Summary
ويصف هذا البروتوكول سرعة نقل واحد للتقنيات التحليلية واوميكس تكميلية بلغت ذروتها في توصيف إقران تماما من المواد العضوية الطبيعية والبروتينات الميكروبية في النظم الإيكولوجية المختلفة. ويسمح هذا النهج مقارنات قوية لتحديد المسارات الأيضية والتحولات الهامة لوصف إنتاج غازات الدفيئة والتنبؤ بالاستجابات للتغير البيئي.
Abstract
المواد العضوية الطبيعية (حركيا) يتكون من خليط معقد جداً الآلاف من المركبات العضوية فيها، تاريخيا، ثبت أن من الصعب على تميز. ومع ذلك، فهم عناصر التحكم الديناميكية الحرارية والحركية في إنتاج الغاز ([CO2] غاز ثاني أكسيد الكربون والميثان [CH4]) الدفيئة الناتجة عن تحلل النوم، وصف المستوى الجزيئي مقرونا الميكروبية ومن الضروري تحليل البروتين. علاوة على ذلك، المتوقع أن التشويش النظم الإيكولوجية الطبيعية، ويحتمل أن تكون مزعجة التفاعلات المعقدة التي تؤثر على الإمدادات الركازات العضوية والكائنات الحية الدقيقة تؤدي التحولات المناخ والتغيرات البيئية. سوف يكون وصف جزيئي مفصلة من المواد العضوية، الميكروبية البروتيوميات، ومسارات والتحولات التي هي تتحلل المواد العضوية اللازمة للتنبؤ باتجاه وحجم الآثار المترتبة على التغييرات البيئية. توضح هذه المقالة إنتاجية منهجية لتوصيف المستقلب شاملة في عينة واحدة من الحقن المباشر فورييه تحويل أيون سيكلوترون الرنين الكتلي (فتيكر مللي ثانية)، الفصل اللوني للغاز الطيف الكتلي (GC-MS)، مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) واللوني السائل الطيف الكتلي (LC-MS) وتحليل البروتينات. ويؤدي هذا النهج dataset إقران تماما مما يحسن الثقة الإحصائية لاستنتاج مسارات تحلل المواد العضوية و أول أكسيد الكربون الناتج2 و CH4 معدلات الإنتاج واستجاباتها لاضطراب البيئة. وهنا نقدم نتائج تطبيق هذا الأسلوب للنوم عينات جمعت من الأراضي الخثية؛ ومع ذلك، البروتوكول تنطبق على أي عينة النوم (مثلاً، الخث، تربة الغابات، الرواسب البحرية، إلخ).
Introduction
على الصعيد العالمي، تقدر الأراضي الرطبة لاحتواء Pg 529 من الكربون (C)، غالباً ما ج العضوية المدفونة في رواسب الخث1. حاليا، هذه الأراضي الخثية العمل كبالوعة صافية ج، عزل تيراغرام ج 29 ص-1 في أمريكا الشمالية وحدها1. غير أن الاضطرابات البيئية مثل تجفيف والحرائق والجفاف ودرجات الحرارة الأكثر دفئا يمكن أن يعوض هذا الحوض ج بزيادة تحلل المادة العضوية أدى إلى زيادة الخسائر ج عبر غازات الدفيئة (ثاني أكسيد الكربون [CO2] و 1،إنتاج الميثان [CH4])2. تغير المناخ قد يسهم في فقدان ج إذا كانت درجات الحرارة الأكثر دفئا أو ظروف مجفف تحفز التحلل ج أسرع من الكائنات الحية الدقيقة. وبدلاً من ذلك، ارتفاع درجات الحرارة، والتركيزات الجوية CO2 قد حفز الإنتاج الأولى لعزل أكثر CO2 كالكربون العضوي (OC). وإلى أي مدى، وكيف سريع أن قائد هو متحللة ثم إلى CO2 والفصل4 يعتمد على التفاعلات المعقدة بين ركائز المانحة الإلكترون، وتوافر المتقبلين للإلكترون، والكائنات الحية الدقيقة التي تتوسط التحول. في كثير من الحالات، الآليات التي لا تتسم جيدا وهكذا استجابتها للاضطرابات البيئية ليست مقيدة جيدا ومازال من غير الواضح ما ستكون النتيجة الصافية لتغير المناخ على توازن الكربون في صياغة النظم الإيكولوجية.
الطبيعة المعقدة للمواد العضوية الطبيعية (حركيا) جعلت حتى تحديد المركبات العضوية الحالية في مخاليط حركيا تاريخيا صعباً. التطورات الأخيرة تحسنت إلى حد كبير قدرتنا على تميز المركبات صورة تقليدية، وإلى حد ما لا تزال تعتبر المعاندة الدبالية أو fulvic عدد كبير من المركبات3،،من45. ونفهم الآن أن العديد من هذه المركبات المتوفرة فعلا ميكروبيالي وقد تكون متحللة وإذا يقبلون إلكترون المحطة طرفية مناسب (الشاي) تتوفر6،7. حساب الدولة الأسمى أكسدة الكربون (نوس) لمجمع يوفر مقياس للتنبؤ بإمكانية التحلل وإنتاج الطاقة من الشاي المطلوب. ومع ذلك، فإنه يتطلب وصف المستوى الجزيئي ل المواد العضوية7. يحسب نوس من الصيغة الجزيئية عن طريق المعادلة التالية7: نوس = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S))/(#C)) + 4، حيث z هو المسؤول عن صافي. نوس يرتبط مع دينامي حراري الدافعة قوة8، أسهل لتتحلل، بينما تتطلب مركبات مع انخفاض نوس الشاي حيوية متزايدة بغية خفض فيها مركبات مع نوس أعلى. المركبات مع نوسك أقل من 2 تتطلب بالطاقة عالية الغلة الشاي مثل س2أو نترات Mnالرابع، ولا يمكن أن يتحلل من الشائع حدوث انخفاض الطاقة الغلة الشاي مثل Feالثالث أو كبريتات7. وهذا هو أحد الاعتبارات هامة في ظروف وصول المشبعة بالمياه في الأراضي الرطبة حيث س2 والأخرى طاقة عالية الغلة الشاي هي نادرة9 ومن ثم تدهور المركبات نوس أقل في ظل هذه الظروف [ثرمودنميكلي] محدودة. اضطراب البيئية يمكن أن تؤثر حالة النظام الإيكولوجي من خلال التغيرات الهيدرولوجية التي تؤثر على س2 (يقبلون الإلكترون الأكثر نشاطا)، تغييرات في الركازات العضوية ومتقبلون إلكترون إتاحة دينامي حراري قبل الابتدائية الإنتاج، وإلى حد أقل بدرجة الحرارة. مثال هام على آثار درجة الحرارة في نظم الأراضي الرطبة يحدث فيما يتعلق بالمفاضلة التي تحدث بين هومواسيتوجينيسيس (أي، إنتاج خلات من CO2 وح2) و (الراكد هيدروجينوتروفيك أيإنتاج4 CH من CO2 وح2). ويبدو عند درجات حرارة منخفضة قليلاً يفضل أن هومواسيتوجينيسيس، بينما درجات الحرارة الأكثر دفئا لصالح الإنتاج4 CH10. قد يكون هذا تأثير الحرارة آثار هامة للاستجابة للنظم الإيكولوجية لتغير المناخ، كما CH4 غاز الدفيئة أقوى بكثير من أول أكسيد الكربون211 ، ومن ثم زيادة الإنتاج من الفصل4 في حسابها من CO2 في درجات حرارة قد تسهم في ردود فعل إيجابية مع احترار المناخ.
الأراضي الخثية تنتج كميات كبيرة على الصعيد العالمي من CO2 والمسألة4CHعبر الميكروبية التنفس6للعضوية تحدث بشكل طبيعي. نوسك ركائز الكربون العضوي يحدد نسبة CO2النسبية: CH4 المنتجة التي هي معلمة حرجة بسبب الإشعاعي العالي CH4 مقارنة بأول أكسيد الكربون211، بل أيضا لأن وحددت جهود النمذجة هذه النسبة كمعلمة حرجة لتقدير الجريان ج في الأراضي الخثية12. نظراً لغياب متقبلون إلكترون المحطة الطرفية خلاف CO2، يمكن إثبات رصيد إلكترون أن ركائز ج العضوية مع نوس > 0 سوف ينتج CO2: CH4 > 1، ج العضوية مع نوس = 0 ينتج CO2 والفصل4 بنسبة اكويمولار، وجيم العضوية مع نوس < 1 سوف ينتج CO2: CH4 < 113. هو وساطة تحلل قائد في النظم الإيكولوجية الطبيعية من الكائنات المجهرية، حيث أنه حتى عندما تحلل مركب محددة من الممكن [ثرمودنميكلي]، هو كينيتيكالي محدودة بنشاط الإنزيمات الميكروبية، وفي ظل ظروف وصول القوة الدافعة الحرارية (أي، نوس)7. حتى الآن قد تم تحدي لتوصيف المواد العضوية تماما نظراً لتنوع المركبات الحالية يتطلب تقنيات مختلفة مكملة لتكييفها. التطورات الأخيرة قد قاموا بإغلاق الفجوة؛ باستخدام مجموعة من التقنيات التحليلية يمكننا تحليل طائفة واسعة من المركبات العضوية تقديم توصيف المستوى الجزيئي، وفي بعض الحالات التحديد الكمي، من نواتج الأيض الأولية الصغيرة مثل الجلوكوز تصل إلى 800 دا بولي-هيتيروسيكليس. سبق هذه الجزيئات الكبيرة المعقدة سوف تتسم ببساطة مثل اللجنين أو مثل التانين والمفترضة قد المعاندة. ومع ذلك، يسمح توصيف المستوى الجزيئي، حساب نوس حتى هذه الجزيئات الكبيرة المعقدة. ترتبط هذه القيم نوس خطيا بالقوة الدافعة الحرارية مما يسمح بإجراء تقييم لنوعية المواد العضوية المتاحة للتحلل، مما يكشف عن أن هذه الجزيئات المعقدة قد يكون في الواقع ميكروبيالي في كثير من الحالات التحلل حتى في ظل ظروف وصول التي تسود في الأراضي الرطبة.
حيث يسمح مقدمة من س2 المواد العضوية ما يقرب من جميع القيم نوس ملاحظتها بطبيعة الحال تكون متحللة، هنا علينا أن نركز على التغييرات في المواد العضوية والبروتينات الميكروبية التي من المحتمل أن تكون برامج التشغيل الأساسية في الأراضي الرطبة (أي، نظم محدودة س2). ومع ذلك، يمكن تطبيقها جميع التقنيات التي سوف نناقش للمواد العضوية من أي النظام الإيكولوجي. عادة، معظم القياسات استناداً الضوئية وتحليلات الأسفار وقد استخدمت لتقييم نوعية المواد العضوية3،14. عند استخدام قياسات السائبة مثل هذه، ولكن التفاصيل الدقيقة يتم فقدان كما تصنف أعدادا كبيرة من الجزيئات معا تحت شروط عامة مثل هوميكس أو فولفيكس. تعاريف هذه الفئات ليست مقيدة جيدا، وقد تختلف في الواقع، يجعل من دراسة لدراسة مقارنات مستحيلة. علاوة على ذلك، معظم القياسات لا توفير الجزيئية التفاصيل اللازمة لحساب الديناميكا الحرارية تحكم النظام وذلك قاصرة عن تقييم نوعية المواد العضوية15حقاً.
التقنيات الفردية مثل فورييه تحويل أيون سيكلوترون الرنين الكتلي (فتيكر مللي ثانية)، مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) والفصل اللوني للغاز الكتلة قياس الطيف الكتلي (GC-MS)، والكتلي اللوني السائل (ش-MS) تفاصيل مثل هذا المستوى الجزيئي. في حين يقدم كل من هذه التقنيات حدوده، أنها تجلب أيضا قوتها الخاصة التي يمكن أن تكون الاستدانة في نهج متكامل لتحقيق التفاصيل الجزيئية الدقيقة اللازمة لقياس نوعية المواد العضوية بمعنى دينامي حراري دقيق . GC-MS مفيد لتحديد نواتج الأيض الصغيرة الحاسمة التي من المرجح أن يكون تأثير الدانية على CO2 والفصل4 الإنتاج (مثل، السكر، خلات، إلخ)؛ ومع ذلك، GC-MS يتطلب التحقق ضد معيار وبالتالي محدودة لمركبات معروفة بالفعل موجوداً في قاعدة منع تحديد هوية المركبات الرواية. وعلاوة على ذلك، GC-MS أسلوب شبه نوعية مما يتيح استنتاج حول التغييرات في تركيزات النسبية، ولكن لا توفر المعلومات تركيز الفعلية اللازمة لحساب الطاقات لجيب الحرة على سبيل المثال. أخيرا، تتطلب GC-MS derivatization الجزيئات قبل التحليل الذي يحد من القرار إلى مركبات أصغر من دا ~ 400 وتضيع كحول متقلبة خلال الخطوة التجفيف.
أحادي البعد (د 1) 1ح الحالة السائلة الرنين المغناطيسي النووي يسمح توصيف كمية عالية من نواتج الأيض الصغيرة (بما في ذلك نواتج الأيض الأساسي صغيرة الوزن الجزيئي والتطاير مثل الكحول، خلات، الأسيتون، فورمات، بيروفات، سوكسيناتي، الأحماض الدهنية القصيرة، فضلا عن مجموعة من الكربوهيدرات المعروف غائبة أو المساس بها من الأساليب المستندة إلى MS) وتركيزاتها مفيدة بشكل خاص لحساب معلمات دينامي حراري. حتى الآن، مثل GC-MS، الرنين المغناطيسي النووي د 1 من الخلائط المعقدة يتطلب توحيد المقاييس بالنسبة لقاعدة بيانات ولذلك لا تسمح وحدة الكشف بسهولة عن رواية من المركبات التي من المحتمل أن تكون وفيرة في النظم الإيكولوجية الطبيعية والمتغيرة المعقدة. بالإضافة إلى ذلك، الرنين المغناطيسي النووي أقل حساسية من التقنيات المستندة إلى MS والتنميط المستقلب الكمية ولذلك يتحقق فقط أعلاه 1 ميكرومتر استخدام أنظمة الرنين المغناطيسي مزودة بتبريد الهليوم الباردة-تحقيقات. التقدير لا على نطاق واسع، بعض الرنين المغناطيسي الباردة-تحقيقات هي الملوحة ويسمح بتحليل خليط البيئية وجود تركيزات الملح ميليمولار عند استخدامها في أصغر قطر (القطر الخارجي < 3 مم) عينة أنابيب16. ومع ذلك، زيادة تعقيد الرنين المغناطيسي النووي أن كميات كبيرة من المعادن باراماجنيتيك والمعادن (مثلالحديد و Mn أعلاه و 1-3%)، التي يمكن أن تكون وفرة في التربة المرتفعة، يمكن توسيع ميزات الطيفية وتعقيد تفسير أطياف الرنين المغناطيسي النووي . استخدام استخراج المرحلة الصلبة (SPE) يمكن أن مساعدي في تفسير الرنين المغناطيسي النووي والمستندة إلى MS جميع أساليب الحد من الأملاح المعدنية وزيادة جودة الطيفية.
مرض التصلب العصبي المتعدد--فتيكر بالحقن المباشر أسلوب حساسة للغاية قادرة على اكتشاف عشرات الآلاف من نواتج الأيض من عينة واحدة، ولكن عدم التقاط والايضات الصغيرة الحاسمة مثل اسيتات، بيروفات، وسوكسيناتي ويصعب استخدام السكريات و الكربوهيدرات الأخرى17، كما أنه لا يقدم معلومات كمية. بيد خلافا للتقنيات الأخرى، فتيكر--مرض التصلب العصبي المتعدد يبرع في تحديد وتعيين الصيغة الجزيئية لمركبات جديدة ويحدد لذلك أكبر عدد من المركبات توفير المعلومات الجزيئية أكثر من أي من الأساليب الموصوفة الأخرى. وهذا مفيد، لأنه يمكن استخدام المعلومات الجزيئية التي قدمها فتيكر-MS (وغيرها من التقنيات) لحساب نوس الذي يتصل بالقوة الدافعة الحرارية تنظم احتمال بعض ردود الفعل8 ومعدلات معينة 7من شروط. وعلاوة على ذلك، باقتران فتيكر--مرض التصلب العصبي المتعدد مع تقنيات الفصل، مثل LC جنبا إلى جنب مع مرض التصلب العصبي المتعدد، جنبا إلى جنب كمية من المعلومات الهيكلية يمكن أن يتحقق، التعويض عن بعض من مساوئ هذا الأسلوب. LC-مرض التصلب العصبي المتعدد مفيدة لتحديد المركبات الشبيهة بالدهن ونواتج الأيض الأخرى ليست جيدة تتسم بأي من الطرق الأخرى. اقتران LC فتيكر--مرض التصلب العصبي المتعدد أو مرض التصلب العصبي المتعدد-LC مع جامع كسر وجمع كسور المجاهيل محددة من الفائدة لتوضيح الهيكلية بثنائي الأبعاد (2D) الحالة السائلة الرنين المغناطيسي النووي هو الوضع المثالي لتعريف وتحديد كمية المركبات غير معروف18 ،19. ومع ذلك، هذا هو خطوة تستغرق وقتاً طويلاً جداً التي يمكن استخدامها عند الحاجة. اتخذت منفردة، كل من هذه التقنيات توفير لقطة مختلفة من المواد العضوية، وإدماجها، يمكننا تحقيق فهم أكثر اكتمالا من استخدام أي من التقنيات في عزلة.
بينما الاعتبارات الحرارية تعيين القيود في نهاية المطاف على ما التحولات المحتملة في نظام، بمراقبة أنشطتها إنزيم معدلات تفاعل الكائنات الحية الدقيقة وساطة تحلل المواد العضوية. وهكذا تماما فهم عناصر التحكم على تحلل المواد العضوية وإنتاج غاز (CO2 والفصل4) الاحتباس الحراري من الأراضي الرطبة في نهاية المطاف يتطلب نهجاً اوميكس متكاملة لوصف الأنشطة الانزيمية الميكروبية، وكذلك نواتج الأيض. في هذه المقالة، يصف لنا وسيلة لتحقيق تحليلاً شاملا من عينة واحدة استخدام نهج متسلسل أن النتائج في تحليل زوجي تماما. يوسع هذا النهج على المستقلب والبروتين، والدهون الاستخراج (مبليكس) البروتوكول الذي اقترن البروتيوميات مع GC-MS ومرض التصلب العصبي المتعدد-LC20 لتحديد نواتج الأيض الصغيرة، والبروتينات، والدهون من خلال دمج المعلومات الكمية المستقلب عن طريق الرنين المغناطيسي وتحديد أكبر نواتج الأيض الثانوية عن طريق فتيكر-السيدة "قليلاً" مختلفة إلى مبليكس، نبدأ البروتوكول مع استخراج المياه ثم استخراج استخدام متسلسلة مع المذيبات غير القطبية في شكل متزايد. وتتم جميع عمليات الاستخراج على عينة واحدة الذي يحفظ عينة عندما تكون كميات محدودة أو يصعب الحصول عليها ويقلل من خطأ تجريبي أدخلت من خلال التباين بين مختبرين من عينة غير متجانسة مصفوفات (مثلاً، والتربة، وحجر) أو الاختلافات في ظروف التخزين والمدة.
أخيرا، باقتران التحليلات أوم مع التحليلات البروتيوميات المجتمع الميكروبية، يمكننا أن نبني شبكات الأيضية التي تصف بمسارات والتحول من تحلل المادة العضوية. وهذا يسمح لنا لاختبار فرضيات محددة حول كيف ستؤثر اضطرابات للنظام في نهاية المطاف CO2 والفصل4 الإنتاج عن طريق تغيير في الركازات العضوية المتاحة ومتقبلون الإلكترون، والمجتمعات الميكروبية تلعب دور الوسيط في ردود فعل عن طريق نشاط إنزيم عوامل حفازة.
والهدف العام لهذا الأسلوب توفير بروتوكول إنتاجية واحدة لتحليل نواتج الأيض والدهون والبروتينات الميكروبية من عينة واحدة وبالتالي إنشاء مجموعة بيانات مقترن بالكامل لبناء شبكات الأيضية بينما تحد من الأخطاء التحليلية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-متسلسلة استخراج المادة العضوية من التربة، والرواسب، أو الخث
- جمع التربة، والرواسب، أو الخث عبر الحفر وتقسيم النوى وفقا لفرضية يجري اختبارها (مثلاً، العمق). مغلف بحاويات تخزين العينات في تترافلوروايثيلين وتجميد في-80 درجة مئوية للتخزين قبل التحليل.
ملاحظة: يلزم حوالي 25 ملغم ج لهذا البروتوكول. الخث (عادة 45% C)، مطلوب 50 مغ خث المجففة. قد تحتاج كميات أكبر من عينة للعينات العضوية المنخفضة مثل محتوى التربة المعدنية أو غابات المرتفعات اعتماداً ج (تصل إلى 5 غ). لأن الاستخراج بالمذيبات العضوية سوف تسحب أي البولي إثيلين غليكول (شماعة) إلى المقتطفات، مما سيؤثر سلبا على التأين أثناء الخطوة 2، 4، من المهم تجنب السماح لعينات الاتصال البلاستيك عند أي نقطة أثناء جمع وتخزين أو استخراج. - عندما تكون جاهزاً لتحليل العينات، تجميد الجافة إلى وزن ثابت، ثم تطحن العينات في مطحنة كرة عالية السرعة باستخدام الفولاذ المقاوم للصدأ طحن الكرات إلى مجانسة وتفريق أي المجاميع.
ملاحظة: يمكن مؤقتاً في البروتوكول في هذه المرحلة، والمواد المخزنة في-80 درجة مئوية. - استخدام الإيثانول تغسل أواني الفولاذ المقاوم للصدأ، الكوة 50 ملغم لكل من العينات المجففة في قنينات زجاجية الفردية 2 مل. سيتم استخراج هذه العينات تسلسلياً باستخدام سلسلة من المذيبات بالتتالي استخراج والايضات متزايد غير القطبية من كل عينة. أضف 1 مل من الماء المقطر، ويطرد (ح2س) لكل عينة وكاب القنينات ويهز ح 2 في جدول شاكر.
- بعد الهز تسمح الحلول للترشح في 20 دقيقة، ثم الطرد المركزي في 15,000 س ز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT)، صب وحفظ المادة طافية من كل منهما.
ملاحظة: سيتم حقن هذه الحلول في فتيكر--مرض التصلب العصبي المتعدد بالحقن المباشر. - سلوك فلك استخراج21 (يعرف أيضا باسم مبليكس20) الآن المياه المستخرجة من المخلفات بتكرار الخطوات من 1.3 و 1.4 استبدال 1 مل من-20 درجة مئوية خليط كلوروفورم: الميثانول 4:3 للماء في الخطوة 1، 3.
تنبيه: كلوروفورم والميثانول شديدة الاشتعال والسمية. استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية) لتجنب تماس الجلد وتجنب اللهب المكشوف. - عناية منفصلة اثنين الناتج المذيبات الطبقات، والتي سوف تكون مميزة بصريا، لتحليل منفصل من فتيكر--مرض التصلب العصبي المتعدد باستخدام فصل القمع أو ببساطة إزالة الطبقة العليا بعناية بيبيتينج.
ملاحظة: سيتم الكسر المحتوية على كلوروفورم في الأسفل بينما الكسر التي تحتوي على الميثانول أقل كثافة، وسوف يكون على رأس. - تمييع استخراج كلوروفورم (الخطوة 1.6) 1:1 في الميثانول واستخراج المياه (الخطوة 1، 4) 2:1 في الميثانول تحسين كفاءة التأين (ESI) اليكتروسبراي لمرض التصلب العصبي المتعدد--فتيكر بالحقن المباشر.
ملاحظة: لا الكسر التي تحتوي على الميثانول من الخطوة 1، 7 تحتاج إلى إضعاف زيادة في الميثانول. سيتم تشغيل طبقة الميثانول بالحقن المباشر في فتيكر--مرض التصلب العصبي المتعدد.
تحليل 2.FTICR--مرض التصلب العصبي المتعدد
- معايرة المطياف فتيكر قبل الحقن مباشرة 100 ميليلتر من حل ضبط (انظر الجدول للمواد) التي تغطي طائفة جماعي لحوالي 100-1,300 دا في فتيكر--مرض التصلب العصبي المتعدد.
- إعداد معيار سوني حمض Fulvic نهر (انظر الجدول للمواد) بجعل حل-1 مل 1 ملغ في المياه التي تمت تصفيتها عالي النقاوة وتمييع ثم الحل الناتج إلى 20 ميكروغرام مل-1 في الميثانول.
- مباشرة حقن ميليلتر 23 هذا الحل النهائي إلى مصدر ESI بالإضافة إلى مطياف فتيكر عن طريق مضخة الحقن لمعدل تدفق من 3.0 ميكروليتر دقيقة-1. تعيين الجهد إبرة إلى 4.4 كيلو فولت، Q1 إلى 150 m/z والزجاج الشعرية عند 180 درجة مئوية. فحص الأطياف الناتجة عن استخدام برمجيات التحليل (انظر الجدول للمواد) للتأكد من جودة البيانات.
- استخدام الميثانول الصف [هبلك] قبل تشغيل عينات وطوال أخذ العينات لمراقبة ترحيل. إدخال 23 ميكروليتر من كل استخراج عن طريق الحقن المباشر للمصدر دليل الاستدامة الاقتصادية بالإضافة إلى مطياف فتيكر عن طريق مضخة الحقن لمعدل تدفق من 3.0 ميكروليتر دقيقة-1. تعيين الجهد إبرة إلى 4.4 كيلو فولت، Q1 إلى 150 m/z والزجاج الشعرية عند 180 درجة مئوية.
- ضبط الوقت تراكم أيون (IAT) لكل عينة أو مجموعة من العينات لحساب التباين في تركيز ج. القيم النموذجية هي بين 0.1 إلى 0.3 س 144 جمع مسح لكل عينة، متوسط بالأشعة، وثم إجراء معايرة داخلية استخدام CH2 مثلى (أي 14 فصل دا) سلسلة.
ملاحظة: بعد التحليل فتيكر--مرض التصلب العصبي المتعدد، يمكن اتخاذ القرار أما الجمع بين الماء والكسور الميثانول المستخرج من أجل تبسيط الخطوات المتبقية أو الكسور يمكن أن تظل منفصلة في جميع أنحاء الخطوات اللاحقة. مزايا وعيوب كل نهج موصوفة بالتفصيل في المناقشة. في حالة القيام بذلك، تجمع المياه واستخراج الميثانول الكسور. - الجاف لاستخدام مركز مقتطفات وإنقاذ ما تبقى المقتطفات (~ 1 مل) GC-MS اللاحقة (المياه، أو الميثانول أو الماء + الميثانول)، LC-مرض التصلب العصبي المتعدد (كلوروفورم) وتحليل الرنين المغناطيسي النووي (الميثانول + المياه).
ملاحظة: يمكن مؤقتاً في البروتوكول في هذه المرحلة، والمواد المخزنة في-20 درجة مئوية.
3-معالجة البيانات فتيكر--مرض التصلب العصبي المتعدد
- شارك محاذاة كافة القوائم ذروة عينة لمجموعة البيانات كاملة للحد من نوبات الشامل وتوحيد الإحالات ذروة استخدام البرمجيات فورمولاريتي22 قبل إحالة الصيغة.
- استخدام البرمجيات فورمولاريتي22 لتعيين الصيغة الجزيئية باستخدام إشارة إلى نسبة الضوضاء أكبر من 7، كتلة قياس خطأ < 1 جزء في المليون، والسماح ج، ح، س، ن، ق، وف مع استبعاد جميع العناصر الأخرى.
- إذا تم إرجاع صيغ متعددة مرشح لكتلة معينة (متكررة أعلاه دا 500) يفرض قيودا متسقة مع المواد التي يتم أخذ عينات. على سبيل المثال، تشمل القيود النمطية في الخث،: خطأ كتلة أدنى، أدنى عدد من heteroatoms (ن، ق، ف)، وعندما تكون موجودة، ف يجب أن تكون في شكل المؤكسدة (أي، يجب أن يكون هناك على الأقل 4 ذرات O لكل ذرة ف في الصيغة).
4-المواد الكيميائية Derivatization ل GC-MS
- إعداد عينات التحكم فارغة من الهكسين [هبلك]-الصف في GC-MS أوتوسامبلير قارورة23. حل 100 مغ الأحماض الدهنية استرات الميثيل (الشهرهشهره: C8-C28) خليط الاحتفاظ بالوقت القياسي في 200 ميليلتر من الهكسين.
- لحماية مجموعات الكربونيل، إضافة ميكروليتر 20 ملغ 30 مل-1 هيدروكلوريد ميثوكسياميني في بيريدين إلى كل من الميثانول مقتطفات والمياه مقتطفات (أو مقتطفات مجتمعة والميثانول والماء في حالة استخدام) من الخطوة 2.6 والفراغات والشهرة معايرة العينات23. ختم القنينات بحروف كبيرة.
تنبيه: بيريدين عالية السمية والقابلة للاشتعال. ارتداء معدات الوقاية الشخصية الملائمة لمنع الجلد أو الاتصال بالعين وتجنب اللهب المكشوف. وباﻹضافة إلى ذلك، بيريدين فولاتيليزيس في الرايت مما تسبب في تلوث الهواء الضار. يعمل فقط في الأماكن جيدة التهوية تحت غطاء دخان. - دوامة مقتطفات لمقتطفات سنكيت س. 20 ل 60 ثانية. ثم احتضان مقتطفات في أجهزة الطرد مركزي في 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة في 100 x ز.
ملاحظة: يمكن أن يسبب كمية زائدة من الكربوهيدرات أو أملاح والايضات تتبلور بعد يجري المجففة إلى أسفل. سونيكاتينج العينات سوف يساعد على إعادة تشكيل نواتج الأيض تبلور في الكاشف ديريفاتيزينج. - بعد التفريخ، إضافة 80 ميكروليتر من N-الميثيل-N-(تريميثيلسيليل) تريفلورواسيتاميدي مع تريميثيلتشلوروسيلاني 1% لكل عينة، دوامة مقتطفات لمقتطفات سنكيت س. 20 60 s واحتضان مقتطفات مرة أخرى في أجهزة الطرد مركزي في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في 100 x ز.
- مقتطفات باردة إلى RT (20-24 درجة مئوية)، ثم نقل إلى قارورة أوتوسامبلير GC-MS.
5-تحليل GC-MS
- ضبط ومعايرة مرض التصلب العصبي المتعدد وفقا لتوصيات المورد (انظر الجدول للمواد) قبل التحليل للتأكد من الجهاز قراءة البيانات MS بشكل صحيح. تأكد من أن ضغط غاز الهليوم داخل التسامح المحدد.
- والايضات القطبية منفصلة في عمود GC (30 م × 0.25 مم × 0.25 ميكرومتر). تعيين بروتوكول درجة حرارة الفرن كما يلي: (1) الأولية درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، (2) المنحدر إلى 325 درجة مئوية بمعدل 10 درجات مئوية دقيقة-1، و (3) عقد في 325 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- تحليل مقتطفات استخدام النشرة المصورة عمومية بالإضافة إلى الرباعي واحد مجموعة السيدة حقن منفذ درجة الحرارة ثابتة 250 درجة مئوية. حقن 1 ميكروليتر من كل استخراج ديريفاتيزيد في وضع سبليتلس.
6-GC-MS تجهيز البيانات
- تفحص كافة ملفات البيانات التأكد من أنهم اعتقلوا بشكل صحيح. إيلاء الاهتمام لتحولات محتملة فيما يتعلق بأوقات استبقاء القياسية الداخلية وكثافة للتأكد من أن البيانات تم القبض على الدوام في جميع أنحاء التحليل.
- تحويل تنسيق بيانات المورد MS محددة إلى تنسيق MS عامة إذا لزم الأمر. ملفات البيانات الخام عملية استخدام ميتابوليتيديتيكتور24 معايرة مؤشرات استبقاء استناداً إلى معايير داخلية الشهرة. بعد مواءمة أوقات الاحتفاظ بكافة ملفات البيانات، تواصل مع deconvolution وأخيراً تحديد المستقلب يناسبها من الاحتفاظ بالأرقام القياسية وأطياف GC-MS ضد مكتبة المستقلب القطبية فيهنليب25.
- تدقيق المتبقية والايضات مجهولون ضد المكتبة NIST14 GC-MS استخدام مطابقة الطيفية. التحقق من صحة هوية منفردة للقضاء على هويات زائفة وتقليل الأخطاء deconvolution.
7-سائل الدولة تحليل الرنين المغناطيسي النووي
- تمييع ما تبقى تستخرج المياه (~ 300 ميليلتر) بنسبة 10% (المجلد/المجلد) مع معيار داخلية 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 5 ملم. وبدلاً من ذلك، تجمع بين المياه واستخراج الميثانول من الخطوة 1 ريسوبستيتوتي ثم في الماء. بالقيام بذلك ومع ذلك، بعض المركبات المتطايرة قد تضيع أثناء الخطوة التجفيف. حجم العينة النهائي النموذجية هي في حدود 180-300 ميليلتر.
- نقل الخليط في أنبوب زجاج البورسليكات الرنين المغناطيسي قطر خارجي (نقلت) عالية الجودة 3 مم.
- جمع الأطياف باستخدام مطياف الرنين المغناطيسي النووي (ومن الناحية المثالية على الأقل 600 ميجاهرتز) مزودة بمجس 5 مم باردة الملوحة رنين ثلاثية ومكبر للصوت قبل الباردة من الكربون.
- جمع أطياف 1ح د 1 استخدام د 1 نووية أوفرهوزر تأثير التحليل الطيفي (نويسي) بريساتوريشن تجربة في 298 ك مع وقت اكتساب s 4 وتأخير إعادة تدوير s 1.5 والنقاط المعقدة 65,536 ومسح 512.
- جمع 2D 1ح-13ج هيتيرونوكلير ارتباط واحد-الكم (هسقك) و 1ح-1ح الأطياف الترابط الكلي (توكسي) للمساعدة في تحديد نواتج الأيض، والتحقق من صحة.
- عملية وتعيين وتحليل جميع الأطياف باستخدام برمجيات تحليل الرنين المغناطيسي النووي (انظر الجدول للمواد) لقياس كثافة مقارنة بمعيار داخلي. تحديد نواتج الأيض عن طريق مطابقة المعلومات الكيميائية التحول، وياء-اقتران وكثافة في العينات ضد المكتبة.
ملاحظة: كما تم تعزيز المكتبة بمعايير المستقلب المستهدفة المخصصة والإضافات المستقلب على أساس منتظم. البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً في هذه المرحلة، والمواد المخزنة في-20 درجة مئوية.
8-LC-ليبيدوميكس الكتلي
- روت استخراج كلوروفورم المجففة التي تم إنشاؤها أثناء الخطوة 2، 5 مع 200 ميكروليتر من الميثانول.
- حقن 10 ميكروليتر من استخراج كل اللوني سائل فائقة الأداء الإضافة إلى مطياف كتلة أوربيتراب استخدام مرحلة عكس اتهم الهجين سطح العمود (3.0 مم × 150 مم × 1.7 حجم الجسيمات ميكرومتر). تعيين تدرج 34-مين (المرحلة المتنقلة ج: الاسيتو الانيتريل/ح2س (حيز) التي تحتوي على خلات الأمونيوم 10 مم؛ المرحلة المحمول ب: الاسيتو الانيتريل/الايزوبروبانول (10:90) التي تحتوي على خلات الأمونيوم 10 ملم) بمعدل 250 ميليلتر/دقيقة استخدام تدفق السلبية والإيجابية على السواء طرق التأين مع الانفصال أعلى الطاقة الاصطدام والتصادم التي يسببها الانفصال.
تنبيه: هو الاسيتو الانيتريل العين والجلد، والجهاز التنفسي مهيجة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. وبالإضافة إلى ذلك، الاسيتو الانيتريل القابلة للاحتراق. عدم السماح بالاتصال بعملاء المؤكسدة، قد تنتج أبخرة سامة أثناء الحرق. - تحميل ملفات البيانات الخام LC-MS/MS في السائل جنبا إلى جنب مع الملف الهدف (أي، قائمة بالأنواع الدهنية > 25,000) لوضع كل منهما التأين (الإيجابية أو السلبية). عملية ملف raw. يدوياً التحقق من الجثث الناتجة بدراسة الأطياف MS/MS لوجود أيونات التشخيص، إذا الأيونات جزء التطبيق والمطابقة (مثل سلاسل اشيل الدهنية)، فصل النظائر، كتلة الخطأ جزء من المليون من السلائف، ووقت الاحتفاظ. تصدير القائمة الناتجة من الدهون ثقة المحددة كملف.tsv.
ملاحظة: البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً في هذه المرحلة، وتخزين المواد في-20 درجة مئوية.
9-البروتيوميات التحليل
- استخراج البروتينات وفقا لبروتوكول مبليكس20 من الفترة المتبقية المرحلة الميثانول الناتجة عن الخطوة 2.4، قبل الغسيل استخراج 20 مرة حجم استخراج الميثانول الباردة إضافية (-20 درجة مئوية).
- استخدام أ 1 مل/50 ملغ القائم على السليكا ماصة (انظر الجدول للمواد) على شرط C18 SPE الأعمدة مع الميثانول 3 مل، 2 مل حامض trifluoroacetic 0.1% (تفا) في المياه، تليها إضافة المقتطف من الخطوة 9.1 بمعدل لا يزيد عن 1 مل/دقيقة.
- وبعد إضافة العينة، أغسل العمود مع 4 مل من الماء 95:4.9:0.1: acetonitrile:TFA، ثم السماح لتجف. ضع أنبوب جمع 1.5 مل تحت العمود جمعية مهندسي البترول، والوت العينة مع 1 مل من 80:19.9:0.1 الميثانول: المياه: تفا.
- تركز المقتطفات إلى 100 ميليلتر تحت ساعد فراغ تجميد مجفف، ثم قياس تركيز البروتين ب مقايسة اللونية حمض (اتفاق التعاون الأساسي) بيسينتشونينيك26 في موجه 562 شمال البحر الأبيض المتوسط.
- مقتطفات من أجهزة الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية الناتجة وجاف بيليه المتبقية تحت الفراغ للحد الأدنى 5 ريسوسبيند بيليه البروتين في الماء بتركيز نهائي من 0.1 ميكروغرام الببتيد كل ميليلتر.
- إضافة ديثيوثريتول إلى تركيز نهائي من 5 مم واحتضان عند 60 درجة مئوية للحد الأدنى 30 ديلوتى 10 إضعاف مع 100 ملم NH4HCO3م 8 اليوريا الحل واحتضان في 37 درجة مئوية ح 3 حضور 1 مم كاكل2 والتربسين الخنزير في 01:50 إنزيم للبروتين نسبة.
ملاحظة: بروتوكول قد يكون مؤقتاً في هذه المرحلة، وتخزين المواد في-20 درجة مئوية. - مقتطفات منفصلة عن طريق اللوني السائل باستخدام تدرج أسي حمض الفورميك 0.1% في المياه المتنقلة المرحلة (A) وحمض الفورميك 0.1% في مرحلة المتنقلة الاسيتو الانيتريل (ب) عند كبسي 10 و 500 دقيقة nL-1.
- إدخال الوينت الناتجة في مطياف شامل دليل الاستدامة الاقتصادية مقرونة جمع الأطياف من 400-2,000 m/z مع القرار 100,000 في m/z 400 في مطياف كتلة أوربيتراب خطي أيون فخ (لتق).
- تحويل ملفات RAW الأطياف مزمل تنسيق باستخدام مسكونفيرت أو بروتيوويزارد قبول جميع المعلمات الافتراضية. استخدم أداة البحث قاعدة بيانات عالمية مسجفبلوس للبحث الناتجة بروتيوميس مقابل قاعدة بيانات بروتين المستهدف من تسلسل البروتين وتوقع من الجينوم ميتاجينومي ذات الصلة التي جمعت.
- إلحاق الملوثات الشائعة (مثل، التربسين، القرتين، الزلال) وإزالة كافة تسلسل البروتين بالضبط المكررة لتحسين إحصاءات مباراة الببتيد إلى كتلة الطيف. تقييم عشرات احتمال الطيفية الناتجة عن MSGF لتحديد مباراة الببتيد إلى كتلة الطيف الذي هو أفضل. استخدم Q-القيمة من مسجفبلوس لتصفية الكومة البيانات بالكامل بمعدل 1% اكتشاف كاذبة (فرانكلين روزفلت).
10-جميع التحليل وبناء شبكة الأيضية
- تجميع جميع الصيغة الجزيئية المستقلب المحددة في الخطوات 3، 6، 7، و 8 في قاعدة بيانات واحدة من نواتج الأيض الموجودة في العينات. الجمع بين هذه المستقلبات مع أرقام لجنة الإنزيم (EC) أو أورثولوجي كيج (كو) الإنزيمات التي تم تحديدها في الخطوة رقم 9. البحث في dataset هذه مجتمعة ضد قاعدة27 كج، قسم الأيضية.
- تقييم النتائج لتحديد المسارات الأكثر احتمالاً ودمج في نموذج ايضية يدوياً.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ونحن أداء البروتوكول وصف التحليل التكميلي ومقارنة الخث بعمق في مستنقع S1 في موقع شجرة التنوب والأراضي الخثية استجابة تحت تغيير البيئات (شجرة التنوب) في ولاية مينيسوتا، الولايات المتحدة الأمريكية. تتم مقارنة هذه النتائج لتلك من مستنقع دائمة التجمد والفين من شمال السويد لإظهار كيفية قد تختلف المواقع في أنشطة المستقلب والانزيم. وقد حددنا الإنزيمات 3,312 في تحليل البروتينات. ويكشف تحليل أنشطة الإنزيمات بعمق أن ينخفض عدد الإنزيمات حادا بين 15 سم و 45 سم في مستنقع الراتينجيه (الشكل 1).
بينما تشير نتائج البروتيوميات إلى البروتينات التي يتم التعبير عنها، تظهر البيانات الأيضية ردود الفعل التي تحدث في الواقع. عموما، وقد حددنا والايضات 67,040 (بما في ذلك الدهون) في جميع عينات الخث من المزيج من فتيكر--مرض التصلب العصبي المتعدد، الرنين المغناطيسي، GC-MS، وتحليلات LC-مرض التصلب العصبي المتعدد. من هؤلاء، كنا قادرين على تعيين الصيغة الجزيئية لمركبات 15,385 (الشكل 2). البيانات المجمعة الأيضية يمتد على نطاق الدول الأكسدة والجماهير وفئات المجمع.
وهذا هو تصور عادة عن طريق استخدام رسم تخطيطي van كريفيلين الذي يتم رسم نسب ح/ج ذرية من الصيغة المحددة ضد تلك النسب س/ج ذرية28. ولقد شملت بعدا إضافيا إلى تنسيق ثنائي الأبعاد النموذجية، يصور نوس عن طريق لون ترميز رموز تمثل الصيغة الفردية (رقم 3 و رقم 4). مع زيادة العمق في مستنقع الراتينجيه، هناك زيادة في إجمالي عدد كبير من نواتج الأيض الثانوية حددها فتيكر مللي ثانية، على وجه التحديد في مكثف جداً (اليسرى السفلي من الأرض كريفيلين van) ومهدرج الصيغ (قمة الأرض) (الرقم 4 ). على أعماق نفسه هناك انخفاض في عدد المركبات النشطة جداً صغيرة تحددها GC-MS والدهون (الشكل 5). هذا يمكن أن يعني أما أن يتم استهلاك الدهون ونواتج الأيض الصغيرة في الخث السطحي قبل الوصول إلى أعماق أعمق، أو أن معدلات التحلل في الخث العميق أسرع منه في السطح حيث أن المركبات أدفيكتينج التنازلي يتم استهلاكها بسرعة. التفريق بين هذه الفرضيات المتنافسة اثنين يتطلب فهم مستوى العملية ج ركوب الدراجات الهوائية في الموقع. يمكن اكتساب فهم مستوى العملية فقط من خلال اقتران البروتيوميات وجميع مجموعات البيانات. علينا إنجاز هذا بواسطة الصليب-التحقق من LC-MS فتيكر--مرض التصلب العصبي المتعدد، GC-MS، مجتمعة، وتحديد الرنين المغناطيسي والايضات ضد قاعدة كيج. في القيام بذلك، نجد أن هذه المركبات قد حددنا الأيضية المشتركة المعنية مثل حمض تريكاربوكسيليتش (TCA) دورة، وتحلل، واستقلاب السكر. منذ والايضات الفردية يمكن أن تشارك في تأكيد مسارات متعددة مع الإنزيمات يزيد من ثقتنا في تعيين مسارات (الشكل 6).
من خلال هذا التعيين نجد أدلة الأيض السكروز والنشا في الخث السطحي، بينما في أعماق أعمق بيروفات وغيرها من منتجات التخمير وبناء (الشكل 6). هذه النتائج تتوافق مع الفرضية الأولى أن السكريات ونواتج الأيض نشطة أخرى هي المتدهورة في الخث السطحي ولا تصل إلى أعماق الخث أعمق. كما يتبين في الشكل 5، والسكريات (نوس = 0) والأحماض الأمينية (0 < نوس < 1) يتم استهلاكها في الخث السطحي، بينما الدهون (-2 < نوس <-1) ويبدو أن تتراكم بعمق. وهذا يتسق مع التوقعات التي تستند إلى قيم نوس أن أعلى نوس مركبات أكثر سهولة المتدهورة بينما تستمر أقل نوس المركبات في اللاهوائية عالية (أي، الشاي المحدودة) شروط الخث تحت السطح. ويميز هذا النهج أيضا بنجاح بين أنواع التربة من بيئات مختلفة. على سبيل المثال، المواد العضوية في التربة من مستنقعات الشمالية يبدو شكل تركيبي مختلف من مستنقعات دائمة التجمد، وكذلك داخل ألفين ومستنقع داخل المنطقة الدائمة التجمد. هذه النتائج تتوافق مع دراسة سابقة أظهرت الاختلافات بين هذه الموائل29، مما يوحي بأن موقع الكيمياء الجيولوجية في موقع الكيمياء الجيولوجية لها تأثير كبير على التحلل الميكروبي ج تحت الأرض.
الشكل 1 : يشير تحليل البروتينات إلى عمق قوية النظام الطبقي في عدد الإنزيمات. أشرطة تبين المتوسطات وأشرطة الخطأ تشير إلى انحراف معياري واحد من وفرة. وهذا يوحي بأن الكائنات الحية الدقيقة الأكثر نشاطا في السطح الخث. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : عدد المركبات التي حددتها كل تقنية في الخث السطحي (< 30 سم) لكل الموئل، فضلا عن متوسط (45 سم) والخصبة العميقة (87 سم) من مستنقع الراتينجيه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الرسم التخطيطي فإن كريفيلين (H/ج ذرية مقابل س/ج من كل تحديد الصيغة الجزيئية) للسطح (15 سم) شجرة التنوب مستنقع عمق تثبت تغطية المركبات تتميز بكل تقنية. فتيكر--مرض التصلب العصبي المتعدد يسمح لنا بتحديد أكبر عدد من المركبات (دوائر صغيرة)، بينما GC-MS (مثلثات) جيد لتمييز وتحديد السكريات (ح/C = 2 وس/ج = 1). مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (المربعات) يوفر معلومات كمية عن المركبات نشاط هام مثل السكريات والأحماض الأمينية، بيروفات، إلخ. LC-مرض التصلب العصبي المتعدد (الماس) ويقدم معلومات عن الدهون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : الرسم التخطيطي فإن كريفيلين (H/ج ذرية مقابل س/ج من كل تحديد الصيغة الجزيئية) للأعماق (87 سم) شجرة التنوب مستنقع عمق تثبت تغطية المركبات تتميز بكل تقنية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : الكسر النسبي لمختلف فئات المواد الكيميائية المحددة عن طريق تقنيات مختلفة في أعماق مختلفة- الأشرطة المرسومة المتوسطات لكل عمق ± انحراف معياري واحد. وتشمل فئات المرسومة الأحماض الأمينية sphingolipids (Cer)، جليسيروفوسفوتشولينيس (PC)، فوسفوثانولامينيس (PE)، دياسيلكليسيرولتريهوموسيريني (دجتسا)، دياسيلجليسيرول (المدير العام)، ترياسيلجليسيرولس (تيراغرام) والسكريات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : الجمع بين النتائج لإنشاء شبكة ايضية. توزيعات عمق من نواتج الأيض التي حددتها الرنين المغناطيسي النووي () و GC-MS (ب)، وخريطة مبسطة ايضية (ج) تبين عدد مختار من التحولات التي حددت في مستنقع الراتينجيه. مربعات خضراء تشير إلى نواتج الأيض التي تنقص بعمق، بني مربعات تشير إلى نواتج الأيض التي تزيد مع العمق. تشير الأسهم يربط الخضراء إلى إنزيم المحددة في أعمالنا dataset التي تتوسط التحويل المشار إليها (إنزيم EC الأرقام أشارت إلى جوار الأسهم). تشير الأسهم يربط الرمادي إلى التحويلات التي لم تحدد الإنزيمات في أعمالنا dataset. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الواحد-الإنتاجية، تيار تماما إلى جانب التحليل المستخدمة لتوصيف نواتج الأيض والبروتين يوفر نظرة ثاقبة المسارات التي ج ركوب الدراجات التي تحدث في النظام إيكولوجي معقد. التربة والخث مصفوفات متجانسة، وذلك، واحدة من الخطوات الحاسمة لهذا الأسلوب يحدث في الخطوات الأولى في ضمان أن الخث انطلاق أو مواد التربة غير متجانسة إلى حد كبير. فمن الأفضل لطحن العينة كذلك المجاميع يمكن أن تقلل من كفاءة الاستخراج. هذه هي مشكلة خاصة لتجميع التربة والتربة مع ج منخفضة وعالية المحتويات المعدنية التي قد تتطلب استخدام طاحونة الكرة الفولاذ المقاوم للصدأ مجانسة على نحو كاف. نظراً لعدم التجانس المكاني للتربة، وحجر داخل موقع تجريبي قد تكون عالية، ينصح replicates البيولوجية.
يستخدم هذا الأسلوب المذيبات ثلاثة: المياه، والميثانول، وكلوروفورم، التي تحيز على أنواع المركبات فمن الممكن لاستخراج. من حيث المبدأ، ينبغي جعل هذا الأسلوب المتسلسل استخراج مركبات تغطي مجموعة واسعة قطبية. ومع ذلك، هذه المذيبات ليست الأمثل لاستخراج المعادن organo مجمعات أو مجمعات مستقرة جداً. إذا كانت هذه المركبات من الفائدة، أشد قسوة من المذيبات مثل الأحماض القوية والقواعد المفضل، ولكن أشد عمليات الاستخراج يمكن أن يغير كيمياء العينات. تتضمن مثل هذه المذيبات في نهاية تسلسل استخراج قد تقليل هذا التأثير. بالإضافة إلى ذلك، سيتم تعطيل كلوروفورم التربة المهمة سريرياً والبكتيريا الخث ومسببات الأمراض الفيروسية، وغيرها من العوامل البيولوجية المسببة للأمراض المسببة للمرض بإذابة الدهون غشاء الخلية. وهكذا، إدماج كلوروفورم في بروتوكول استخراج سيقلل من المخاطر التي ينطوي عليها في دراسات علم الأحياء لعينات يحتمل أن تكون مصابة بمسببات الأمراض من مناطق مختلفة من العالم. إذا كانت هناك شواغل بشأن الخلايا الجرثومية ميتا أو الحطام الجسيمات بعد الاستخراج، ينصح تصفية تستخرج من خلال عامل تصفية ألياف زجاجية ميكرومتر 0.2.
لتبسيط هذه العملية، والمياه والميثانول يمكن الجمع بين مقتطفات لتحليل GC-MS أثناء الخطوة 4.1. ومع ذلك، يجب أن تظل هذه المقتطفات المنفصلين لتحليل فتيكر--مرض التصلب العصبي المتعدد بسبب قضايا الكفاءة التأين مع المصدر دليل الاستدامة الاقتصادية. ميزة تشغيل استخراج مجتمعة على GC-MS أن يتم تحديد أكثر من الأيض (الذي يغطي طائفة أوسع من قطبية). الحرمان من الجمع بين المقتطفات في هذه المرحلة هو أن إحدى الايضات الرئيسية الهامة في معالجة المواد العضوية الميكروبية الميثانول. آثار ميثانول سيظل دائماً في العينة مجتمعة، حتى بعد التجفيف، حتى إذا كان الميثانول المستقلب فائدة، يجب تشغيل استخراج المياه بشكل منفصل. وجود ضوابط جيدة مع لا تحليلها سوف يساعد أيضا في تحديد التلوث المحتملة في العينات.
في الخطوة 7-1 من إعداد خلاصات لتحليل الرنين المغناطيسي، كما هو الحال في تحليل GC-MS، أما استخراج المياه وحدها أو المياه المجمعة ويمكن استخدام مقتطفات الميثانول. أن مساوئ القيام بذلك مماثلة لتلك المذكورة في الفقرة السابقة. الاستفادة من الجمع بين المقتطفات والميثانول والماء هو أن يتم تحديد بعض نواتج الأيض تقل القطبية التي هي solubilized في الكسر الميثانول. ومع ذلك، بسبب خطوة التجفيف، ستفقد العديد من المركبات المتطايرة أكثر. وهذا وضع غير مؤات إذا كان التحديد الكمي للأحماض الدهنية المتطايرة عنصر حاسم للتجربة.
في هذا الإجراء لتحديد البروتينات، الببتيدات تريبتيك تماما فقط نشاط peptidase تفتيشه، وهكذا الذاتية وسيفتقد التشظيات في المصدر. من ناحية أخرى، الميثيونين المؤكسدة قد يعتبرون كتعديل بوستترانسلاشونال للمرشحين الببتيد هذا التعديل يحدث عادة أثناء أخذ عينات من تجهيز ومناولة. التحديد الكمي للإنزيمات باستخدام الببتيد شطف المناطق يمكن القيام به، ولكن هو خارج نطاق هذا المشروع.
يتم توفير العديد من أوجه التقدم الأخيرة في تحليل الاسم والمعلمات الميكروبية ثروة تقنيات لفهم ج العضوية ركوب الدراجات. من خلال الجمع بين هذه التقنيات في بروتوكول مبسط واحد، لنا الحصول على طريقة عرض جديدة للعمليات التي تجري. تحليل البروتينات مع التحليلات الأيضية اقتران يوفر قاهرة أدلة مؤيدة فعلا حدوث رد فعل. يقتصر التحليل الأيضي وحدها في ذلك أنه يبلغنا نواتج الأيض التي تكون أعلى أو أقل في التركيز في مقارنات بين المواقع أو بعد تأثير علاج، ولكن لا يمكن أن نستشف أسباب هذه التغييرات. على سبيل المثال، حددنا تناقص تركيزات السكر بعمق في المستنقع، ولكن دون مزيد من المعلومات غير الواضح عما إذا كان الانخفاض بعمق سبب بطء المدخلات أو تدهور سريع في الخث العميق. تحليل البروتين وانخفاض إنزيم التعبير بعمق يسمح لنا برفض الفرضية الثانية. بدلاً من ذلك لدينا نتائج تتسق مع تدهور سريع السكر في المدخلات يحد الخث السطحي في أعماق أعمق. هذه الرؤى خاصة هي فقط ممكن عندما تعتبر جميع التقنيات بالترادف كما يوفر كل واحدة فريدة من نوعها، ولكن قطعة حرجة ج ركوب الدراجات لغز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
نود أن نشكر كانتون جيه بي و J.E. Kostka كولتون م. م. للمساعدة في جمع عينات الخث. أجزاء من هذا العمل أجريت في "مختبر العلوم الجزيئية البيئية"، الكيان التشغيلي المعين مكتب للعلم المستخدم منشأة برعاية مكتب البيولوجية والبحوث البيئية. وتتولى بننل Battelle للكيان التشغيلي المعين تحت العقد دي-AC05-76RL01830. وأيده هذا العمل وزارة الطاقة الأمريكية ومكتب العلوم والأبحاث مكتب البيولوجية والبيئية (المنح: دي-AC05-00OR22725، دي-SC0004632، DESC0010580، SC0012088 دي ودي-SC0014416).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| methoxyamine hydrochloride | Sigma Aldrich | 226904 | derivitization agent |
| 5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe | Bruker | instrumentation | |
| capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) | Agilent | AG19091S-433 | instrumentation |
| reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size) | ThermoFisher | instrumentation | |
| 2 mL glass vials | VWR International | 46610-722 | sample vials |
| autosampler vials | VWR International | 97055-324; 9467671 | sample vials |
| Chloroform | VWR International | JT9174-3 | solvent |
| Ethanol | VWR International | BDH67002.400 | solvent |
| methanol | VWR International | BDH85681.400 | solvent |
| pyridine | VWR International | BDH67007.400 | solvent |
| 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 | Sigma Aldrich | 178837 | standard |
| C8-C24 fatty acid methyl ester | Sigma Aldrich | CRM18918 | standard |
| N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide | Sigma Aldrich | 24589-78-4 | standard |
| Suwanee River Fulvic Acid standard | International Humic Substances Society | 2S101F | standard |
| trimethylchlorosilane | Sigma Aldrich | 89595 | standard |
| Tuning Solution | Agilent | ||
| FTICR-MS analysis software | Bruker | Compass DataAnalysis 4.1 | |
| Formularity Software | Pacific Northwest National Laboratory | Formularity | available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity |
| GC-MS | Agilent | Agilent GC 7890A with MSD 5975C | |
| silica-based sorbent | Phenomenex (Torrance, CA) | Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK) | |
| NMR TUBE 3MM 8 150 CS5 | VWR International | KT897820-0008 | NMR tube |
| Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer | Varian Inova | Varian Direct Drive 600-MHz | NMR spectrometer |
| Chenomx NMR Suite 8.3 | Chenomx | Chenomx NMR Suite | NMR software |
| ultra-performance liquid chromatograph | waters | Aquity UPLC H | liquid chromatograph |
| Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer | ThermoFisher | Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos | mass spectrometer |
References
- Bridgham, S. D., Megonigal, P. J., Keller, J. K., Bliss, N. B., Trettin, C. The carbon balance of North American wetlands. Wetlands. 26 (4), 889-916 (2006).
- Wilson, R. M., et al. Greenhouse gas balance over thaw-freeze cycles in discontinuous zone permafrost. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (2), 387-404 (2017).
- Broder, T., Knorr, K. H., Biester, H. Changes in dissolved organic matter quality in a peatland and forest headwater stream as a function of seasonality and hydrologic conditions. Hydrology and Earth System Sciences. 21 (4), 2035-2051 (2017).
- Ejarque, E., et al. Quality and reactivity of dissolved organic matter in a Mediterranean river across hydrological and spatial gradients. Science of The Total Environment. 599, 1802-1812 (2017).
- Valenzuela, E. I., et al. Anaerobic methane oxidation driven by microbial reduction of natural organic matter in a tropical wetland. Applied and Environmental Microbiology. 83 (11), e00645-e00617 (2017).
- Lehmann, J., Kleber, M. The contentious nature of soil organic matter. Nature. 528 (7580), 60-68 (2015).
- Keiluweit, M., Nico, P. S., Kleber, M., Fendorf, S. Are oxygen limitations under recognized regulators of organic carbon turnover in upland soils? Biogeochemistry. 127 (2-3), 157-171 (2016).
- LaRowe, D. E., Van Cappellen, P. Degradation of natural organic matter: A thermodynamic analysis. Geochimica et Cosmochimica Acta. 75 (8), 2030-2042 (2011).
- Wilson, R. M., et al. Hydrogenation of organic matter as a terminal electron sink sustains high CO2: CH4 production ratios during anaerobic decomposition. Organic Geochemistry. 112, 22-32 (2017).
- Ye, R., Jin, Q., Bohannan, B., Keller, J. K., Bridgham, S. D. Homoacetogenesis: A potentially underappreciated carbon pathway in peatlands. Soil Biology and Biochemistry. 68, 385-391 (2014).
- Neubauer, S. C., Megonigal, J. P. Moving beyond global warming potentials to quantify the climatic role of ecosystems. Ecosystems. 18 (6), 1000-1013 (2015).
- Ma, S., et al. Data-Constrained Projections of Methane Fluxes in a Northern Minnesota Peatland in Response to Elevated CO2 and Warming. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 122 (11), 2841-2861 (2017).
- Conrad, R. Contribution of hydrogen to methane production and control of hydrogen concentrations in methanogenic soils and sediments. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Ecology. 28 (3), 193-202 (1999).
- Cunada, C. L., Lesack, L. F. W., Tank, S. E. Seasonal dynamics of dissolved methane in lakes of the Mackenzie Delta and the role of carbon substrate quality. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123 (2), 591-609 (2018).
- Wilson, R. M., Tfaily, M. M. Advanced molecular techniques provide new rigorous tools for characterizing organic matter quality in complex systems. Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 123 (6), 1790-1795 (2018).
- Borton, M. A., et al. Coupled laboratory and field investigations resolve microbial interactions that underpin persistence in hydraulically fractured shales. Proceedingsof the National Academy of Sciences. 115 (28), E6585-E6659 (2018).
- Tang, K., Page, J. S., Smith, R. D. Charge competition and the linear dynamic range of detection in electrospray ionization mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 15 (10), 1416-1423 (2004).
- Boiteau, R. M., et al. Structure Elucidation of Unknown Metabolites in Metabolomics by Combined NMR and MS/MS Prediction. Metabolites. 8 (1), 8 (2018).
- Walker, L. R., et al. Unambiguous Metabolite Identification in High-throughput Metabolomics by Hybrid 1DNMR/ESI MS Approach. Magnetic Resonance in Chemistry. 54 (12), 998-1003 (2016).
- Nicora, C. D., Burnum-Johnson, K. E., Nakayasu, E. S., Casey, C. P., White III, R. A., Roy Chowdhury, T., Kyle, J. E., Kim, Y. M., Smith, R. D., Metz, T. O., Jansson, J. K., Baker, E. S. The MPLEx Protocol for Multi-omic Analyses of Soil Samples. J. Vis. Exp. (135), e57343 (2018).
- Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. Extraction of fatty acid. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
- Tolic, N., et al. Formularity: software for automated formula assignment of natural and other organic matter from ultrahigh-resolution mass spectra. Analytical Chemistry. 89 (23), 12659-12665 (2017).
- Kim, Y. M., et al. Diel metabolomics analysis of a hot spring chlorophototrophic microbial mat leads to new hypotheses of community member metabolisms. Frontiers in microbiology. 6, 209 (2015).
- Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical Chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
- Kind, T., et al. FiehnLib: mass spectral and retention index libraries for metabolomics based on quadrupole and time-of-flight gas chromatography/mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (24), 10038-10048 (2009).
- Kyle, J. E., et al. LIQUID: an-open source software for identifying lipids in LC-MS/MS-based lipidomics data. Bioinformatics. 33 (11), 1744-1746 (2017).
- Kanehisa, M. Enzyme annotation and metabolic reconstruction using KEGG. Protein Function Prediction: Methods and Protocols. 1611, 135-145 (2017).
- Van Krevelen, D. W. Graphical-statistical method for the study of structure and reaction processes of coal. Fuel. 29, 269-284 (1950).
- Hodgkins, S. B., et al. Changes in peat chemistry associated with permafrost thaw increase greenhouse gas production. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (16), 5819-5824 (2014).
