Summary
Ce protocole décrit un débit unique pour les techniques analytiques et omiques complémentaires aboutissant à une caractérisation entièrement appariés de la matière organique naturelle et de la protéomique microbienne dans les écosystèmes différents. Cette approche permet des comparaisons robustes pour l’identification des voies métaboliques et les transformations importantes pour décrire la production de gaz à effet de serre et de prédire les réponses aux changements environnementaux.
Abstract
Matière organique naturelle (mon) est composée d’un mélange très complexe de milliers de composés organiques qui, historiquement, s’est révélée difficiles à caractériser. Toutefois, pour comprendre les contrôles thermodynamiques et cinétiques de la production de gaz (dioxyde de carbone [CO2] et de méthane [CH4]) à effet de serre résultant de la décomposition du NOM, une caractérisation moléculaire couplé avec microbienne proteome analyses est nécessaire. En outre, changements climatiques et environnementaux sont censés perturbent les écosystèmes naturels, potentiellement perturber les interactions complexes qui influent sur la livraison des substrats de la matière organique et les microorganismes, effectuer des transformations des. Une caractérisation moléculaire détaillée de la matière organique, protéomique microbienne et les voies et les transformations par lequel la matière organique est décomposée sera nécessaire de prévoir la direction et l’ampleur des effets des changements environnementaux. Cet article décrit un débit méthodologique pour la caractérisation de métabolites complète dans un seul échantillon par injection directe Fourier transform ion cyclotron resonance spectrométrie de masse (FTICR-MS), chromatographie en phase gazeuse (GC-MS), la spectrométrie de masse spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN), chromatographie en phase liquide spectrométrie de masse (LC-MS) et d’analyse protéomique. Cette approche se traduit par un ensemble de données totalement appariés qui améliore la confiance statistique pour inférer les voies de la décomposition des matières organiques, la résultante de CO2 et les taux de production de4 CH et leurs réactions aux perturbations environnementales. Ci-après nous présentons les résultats de l’application de cette méthode au NOM des échantillons prélevés dans les tourbières ; Toutefois, le protocole s’applique à n’importe quel échantillon NOM (par exemple, de tourbe, les sols forestiers, les sédiments marins, etc.).
Introduction
Dans le monde, zones humides contiennent environ 529 Pg de carbone (C), principalement en tant que C organique enfouie dans les gisements de tourbe1. Actuellement, ces tourbières agissent comme un puits net de C, séquestrant 29 Tg C y-1 en Amérique du Nord seulement1. Cependant, les perturbations environnementales telles que la vidange, les incendies, la sécheresse et des températures plus chaudes peuvent compenser ce puits de carbone en augmentant la décomposition des matières organiques résultant en une augmentation C pertes par effet de serre (dioxyde de carbone [CO2] et la production de méthane [CH4])1,2. Le changement climatique peut contribuer à une perte C si les températures plus chaudes ou conditions de sécheuse stimulent plus rapide C décomposition par les microorganismes. Alternativement, des températures plus élevées et les concentrations atmosphériques de CO2 peuvent stimuler la production primaire pour piéger le plus de CO2 sous forme de carbone organique (OC). Dans quelle mesure et à quelle vitesse cette OC est ensuite décomposé en CO2 et CH4 dépend d’interactions complexes entre les substrats de donneur d’électrons, la disponibilité des accepteurs d’électrons et les microorganismes qui médient le transformation. Dans de nombreux cas, les mécanismes ne sont pas bien caractérisés, ainsi leur réponse aux perturbations de l’environnementales n’est pas bien et on ne sait toujours pas quel sera le résultat net du changement climatique sur le bilan du carbone dans les écosystèmes de tourbières.
La nature complexe de la matière organique naturelle (mon) a fait de même identifier les composés organiques présents dans les mélanges NOM historiquement difficiles. Les progrès récents ont grandement amélioré notre capacité à caractériser les composés qui traditionnellement et, dans une certaine mesure, continuer à être, considéré comme récalcitrants humiques ou fulviques composés3,4,5. Nous comprenons maintenant que bon nombre de ces composés sont effectivement microbienne disponibles et peuvent être décomposées si un accepteur d’électron terminal approprié (thé) est rendu disponible6,7. Calcul de l’état d’oxydation nominale du carbone (CNOP) pour un composé fournit une métrique pour prédire le potentiel de décomposition et le rendement énergétique du thé requis. Cependant, elle nécessite une qualification de niveau moléculaire de la matière organique7. CNOP est calculée de la formule moléculaire par l’équation suivante7: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, où z est la charge nette. CNOP est corrélée avec la thermodynamique conduite force8, dans lequel composés avec NOSC supérieur sont plus faciles à se dégrader, tandis que les composés avec NOSC inférieur nécessitent des thés de plus en plus énergiques afin de réduire. Composés avec NOSC moins de −2 nécessitent une énergie élevée produisant des thés tels que O2, nitrate ou MnIVet ne peut être dégradés par fréquents s’abaissent en énergie, ce qui donne des thés comme FeIII ou sulfate7. Il s’agit d’une considération importante dans les conditions anoxiques gorgés d’eau, milieux humides où O2 et autre énergie élevée produisant des thés sont rares9 et donc la dégradation des composés NOSC inférieur dans ces conditions sont thermodynamiquement limitée. Les perturbations environnementales peuvent influencer l’état thermodynamique de l’écosystème à travers les changements hydrologiques qui influencent O2 (le plus énergique accepteur d’électron), changements de substrats organiques et les accepteurs d’électrons mis à disposition par primaire production et dans une moindre mesure de la température. Un exemple important des effets de la température dans les systèmes de zones humides se produit en ce qui concerne le compromis qui se produit entre homoacetogenesis (p. ex., production d’acétate de CO2 et H2) et (méthanogénèse) hydrogenotrophic par exemple, production4 CH de CO2 et H2). À basse température, il semble que homoacetogenesis est légèrement favorisé, alors que les températures plus chaudes favorisent CH4 production10. Cet effet de la température peut avoir des implications importantes pour la réponse des écosystèmes au changement climatique, comme CH4 est un gaz à effet de serre beaucoup plus fort que le CO211 et donc augmentation de la production de CH4 au détriment de CO2 à des températures plus chaudes peuvent contribuer à une rétroaction positive avec le réchauffement climatique.
Tourbières produisent des quantités importantes de CO2 et CH46via la respiration microbienne d’origine naturelle organique d’importance. Le CNOP des substrats organiques de carbone détermine la proportion relative du CO2: CH4 produit qui est un paramètre essentiel à cause du forçage radiatif supérieur de CH4 par rapport au CO211, mais aussi parce que les efforts de modélisation ont identifié ce ratio comme un paramètre essentiel pour l’estimation des flux de C dans les tourbières,12. En l’absence d’accepteurs d’électrons terminal autres que le CO2, il peut être démontré par prépondérance des électrons que des substrats organiques C avec la volonté de > 0 NOSC produisent CO2: CH4 > 1, C organique avec NOSC = 0 produit CO2 et CH4 dans rapport équimolaire et C organique avec NOSC < 1 produira CO2: CH4 < 113. Décomposition du crime organisé dans les écosystèmes naturels est médiée par des micro-organismes, afin que même quand la dégradation d’un composé particulier est thermodynamiquement possible, elle est cinétiquement limité par l’activité d’enzymes microbiennes et, dans des conditions anoxiques, par la force motrice thermodynamique (c'est-à-direCNOP)7. Jusqu'à présent, il a été difficile pour caractériser complètement la matière organique, car la diversité des composés présents nécessite différentes techniques complémentaires pour leur caractérisation. Les progrès récents ont comblé l’écart ; à l’aide d’un ensemble de techniques d’analyse, nous pouvons analyser une large gamme de composés organiques, fournissant la caractérisation moléculaire et, dans certains quantification de cas, de petits métabolites primaires comme glucose jusqu'à 800 Da poly-hétérocycles. Auparavant ces grosses molécules complexes seraient ont été caractérisées simplement comme comme la lignine ou tanin-like et supposé avoir été récalcitrant. Caractérisation moléculaire-niveau, cependant, permet de calculer NOSC pour ces grosses molécules complexes. Ces valeurs NOSC sont corrélées linéairement avec la force motrice thermodynamique permettant d’évaluer la qualité de la matière organique disponible par décomposition, ce qui, dans de nombreux cas, révèle que ces molécules complexes peuvent effectivement être microbienne dégradable même dans des conditions anoxiques qui prévalent dans les milieux humides.
Depuis l’introduction de O2 permet de presque toutes les valeurs NOSC naturellement observées à décomposer la matière organique, dans les présentes, nous nous concentrons sur les changements dans la matière organique et de la protéomique microbienne qui risquent d’être les principaux facteurs en milieu humide (c'est-à-dire, systèmes de limitée O2). Cependant, toutes les techniques que nous allons discuter peuvent être appliquées à la matière organique d’un écosystème. Communément, en vrac mesures basées sur optique et analyses de fluorescence ont été utilisés pour évaluer la qualité de la matière organique3,14. Lors de l’utilisation de mesures en vrac tels que ceux-ci, cependant, les détails fins sont perdus comme un grand nombre de molécules est classé ensemble sous des termes génériques comme dérivés humiques ou fulvics. Les définitions de ces catégories ne sont pas bien contraintes et, en fait, peuvent varier d’une étude à faire des comparaisons impossibles. En outre, mesures en vrac ne fournissent les détails moléculaires nécessaires pour le calcul de la thermodynamique qui régissent le système et ne répondent donc vraiment évaluer les matières organiques qualité15.
Techniques individuelles telles que Fourier transforment ion cyclotron resonance spectrométrie de masse (FTICR-MS), la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN), chromatographie en phase gazeuse (GC-MS) de la spectrométrie de masse, et faire de la spectrométrie de masse par chromatographie liquide (LC-MS) fournir ces détails au niveau moléculaire. Alors que chacune de ces techniques présente ses propres limites, ils apportent aussi leurs propres points forts qui peuvent être exploitées dans une approche intégrée pour atteindre la finesse des détails moléculaires nécessaires pour quantifier la qualité de la matière organique dans un sens rigoureux de thermodynamique . GC-MS est utile pour identifier des métabolites petites critiques qui sont susceptibles d’exercer une influence proximale sur le CO2 et de production de4 CH (p. ex., glucose, acétate, etc.) ; Cependant, GC-MS requiert la vérification contre une norme et est donc limité à des composés déjà connus présents dans la base de données, empêchant l’identification de nouveaux composés. En outre, GC-MS est une technique semi qualitative permettant d’inférence sur les changements dans les concentrations relatives, mais ne pas fournir les informations de concentration réelle nécessaires pour le calcul des énergies libres de Gibbs par exemple. Enfin, GC-MS nécessite la dérivatisation de molécules avant l’analyse, ce qui limite la résolution de composés plus petits que ~ 400 Da et alcools volatiles sont perdus pendant l’étape de séchage.
Unidimensionnelle (1D) 1H état liquide NMR permet une caractérisation très quantitative des petits métabolites (y compris les métabolites primaires de faible poids moléculaire et substances volatiles comme l’acétate, acétone, formiate, pyruvate, alcools, succinate, paraffines chlorées des acides gras, comme un éventail de glucides notoirement absents ou compromis de méthodes axées sur le MS) et leurs concentrations sont particulièrement utiles pour le calcul des paramètres thermodynamiques. Pourtant, comme le GC-MS, 1D NMR de mélanges complexes nécessite la normalisation par rapport à une base de données et donc ne permet pas seul faciliter l’identification de nouveaux composés qui sont susceptibles d’être abondante dans des écosystèmes complexes naturels et changeantes. En outre, la RMN est moins sensible que les techniques basées sur MS et donc, profilage métabolite quantitative est réalisé seulement au-dessus de 1 µM à l’aide de systèmes NMR équipés de sondes froid refroidi à l’hélium. Pas très apprécié, certains NMR froid-sondes sont tolérantes au sel et permettent une analyse environnementale de mélange en présence de concentrations millimolaires de sels lorsqu’il est utilisé dans le plus petit diamètre (< 3 mm de diamètre extérieur) échantillon tubes16. Cependant, une autre complication de la RMN est celui des quantités élevées de minéraux et des métaux paramagnétiques (p. ex., Fe et Mn au-dessus % de poids de 1-3), qui peut être abondant dans les sols secs, peut élargir les caractéristiques spectrales et compliquer l’interprétation des spectres RMN . À l’aide d’extraction en phase solide (SPE) peut aide dans l’interprétation de la RMN et de métabolomique basées sur les méthodes de réduction des sels minéraux et en augmentant la qualité spectrale.
FTICR-MS par injection directe est une technique très sensible permettant de détecter des dizaines de milliers de métabolites provenant d’un échantillon unique, mais elle ne capture pas les métabolites petites critiques tels que l’acétate, le pyruvate et succinate et est notoirement difficile à utiliser des sucres et autres glucides17, ni fournit des informations quantitatives. Cependant, contrairement aux autres techniques, FTICR-MS excelle en identifiant et en assignant la formule moléculaire de nouveaux composés et identifie par conséquent le plus grand nombre de composés en fournissant des informations moléculaires plus que n’importe lequel des autres techniques décrites. Ceci est utile, car l’information moléculaire fournie par FTICR-MS (et d’autres techniques) peut être utilisée pour calculer NOSC qui est liée à la force motrice thermodynamique régissant la probabilité de certaines réactions8 et leurs tarifs dans certaines conditions7. En outre, en couplant FTICR-MS avec des techniques de séparation, comme LC avec tandem MS, informations structurelles quantitatives peuvent être atteint, compenserait une partie des inconvénients de cette technique. LC-MS est utile pour identifier des composés de type lipidique et d’autres métabolites qui ne sont pas bien caractérisés par une des autres méthodes. Couplage LC FTICR-MS ou LC-MS avec un collecteur de fraction et recueillant des fractions d’inconnues spécifiques d’intérêt pour l’élucidation de la structure de l’état liquide de deux dimensions (2D) NMR est la situation idéale pour identifier et quantifier les composés inconnus18 ,,19. Il s’agit cependant d’une très longue étape qui pourrait être utilisée si nécessaire. Pris individuellement, chacune de ces techniques présentent un portrait différent de la matière organique, et en les intégrant, nous pouvons parvenir à une compréhension plus complète que l’utilisation des techniques d’isolément.
Alors que les considérations thermodynamiques définir les contraintes ultimes sur quelles transformations sont possibles dans un système, décomposition des matières organiques est médiée par des microorganismes dont les activités enzymatiques contrôlent les vitesses de réaction. Bien comprendre les contrôles sur la décomposition des matières organiques et, finalement, la production de gaz (CO2 et CH4) à effet de serre des milieux humides exige donc une approche intégrée omiques pour caractériser les activités des enzymes microbiennes ainsi que les métabolites. Dans cet article, nous décrivons une méthode pour parvenir à une telle analyse complète d’un seul échantillon en utilisant une approche séquentielle qui se traduit par une analyse complètement appariée. Cette approche se développe sur le métabolite, protéines et lipides extraction (MPLex) protocole dans lequel protéomique a été couplé avec le GC-MS et LC-MS20 pour identifier les petits métabolites, les protéines et les lipides en incorporant les informations quantitatives métabolite par l’intermédiaire RMN et identification des grandes métabolites secondaires via FTICR-Mme légèrement différentes à MPLex, nous commençons le protocole avec un captage d’eau, puis utiliser l’extraction séquentielle avec plus en plus des solvants non-polaires. Toutes les extractions sont effectuées sur un échantillon unique qui conserve l’échantillon lorsque les volumes sont limités ou difficiles à obtenir et diminue les erreurs expérimentales introduites par la variation entre les aliquotes de matrices de prélèvement hétérogènes (par exemple, le sol et tourbe) ou différences dans les conditions d’entreposage et de la durée.
Enfin, en couplant les analyses de l’OM avec les analyses protéomique de la communauté microbienne, nous pouvons bâtir des réseaux métaboliques qui décrivent les voies et la transformation de la décomposition des matières organiques. Cela nous permet de tester des hypothèses spécifiques au sujet de comment les perturbations au système influenceront ultime CO2 et production4 CH au travers les substrats organiques disponibles, accepteurs d’électrons et les communautés microbiennes médiation des réactions via l’activité de catalyseurs enzymatiques.
L’objectif général de cette méthode consiste à fournir un protocole de débit unique pour l’analyse des métabolites, des lipides et des protéines microbiennes auprès d’un échantillon unique, créant ainsi un ensemble de données totalement apparié pour la construction de réseaux métaboliques tout en limitant les erreurs analytiques .
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Protocol
1. sequential Extraction de matière organique du sol, de sédiments ou de tourbe
- Recueillir les sols, les sédiments ou tourbe par carottage et diviser les cœurs selon l’hypothèse testée (p. ex., profondeur). Échantillons de magasin en polytétrafluoroéthylène enduit contenants et congeler à-80 ° C pour le stockage avant l’analyse.
NOTE : Environ 25 mg C est nécessaire pour ce protocole. Pour la tourbe (en général 45 % C), 50 mg de tourbe séchée est nécessaire. Plus grandes quantités d’échantillon peuvent être nécessaire pour des échantillons organiques faibles comme les sols des hautes terres minières ou forestières selon le C content (jusqu'à 5 g). Parce que l’extraction par des solvants organiques tirera tout polyéthylène glycol (PEG) dans les extraits, ce qui affecteront négativement l’ionisation au cours de l’étape 2.4, il est important d’éviter ce qui permet de contacter plastique à tout moment au cours de la collecte, le stockage des échantillons ou extraction. - Lorsque vous êtes prêt à analyser les échantillons, congeler sec jusqu'à poids constant, puis les moudre les échantillons dans un broyeur à billes haute vitesse à l’aide de boulets de broyage en acier inoxydable d’homogénéiser et de casser vers le haut de n’importe quel agrégat.
Remarque : Le protocole peut être suspendu à ce stade et le matériel stocké à-80 ° C. - Utilisation d’un éthanol-lavé inox ustensile, l’aliquote 50 mg de chacun des échantillons séchés dans les flacons de verre bouteille de 2 mL. Ces échantillons seront extraites successivement à l’aide d’une série de solvants pour extraire consécutivement des métabolites de plus en plus non polaires de chaque échantillon. Ajouter 1 mL d’eau distillée et dégazé (H2O) pour chaque échantillon, boucher les flacons et agiter pendant 2 h sur une table de shaker.
- Après agitation permettent les solutions reposer à température ambiante (RT) pendant 20 min, puis centrifuger à 15 000 x g pendant 30 min, décanter et sauver le surnageant de chacun.
Remarque : Ces solutions seront injectées dans la FTICR-MS par injection directe. - Conduite un Folch extraction21 (également connu sous le nom MPLEx20) sur l’instant l’eau extraite des résidus en répétant les étapes 1.3 et 1.4, de 1 mL d’a-20 ° C mélange chloroforme : méthanol 4 / 3 pour l’eau à l’étape 1.3.
Attention : Chloroforme / méthanol sont hautement inflammables et toxiques. Portez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié permet d’éviter le contact avec la peau et éviter les flammes. - Soigneusement séparer les deux résultant de solvant couches, qui seront visuellement distinguables, analyse distincte par FTICR-MS à l’aide d’une séparation de l’entonnoir ou il suffit d’enlever la couche supérieure de pipetage prudent.
Remarque : La fraction contenant du chloroforme sera en bas tandis que la fraction contenant du méthanol est moins dense et sera sur le dessus. - Diluer l’extrait de chloroforme (étape 1.6) 1:1 dans le méthanol et l’extrait de l’eau (étape 1.4) 2:1 dans le méthanol pour améliorer l’efficacité d’ionisation (ESI) d’electrospray pour FTICR-MS par injection directe.
Remarque : La fraction contenant du méthanol, de l’étape 1.7 n’a pas besoin d’être diluée en méthanol. La couche de méthanol sera exécutée par injection directe dans le FTICR-SM.
Analyse 2.FTICR-SM
- Calibrer le spectromètre FTICR en injectant directement 100 µL d’une solution de réglage (voir Table des matières) oeuvrant dans une masse d’environ 100-1 300 Da dans la FTICR-MS.
- Élaborer la norme de l’acide fulvique Suwannee River (voir Table des matières) en effectuant une solution de-1 mg 1 mL dans l’eau ultrapure filtrée puis diluer la solution obtenue à 20 µg mL-1 dans le méthanol.
- Direct injecter 23 µL de cette solution finale à la source de l’ESI couplée au spectromètre FTICR grâce à une pompe à seringue a un débit de 3,0 μL min-1. Valeur tension aiguille + 4,4 kV, Q1 à 150 m/z et verre capillaire à 180 ° C. Inspecter les spectres résultants en utilisant le logiciel d’analyse (voir Table des matières) pour vérifier la qualité des données.
- Utilisez méthanol de qualité CLHP avant d’exécuter des échantillons et tout au long de l’échantillonnage pour surveiller report. Introduire 23 μL de chaque extrait par injection directe à la source de l’ESI couplée au spectromètre FTICR grâce à une pompe à seringue a un débit de 3,0 μL min-1. Valeur tension aiguille + 4,4 kV, Q1 à 150 m/z et verre capillaire à 180 ° C.
- Ajuster les temps d’accumulation ion (IAT) pour chaque échantillon ou d’un groupe d’échantillons pour tenir compte de la variation de concentration C. Les valeurs typiques sont entre les balayages de s. 144 recueillir de 0,1 à 0,3 pour chaque échantillon, la moyenne les scans et puis procéder à un étalonnage interne à l’aide d’homologues CH2 (c'est-à-dire 14 Da séparation) série.
Remarque : Après analyse FTICR-SM, la décision peut être prise soit combiner l’eau et méthanol extrait fractions afin de rationaliser les étapes restantes ou les fractions peuvent être distincte tout au long des étapes ultérieures. Les avantages et les inconvénients de chaque solution sont décrites en détail dans la Discussion. Si ce faisant, combiner les fractions extraites à l’aide de méthanol et l’eau. - Sécher les extraits à l’aide d’un concentrateur et sauver le reste des extraits (~ 1 mL) pour les GC-MS (eau, méthanol ou eau + méthanol), LC-MS (chloroforme) et analyse par RMN (eau + méthanol).
Remarque : Le protocole peut être suspendu à ce stade et le matériel stocké à-20 ° C.
3. FTICR-MS informatique
- A aligner tous les exemples de listes de pointe pour le dataset entier à réduire les déplacements de massives et de normaliser les affectations de crête à l’aide de Formularity logiciel22 avant l’affectation de la formule.
- Le logiciel de Formularity22 permet d’affecter formule moléculaire à l’aide d’un signal / bruit supérieur à 7, de la masse mesure erreur < 1 ppm et permettant de C, H, O, N, S et P tout en excluant tous les autres éléments.
- Si plusieurs formules de candidats sont retournés pour une masse donnée (souvent au-dessus de 500 Da) imposent des contraintes compatibles avec le matériel à échantillonner. Par exemple, dans de la tourbe, contraintes typiques incluent : erreur de masse plus faible, le plus bas nombre d’hétéroatomes (N, S, P), et lorsqu’il est présent, P doit être sous forme oxydée (c'est-à-direqu’il doit y avoir au moins 4 atomes de O pour chaque atome de P dans la formule).
4. chimique dérivatisation pour GC-MS
- Préparer les échantillons de contrôle à blanc d’hexane qualité HPLC en GC-MS de flacons pour échantillonneur automatique23. Dissoudre les esters méthyliques d’acides gras 100 mg (FAMEs : C8 - C28) temps de rétention de mélange standard dans 200 µL d’hexane.
- Pour protéger les groupes carbonyles, ajouter 20 μL de chlorhydrate de méthoxyamine-1 mg 30 mL de pyridine à chacun du méthanol extraits et eau extraits (ou si vous utilisez des extraits de méthanol/eau combinée) à l’étape 2.6, flans et FAME étalonnage échantillons23. Sceller les flacons avec bouchon.
Attention : La Pyridine est hautement toxique et inflammable. Porter les EPI approprié pour prévenir le contact cutané ou oculaire et éviter les flammes. En outre, pyridine se volatilise à ta provoquant la contamination de l’air dangereux. Travailler uniquement dans des endroits bien ventilés sous une hotte aspirante. - Extraits de vortex pour 20 s. un extraits pendant 60 s. Puis, incuber les extraits dans une centrifugeuse à 37 ° C pendant 90 min à 100 g.
Remarque : Une quantité excessive de glucides ou de sels peut provoquer des métabolites à cristalliser séchées vers le bas. Sonification les échantillons vous aidera à reconstituer les métabolites cristallisés dans le réactif de dérivatisation. - Après l’incubation, ajouter 80 μL de N-méthyl - N-(triméthylsilyl) trifluoroacétamide avec triméthylchlorosilane 1 % pour chaque échantillon, extraits de vortex pour 20 s. un extraits pendant 60 s et incuber extraits à nouveau dans une centrifugeuse à 37 ° C pendant 30 min à 100 g.
- Extraits cool a RT (20-24 ° C), puis les transférer dans des flacons pour échantillonneur automatique GC-MS.
5. GC-MS Analysis
- Régler et étalonner MS conformément aux recommandations du vendeur (voir Table des matières) avant l’analyse pour s’assurer que la machine à lire les données de MS correctement. Vérifier que la pression du gaz hélium est dans la tolérance spécifiée.
- Métabolites polaires séparées sur une colonne (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm). Ajustez le protocole de température de four comme suit : (1) première température de 60 ° C pendant 1 min, (2) rampe à 325 ° C à raison de 10 ° C min-1et (3) prise à 325 ° C pendant 5 min.
- Analyser les extraits à l’aide d’un GC couplé à un quadripôle unique MS. Set injection port température à une température constante de 250 ° C. Injecter 1 μL de chaque extrait dérivé en mode splitless.
6. GC-MS informatique
- Inspecter tous les fichiers de données pour s’assurer qu’ils ont été correctement capturés. Attention aux variations potentielles en ce qui concerne les temps de rétention standard interne et intensités de confirmer que les données a été capturées constamment tout au long de l’analyse.
- Convertir le format de données MS spécifique du vendeur à un format MS général si nécessaire. Traiter les fichiers de données brutes à l’aide de MetaboliteDetector24 étalonnage des indices de rétention basés sur les normes internes de FAME. Après avoir aligné les temps de rétention de tous les fichiers de données, continuent avec la déconvolution et enfin l’identification métabolite en faisant correspondre les indices de rétention et les spectres de la GC-MS contre le FiehnLib métabolite polaire bibliothèque25.
- Contre-vérifier restant des métabolites non identifiés à la bibliothèque de NIST14 GC-MS par correspondance spectrale. Valider les identifications individuellement afin d’éliminer les fausses identifications et réduire les erreurs de déconvolution.
7. analyse par RMN état liquide
- Diluer le reste des extraits l’eau (~ 300 µL) de 10 % (vol/vol) avec un étalon interne 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 de 5 mM. Vous pouvez également mélanger l’eau et des extraits méthanoliques de l’étape 1 puis resubstitute dans l’eau. Faisant toutefois, certains des composés volatils peuvent être perdues lors de l’étape de lyophilisation. Volumes d’échantillon final typiques sont de l’ordre de 180 à 300 µL.
- Transférer le mélange dans un tube de verre de borosilicate NMR haute qualité 3 mm diamètre extérieur (diamètre extérieur).
- Recueillir les spectres à l’aide d’un spectromètre RMN (idéalement au moins 600 MHz) équipé d’une sonde à froid tolérantes au sel 5 mm triple résonance et un pré-ampli froid-carbone.
- Recueillir les spectres 1H 1D en utilisant une expérience déboisée 1D nucléaire Overhauser effet spectroscopie (NOESY) à 298 K, avec un temps d’acquisition 4 s, 1,5 s recycle delay, 65 536 points complexes et 512 scans.
- Recueillir les 2D 1H -13C hétéronucléaire single-quantique corrélation (HSQC) et spectres de corrélation totale (TOCSY)1H 1H - pour aider à attribuer les métabolites et validation.
- Traiter, assigner et d’analyser tous les spectres en utilisant le logiciel d’analyse NMR (voir Table des matières) pour quantifier les intensités par rapport à l’étalon interne. Identifier les métabolites en faisant correspondre les informations chimiques de Maj, J-couplage et l’intensité dans les échantillons à la bibliothèque.
NOTE : La bibliothèque est rehaussée par normes de métabolite ciblé personnalisé et ajouts de métabolite faites sur une base régulière. Le protocole peut être suspendu à ce stade et le matériel stocké à-20 ° C.
8. LC-MS lipidomique analyse
- Mouillez l’extrait de chloroforme séchées générée au cours de l’étape 2.5 avec 200 μl de méthanol.
- Injecter 10 μl de chaque extrait dans un chromatographe en phase liquide ultra performants, couplé à un spectromètre de masse orbitrap valant à l’aide d’une phase inverse facturée colonne surface hybride (taille des particules 3,0 mm × 150 mm × 1,7 μm). Définir un dégradé de 34 min (phase mobile A: acétonitrile/H2O (40 : 60) contenant de l’acétate d’ammonium 10 mM ; phase mobile B: acétonitrile/isopropanol (10 : 90) contenant de l’acétate d’ammonium 10 mM) à un débit de 250 µL/min. utilisation tant négatives que positives modes d’ionisation avec dissociation d’énergie plus élevée collision et dissociation induite par collision.
Attention : L’acétonitrile est un œil, peau et irrite les voies respiratoires. Porter les EPI approprié. En outre, l’acétonitrile est combustible. Ne permettent pas de communiquer avec les agents oxydants, des vapeurs toxiques peuvent être produites durant la combustion. - Télécharger les fichiers de données brutes LC-MS/MS dans le liquide ainsi que le fichier cible (c'est-à-dire, la liste des espèces de lipides > 25 000) pour le mode d’ionisation respectifs (positif ou négatif). Traiter le fichier raw. Manuellement valider les identifications qui en résulte en examinant le spectre MS/MS pour la présence d’ions diagnostiques, si des ions fragment correspondant applicable (par exemple, les chaînes d’acides gras), la séparation isotopique, erreur ppm de précurseurs et le temps de rétention de masse. Exporter la liste résultante des lipides avec confiance identifiés en format .tsv.
Remarque : Le protocole peut être suspendue à ce stade et stocker les matériaux à-20 ° C.
9. analyse protéomique
- Extrait de protéines selon le protocole de MPLEx20 du reste de la phase de méthanol résultant de l’étape 2.4, en lavant l’extrait avec 20 fois le volume extrait de méthanol à froid supplémentaires (-20 ° C).
- Utiliser 1 mL/50 mg à base de silice absorbant (voir la Table des matières) aux colonnes C18 SPE condition avec 3 mL de méthanol, 2 mL de 0,1 % d’acide trifluoroacétique (TFA) dans l’eau, suivie par l’ajout de l’extrait à l’étape 9.1 à un taux ne dépassant pas 1 mL/min.
- Après l’ajout de l’échantillon, laver la colonne avec 4 mL d’eau de 95:4.9:0.1 : acetonitrile:TFA, puis laisser pour sécher. Placez un tube de prélèvement de 1,5 mL sous la colonne SPE et éluer l’échantillon avec 1 mL de méthanol : eau : TFA 80:19.9:0.1.
- Concentré, les extraits à 100 µL sous vide assistée gel sèche, puis mesurer la concentration de protéine par bicinchoninic acide (BCA) dosage colorimétrique26 à une longueur d’onde de 562 nm.
- Extraits de la centrifugeuse à 10 000 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant qui en résulte et sécher le granule restant sous vide pour 5 min. resuspendre le culot de protéine dans l’eau à une concentration finale de 0,1 µg peptide par µL.
- Ajouter le dithiothréitol à une concentration finale de 5 mM et incuber à 60 ° C pendant 30 min. diluer 10 fois avec la solution d’urée 8 M 100 mM NH4HCO3et incuber à 37 ° C pendant 3 h en présence de 1 mM CaCl2 et trypsine porcine à un 01:50 enzymatique de protéines ratio.
Remarque : Le protocole peut être interrompu à ce stade et entreposer les matières à-20 ° C. - Extraits séparés par chromatographie en phase liquide en utilisant un gradient exponentiel d’acide formique 0,1 % dans la phase mobile de l’eau (A) et un acide formique de 0,1 % dans la phase mobile d’acétonitrile (B) à kpsi 10 et 500 nL min-1.
- Introduire éluant qui en résulte dans un spectromètre de masse couplé à ESI collecte des spectres de 400-2 000 m/z avec une résolution de 100 000 à m/z 400 dans un spectromètre de masse orbitrap valant linéaire piège ionique (LTQ).
- Convertir les fichiers RAW de spectres au format Hatta dit Harber à l’aide de msConvert ou ProteoWizard accepter tous les paramètres par défaut. Utilisez l’outil de recherche de base de données universelle MSGFPlus pour rechercher des protéomes obtenue contre une base de données de protéine ciblée de séquences protéiques prévues des génomes pertinentes métagénome assemblé.
- Ajout des contaminants (par exemple, la trypsine, kératine, albumine) et supprimer toutes les séquences de protéines exactement dupliqué pour améliorer les statistiques de match de peptide-à-masse-spectre. Évaluer les scores de probabilité spectral MSGF qui en résulte pour déterminer quel match de peptide-à-masse-spectre est préférable. Utilisez la valeur Q de MSGFPlus pour filtrer la pile de données entière au taux de 1 % fausse découverte (FDR).
10. métabolomique analyse et construction de réseaux métaboliques
- Compilez toutes les formule moléculaire de métabolites identifiés dans les étapes 3, 6, 7 et 8 en une seule base de données des métabolites présents dans les échantillons. Combiner ces métabolites avec les numéros de Enzyme Commission (EC) ou niveau KEGG (KO) d’enzymes identifiées à l’étape 9. Rechercher ce dataset combiné sur la base de données KEGG27 , section de voies métaboliques.
- Évaluer les résultats pour identifier les voies plus probables et à intégrer dans un modèle métabolique manuellement.
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Representative Results
Nous avons effectué le protocole d’analyse complémentaires décrites et comparées de tourbe avec la profondeur dans la tourbière de S1 dans le site épinettes et tourbières réponse sous changer environnements () dans le Minnesota, USA. Ces résultats sont comparés à ceux d’une tourbière du pergélisol et de la fen, du Nord de la Suède pour montrer comment les sites peuvent varier en métabolite et les activités enzymatiques. Nous avons identifié 3 312 enzymes dans l’analyse protéomique. L’analyse de l’activité d’enzymes avec profondeur révèle que le nombre des enzymes diminue brusquement entre 15 cm et 45 cm de la tourbière d’épinette (Figure 1).
Alors que les résultats de la protéomique indiquent quelles protéines sont exprimées, les données métaboliques montrent quelles réactions se produisent réellement. Dans l’ensemble, nous avons identifié 67 040 métabolites (y compris les lipides) dans tous les échantillons de tourbe de la combinaison de FTICR-MS, RMN, GC-MS et LC-MS analyses. Parmi ceux-ci, nous avons pu assigner formule moléculaire à 15 385 composés (Figure 2). La combinaison des données métaboliques s’étend sur une gamme des États d’oxydation, des masses et des classes de composés.
Cela est généralement visualisé à l’aide d’un diagramme de van Krevelen dans lequel les rapports atomiques H/C formule identifié sont tracées contre leur atomique de ratios d’o/c28. Nous avons inclus une nouvelle dimension pour le format 2D classique, illustrant NOSC au moyen de couleur codage les symboles représentant la formule individuelle (Figure 3 et Figure 4). Avec la profondeur dans la tourbière de l’épinette, il y a une augmentation du nombre total de métabolites secondaires grands identifié par FTICR-SM, plus précisément à fortement condensée (coin inférieur gauche de la courbe de van Krevelen) et hydrogénée formules (en haut de la parcelle) (Figure 4 ). Au cours de la même profondeur, il y a une diminution du nombre de petits composés hautement énergétiques identifiés par GC-MS et les lipides (Figure 5). Ceci pourrait suggérer que les lipides et les petits métabolites sont consommés dans la tourbe en surface avant d’atteindre les plus grandes profondeurs ou que les taux de décomposition dans la tourbe profonde sont plus rapides que dans la surface tels que les composés amenant à la baisse sont rapidement consommés. Différenciation entre ces deux hypothèses concurrentes nécessite une compréhension au niveau des processus de la ch. cyclisme sur le site. Telle une compréhension au niveau du processus seulement peut être obtenue qu’en couplant les ensembles de données métabolomique et protéomique. Nous accomplissons ceci en croix-validant le combiné FTICR-MS, GC-MS, LC-MS et NMR identifiés métabolites sur la base de données KEGG. Ce faisant, nous constatons que les composés que nous avons identifiés sont impliqués en commun métaboliques tels que le cycle des acides tricarboxyliques (TCA), la glycolyse et le métabolisme du sucre. Depuis différents métabolites peuvent être impliqués dans plusieurs confirmation de voies avec les enzymes augmente notre confiance dans l’attribution de voies (Figure 6).
Grâce à cette cartographie nous trouver des preuves de métabolisme de saccharose et amidon dans la tourbe en surface, tandis que dans les plus grandes profondeurs pyruvate et autres produits de fermentation s’accumuler (Figure 6). Ces résultats sont en accord avec la première hypothèse que les sucres et autres métabolites énergiques sont dégradés dans la tourbe en surface et n’atteignent pas les plus grandes profondeurs de tourbe. Comme il ressort de la Figure 5, sucres (CNOP = 0) et les acides aminés (0 < NOSC < 1) sont consommés dans la tourbe en surface, tandis que les lipides (-2 < NOSC < -1) semblent s’accumuler avec la profondeur. Cela correspond aux attentes basées sur les valeurs NOSC que supérieur NOSC composés ne sont plus facilement dégradés composés NOSC inférieur persistent dans le très anaérobie (c'est-à-dire, limitée dans le thé) conditions de tourbe sous la surface. Cette approche se distingue également avec succès entre les types de sols de différents environnements. Par exemple, la matière organique du sol des tourbières boréales semble être une composition différente que la tourbière à pergélisol, ainsi que dans les marais et tourbières dans la région de pergélisol. Ces résultats sont compatibles avec une étude antérieure a montré des différences en géochimie site entre ces habitats29, suggérant que géochimie de site ont un grand effet sur la dégradation microbienne des C sous terre.
Figure 1 : L’analyse protéomique indique stratification profondeur forte du nombre d’enzymes. Les barres indiquent les moyennes et les barres d’erreur indiquent un écart type de l’abondance. Ceci suggère que les micro-organismes sont plus actifs dans la surface de la tourbe. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Le nombre de composés identifiés par chaque technique dans la surface tourbe (< 30 cm) de chacun des habitats ainsi que le milieu (45 cm) et la tourbe (87 cm) de profondeur de la tourbière épinette. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Diagramme de the van Krevelen (atomique H/C vs o/c de chacun identifié formule moléculaire) pour la surface (15 cm) SPRUCE bog profondeur pour illustrer la couverture de composés caractérisés par chaque technique. FTICR-MS permet d’identifier le plus grand nombre de composés (petits cercles), tandis que le GC-MS (triangles) est bon pour la différenciation et l’identification des sucres (H/C = 2 et o/c = 1). Spectroscopie RMN (carrés) fournit des renseignements quantitatifs sur les composés énergétiquement importants tels que les sucres, acides aminés, pyruvate, etc.. LC-MS (diamants) fournit des informations sur les lipides. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Diagramme de the van Krevelen (atomique H/C vs o/c de chacun identifié formule moléculaire) pour la profondeur (87 cm) SPRUCE bog profondeur pour illustrer la couverture de composés caractérisés par chaque technique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : La fraction relative des différentes classes chimiques identifiés par l’intermédiaire les différentes techniques dans les profondeurs différentes. Barres sont tracés en moyennes pour chaque profondeur ± écart. Les classes tracées incluent des acides aminés, sphingolipides (Cer), glycerophosphocholines (PC), phosphoethanolamines (PE), diacylclyceroltrihomoserine (DGTSA), diacylglycerol (DG), triacylglycérols (TG) et des sucres. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Combinaison des résultats pour créer un réseau métabolique. Profondeurs de métabolites identifiés par RMN (un) et GC-MS (b) et une carte simplifiée métabolique (c) montrant un certain nombre de transformations identifiées à épinette bog. Cases vertes indiquent les métabolites qui diminuent avec les boîtes de profondeur, brun indiquent des métabolites qui augmentent avec la profondeur. Flèches de connexion vertes indiquent enzyme identifié dans notre dataset qui médient la transformation indiquée (numéros de EC enzyme indiqués en regard de flèches). Flèches grises de raccordement indiquent les transformations dont les enzymes ne figuraient pas dans notre dataset. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le single-débit, flux de plein-accouplées analyse utilisé pour caractériser les métabolites et le protéome permet de mieux comprendre les voies par lesquelles C cyclisme se produit dans un écosystème complex. Sol et la tourbe sont des matrices hétérogènes, et par conséquent, une des étapes essentielles de cette méthode se produit dans les premières étapes en veillant à ce que le départ de tourbe ou les matériaux du sol est très homogène. Il est préférable de broyer l’échantillon ainsi que les agrégats peuvent réduire l’efficacité de l’extraction. Il s’agit d’un problème particulier pour les sols agrégées et sols C faible et des teneurs élevées en minéraux qui peuvent nécessiter l’utilisation d’un moulin à billes en acier inoxydable pour bien homogénéiser. Car l’hétérogénéité spatiale des sols et de la tourbe au sein d’un site expérimental peut-être être élevée, des réplicats biologiques sont fortement recommandés.
Cette méthode utilise trois solvants : eau, méthanol et le chloroforme, qui biaiser les types de composés, il est possible d’extraire. En principe, cette méthode d’extraction séquentielle devrait solubiliser composés couvrant un éventail large de polarité. Toutefois, ces solvants ne sont pas optimisés pour l’extraction des complexes organo-minéraux ou complexes hautement stabilisés. Si ces composés présentent un intérêt, solvants plus sévères tels que les acides forts et bases sont préférés, mais les procédés d’extraction plus sévères pouvant altérer la composition chimique des échantillons. Intégrant ces solvants à la fin de la séquence d’extraction peut minimiser cet effet. En outre, chloroforme inactivera sol cliniquement important et bactérienne de la tourbe et virus pathogènes et autres agents biologiques pathogènes qui causent des maladies, en dissolvant les lipides de la membrane cellulaire. Ainsi, incorporant de chloroforme dans le protocole d’extraction permettra de réduire les risques liés à des études de biologie des échantillons potentiellement infectées par des agents pathogènes provenant de différentes régions du monde. S’il y a des préoccupations au sujet de cellules microbiennes mortes, des débris ou particules après l’extraction, les extraits de filtrage à travers un filtre en fibre de verre 0,2 µm est recommandé.
Afin de simplifier le processus, l’eau et le méthanol extraits seront cumulables pour analyse par CPG-SM au cours de l’étape 4.1. Toutefois, ces extraits doivent rester séparés pour analyse FTICR-SM en raison de problèmes d’efficacité d’ionisation avec la source de l’ESI. L’avantage de l’exécution de l’extrait combinée sur le GC-MS est que plusieurs métabolites (qui couvre un plus large éventail de polarité) seront identifiés. L’inconvénient de combiner les extraits à ce stade est que les principaux métabolites importants dans le traitement microbien de la matière organique est méthanol. Traces de méthanol seront toujours sur l’échantillon combiné, même après le séchage, donc si le méthanol est un métabolite de l’intérêt, l’extrait de l’eau doit être exécutée séparément. Ayant de bons contrôles avec aucun analytes aidera également à identifier la contamination potentielle dans les échantillons.
À l’étape 7.1 de la préparation des extraits pour analyse par RMN, comme dans l’analyse de la GC-MS, soit l’extrait de l’eau seule ou de l’eau combinée et extraits au méthanol peuvent être utilisés. Les inconvénients d’y parvenir sont semblables à ceux énumérés à l’alinéa précédent. L’avantage de combiner les extraits de méthanol et d’eau, c’est que certains des métabolites moins polaires que sont solubilisés dans la fraction de méthanol seront identifié. Toutefois, en raison de l’étape de lyophilisation, beaucoup plus volatils seront perdues. Il s’agit d’un désavantage particulier si quantification des acides gras volatils est un élément essentiel de l’expérience.
Dans cette procédure d’identification de protéomique, seuls les peptides entièrement tryptiques sont activité peptidase recherchés, donc endogène et fragmentations source nous manquera. En revanche, méthionine oxydée peut-être être considérée comme une modification post-traductionnelle pour les candidats de peptide où cette modification survient souvent durant le prélèvement d’échantillons de traitement et de manutention. Quantification des enzymes à l’aide de zones de peptide d’élution peut être faite, mais il déborde le cadre de ce projet.
Beaucoup de récents progrès dans l’analyse de NOM et les paramètres microbiens fournissent une multitude de techniques permettant de comprendre le C organique cyclisme. En combinant ces techniques dans un seul protocole simplifié, nous gagnons une vue nouvelle des processus qui se déroulent. Couplage de l’analyse protéomique avec les analyses métaboliques offre convaincante qu’une réaction se produit effectivement une preuve corroborante. Analyse métabolique seul est limité car il nous informe que les métabolites sont plus ou moins élevé de concentration dans les comparaisons entre les sites, ou après un effet de traitement, mais ne peut pas discerner les causes de ces changements. Par exemple, nous avons relevé des concentrations de sucre baisse avec la profondeur dans la tourbière, mais sans plus d’information, on ne sait pas si le déclin avec la profondeur est due à des entrées lentes ou rapide dégradation dans la tourbe profonde. Analyse du protéome et l’expression enzymatique en déclin avec la profondeur nous permet de rejeter la seconde hypothèse. Nos résultats sont plutôt conformes à la dégradation rapide de sucre aux entrées tourbe surface limitant les plus grandes profondeurs. Ces idées particulières sont uniquement possible lorsque toutes les techniques sont considérés comme en tandem, car chacun d’eux fournit un unique, mais un élément essentiel de la ch. cyclisme puzzle.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier J.P. Chanton, J.E. Kostka et M.M. Kolton d’assistance avec le prélèvement d’échantillons de tourbe. Parties de ce document ont été effectuées au laboratoire de Sciences moléculaires environnement, un DOE bureau de l’utilisateur installation scientifique parrainé par l’Office of Biological and Environmental Research. PPNL est exploité par Battelle pour l’entité opérationnelle désignée en vertu du contrat DE-AC05-76RL01830. Ce travail a été soutenu par l’US Department of Energy Office of Science et Office of Biological and Environmental research (subventions : DE-AC05-00OR22725, DE-SC0004632, DESC0010580, DE-SC0012088 et DE-SC0014416).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| methoxyamine hydrochloride | Sigma Aldrich | 226904 | derivitization agent |
| 5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe | Bruker | instrumentation | |
| capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) | Agilent | AG19091S-433 | instrumentation |
| reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size) | ThermoFisher | instrumentation | |
| 2 mL glass vials | VWR International | 46610-722 | sample vials |
| autosampler vials | VWR International | 97055-324; 9467671 | sample vials |
| Chloroform | VWR International | JT9174-3 | solvent |
| Ethanol | VWR International | BDH67002.400 | solvent |
| methanol | VWR International | BDH85681.400 | solvent |
| pyridine | VWR International | BDH67007.400 | solvent |
| 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 | Sigma Aldrich | 178837 | standard |
| C8-C24 fatty acid methyl ester | Sigma Aldrich | CRM18918 | standard |
| N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide | Sigma Aldrich | 24589-78-4 | standard |
| Suwanee River Fulvic Acid standard | International Humic Substances Society | 2S101F | standard |
| trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 89595 | standard |
| Tuning Solution | Agilent | ||
| FTICR-MS analysis software | Bruker | Compass DataAnalysis 4.1 | |
| Formularity Software | Pacific Northwest National Laboratory | Formularity | available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity |
| GC-MS | Agilent | Agilent GC 7890A with MSD 5975C | |
| silica-based sorbent | Phenomenex (Torrance, CA) | Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK) | |
| NMR TUBE 3MM 8 150 CS5 | VWR International | KT897820-0008 | NMR tube |
| Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer | Varian Inova | Varian Direct Drive 600-MHz | NMR spectrometer |
| Chenomx NMR Suite 8.3 | Chenomx | Chenomx NMR Suite | NMR software |
| ultra-performance liquid chromatograph | waters | Aquity UPLC H | liquid chromatograph |
| Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer | ThermoFisher | Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos | mass spectrometer |
References
- Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. The carbon balance of North American wetlands. Wetlands. 26 (4), 889-916 (2006).
- Wilson, R. M., et al. Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone permafrost. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (2), 387-404 (2017).
- Broder, T., Knorr, K. H., Biester, H. Changes in dissolved organic matter quality in a peatland and forest headwater stream as a function of seasonality and hydrologic conditions. Hydrology and Earth System Sciences. 21 (4), 2035-2051 (2017).
- Ejarque, E., et al. Quality and reactivity of dissolved organic matter in a Mediterranean river across hydrological and spatial gradients. Science of The Total Environment. 599, 1802-1812 (2017).
- Valenzuela, E. I., et al. Anaerobic methane oxidation driven by microbial reduction of natural organic matter in a tropical wetland. Applied and Environmental Microbiology. 83 (11), e00645-e00617 (2017).
- Lehmann, J., Kleber, M. The contentious nature of soil organic matter. Nature. 528 (7580), 60-68 (2015).
- Keiluweit, M., Nico, P. S., Kleber, M., Fendorf, S. Are oxygen limitations under recognized regulators of organic carbon turnover in upland soils? Biogeochemistry. 127 (2-3), 157-171 (2016).
- LaRowe, D. E., Van Cappellen, P. Degradation of natural organic matter: A thermodynamic analysis. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75 (8), 2030-2042 (2011).
- Wilson, R. M., et al. Hydrogenation of organic matter as a terminal electron sink sustains high CO2: CH4 production ratios during anaerobic decomposition. Organic Geochemistry. 112, 22-32 (2017).
- Ye, R., Jin, Q., Bohannan, B., Keller, J. K., Bridgham, S. D. Homoacetogenesis: A potentially underappreciated carbon pathway in peatlands. Soil Biology and Biochemistry. 68, 385-391 (2014).
- Neubauer, S. C., Megonigal, J. P. Moving beyond global warming potentials to quantify the climatic role of ecosystems. Ecosystems. 18 (6), 1000-1013 (2015).
- Ma, S., et al. Data-Constrained Projections of Methane Fluxes in a Northern Minnesota Peatland in Response to Elevated CO2 and Warming. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (11), 2841-2861 (2017).
- Conrad, R. Contribution of hydrogen to methane production and control of hydrogen concentrations in methanogenic soils and sediments. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Ecology. 28 (3), 193-202 (1999).
- Cunada, C. L., Lesack, L. F. W., Tank, S. E. Seasonal dynamics of dissolved methane in lakes of the Mackenzie Delta and the role of carbon substrate quality. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123 (2), 591-609 (2018).
- Wilson, R. M., Tfaily, M. M. Advanced molecular techniques provide new rigorous tools for characterizing organic matter quality in complex systems. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123 (6), 1790-1795 (2018).
- Borton, M. A., et al. Coupled laboratory and field investigations resolve microbial interactions that underpin persistence in hydraulically fractured shales. Proceedingsof the National Academy of Sciences. 115 (28), E6585-E6659 (2018).
- Tang, K., Page, J. S., Smith, R. D. Charge competition and the linear dynamic range of detection in electrospray ionization mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 15 (10), 1416-1423 (2004).
- Boiteau, R. M., et al. Structure Elucidation of Unknown Metabolites in Metabolomics by Combined NMR and MS/MS Prediction. Metabolites. 8 (1), 8 (2018).
- Walker, L. R., et al. Unambiguous Metabolite Identification in High-throughput Metabolomics by Hybrid 1DNMR/ESI MS Approach. Magnetic Resonance in Chemistry. 54 (12), 998-1003 (2016).
- Nicora, C. D., Burnum-Johnson, K. E., Nakayasu, E. S., Casey, C. P., White III, R. A., Roy Chowdhury, T., Kyle, J. E., Kim, Y. M., Smith, R. D., Metz, T. O., Jansson, J. K., Baker, E. S. The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples. J. Vis. Exp. (135), e57343 (2018).
- Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. Extraction of fatty acid. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
- Tolic, N., et al. Formularity: software for automated formula assignment of natural and other organic matter from ultrahigh-resolution mass spectra. Analytical Chemistry. 89 (23), 12659-12665 (2017).
- Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Frontiers in microbiology. 6, 209 (2015).
- Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical Chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
- Kind, T., et al. FiehnLib: mass spectral and retention index libraries for metabolomics based on quadrupole and time-of-flight gas chromatography/mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (24), 10038-10048 (2009).
- Kyle, J. E., et al. LIQUID: an-open source software for identifying lipids in LC-MS/MS-based lipidomics data. Bioinformatics. 33 (11), 1744-1746 (2017).
- Kanehisa, M. Enzyme annotation and metabolic reconstruction using KEGG. Protein Function Prediction: Methods and Protocols. 1611, 135-145 (2017).
- Van Krevelen, D. W. Graphical-statistical method for the study of structure and reaction processes of coal. Fuel. 29, 269-284 (1950).
- Hodgkins, S. B., et al. Changes in peat chemistry associated with permafrost thaw increase greenhouse gas production. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (16), 5819-5824 (2014).
