qualität3,14zu beurteilen. Bei der Verwendung von Bulk-Messungen wie diese sind feine Details verloren wie die große Zahl von Molekülen zusammen unter Oberbegriffe wie Humics oder Fulvics kategorisiert werden. Die Definitionen dieser Kategorien sind nicht gut eingeschränkt und in der Tat variieren von Studie zu Studie machen Vergleiche unmöglich. Weiter, Bulk-Messungen nicht die molekularen Details zur Berechnung der Thermodynamik für das System und daher wirklich Beurteilung organischer Qualität15zurückbleiben.
Einzeltechniken wie Fourier transformieren Ion Cyclotron Resonance Massenspektrometrie (FTICR-MS), Kernresonanzspektroskopie (NMR), Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) und Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) tun Geben Sie die Details solcher molekularer Ebene. Während jede dieser Techniken seine eigenen Grenzen präsentiert, bringen sie auch ihre eigenen Stärken, die in einem integrierten Ansatz zu molekularen Details zur Quantifizierung organischer Qualität in einem rigorosen thermodynamischen Sinne notwendig genutzt werden können . GC-MS ist nützlich zur Identifikation von kritischen kleine Metaboliten, die voraussichtlich proximalen Einfluss auf CO2 und CH4 Produktion (z. B.Glukose, Acetat, etc.); jedoch, GC-MS erfordert Überprüfung gegen einen Standard und beschränkt sich daher auf bereits bekannte Verbindungen, die in der Datenbank, die Identifizierung der neuartige Substanzen zu verhindern. GC-MS ist eine semi-qualitative Technik erlaubt Rückschlüsse über die Veränderungen im relativen Konzentrationen, aber nicht der Information tatsächliche Konzentration notwendig für die Berechnung der Gibb freie Energien zum Beispiel. Zu guter Letzt GC-MS erfordert Derivatisierung von Molekülen vor der Analyse die Auflösung kleiner als ~ 400 Da Verbindungen begrenzt und flüchtige Alkohole sind verloren während der Trocknung.
Eindimensionale (1D) 1H flüssigen Zustand NMR ermöglicht hoch quantitative Charakterisierung der kleinen Metaboliten (einschließlich primäre kleines Molekulargewicht Metaboliten und flüchtigen Stoffen wie Alkohole, Acetat, Aceton, Formiat, Pyruvat, Succinat, kurzkettige Fettsäuren, sowie eine Reihe von Kohlenhydraten notorisch abwesend oder gefährdete aus MS-basierte Methoden) und deren Konzentrationen sind besonders nützlich für die Berechnung der thermodynamischen Parameter. Doch wie GC-MS, 1D NMR von komplexen Gemischen erfordert Standardisierung im Vergleich zu einer Datenbank und daher nicht allein erlauben einfache Identifizierung von neuartigen Verbindungen, die reich an komplexen Natur- und veränderten Ökosysteme sein dürften. Darüber hinaus NMR ist unempfindlicher als die MS-basierte Techniken und Profilierung quantitative Metabolit daher erst ab 1 µM mit NMR-Systeme ausgestattet mit Helium gekühlt Kälte-Sonden erreicht ist. Nicht weithin geschätzt, einige NMR Kälte-Sonden sind salztoleranten und ökologischen Mischung Analyse im Beisein von millimolaren Salzkonzentrationen bei Verwendung in kleineren Durchmesser (< 3 mm Außendurchmesser) Probe Rohre16ermöglichen. Eine weitere Komplikation der NMR ist jedoch, dass hohe Mengen an paramagnetischen Metalle und Mineralien (z.B.Fe und Mn über 1-3 wt %(), die reichlich in Hochland Böden lässt, können spektrale Funktionen zu erweitern und erschweren die Interpretation von NMR-Spektren . Mit Festphasenextraktion (SPE) können Hilfe bei der Interpretation von NMR und MS-basierte Metabolomik Methoden durch die Verringerung der Mineralsalze und spektrale Qualitätssteigerung.
FTICR-MS durch direkte Injektion ist eine hochsensible Technik in der Lage, Zehntausende von Metaboliten aus einer einzigen Probe zu erkennen, aber es erfasst nicht die kritische kleine Metaboliten wie Acetat, Pyruvat und Succinat und ist notorisch schwierig zu Verwenden Sie für Zucker und andere Kohlenhydrate17, noch enthält es quantitative Angaben. Jedoch im Gegensatz zu den anderen Techniken FTICR-MS zeichnet sich bei identifizieren und neuartige Substanzen Molekulare Formel zuweisen und somit die größte Anzahl an Verbindungen mehr molekularen Informationen als alle anderen beschriebenen Techniken identifiziert. Dies ist nützlich, weil die molekularen Informationen FTICR-MS (und andere Techniken) verwendet werden kann, um NOSC zu berechnen, bezogen auf die thermodynamische Antriebskraft für die Wahrscheinlichkeit, dass bestimmte Reaktionen8 und ihre Preise unter bestimmten Bedingungen-7. Darüber hinaus kann durch die Kopplung von FTICR-MS mit Trennverfahren, wie z. B. LC zusammen mit Tandem MS, quantitative Strukturinformationen erreicht werden versetzen einige der Nachteile dieser Technik. LC-MS ist nützlich zur Identifikation von Lipid-ähnliche Verbindungen und andere Metaboliten, die nicht gut zeichnen sich durch eine der anderen Methoden. Kupplung FTICR LC-MS oder LC-MS mit Fraktionssammler und sammeln von Bruchteilen von bestimmten unbekannten von Interesse für strukturelle Aufklärung durch zweidimensionale (2D) flüssigen Zustand NMR ist die ideale Situation für die Identifizierung und Quantifizierung der unbekannte Verbindungen18 ,19. Dies ist jedoch eine sehr zeitaufwendige Schritt, der verwendet werden könnte, bei Bedarf. Einzeln genommen, jede dieser Techniken bieten eine andere Momentaufnahme der organischen Substanz und von zu integrieren, können wir ein vollständigeres Verständnis als die Verwendung einer der Techniken isoliert.
Während die thermodynamischen Überlegungen die ultimative Einschränkungen stellen für welche Transformationen in einem System möglich sind, ist Abbau organischer Materie durch Mikroorganismen vermittelt, deren Enzymaktivitäten Reaktionsgeschwindigkeiten steuern. Vollständig zu verstehen, die Steuerelemente am Abbau organischer Materie und letztlich (CO2 und CH4) Treibhausgasproduktion aus Feuchtgebieten erfordert daher einen integrierte Omics Ansatz zur Charakterisierung mikrobieller Enzymaktivitäten sowie die Metaboliten. In diesem Artikel beschreiben wir eine Methode zur Erreichung einer umfassenden Analysis von einer einzigen Probe mit einem sequentiellen Ansatz, der eine vollständig gekoppelte Analyse führt. Dieser Ansatz baut auf der Metabolit, Protein und Lipid-Extraktion (MPLex)-Protokoll in der Proteomik mit GC-MS und LC-MS20 kleine Metaboliten, Proteinen und Lipiden zu identifizieren, durch die Einbeziehung quantitativer Metabolit Informationen gekoppelt war über NMR und Identifizierung von größeren Sekundärmetaboliten über FTICR-Frau etwas anders, MPLex, beginnen wir das Protokoll mit einem Wasserextraktion und dann Verwendung sequentielle Extraktion mit zunehmend unpolaren Lösungsmitteln. Alle Extraktionen erfolgen auf einer einzigen Probe die Probe konserviert, wenn Volumen begrenzt oder schwer zu beschaffen sind und experimentellen Fehler eingeführt durch Unterschiede zwischen den Aliquoten aus heterogenen Stichprobe Matrizen (z.B., Erde und Torf) verringert oder Unterschiede in der Lagerbedingungen und Dauer.
Schließlich können wir durch die Kopplung der OM-Analysen mit Proteomics Analysen der mikrobiellen Gemeinschaft, metabolische Netzwerke aufbauen, die die Wege und die Transformation der Abbau organischer Materie zu beschreiben. Dies ermöglicht uns, testen Sie spezifische Hypothesen, wie Störungen des Systems ultimative CO2 und CH4 Produktion durch Änderung der vorhandenen organischen Substrate, Elektronen-Akzeptoren und mikrobiellen Gemeinschaften beeinflussen wird Vermittlung der Reaktionen über die Aktivität des Enzymkatalysatoren.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein einzelnes Durchsatz-Protokoll zur Verfügung stellen für die Analyse von Metaboliten, Lipide und mikrobielle Proteine aus einer einzigen Probe, wodurch eine vollständig gekoppelte Dataset für metabolische Netzwerke aufzubauen, während analytische Fehler einschränken .
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Protocol
(1) sequentielle Extraktion der organischen Substanz aus Boden, Sediment oder Torf
- Sammeln Sie Boden, Sedimente oder Torf über Kernbohrungen und teilen Sie Kerne nach der Hypothese getestet (z.B. Tiefe). Shop-Proben im Polytetrafluorethylen beschichtet Container und Einfrieren bei-80 ° C Lagerung vor der Analyse.
Hinweis: Ca. 25 mg C ist für dieses Protokoll benötigt. Für Torf (in der Regel 45 % C) ist 50 mg von getrockneten Torf erforderlich. Größere Probenmengen können für niedrigen organischen Proben erforderlich sein, wie Mineral- oder bewaldete Hochland Böden je nach dem C (bis zu 5 g) Inhalt. Da Extraktion mit organischen Lösungsmitteln Polyethylenglykol (PEG) in die Auszüge ziehen die Ionisation während Schritt 2.4 negativ beeinflussen wird, ist es wichtig, zu vermeiden, dass Proben an Kunststoff zu jedem Zeitpunkt während der Erhebung, Speicherung oder Extraktion. - Wenn Sie bereit sind, die Proben zu analysieren, frieren Sie ein, Trocknen zur Gewichtskonstanz, dann Schleifen Sie die Proben in einer High-Speed-Kugelmühle mit Edelstahl Mahlkugeln zu homogenisieren und Aggregate aufzubrechen.
Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle unterbrochen und das Material bei-80 ° c gelagert - Unter Verwendung eines Ethanol gewaschen Edelstahl-Kochgeschirr, aliquoten 50 mg von jedem der getrockneten Proben in einzelnen 2 mL Glasfläschchen. Diese Proben werden nacheinander mit einer Reihe von Lösungsmitteln nacheinander immer mehr nicht-polaren Metaboliten von jeder Probe extrahiert extrahiert werden. Jede Probe 1 mL destilliertes, entgastem Wasser (H2O) hinzufügen, die Küvetten mit dem Deckel und schütteln Sie für 2 h auf einem Shaker-Tisch.
- Nach dem Schütteln ermöglichen Lösungen für 20 min, dann Zentrifuge bei 15.000 x g für 30 min bei Raumtemperatur (RT) stehen, Dekantieren und Speichern des Überstands voneinander.
Hinweis: Diese Lösungen werden durch direkte Injektion in die FTICR-MS injiziert werden. - Durchführung einer Folch Extraktion21 (auch bekannt als MPLEx20) auf der jetzt Wasser extrahierten Rückstände durch Wiederholen der Schritte 1.3 und 1.4 ersetzen 1 mL einer-20 ° c 4:3 Chloroform: Methanol Gemisch des Wassers in Schritt 1.3.
Achtung: Chloroform und Methanol sind leicht entzündlich und giftig. Verwenden Sie geeignetsten persönliche Schutzausrüstung (PSA), vermeiden Hautkontakt und vermeiden offene Flammen. - Trennen Sie vorsichtig die beiden resultierenden Lösungsmittel Schichten, die visuell unterscheidbar, für die separate Analyse durch FTICR-MS mit einer Trennung werden Trichter oder einfach die obere Schicht entfernen, indem Sie vorsichtig pipettieren.
Hinweis: Die Chloroform-haltigen Bruchteil werden an der Unterseite während der Methanol-haltigen Bruch hat eine geringere Dichte und auf der Oberseite werden. - Chloroform-Extrakt (Schritt 1.6) 1:1 in Methanol und Wasser-Extrakt (Schritt 1.4) 2:1 in Methanol Electrospray Ionisierung (ESI) für FTICR-MS durch direkte Injektion, effizienter zu verdünnen.
Hinweis: Die Methanol-haltigen Fraktion aus Schritt 1.7 muss nicht verdünnt werden weiter in Methanol. Die Methanol-Schicht wird durch direkte Injektion auf dem FTICR-MS ausgeführt werden.
2.FTICR-MS-Analyse
- Das FTICR Spektrometer durch direkte Injektion 100 µL einer tuning-Lösung zu kalibrieren (siehe Tabelle der Materialien) überspannt einen Massenbereich von ca. 100-1.300 Da in FTICR-MS.
- Vorbereiten den Suwannee River Fulvinsäuren Säure-Standard (siehe Tabelle der Materialien) durch eine 1 mg mL-1 Lösung in gefilterte Reinstwasser und wieder verdünnt die resultierende Lösung auf 20 µg mL-1 in Methanol.
- Injizieren Sie direkt 23 µL dieses endgültige Lösung für die ESI-Quelle gekoppelt an das FTICR Spektrometer durch eine Spritzenpumpe auf einen Durchfluss von 3,0 μl min-1festgelegt. Stellen Sie Nadel Spannung um + 4,4 kV, Q1 bis 150 m/Z und Glas Kapillare bei 180 ° C. Daraus resultierende Spektren mit Hilfe der Analysesoftware zu überprüfen (siehe Tabelle der Materialien), die Qualität der Daten zu bestätigen.
- Verwenden Sie HPLC Grade Methanol vor dem Ausführen von Proben und während der Probenahme, um Übertrag zu überwachen. Stellen Sie 23 μL jeder Auszug über Direkteinspritzung auf die ESI-Quelle gekoppelt an das FTICR Spektrometer durch eine Spritzenpumpe auf einen Durchfluss von 3,0 μl min-1festgelegt. Stellen Sie Nadel Spannung um + 4,4 kV, Q1 bis 150 m/Z und Glas Kapillare bei 180 ° C.
- Stellen Sie ein Ionen-Ansammlung (IAT) für jedes Muster oder Proben, Variationen in C Konzentration zu berücksichtigen. Typische Werte liegen zwischen 0,1 bis 0,3 s. 144 sammeln Scans für jede Probe, durchschnittliche Scans und führen Sie dann eine interne Kalibrierung mit homologen CH2 (d. h. 14 Da Trennung) Serie.
Hinweis: Nach FTICR-MS-Analyse, die Entscheidung kann entweder das Wasser kombinieren und Methanol extrahiert Fraktionen um die verbleibenden Schritte zu straffen oder die Brüche können in nachfolgenden Schritten getrennt gehalten werden. Die vor- und Nachteile der einzelnen Ansätze werden in der Diskussionausführlich beschrieben. Wenn dabei kombinieren Sie die Wasser und Methanol extrahiert Brüche. - Auszüge mit einem Konzentrator zu trocknen und speichern Sie den Rest der Extrakte (~ 1 mL) für nachfolgende GC-MS (Wasser, Methanol oder Wasser + Methanol), LC-MS (Chloroform) und NMR (Wasser + Methanol)-Analyse.
Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle unterbrochen und das Material bei-20 ° c gelagert
3. FTICR-MS-Datenverarbeitung
- Gemeinsam richten Sie alle Probe-Peak-Listen für das gesamte Dataset zu reduzieren Masse Schichten und Peak-Zuordnungen mit Formularity Software22 vor Formel Zuordnung zu standardisieren.
- Verwenden der Formularity Software22 , Molekulare Formel mit einem Signal zuzuweisen Rausch-Verhältnis größer als 7, Masse Messung Fehler < 1 ppm und damit C, H, O, N, S und P unter Ausschluss aller anderen Elemente.
- Wenn mehrere Kandidaten Formeln für eine gegebene Masse (häufig über 500 Da) zurückgegeben werden verhängen Sie Abhängigkeiten konsistent mit dem Material wird abgetastet. Z. B. in Torf, typische Einschränkungen gehören: niedrigsten Masse Fehler, geringste Zahl von Heteroatomen (N, S, P), und wenn vorhanden, P muss in oxidierter Form (d. h., muss mindestens 4 O-Atome für jedes P-Atom in der Formel).
4. chemische Derivatisierung für GC-MS
- Blindkontrolle Proben von HPLC-Grade Hexan im GC-MS Autosampler Vials23vorbereiten. Auflösen von 100 mg Fettsäure-Methylester (FAMEs: C8 - C28) Mischung Retentionszeit standard in 200 µL von Hexan.
- Um Carbonyl-Gruppen zu schützen, hinzu kommen 20 μL 30 mg mL-1 Methoxyamine Hydrochlorid in Pyridin aller der Methanol-Extrakte und Wasser Extrakte (oder kombinierte Methanol/Wasser Auszüge verwenden) von Schritt 2.6, Zuschnitte und Ruhm Kalibrierung Proben23. Verschließen Sie Fläschchen mit Deckeln.
Achtung: Pyridin ist hoch giftig und brennbar. Tragen Sie geeignete PSA zur Verhütung Haut- oder Augenkontakt und vermeiden offene Flammen. Darüber hinaus verflüchtigt Pyridin bei RT schädliche Luftverunreinigungen verursachen. Arbeiten Sie nur in gut belüfteten Räumen unter einem Abzug. - Vortex-Extrakte für 20 S. Sonicate-Extrakte für 60 s. Dann inkubieren Sie Extrakte in einer Zentrifuge bei 37 ° C für 90 min bei 100 X g.
Hinweis: Eine übermäßige Menge an Kohlenhydraten oder Salze verursachen Metaboliten zu kristallisieren nach unten getrocknet wird. Beschallen die Proben wird dazu beitragen, um die kristallisierte Metaboliten in das derivatizing Reagenz zu rekonstruieren. - Nach der Inkubation hinzufügen 80 μl des N-Methyl - N-(Trimethylsilyl) Trifluoroacetamide mit 1 % Trimethylchlorosilane zu jeder Probe, Vortex Extrakte für 20 S. Sonicate-Extrakte für 60 s und inkubieren Sie Auszüge wieder in einer Zentrifuge bei 37 ° C für 30 min bei 100 X g.
- Cool-Extrakte, RT (20-24 ° C), dann übertragen in GC-MS Autosampler Vials.
5. GC-MS-Analyse
- Tune und MS gemäß den Empfehlungen der Hersteller zu kalibrieren (siehe Tabelle der Materialien) vor der Analyse darauf achten die Maschine MS Daten richtig gelesen. Überprüfen Sie die Helium-Gas-Druck innerhalb der angegebenen Toleranz.
- Separaten polaren Metaboliten auf einem GC-Säulen (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm). Legen Sie die Backofen-Temperatur-Protokoll wie folgt: (1) anfängliche Temperatur von 60 ° C für 1 min, (2) Rampe bis 325 ° C mit einer Rate von 10 ° C min-1und (3) halten bei 325 ° C für 5 min.
- Analysieren Sie Extrakte mit einer GC gekoppelt an ein einzelnes Quadrupol MS. Set Einspritztemperatur Port auf eine konstante 250 ° C. 1 μL jeder derivatisierte Extrakt im splitless Modus zu injizieren.
6. GC-MS-Datenverarbeitung
- Überprüfen Sie alle Datendateien um sicherzustellen, dass sie korrekt erfasst wurden. Achten Sie auf mögliche Verschiebungen in Bezug auf interne standard Retentionszeiten und Intensitäten zu bestätigen, dass, das die Daten konsistent im gesamten erfasst wurde die Analyse.
- Umwandeln Sie der Kreditor bestimmte MS-Datenformat in ein allgemeine MS-Format, falls erforderlich. Prozesses Rohdatendateien mit MetaboliteDetector24 Kalibrierung Aufbewahrung Indizes auf Basis der Ruhm internen Standards. Nach dem Ausrichten der Retentionszeiten aller Datendateien, Entfaltung und schließlich Metabolit Identifikation durch passende Aufbewahrung Indizes und GC-MS Spektren gegen die FiehnLib polaren Metaboliten Bibliothek25fortzusetzen.
- Cross-Check verbleibende unbekannte Metaboliten gegen die NIST14 GC-MS-Bibliothek mit spektrale Anpassung. Validieren Sie Identifikationen individuell zu beseitigen falsche Identifikationen und Dekonvolution Fehler zu reduzieren.
(7) flüssiger Zustand NMR-Analyse
- Verdünnen Sie den Rest der Wasser-Extrakte (~ 300 µL) um 10 % (Vol/Vol) mit einem 5 mM 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 internen Standard. Alternativ, kombinieren Sie Wasser und Methanol extrahiert aus Schritt 1 dann Resubstitute im Wasser. Auf diese Weise jedoch können einige der flüchtigen Verbindungen während der Gefriertrocknung Schritt verloren. Typische Endprobe Bände sind im Bereich von 180-300 µL.
- Übertragen Sie die Mischung in ein hochwertiges 3 mm Außendurchmesser (O.D) Borosilikatglas NMR Röhrchen.
- Sammeln Sie Spektren mit einem NMR-Spektrometer (idealerweise mindestens 600 MHz) mit einer 5 mm dreifach Resonanz salztoleranten kalten Sonde und eine Kälte-Kohlenstoff-Vorverstärker ausgestattet.
- 1D 1H Spektren mit einem 1D nuclear Overhauser Effekt Spektroskopie (NOESY) presaturation Experiment bei 298 K mit einem 4 s-Erfassungszeit, 1,5 s Recycling Verzögerung, 65.536 komplexe Punkte und 512 Scans zu sammeln.
- Sammeln Sie 2D 1H -13C Heteronuclear Single-Quantum Korrelation (HSQC-) und 1H -1H insgesamt Korrelation (TOCSY) Spektren zu helfen bei der Zuordnung von Metaboliten und Validierung.
- Verarbeiten, zuordnen und analysieren alle Spektren mit Hilfe der NMR-Analyse-Software (siehe Tabelle der Materialien), Intensitäten im Verhältnis zu dem internen Standard zu quantifizieren. Metaboliten durch passende chemische Verschiebung, J-Kupplung und Intensität Informationen in den Proben gegen die Bibliothek zu identifizieren.
Hinweis: Die Bibliothek ist durch benutzerdefinierte gezielte Metabolit Standards und Metabolit Ergänzungen auf einer regelmäßigen Basis verstärkt. Das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten und das Material bei-20 ° c gelagert
8. LC-MS Lipidomics Analyse
- Rewet des getrockneten Chloroform Extraktes während Schritt 2.5 mit 200 μL von Methanol erzeugt.
- Injizieren Sie 10 μL jeder Extrakt in ein Ultra-Performance liquid Chromatograph gekoppelt an ein Orbitrap-Massenspektrometer mit einer reversed-Phase Oberfläche Hybrid Spalte (3,0 mm × 150 mm × 1,7 μm Partikelgröße) in Rechnung gestellt. Einen 34-min-Gradienten (mobile Phase A: Acetonitril/H2O (40: 60) mit 10 mM Ammoniumacetat, mobile Phase B: Acetonitril/Isopropanol (10: 90) mit 10 mM Ammoniumacetat) mit einer Durchflussrate von 250 µL/min Nutzung eingestellt, sowohl negative als auch positive Ionisation-Modi mit höherer Energie Kollision Dissoziation und Kollision induzierte Dissoziation.
Achtung: Acetonitril ist ein Auge, Haut und Atemwege reizend. Tragen Sie geeignete PSA. Darüber hinaus ist Acetonitril brennbar. Erlauben nicht an Oxidationsmitteln, giftige Dämpfe während der Verbrennung produziert werden können. - Laden Sie die raw-LC-MS/MS-Daten-Dateien in Flüssigkeit zusammen mit der Zieldatei (d.h. > 25.000 Lipid Artliste) für den jeweiligen Ionisation Modus (positiv oder negativ). Die raw-Datei zu verarbeiten. Manuell überprüfen Sie die resultierenden Identifikationen anhand der MS/MS Spektren auf Vorhandensein von diagnostischen Ionen, wenn zutreffend, passende Fragment-Ionen (z. B. fetthaltige Acyl-Ketten), isotopische Trennung ppm Fehler der Ausgangsstoffe und die Retentionszeit Masse. Exportieren Sie Ergebnisliste der sicher identifizierten Lipide als haben.TSV-Datei.
Hinweis: Das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten und speichern das Material bei-20 ° C.
9. Proteomics-Analyse
- Der Rest der infolge Schritt 2.4, durch Waschen des Extraktes mit 20 Mal das Extrakt Volumen der zusätzlichen kalt (-20 ° C) Methanol Methanol-Phase entziehen Sie Proteine nach MPLEx Protokoll20 .
- Verwenden Sie eine 1 mL/50 mg Silizium-basierten Sorbens (siehe Tabelle der Materialien), um Zustand C18 SPE Säulen mit 3 mL Methanol, 2 mL 0,1 % Trifluoroacetic Säure (TFA) im Wasser, gefolgt von dem Zusatz des Auszugs aus Schritt 9.1 mit einer Rate nicht größer als 1 mL/min.
- Nach der Zugabe der Probe die Spalte mit 4 mL 95:4.9:0.1 Wasser: Acetonitrile:TFA waschen, dann trocknen lassen. Legen Sie eine 1,5 mL Sammelröhrchen unter der SPE-Spalte und eluieren Sie Probe mit 1 mL 80:19.9:0.1 Methanol: Wasser: TFA.
- Konzentrat der Auszüge zu 100 µL unter Vakuum-assistierte Gefriertrockner, dann messen Sie die Proteinkonzentration von Bicinchoninic Säure (BCA) farbmetrischen Assay26 bei einer Wellenlänge von 562 nm.
- Zentrifuge Auszüge bei 10.000 x g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie den daraus resultierende Überstand und trocknen Sie die restlichen Pellets unter Vakuum für 5 min. Aufschwemmen der Protein-Pellets in Wasser, um eine Endkonzentration von 0,1 µg Peptid pro Mikroliter.
- Eine Endkonzentration von 5 mM Dithiothreitol hinzu und inkubieren Sie 10-Mal bei 60 ° C für 30 min. verdünnt mit 100 mM NH4HCO38 M Harnstofflösung und inkubieren Sie bei 37 ° C für 3 h in Anwesenheit von 1 mM CaCl2 und Schweinen Trypsin bei einem 01:50 Enzym Protein Verhältnis.
Hinweis: Protokoll kann an dieser Stelle angehalten und speichern Material bei-20 ° C. - Separate Auszüge über Flüssigchromatographie mit einer exponentiellen Steigung von einem 0,1 % Ameisensäure in mobilen Wasserphase (A) und eine 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril mobile Phase (B) auf 10 Kpsi und 500 nL min-1.
- Führen Sie daraus resultierende Elutionsmittels in eine ESI-gekoppelten Massenspektrometer sammeln Spektren von 400-2.000 m/Z mit 100.000 Auflösung bei m/Z 400 in einem linearen Ionenfalle (LTQ) Orbitrap Massenspektrometer ein.
- Das MzML-Format mit MsConvert oder ProteoWizard akzeptieren alle Standardparameter umwandeln Sie RAW Spektren Dateien. Verwenden Sie das universelle Datenbank-such-Tool MSGFPlus, um resultierende Proteome anhand einer gezielten Proteindatenbank von Proteinsequenzen vorhergesagt von relevanten Metagenom montiert Genome zu suchen.
- Fügen Sie gemeinsame Verunreinigungen (z.B.Trypsin, Keratin, Albumin) und entfernen Sie alle genau duplizierten Proteinsequenzen, Peptid-zu-Masse-Spektrum Spielstatistiken zu verbessern. Die daraus resultierende MSGF spektrale Wahrscheinlichkeitsergebnisse um festzustellen, welche Peptid-zu-Masse-Spektrum passt am besten zu bewerten. Verwenden Sie den Q-Wert von MSGFPlus zum Filtern des gesamten Daten Haufen 1 % false Discovery Rate (FDR).
10. Metabolomik Analyse und metabolische Netzwerkbildung
- Kompilieren Sie alle Metabolit Summenformel identifiziert in Schritte 3, 6, 7 und 8 in einer einzigen Datenbank von Metaboliten in den Proben vorhanden. Kombinieren Sie diese Metaboliten mit dem Enzym Kommission (EK) oder KEGG Orthopädie (KO) Zahlen der Enzyme identifiziert in Schritt 9. Suchen Sie dieses kombinierte Dataset gegen die KEGG27 Datenbank Stoffwechselwege Abschnitt.
- Manuell Werten Sie Ergebnisse aus, um am wahrscheinlichsten Wege zu identifizieren und in eine metabolische Modell zu integrieren.
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Representative Results
Wir die beschriebenen ergänzenden Analyse-Protokoll durchgeführt und verglichen Torf mit Tiefe im S1 Moor in der Fichte und Mooren Antwort unter wechselnden Umgebungen (Fichte) Website in Minnesota, USA. Diese Ergebnisse sind im Vergleich zu denen aus dem Permafrost Moor und Fen aus Nordschweden zu zeigen, wie Websites in Metaboliten und Enzym-Aktivitäten variieren können. Wir identifizierten 3.312 Enzyme in der Proteomik-Analyse. Eine Analyse der Aktivitäten der Enzyme mit Tiefe zeigt, dass die Anzahl der Enzyme scharf zwischen 15 und 45 cm in Fichte Moor (Abbildung 1) sinkt.
Während die Proteomik-Ergebnisse deuten darauf hin, welche Proteine exprimiert werden, zeigen die metabolischen Daten welche Reaktionen tatsächlich auftreten. Alles in allem wir identifiziert 67.040 Metaboliten (einschließlich Lipiden) in allen Torf Proben aus der Kombination von FTICR-MS, NMR, GC-MS und LC-MS-Analysen. Von diesen konnten wir molekulare Formel zuweisen 15.385 Verbindungen (Abbildung 2). Die kombinierten metabolischen Daten umfasst eine Palette von Oxidationsstufen, Massen und Stoffklassen.
Dies ist in der Regel durch den Einsatz von einem van Krevelen Diagramm visualisiert in die atomare H/C-Verhältnis von identifizierten Formel gegen ihre atomare o/c-Verhältnis28aufgetragen werden. Wir haben eine neue Dimension in der typischen 2D Format enthalten Darstellung NOSC durch Farbcodierung der Symbole, die einzelnen Formel (Abbildung 3 und Abbildung 4). Mit zunehmender Tiefe in der Fichte Moor, gibt es eine Zunahme der Gesamtzahl der großen sekundären Pflanzenstoffen durch FTICR-MS, speziell in hoch verdichteten (unten links der van Krevelen Handlung) identifiziert und Formeln (oben auf dem Grundstück) hydriert (Abbildung 4 ). Über die gleichen tiefen gibt es eine Abnahme in der Zahl der kleine hochenergetischen Verbindungen durch GC-MS identifiziert und in die Lipide (Abbildung 5). Dies könnte nahelegen, dass die Lipide und kleine Metaboliten in der Oberfläche Torf konsumiert werden, vor dem Erreichen der größeren Tiefen oder Zersetzung Preise in der Tiefe Torf schneller als in der Oberfläche sind, derart, dass nach unten advecting Verbindungen rasch verbraucht werden. Unterscheidung zwischen diesen zwei konkurrierenden Hypothesen erfordert ein Prozessebene Verständnis des Radsports am Standort C. Solch ein Verständnis der Prozessebene kann nur gewonnen werden, durch die Kopplung der Metabolomik und Proteomics Datasets. Dies erreichen wir durch Cross-Validierung der kombinierten FTICR-MS, GC-MS, LC-MS und NMR Metaboliten gegen die KEGG-Datenbank identifiziert. Auf diese Weise finden wir, dass die Verbindungen, die wir identifiziert Beteiligten gemeinsam Stoffwechselwege wie tricarboxylic Säure (TCA) Zyklus, Glykolyse und Zuckerstoffwechsel. Da einzelnen Metaboliten in einbezogen werden können steigt mehrere Wege-Bestätigung mit den Enzymen, unser Vertrauen in die Zuordnung von Bahnen (Abbildung 6).
Durch diese Zuordnung finden wir Beweise des Metabolismus von Saccharose und Stärke in der Oberfläche Torf, während in den größeren Tiefen Pyruvat und andere Fermentationsprodukte (Abbildung 6) aufzubauen. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der Hypothese, dass Zucker und anderen energetischen Metaboliten in der Oberfläche Torf abgebaut sind und nicht die größeren Torf tiefen erreichen. Wie in Abbildung 5zu sehen, Zucker (NOSC = 0) und Aminosäuren (0 < NOSC < 1) sind in der Oberfläche Torf, während Lipide verbraucht (-2 < NOSC <-1) erscheinen, mit Tiefe zu sammeln. Dies steht im Einklang mit Erwartungen basierend auf NOSC Werten, dass höhere NOSC Verbindungen leichter abgebaut sind, während niedrigere NOSC Verbindungen in die hoch anaeroben bestehen (d. h., Tee-Limited) Bedingungen des Untergrundes Torf. Dieser Ansatz unterscheidet sich auch erfolgreich zwischen Bodentypen aus verschiedenen Umgebungen. Zum Beispiel erscheint organischen Bodensubstanz von boreal Torfland kompositorisch als Permafrost Moor sowie im Sumpf und Moor innerhalb der Permafrost-Region unterscheiden. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit einer früheren Studie, die zeigte, dass Unterschiede in der Website Geochemie zwischen diesen Lebensräumen29, was darauf hindeutet, dass Website-Geochemie haben einen großen Einfluss auf den mikrobiellen Abbau von C unter der Erde.
Abbildung 1 : Proteomics Analyse zeigt starke Tiefe Schichtung in der Reihe von Enzymen. Balken zeigen Durchschnittswerte und Fehlerbalken zeigen eine Standardabweichung von Häufigkeiten. Dies deutet darauf hin, dass Mikroorganismen in der Torf-Oberfläche am aktivsten sind. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Die Anzahl der Verbindungen, die durch jede Technik in der Oberfläche Torf (< 30 cm) von jedem Lebensraum sowie die Mitte (45 cm) und Tiefe (87 cm) Torf aus dem Moor Fichte identifiziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : The van Krevelen Diagramm (atomic H/C vs. o/c der einzelnen identifizierten Molekulare Formel) für die Oberfläche (15 cm) SPRUCE bog Tiefe um die Berichterstattung über Verbindungen zeichnet sich durch jede Technik zu demonstrieren. FTICR-MS ermöglicht es uns, die größte Anzahl von Verbindungen (kleine Kreise), identifizieren GC-MS (Dreiecke) ist zwar gut zur Differenzierung und Identifizierung von Zuckern (H/C = 2 und o/c = 1). (Quadrate) NMR-Spektroskopie liefert quantitative Informationen über energetisch wichtige Verbindungen wie Zucker, Aminosäuren, Pyruvat. LC-MS (Diamanten) informiert über Lipide. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : The van Krevelen Diagramm (atomic H/C vs. o/c der einzelnen identifizierten Molekulare Formel) für die Tiefe (87 cm) SPRUCE bog Tiefe um die Berichterstattung über Verbindungen zeichnet sich durch jede Technik zu demonstrieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Der relative Anteil der verschiedenen chemischen Klassen identifiziert über die verschiedenen Techniken in den verschiedenen Tiefen. Bars sind als Durchschnittswerte für jede Tiefe ± eine Standardabweichung dargestellt. Klassen, die geplottet enthalten Aminosäuren, Sphingolipide (Cer), Glycerophosphocholines (PC), Phosphoethanolamines (PE), Diacylclyceroltrihomoserine (DGTSA), Diacylglycerol (DG), Triacylglyzerole (TG) und Zucker. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Zusammenführung der Ergebnisse zu einem metabolischen Netzwerk. Tiefe-Distributionen von Metaboliten identifiziert durch NMR (ein) und GC-MS (b) und eine vereinfachte metabolische Karte (c) zeigt eine ausgewählte Anzahl von Transformationen auf Fichte Moor identifiziert. Grüne Kästchen bedeuten, dass Stoffwechselprodukte, die mit Tiefe, braune Kisten Abnahme Metaboliten anzugeben, die mit der Tiefe zu erhöhen. Grün mit Verbindungstür Pfeile zeigen Enzym identifiziert in unserem Dataset, das die angegebene Transformation (Enzym EG-Nummern angegeben neben Pfeile) zu vermitteln. Grau mit Verbindungstür Pfeile zeigen Transformationen für die Enzyme in unserem Dataset nicht identifiziert wurden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Der Single-Durchsatz bietet voll-gekoppelte Analyse Bach Metaboliten und das Proteom zu charakterisieren Einblicke in die Wege, durch welche, die c Radfahren in ein komplexes Ökosystem stattfindet. Boden und Torf sind heterogene Matrizen, und daher einer der kritischen Schritte dieser Methode tritt in die ersten Schritte um sicherzustellen, dass der Start Torf oder Bodenmaterial sehr homogen ist. Es empfiehlt sich, die Probe Schleifen sowie Aggregate Extraktionseffizienz reduzieren können. Dies ist ein besonderes Problem für aggregierte Böden und Böden mit niedrigen C und hohe mineralische Inhalte, die eine Edelstahl-Kugel-Mühle, adäquat zu homogenisieren erfordern können. Da räumliche Heterogenität der Böden und Torf innerhalb einer experimentellen Site hoch sein kann, sind biologische repliziert dringend empfohlen.
Diese Methode nutzt drei Lösungsmittel: Wasser, Methanol und Chloroform, welche Arten von Verbindungen-es möglich Bias ist, zu extrahieren. Grundsätzlich sollten diese sequenzielle Extraktionsmethode Verbindungen, die ein breites Polarität Spektrum solubilisieren. Allerdings sind diese Lösungsmittel nicht zum Extrahieren von Organo-mineralische komplexe oder höchst stabilisierte komplexe optimiert. Wenn solche Verbindungen von Interesse sind, härtere Lösungsmitteln wie z.B. starke Säuren und Basen werden bevorzugt, aber härtere Abbauverfahren konnten die Chemie der Proben verändern. Mit solchen Lösungsmitteln am Ende der Extraktion Sequenz kann diesen Effekt minimieren. Darüber hinaus wird Chloroform zu inaktivieren klinisch wichtigen Boden und Torf bakterielle und virale Erreger und andere Pathogene biologische Krankheitserreger durch Lipide der Zellmembran auflösen. Somit verringert sich mit Chloroform Extraktion Protokoll die Risiken im Studium der Biologie von Proben, die potentiell infizierte durch Krankheitserreger aus verschiedenen Regionen der Welt. Gibt es Bedenken bezüglich tot mikrobiellen Zellen, Schmutz oder Partikel nach Extraktion, empfiehlt sich die Extrakte durch einen 0,2 µm Glasfaser Filter filtern.
Um den Prozess, die Wasser und Methanol zu optimieren könnte Extrakte für GC-MS-Analyse während Schritt 4.1 kombiniert werden. Allerdings müssen diese Extrakte für FTICR-MS-Analyse durch Ionisation Fragen der Energieeffizienz mit der ESI-Quelle getrennt bleiben. Der Vorteil den kombinierten Extrakt auf der GC-MS ausgeführt ist, dass weitere Metaboliten (für eine größere Reichweite der Polarität) identifiziert werden. Der Nachteil an dieser Stelle die Extrakte zu verbinden ist, dass eines der wichtigsten Metaboliten in mikrobiellen Verarbeitung organischer Stoffe wichtig Methanol. Spuren von Methanol bleibt in der kombinierten Probe auch nach dem Trocknen, also wenn Methanol ein Metabolit von Interesse ist, das Wasser-Extrakt separat ausgeführt werden muss. Gute Kontrollen mit keine Analyten auch hilft bei der Identifizierung von möglichen Verunreinigungen in den Proben.
Im Schritt 7.1 Vorbereitung Extrakte für NMR-Analyse, wie in der GC-MS-Analyse entweder allein Wasser-Extrakt oder gebundenem Wasser und Methanol-Extrakte eingesetzt werden. Die Nachteile dabei sind ähnlich denen in der vorstehenden Randnummer aufgezählt. Der Vorteil der Kombination von Wasser und Methanol-Extrakte ist, dass einige der weniger polaren Metaboliten, die in der Methanol-Anteil solubilisiert werden identifiziert werden. Wegen der Gefriertrocknung Schritt werden jedoch viele mehr flüchtige Verbindungen verloren gehen. Dies ist besonders nachteilig, wenn die Quantifizierung von flüchtigen Fettsäuren eine wichtige Komponente des Experiments ist.
In diesem Verfahren zur Identifizierung von Proteomics nur voll tryptic Peptide sind gesucht, somit endogene Peptidase Aktivität und Source-Fragmentierungen werden vermisst. Auf der anderen Seite oxidierte Methionin als Post-translationale Modifikation für die Peptid-Kandidaten in Betracht wie diese Änderung häufig tritt während der Probenahme, Aufbereitung und den Umschlag. Quantifizierung von Enzymen durch Peptid Elution Gebiete kann getan werden, aber nicht in den Anwendungsbereich dieses Projekts ist.
Viele Fortschritte bei der Analyse der NOM und mikrobielle Parameter bieten eine Fülle von Techniken für das Verständnis Bio C Radfahren. Durch die Kombination dieser Techniken in einem einzigen optimierten Protokoll, gewinnen wir eine neuartige Sicht auf die Prozesse, die stattfinden. Kopplung der Proteomics-Analysis mit den metabolischen Analysen bietet überzeugende bestätigende Beweise, dass eine Reaktion tatsächlich stattfindet. Stoffwechselanalyse allein beschränkt, dass er uns informiert, welche Metaboliten sind höher oder niedriger Konzentration im Vergleich zu Standorten oder nach eine Wirkung der Behandlung, aber nicht die Ursachen für diese Veränderungen wahrnehmen. Z. B. wir identifiziert rückläufigen Zucker-Konzentrationen mit Tiefe im Moor, aber ohne weitere Informationen ist unklar, ob der Rückgang mit Tiefe langsame Eingänge oder schnelle Verschlechterung in der Tiefe Torf liegt. Analyse der Proteomforschung und der rückläufigen Enzymexpression mit Tiefe ermöglicht es uns, die zweite Hypothese abzulehnen. Unsere Ergebnisse entsprechen eher schnelle Zucker Abbau in die Oberfläche Torf begrenzende Eingaben in größeren Tiefen. Diese besonderen Einsichten sind nur möglich wenn alle Techniken parallel betrachtet werden, da jeweils ein einzigartiges bietet, aber kritische Stück des Radsports Puzzle. C
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir möchten J.P. Chanton, j.e. Kostka und M.M. Kolton danken für Unterstützung mit Torf Proben. Teile dieser Arbeit wurden an den molekularen Wissenschaften Umweltlabor, eine DOE Büro der Wissenschaft Benutzer Einrichtung vom Büro des biologischen und Umweltforschung durchgeführt. Battelle für DOE unter Vertrag DE AC05 76RL01830 PNNL gesteuert. Diese Arbeit wurde vom U.S. Department of Energy, Office of Science und Büro der biologische und ökologische Forschung unterstützt (gewährt: DE-AC05-00OR22725, DE-SC0004632, DESC0010580, DE SC0012088 und DE-SC0014416).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| methoxyamine hydrochloride | Sigma Aldrich | 226904 | derivitization agent |
| 5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe | Bruker | instrumentation | |
| capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) | Agilent | AG19091S-433 | instrumentation |
| reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size) | ThermoFisher | instrumentation | |
| 2 mL glass vials | VWR International | 46610-722 | sample vials |
| autosampler vials | VWR International | 97055-324; 9467671 | sample vials |
| Chloroform | VWR International | JT9174-3 | solvent |
| Ethanol | VWR International | BDH67002.400 | solvent |
| methanol | VWR International | BDH85681.400 | solvent |
| pyridine | VWR International | BDH67007.400 | solvent |
| 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 | Sigma Aldrich | 178837 | standard |
| C8-C24 fatty acid methyl ester | Sigma Aldrich | CRM18918 | standard |
| N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide | Sigma Aldrich | 24589-78-4 | standard |
| Suwanee River Fulvic Acid standard | International Humic Substances Society | 2S101F | standard |
| trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 89595 | standard |
| Tuning Solution | Agilent | ||
| FTICR-MS analysis software | Bruker | Compass DataAnalysis 4.1 | |
| Formularity Software | Pacific Northwest National Laboratory | Formularity | available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity |
| GC-MS | Agilent | Agilent GC 7890A with MSD 5975C | |
| silica-based sorbent | Phenomenex (Torrance, CA) | Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK) | |
| NMR TUBE 3MM 8 150 CS5 | VWR International | KT897820-0008 | NMR tube |
| Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer | Varian Inova | Varian Direct Drive 600-MHz | NMR spectrometer |
| Chenomx NMR Suite 8.3 | Chenomx | Chenomx NMR Suite | NMR software |
| ultra-performance liquid chromatograph | waters | Aquity UPLC H | liquid chromatograph |
| Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer | ThermoFisher | Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos | mass spectrometer |
References
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