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निस्र्पक जटिल प्राकृतिक कार्बनिक पदार्थ मिश्रण के लिए एकल-प्रवाह पूरक उच्च संकल्प विश्लेषणात्मक तकनीक

doi: 10.3791/59035 Published: January 7, 2019
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल पूरक विश्लेषणात्मक और ओमिक्स प्राकृतिक कार्बनिक पदार्थ और विभिंन पारिस्थितिकी प्रणालियों में माइक्रोबियल प्रोटियोमिक् के एक पूरी तरह से युग्मित लक्षण वर्णन में समापन तकनीक के लिए एक एकल प्रवाह का वर्णन । यह दृष्टिकोण चयापचय रास्ते और परिवर्तन ग्रीनहाउस गैस उत्पादन का वर्णन करने के लिए महत्वपूर्ण है और पर्यावरण को बदलने के लिए प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी की पहचान के लिए मजबूत तुलना परमिट ।

Abstract

प्राकृतिक कार्बनिक पदार्थ (NOM) कार्बनिक यौगिकों के हजारों की एक अत्यंत जटिल मिश्रण से बना है, जो ऐतिहासिक, विशेषताएं मुश्किल साबित कर दिया । हालांकि, ग्रीनहाउस गैस पर ऊष्मा और काइनेटिक नियंत्रण को समझने के लिए (कार्बन डाइऑक्साइड [CO2] और मीथेन [CH4]) NOM के अपघटन से उत्पंन उत्पादन, एक आणविक स्तर के माइक्रोबियल के साथ युग्मित लक्षण वर्णन proteome िरा जरूरी है । इसके अलावा, जलवायु और पर्यावरण परिवर्तन प्राकृतिक पारिस्थितिकी प्रणालियों perturb, संभावित जटिल बातचीत है कि कार्बनिक पदार्थ सब्सट्रेट और परिवर्तनों को प्रदर्शन सूक्ष्मजीवों की आपूर्ति दोनों को प्रभावित करने की उंमीद कर रहे हैं । कार्बनिक पदार्थ का एक विस्तृत आणविक लक्षण वर्णन, माइक्रोबियल प्रोटियोमिक्, और रास्ते और परिवर्तनों जिसके द्वारा कार्बनिक पदार्थ विघटित करने के लिए दिशा और पर्यावरण परिवर्तन के प्रभाव की भयावहता की भविष्यवाणी करने के लिए आवश्यक हो जाएगा । यह आलेख वर्णन करता है कि प्रत्यक्ष इंजेक्शन द्वारा एक एकल नमूने में व्यापक metabolite लक्षण वर्णन के लिए एक methodological प्रवाह रूपान्तर रूपांतरण आयन साइक्लोट्रॉन अनुनाद मास स्पेक्ट्रोमेट्री (FTICR-ms), गैस क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-ms), नाभिकीय चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी, तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-MS), और प्रोटियोमिक् विश्लेषण । एक पूरी तरह से युग्मित डेटासेट में यह दृष्टिकोण परिणाम जो कार्बनिक पदार्थ अपघटन, जिसके परिणामस्वरूप सह2 और CH4 उत्पादन दर के रास्ते को संदर्भित करने के लिए सांख्यिकीय विश्वास में सुधार, और पर्यावरण गड़बड़ी के लिए अपनी प्रतिक्रियाओं । इस के साथ साथ हम peatlands से एकत्र नमूनों NOM करने के लिए इस पद्धति को लागू करने के परिणाम मौजूद; हालांकि, प्रोटोकॉल किसी भी NOM नमूना (जैसे, पीट, वन मिट्टी, समुद्री तलछट, आदि) के लिए लागू है ।

Introduction

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विश्व स्तर पर, झीलों कार्बन के ५२९ स्नातकोत्तर (सी), ज्यादातर पीट जमा1में दफन कार्बनिक सी के रूप में शामिल होने का अनुमान है । वर्तमान में, इस तरह के peatlands एक शुद्ध सी सिंक के रूप में कार्य, sequestering 29 टीजी सी वाई 1अकेले उत्तरी अमेरिका में । हालांकि, ऐसे draining, आग, सूखे के रूप में पर्यावरणीय गड़बड़ी, और गर्म तापमान कार्बनिक पदार्थ ग्रीनहाउस गैस (कार्बन डाइऑक्साइड [CO2] के माध्यम से वृद्धि हुई सी घाटे में जिसके परिणामस्वरूप अपघटन द्वारा इस सी सिंक ऑफसेट कर सकते है और मीथेन [CH4]) उत्पादन1,2. जलवायु परिवर्तन सी हानि में योगदान अगर गर्म तापमान या ड्रायर शर्तों सूक्ष्मजीवों द्वारा तेजी से सी अपघटन को प्रोत्साहित कर सकते हैं । वैकल्पिक रूप से, उच्च तापमान और हवा सह2 सांद्रता जैविक कार्बन (ओसी) के रूप में अधिक सह2 एकांत करने के लिए प्राथमिक उत्पादन को उत्तेजित कर सकते हैं । किस हद तक और कितनी तेजी से है कि OC तो सह2 और CH4 में विघटित है इलेक्ट्रॉन दाता सब्सट्रेट के बीच जटिल बातचीत पर निर्भर करता है, इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने वालों की उपलब्धता, और सूक्ष्मजीवों कि मध्यस्थता परिवर्तन. कई मामलों में, तंत्र अच्छी तरह से विशेषता नहीं कर रहे हैं, इस प्रकार पर्यावरण perturbations के लिए उनकी प्रतिक्रिया अच्छी तरह से विवश नहीं है और यह स्पष्ट नहीं है क्या जलवायु परिवर्तन के शुद्ध परिणाम peatland पारिस्थितिकी प्रणालियों में कार्बन संतुलन पर होगा ।

प्राकृतिक कार्बनिक पदार्थ (NOM) की जटिल प्रकृति भी NOM मिश्रण ऐतिहासिक मुश्किल में मौजूद कार्बनिक यौगिकों की पहचान बना दिया है । हाल के अग्रिमों काफी हमारे यौगिकों कि पारंपरिक रूप से और, कुछ हद तक जारी रखने के लिए, अड़ियल humic या fulvic यौगिकों3,4,5के रूप में माना की विशेषता की क्षमता में सुधार हुआ है । अब हम समझते है कि इन यौगिकों के कई वास्तव में सूक्ष्मता से उपलब्ध है और विघटित हो सकता है अगर एक उपयुक्त टर्मिनल इलेक्ट्रॉन स्वीकार (चाय) उपलब्ध कराया है6,7। एक यौगिक के लिए कार्बन (NOSC) के नाममात्र ऑक्सीकरण राज्य की गणना अपघटन और आवश्यक चाय की ऊर्जा की उपज के लिए क्षमता की भविष्यवाणी के लिए एक मीट्रिक प्रदान करता है । हालांकि, यह कार्बनिक पदार्थ7के एक आणविक स्तर के लक्षण वर्णन की आवश्यकता है । NOSC निंनलिखित समीकरण7के माध्यम से आणविक सूत्र से गणना की है: NOSC = − ((− z + 4 (#C) + (#H) − 3 (#N) − 2 (#O) + 5 (#P) − 2 (#S)))/(#C)) + 4, जहां z शुद्ध प्रभार है । NOSC ऊष्मा ड्राइविंग बल8, जिसमें उच्च NOSC के साथ यौगिकों को नीचा करना आसान कर रहे है के साथ संबंधित है, जबकि कम NOSC के साथ यौगिकों तेजी से ऊर्जावान चाय की आवश्यकता के क्रम में कम किया जा करने के लिए । NOSC के साथ यौगिकों से कम − 2 जैसे हे2, नाइट्रेट या MnIVके रूप में एक उच्च ऊर्जा उपज चाय की आवश्यकता होती है, और आमतौर पर होने वाली कम ऊर्जा जैसे FeIII या सल्फेट7उपज चाय द्वारा नीचा नहीं किया जा सकता है । यह जल भराव anoxic स्थितियों में एक महत्वपूर्ण विचार है झीलों में पाया जहां ओ2 और अंय उच्च ऊर्जा उपज चिढ़ाने9 दुर्लभ है और इसलिए इन शर्तों के तहत कम NOSC यौगिकों के क्षरण कर रहे है ऊष्मा सीमित । पर्यावरण गड़बड़ी hydrologic परिवर्तन के माध्यम से पारिस्थितिकी तंत्र के ऊष्मा राज्य को प्रभावित कर सकते है कि प्रभाव2 हे (सबसे ऊर्जावान इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ता), कार्बनिक सब्सट्रेट और इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने में परिवर्तन प्राथमिक द्वारा उपलब्ध कराया उत्पादन, और तापमान से एक छोटी सीमा तक । एक महत्वपूर्ण उदाहरण है झीलों प्रणालियों में तापमान प्रभाव का व्यापार बंद है कि homoacetogenesis के बीच होता है के संबंध में होता है (यानी, CO2 और H2से एसीटेट उत्पादन) और hydrogenotrophic methanogenesis ( यानी, CH4 CO2 और H2से उत्पादन) । कम तापमान पर यह प्रतीत होता है कि homoacetogenesis थोड़ा इष्ट है, जबकि गर्म तापमान CH4 उत्पादन10एहसान । इस तापमान प्रभाव जलवायु को बदलने के लिए पारिस्थितिकी प्रणालियों की प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हो सकता है, ch4 के रूप में एक बहुत मजबूत सह211 से ग्रीनहाउस गैस है और इस तरह की कीमत पर ch4 के उत्पादन में वृद्धि गर्म तापमान पर CO2 जलवायु वार्मिंग के साथ एक सकारात्मक प्रतिक्रिया के लिए योगदान कर सकते हैं ।

Peatlands स्वाभाविक रूप से होने वाली कार्बनिक पदार्थ के माइक्रोबियल श्वसन केमाध्यम से2 और CH46के विश्व स्तर पर महत्वपूर्ण मात्रा का उत्पादन । कार्बनिक कार्बन सब्सट्रेट के NOSC co2के सापेक्ष अनुपात: ch4 का उत्पादन किया है, क्योंकि उच्च radiating के एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है4 co211की तुलना में, लेकिन यह भी क्योंकि मॉडलिंग के प्रयासों peatlands12में सी प्रवाह का अनुमान लगाने के लिए एक महत्वपूर्ण पैरामीटर के रूप में इस अनुपात की पहचान की है । टर्मिनल के अभाव में इलेक्ट्रॉन2co के अलावा अंय स्वीकार करता है, यह इलेक्ट्रॉन संतुलन द्वारा दिखाया जा सकता है कि NOSC > 0 के साथ कार्बनिक सी सब्सट्रेट सह2का उत्पादन होगा: CH4 > 1, NOSC के साथ कार्बनिक सी = 0 उत्पादन सह2 और CH4 equimolar अनुपात में, और NOSC < 1 के साथ कार्बनिक सी सह2उत्पादन होगा: CH4 < 113। प्राकृतिक पारिस्थितिकी प्रणालियों में OC के अपघटन सूक्ष्मजीवों द्वारा मध्यस्थता है, इसलिए है कि जब भी एक विशिष्ट यौगिक का क्षरण ऊष्मा साध्य है, यह काइनेटिक रूप से माइक्रोबियल एंजाइमों की गतिविधि द्वारा सीमित है और anoxic शर्तों के तहत, ऊष्मा ड्राइविंग बल (यानी, NOSC)7. अब तक यह पूरी तरह से कार्बनिक पदार्थ की विशेषता है क्योंकि वर्तमान यौगिकों की विविधता उनके लक्षण वर्णन के लिए विभिंन पूरक तकनीक की आवश्यकता है चुनौतीपूर्ण है । हाल ही में अग्रिम अंतर बंद कर दिया है; विश्लेषणात्मक तकनीक का एक सूट का उपयोग हम कार्बनिक आणविक स्तर लक्षण वर्णन प्रदान यौगिकों की एक बड़ी रेंज का विश्लेषण कर सकते है और, कुछ मामलों में ठहराव, ग्लूकोज की तरह छोटे प्राथमिक चयापचयों से ८०० Da पाली-heterocycles । पहले इस तरह के बड़े जटिल अणुओं बस के रूप में lignin की विशेषता होती है या टनीन की तरह है और मान लिया गया है अड़ियल । आणविक स्तर के लक्षण वर्णन, तथापि, यहां तक कि इन बड़े जटिल अणुओं के लिए NOSC की गणना की अनुमति देता है । इन NOSC मूल्यों रैखिक के साथ जुड़े हुए हैं, जो कई मामलों में पता चलता है कि इन जटिल अणुओं वास्तव में सूक्ष्मता से हो सकता है अपघटन के लिए उपलब्ध कार्बनिक पदार्थ की गुणवत्ता का एक आकलन के लिए अनुमति ऊष्मा ड्राइविंग बल के साथ संबंधित anoxic शर्तों है कि झीलों में प्रबल के तहत भी सड़ ।

2 O का परिचय के बाद से लगभग सभी स्वाभाविक रूप से मनाया NOSC मूल्यों के कार्बनिक पदार्थ को विघटित होने की अनुमति देता है, इस के साथ साथ हम कार्बनिक पदार्थ और माइक्रोबियल प्रोटियोमिक् जो झीलों में प्राथमिक ड्राइवरों की संभावना है में परिवर्तन पर ध्यान केंद्रित (यानी, लिमिटेड ओ2) सिस्टम । हालांकि, सभी तकनीकों है कि हम चर्चा करेंगे किसी भी पारिस्थितिकी तंत्र से कार्बनिक पदार्थ के लिए लागू किया जा सकता है । सामांयतः, थोक माप ऑप्टिकल और प्रतिदीप्ति विश्लेषण के आधार पर कार्बनिक पदार्थ गुणवत्ता3,14का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । जब ऐसे इन के रूप में थोक माप का उपयोग, तथापि, ठीक विवरण अणुओं की बड़ी संख्या के रूप में खो रहे है एक साथ humics या fulvics तरह जेनेरिक शब्दों के तहत वर्गीकृत कर रहे हैं । इन श्रेणियों की परिभाषा अच्छी तरह से विवश नहीं कर रहे है और वास्तव में, अध्ययन से तुलना असंभव बनाने के अध्ययन से भिंन हो सकते हैं । इसके अलावा, थोक मापन प्रणाली को नियंत्रित ऊष्मा की गणना के लिए आवश्यक आणविक विस्तार प्रदान नहीं करते हैं और इसलिए वास्तव में कार्बनिक पदार्थ गुणवत्ता15का आकलन करने की कमी है ।

व्यक्तिगत तकनीकों जैसे रूपान्तर रूपांतरण आयन साइक्लोट्रॉन अनुनाद मास स्पेक्ट्रोमेट्री (FTICR-ms), नाभिकीय चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी, गैस क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (GC-ms), और तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-ms) ऐसे आणविक स्तर का विस्तार प्रदान करें. जबकि इन तकनीकों में से प्रत्येक अपनी सीमाएं प्रस्तुत करता है, वे भी अपनी ताकत है कि एक एकीकृत दृष्टिकोण में leveraged किया जा सकता है लाने के लिए ठीक आणविक विस्तार एक कठोर ऊष्मा भावना में कार्बनिक पदार्थ की गुणवत्ता को बढ़ाता है के लिए आवश्यक . GC-MS सह2 और CH4 उत्पादन पर समीपस्थ प्रभाव की संभावना है कि महत्वपूर्ण छोटे चयापचयों की पहचान करने के लिए उपयोगी है (जैसे, ग्लूकोज, एसीटेट, आदि); हालांकि, GC-MS एक मानक के खिलाफ सत्यापन की आवश्यकता है और इसलिए पहले से ही उपंयास यौगिकों की पहचान को रोकने डाटाबेस में मौजूद यौगिकों को ज्ञात करने के लिए सीमित है । इसके अलावा, जीसी-MS एक अर्द्ध गुणात्मक सापेक्ष सांद्रता में परिवर्तन के बारे में अनुमान की अनुमति तकनीक है, लेकिन प्रदान नहीं वास्तविक एकाग्रता उदाहरण के लिए है Gibb मुक्त ऊर्जा की गणना के लिए आवश्यक जानकारी । अंत में, GC-MS अणुओं की derivatization की आवश्यकता है विश्लेषण करने के लिए जो सीमा संकल्प से पहले छोटे यौगिकों ~ ४०० दा और अस्थिर शराब सुखाने कदम के दौरान खो रहे हैं ।

एक आयामी (3 डी) 1एच तरल राज्य एनएमआर छोटे चयापचयों के उच्च मात्रात्मक लक्षण वर्णन की अनुमति देता है (प्राथमिक छोटे आणविक वजन चयापचयों और शराबियों की तरह वाष्पशीलता सहित, एसीटेट, एसीटोन, स्वरूप, पाइरूवेट, succinate, अल्प-जंजीर फैटी एसिड, साथ ही कार्बोहाइड्रेट की एक सीमा कुख्यात अनुपस्थित या एमएस आधारित तरीकों से समझौता) और उनकी सांद्रता ऊष्मा मापदंडों की गणना के लिए विशेष रूप से उपयोगी होते हैं । फिर भी, जैसे GC-एमएस, 1 डी जटिल मिश्रण के एनएमआर एक डाटाबेस के सापेक्ष मानकीकरण की आवश्यकता है और इसलिए अकेले नहीं है उपंयास यौगिकों कि जटिल प्राकृतिक और बदलते पारिस्थितिकी प्रणालियों में प्रचुर मात्रा में होने की संभावना है की आसान पहचान की अनुमति है । इसके अतिरिक्त, एनएमआर से कम संवेदनशील है एमएस आधारित तकनीक और इसलिए, मात्रात्मक metabolite profiling केवल ऊपर 1 µ मीटर एनएमआर हीलियम ठंडा ठंड जांच के साथ सुसज्जित प्रणालियों का उपयोग कर प्राप्त की है । नहीं व्यापक रूप से सराहना की, कुछ एनएमआर ठंड जांच नमक सहिष्णु है और millimolar नमक सांद्रता की उपस्थिति में पर्यावरण मिश्रण विश्लेषण की अनुमति जब छोटे व्यास में इस्तेमाल किया (< 3 मिमी बाहरी व्यास) नमूना ट्यूबों16। हालांकि, एनएमआर की एक और जटिलता है कि paramagnetic धातुओं और खनिजों की उच्च मात्रा (जैसे, Fe और 1-3 wt% से ऊपर Mn), जो अंतर्देशीय मिट्टी में प्रचुर मात्रा में हो सकता है, वर्णक्रमीय सुविधाओं को व्यापक कर सकते है और एनएमआर स्पेक्ट्रा की व्याख्या जटिल . ठोस चरण निष्कर्षण का उपयोग (एसपीई) खनिज लवण को कम करने और वर्णक्रमीय गुणवत्ता में वृद्धि के द्वारा दोनों एनएमआर और एमएस-आधारित metabolomics तरीकों की व्याख्या में सहयोगी कर सकते हैं ।

FTICR-MS डायरेक्ट इंजेक्शन द्वारा एक अति संवेदनशील तकनीक एक नमूना से चयापचयों हजारों की दसियों का पता लगाने में सक्षम है, लेकिन यह इस तरह के एसीटेट, पाइरूवेट, और succinate के रूप में महत्वपूर्ण छोटे चयापचयों पर कब्जा नहीं है और करने के लिए कुख्यात मुश्किल है शर्करा और अंय कार्बोहाइड्रेट17के लिए उपयोग करें, और न ही यह मात्रात्मक जानकारी प्रदान करता है । हालांकि, अंय तकनीकों के विपरीत, FTICR-MS excels की पहचान करने और उपंयास यौगिकों को आणविक फार्मूला निर्दिष्ट और इसलिए अंय वर्णित तकनीकों में से किसी से अधिक आणविक जानकारी उपलब्ध कराने के यौगिकों की सबसे बड़ी संख्या को दिखाता है । यह उपयोगी है, क्योंकि आणविक FTICR द्वारा प्रदान की जानकारी-एमएस (और अंय तकनीकों) के लिए NOSC जो ऊष्मा ड्राइविंग बल कुछ प्रतिक्रियाओं की संभावना को नियंत्रित करने के लिए संबंधित है की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है8 और उनकी दरों के तहत कुछ अटी7. इसके अलावा, युग्मन FTICR द्वारा-जुदाई तकनीक के साथ एमएस, जैसे नियंत्रण रेखा के साथ मिलकर एमएस के साथ, मात्रात्मक संरचनात्मक जानकारी प्राप्त किया जा सकता है, इस तकनीक के नुकसान के कुछ offsetting । LC-MS लिपिड की तरह यौगिकों और अन्य चयापचयों कि अच्छी तरह से किसी भी अन्य विधियों की विशेषता नहीं कर रहे हैं की पहचान करने के लिए उपयोगी है. युग्मन नियंत्रण रेखा FTICR-एमएस या नियंत्रण रेखा-एक अंश कलेक्टर के साथ एमएस और दो आयामी (2d) द्वारा संरचनात्मक elucidation के लिए ब्याज की विशिष्ट unknown के अंशों का संग्रह तरल राज्य एनएमआर की पहचान करने और मात्रा अज्ञात यौगिकों के लिए आदर्श स्थिति है18 ,19. हालांकि, यह एक बहुत समय लेने वाला कदम है कि अगर और जब जरूरत इस्तेमाल किया जा सकता है । व्यक्तिगत रूप से लिया, इन तकनीकों में से प्रत्येक कार्बनिक पदार्थ का एक अलग स्नैपशॉट प्रदान करते हैं, और उंहें एकीकृत करके, हम अलगाव में तकनीक के किसी भी प्रयोग से एक और अधिक पूर्ण समझ प्राप्त कर सकते हैं ।

जबकि ऊष्मा विचार क्या परिवर्तन एक प्रणाली में संभव हो पर अंतिम बाधाओं सेट, कार्बनिक पदार्थ अपघटन सूक्ष्मजीवों जिसका एंजाइम गतिविधियों नियंत्रण प्रतिक्रिया दरों द्वारा मध्यस्थता है । इस प्रकार, पूरी तरह से कार्बनिक पदार्थ अपघटन और अंततः ग्रीनहाउस गैस (CO2 और CH4) झीलों से उत्पादन पर नियंत्रण को समझने के लिए एक एकीकृत ओमिक्स दृष्टिकोण की आवश्यकता है निस्र्पक माइक्रोबियल एंजाइम गतिविधियों के रूप में अच्छी तरह के रूप में चयापचयों । इस आलेख में, हम एक पूरी तरह से युग्मित विश्लेषण में परिणाम है कि एक अनुक्रमिक दृष्टिकोण का उपयोग कर एक एकल नमूना से इस तरह के एक व्यापक विश्लेषण प्राप्त करने के लिए एक विधि का वर्णन. इस दृष्टिकोण metabolite, प्रोटीन पर फैलता है, और लिपिड निष्कर्षण (MPLex) प्रोटोकॉल जिसमें प्रोटियोमिक् जीसी-एमएस और नियंत्रण रेखा के साथ युग्मित-ms20 मात्रात्मक metabolite जानकारी को शामिल करके छोटे चयापचयों, प्रोटीन, और लिपिड की पहचान करने के लिए वाया एनएमआर और FTICR के माध्यम से बड़े माध्यमिक चयापचयों की पहचान-MS. MPLex के लिए थोड़ा अलग है, हम एक पानी निकासी के साथ प्रोटोकॉल शुरू और फिर तेजी से गैर ध्रुवीय सॉल्वैंट्स के साथ अनुक्रमिक निष्कर्षण का उपयोग करें । सभी निकालने एक नमूना है जो जब मात्रा सीमित या प्राप्त करने के लिए कठिन है और विषम नमूना मैट्रिक्स (जैसे, मिट्टी और पीट) से aliquots के बीच भिन्नता के माध्यम से प्रस्तुत प्रयोगात्मक त्रुटि कम हो जाती है, जो नमूना संरक्षित पर किया जाता है या भंडारण की स्थिति और अवधि में अंतर ।

अंत में, एक माइक्रोबियल समुदाय के प्रोटियोमिक् विश्लेषण के साथ ओम विश्लेषण युग्मन द्वारा, हम चयापचय नेटवर्क है कि रास्ते और कार्बनिक पदार्थ अपघटन के परिवर्तन का वर्णन का निर्माण कर सकते हैं । यह हमें कैसे प्रणाली को perturbations के बारे में विशिष्ट परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए उपलब्ध कार्बनिक सब्सट्रेट, इलेक्ट्रॉन स्वीकार करने के लिए परिवर्तन के माध्यम से परम सह2 और CH4 उत्पादन को प्रभावित करेगा अनुमति देता है, और माइक्रोबियल समुदायों एंजाइम उत्प्रेरक की गतिविधि के माध्यम से प्रतिक्रियाओं मध्यस्थता.

इस विधि का समग्र लक्ष्य चयापचयों, लिपिड का विश्लेषण करने के लिए एक एकल प्रवाह प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए है, और एक एकल नमूने से माइक्रोबियल प्रोटीन जिससे विश्लेषणात्मक त्रुटियों को विवश करते हुए चयापचय नेटवर्क के निर्माण के लिए एक पूरी तरह से बनती डेटासेट बनाने .

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Protocol

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1. मिट्टी, तलछट, या पीट से कार्बनिक पदार्थ की अनुक्रमिक निष्कर्षण

  1. coring के माध्यम से मिट्टी, तलछट, या पीट लीजिए और परिकल्पना के अनुसार कोर विभाजित (उदाहरणके लिए, गहराई) का परीक्षण किया जा रहा है । polytetrafluoroethylene लेपित कंटेनरों में नमूनों की दुकान और भंडारण के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर स्थिर विश्लेषण से पहले ।
    नोट: लगभग 25 मिलीग्राम सी इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक है । पीट के लिए (आमतौर पर ४५% सी), ५० मिलीग्राम सूखे पीट की आवश्यकता है । नमूना की बड़ी मात्रा सी सामग्री (5 ग्राम) के आधार पर खनिज या वन अंतर्देशीय मिट्टी की तरह कम कार्बनिक नमूनों के लिए आवश्यक हो सकता है । क्योंकि कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ निष्कर्षण के अर्क है, जो नकारात्मक कदम २.४ के दौरान ionization को प्रभावित करेगा में किसी भी पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) खींच जाएगा, यह करने के लिए नमूने संग्रह के दौरान किसी भी बिंदु पर प्लास्टिक से संपर्क करने की अनुमति से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, भंडारण या निष्कर्षण.
  2. जब नमूनों का विश्लेषण करने के लिए तैयार, लगातार वजन करने के लिए सूखी फ्रीज, तो एक उच्च गति गेंद मिल में नमूनों पीसने स्टेनलेस स्टील पीस गेंदों का उपयोग करने के लिए homogenize और किसी भी समुच्चय को तोड़ने ।
    नोट: प्रोटोकॉल इस बिंदु पर रोका जा सकता है और सामग्री पर संग्रहीत-८० ° c ।
  3. एक इथेनॉल-धोया स्टेनलेस स्टील के बर्तन का उपयोग कर, aliquot ५० प्रत्येक व्यक्ति 2 मिलीलीटर कांच शीशियों में सूखे नमूनों की मिलीग्राम । इन नमूनों क्रमिक रूप से एक नमूना से तेजी से गैर-ध्रुवीय चयापचयों निकालने के लिए सॉल्वैंट्स की एक श्रृंखला का उपयोग कर निकाला जाएगा । आसुत, degassed पानी (एच2ओ) के प्रत्येक नमूने के लिए 1 मिलीलीटर जोड़ें, शीशियों टोपी और एक शेखर मेज पर 2 घंटे के लिए हिला ।
  4. मिलाते के बाद समाधान की अनुमति कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए (आरटी) खड़े हो जाओ, तो 30 मिनट, खिचड़ी भाषा के लिए १५,००० x जी पर केंद्रापसारक और प्रत्येक से supernatant बचाने के लिए ।
    नोट: इन समाधानों को FTICR-MS में डायरेक्ट इंजेक्शन द्वारा इंजेक्ट किया जाएगा ।
  5. आचरण एक Folch निष्कर्षण21 (भी MPLEx20के रूप में जाना जाता है) पर अब १.३ कदम दोहरा और १.४ एक-20 डिग्री सेल्सियस 4:3 क्लोरोफॉर्म के 1 मिलीलीटर प्रतिस्थापन द्वारा निकाले गए अवशेषों: पानी के लिए मेथनॉल मिश्रण चरण १.३ में ।
    सावधानी: क्लोरोफॉर्म और मेथनॉल दोनों अत्यधिक ज्वलनशील और विषाक्त हैं । त्वचा संपर्क से बचने और खुली लौ से बचने के लिए उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) का प्रयोग करें ।
  6. ध्यान से एक जुदाई कीप का उपयोग करके FTICR-MS द्वारा अलग विश्लेषण के लिए, जो नेत्रहीन अलग हो जाएगा दो परिणामी विलायक परतों, पृथक या बस सावधान pipetting द्वारा शीर्ष परत हटा दें ।
    नोट: क्लोरोफॉर्म-युक्त अंश नीचे की ओर होंगे जबकि मेथनॉल-युक्त अंश कम घना होगा और ऊपर की ओर होगा ।
  7. पतला क्लोरोफॉर्म निकालें (चरण १.६) मेथनॉल में 1:1 और पानी निकालने (चरण १.४) 2:1 मेथनॉल में ionization-MS के लिए electrospray FTICR (ईएसआई) दक्षता में सुधार करने के लिए डायरेक्ट इंजेक्शन द्वारा ।
    नोट: १.७ चरण से मेथनॉल-युक्त अंश को मेथनॉल में आगे पतला करने की आवश्यकता नहीं है । FTICR-MS पर डायरेक्ट इंजेक्शन द्वारा मेथनॉल लेयर चलाई जाएगी ।

2. FTICR-एमएस विश्लेषण

  1. सीधे एक ट्यूनिंग समाधान के १०० µ एल इंजेक्शन द्वारा FTICR स्पेक्ट्रोमीटर जांचना ( सामग्री की तालिकादेखें) लगभग १०० के एक बड़े पैमाने पर फैले रेंज-१,३०० FTICR-MS में डा.
  2. Suwannee नदी Fulvic एसिड मानक ( सामग्री की तालिकादेखें) एक 1 मिलीग्राम मिलीलीटर-1 ultrapure फ़िल्टर्ड पानी में समाधान बनाने के द्वारा तैयार है और फिर कमजोर के परिणामस्वरूप समाधान 20 µ जी एमएल-1 में मेथनॉल ।
  3. प्रत्यक्ष एक सिरिंज ३.० μL मिन के एक प्रवाह की दर के लिए सेट पंप के माध्यम से ईएसआई FTICR स्पेक्ट्रोमीटर करने के लिए युग्मित स्रोत के लिए इस अंतिम समाधान के 23 µ एल सुई-1। सेट सुई वोल्टेज करने के लिए ४.४ केवी, Q1 करने के लिए १५० m/z और ग्लास केशिका पर १८० ° c. डेटा की गुणवत्ता की पुष्टि करने के लिए विश्लेषण सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके परिणामस्वरूप स्पेक्ट्रा का निरीक्षण करें ।
  4. नमूने चलने से पहले HPLC ग्रेड मेथनॉल का उपयोग करें और carryover पर नजर रखने के लिए नमूना भर । एक सिरिंज ३.० μL मिन-1की एक प्रवाह दर के लिए सेट पंप के माध्यम से FTICR स्पेक्ट्रोमीटर करने के लिए युग्मित स्रोत के लिए सीधे इंजेक्शन के माध्यम से प्रत्येक निकालने के 23 μL परिचय । सेट सुई वोल्टेज करने के लिए ४.४ केवी, Q1 करने के लिए १५० m/z और ग्लास केशिका पर १८० ° c.
  5. सी एकाग्रता में भिन्नता के लिए खाते में प्रत्येक नमूने या नमूनों के समूह के लिए आयन संचय समय (IAT) समायोजित करें. सामान्य मान ०.१ से ०.३ s के बीच हैं. प्रत्येक नमूने के लिए १४४ स्कैन लीजिए, औसत स्कैन और फिर मुताबिक़ CH2 का उपयोग कर एक आंतरिक अंशांकन आचरण (यानी, 14 दा जुदाई) श्रृंखला.
    नोट: FTICR-एमएस विश्लेषण के बाद, निर्णय या तो पानी और मेथनॉल निकाले भागों गठबंधन करने के क्रम में शेष चरणों को कारगर बनाने के लिए या भागों बाद के चरणों में अलग रखा जा सकता है बनाया जा सकता है । प्रत्येक दृष्टिकोण के फायदे और नुकसान चर्चामें लंबाई पर वर्णित हैं । यदि ऐसा करते हैं, तो पानी और मेथनॉल-निकाले गए अंशों को संयोजित करें.
  6. सूखी एक ध्यानी का उपयोग कर निष्कर्षों और अर्क (~ 1 मिलीलीटर) के बाद GC-एमएस (पानी, मेथनॉल या पानी + मेथनॉल), नियंत्रण रेखा-एमएस (क्लोरोफॉर्म) और एनएमआर (जल + मेथनॉल) विश्लेषण के लिए शेष बचा ।
    नोट: प्रोटोकॉल इस बिंदु पर रोका जा सकता है और सामग्री-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।

3. FTICR-एमएस डाटा प्रोसेसिंग

  1. सह-सभी नमूना पीक सूचियों के लिए पूरे डेटासेट के लिए बड़े पैमाने पर परिवर्तन को कम करने और मानकीकरण पीक कार्य Formularity22 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर आगे सूत्र असाइनमेंट ।
  2. Formularity सॉफ्टवेयर22 का उपयोग करने के लिए आणविक फार्मूला 7 से अधिक शोर अनुपात के लिए एक संकेत का उपयोग कर आवंटित करने के लिए, जन माप त्रुटि < 1 पीपीएम, और सी, एच, ओ, एन, एस, और पी की अनुमति जबकि अंय सभी तत्वों को छोड़कर ।
  3. यदि एकाधिक उंमीदवार फार्मूले के लिए दिए गए है एक बड़े पैमाने पर (५०० से ऊपर अक्सर दा) नमूना सामग्री के साथ सुसंगत बाधाओं थोपना । उदाहरण के लिए, पीट में, ठेठ बाधाओं में शामिल हैं: सबसे कम जन त्रुटि, heteroatoms की सबसे कम संख्या (एन, एस, पी), और जब वर्तमान, पी ऑक्सीकरण फार्म में होना चाहिए (यानी, वहां के फार्मूले में एक पी एटम के लिए कम से कम 4 हे परमाणुओं होना चाहिए) ।

4. जीसी-MS के लिए केमिकल Derivatization

  1. जीसी-MS में HPLC ग्रेड hexane के रिक् त नियंत्रण नमूने तैयार करें-एमएस पारखी शीशियों23. भंग १०० मिलीग्राम फैटी एसिड मिथाइल एस्टर (प्रसिद्धि: C8-C28) मिश्रण प्रतिधारण समय मानक २०० µ में hexane के एल ।
  2. carbonyl समूहों की रक्षा के लिए, pyridine में 30 मिलीग्राम मिलीलीटर-1 methoxyamine हाइडरोक्लॉराइड के 20 μL जोड़ें मेथनॉल अर्क और पानी के अर्क से प्रत्येक को (या संयुक्त मेथनॉल/पानी के अर्क का उपयोग अगर) से कदम २.६, कारतूस और प्रसिद्धि अंशांकन23नमूने । टोपी के साथ सील शीशियों ।
    चेतावनी: Pyridine दोनों अत्यधिक विषाक्त और ज्वलनशील है । त्वचा या आँख से संपर्क को रोकने और खुली लौ से बचने के लिए उपयुक्त पीपीई पहनें । इसके अतिरिक्त, pyridine volatilizes पर आरटी हानिकारक वायु प्रदूषण के कारण । एक धुएं हुड के नीचे अच्छी तरह हवादार स्थानों में ही काम करते हैं ।
  3. भंवर अर्क के लिए 20 एस Sonicate अर्क के लिए ६० एस. फिर, ३७ डिग्री सेल्सियस पर १०० एक्स जी में ९० मिनट के लिए एक केंद्रापसारक में अर्क की मशीन
    नोट: कार्बोहाइड्रेट या लवण की एक अत्यधिक मात्रा में सूख जाने के बाद crystalize को चयापचयों पैदा कर सकता है । Sonicating नमूनों में क्रिस्टलीय चयापचयों को derivatizing रिएजेंट में पुनर्गठित करने में मदद मिलेगी ।
  4. मशीन के बाद, जोड़ें ८० μL n-मिथाइल-n-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide 1% trimethylchlorosilane के साथ प्रत्येक नमूना, भंवर अर्क के लिए 20 एस Sonicate अर्क के लिए ६० एस और के लिए एक केंद्रापसारक में फिर से अर्क के लिए ३७ ° c पर 30 मिनट के लिए १०० x जी ।
  5. आरटी को शांत अर्क (20-24 ° c), तो GC में स्थानांतरण-एमएस नमूना शीशियों ।

5. जीसी-एमएस विश्लेषण

  1. धुन और विक्रेता सिफारिशों के अनुसार एमएस जांचना ( सामग्री की तालिकादेखें) विश्लेषण करने के लिए सुनिश्चित करें कि मशीन एमएस डेटा सही ढंग से पढ़ने के लिए । जांच करें कि हीलियम गैस दबाव निर्दिष्ट सहिष्णुता के भीतर है ।
  2. एक जीसी कॉलम पर अलग ध्रुवीय चयापचयों (30 एम × ०.२५ mm × ०.२५ माइक्रोन) । इस प्रकार के रूप में ओवन तापमान प्रोटोकॉल सेट करें: (1) 1 मिनट के लिए ६० ° c के प्रारंभिक तापमान, (2) रैंप के लिए ३२५ ° c 10 डिग्री सेल्सियस की दर से-1, और (3) 5 मिनट के लिए ३२५ ° c पर पकड़ो ।
  3. एक लगातार २५० डिग्री सेल्सियस के लिए एक एकल quadrupole एमएस सेट इंजेक्शन बंदरगाह तापमान के लिए युग्मित GC का उपयोग कर निष्कर्षों का विश्लेषण । प्रत्येक derivatized निकालने के विभाजन मोड में 1 μL इंजेक्षन ।

6. जीसी-एमएस डाटा प्रोसेसिंग

  1. यह सुनिश्चित करने के लिए कि वे सही तरीके से कैप्चर किए गए सभी डेटा फ़ाइलों का निरीक्षण करें । के साथ संभावित बदलाव के लिए ध्यान देने के लिए आंतरिक मानक प्रतिधारण समय और तीव्रता के संबंध में पुष्टि करते है कि डेटा लगातार विश्लेषण भर में कब्जा कर लिया गया था ।
  2. यदि आवश्यक हो तो विक्रेता विशिष्ट ms डेटा स्वरूप एक सामान्य ms स्वरूप में कनवर्ट करें । MetaboliteDetector24 की प्रसिद्धि आंतरिक मानकों के आधार पर औजार अवधारण सूचकांक का उपयोग कर कच्चे डेटा फ़ाइलों की प्रक्रिया । सभी डेटा फ़ाइलों के प्रतिधारण समय संरेखित करने के बाद, deconvolution के साथ जारी रखने और अंत में metabolite पहचान के साथ मिलान प्रतिधारण सूचकांक और GC-MS स्पेक्ट्रा FiehnLib ध्रुवीय metabolite पुस्तकालय के खिलाफ25.
  3. क्रॉस-चेक शेष अज्ञात चयापचयों के खिलाफ NIST14 GC-एमएस पुस्तकालय वर्णक्रमीय मिलान का उपयोग कर. झूठी पहचान को समाप्त करने और deconvolution त्रुटियों को कम करने के लिए व्यक्तिगत रूप से पहचान सत्यापित करें ।

7. तरल राज्य एनएमआर विश्लेषण

  1. एक 5 मिमी 2, 2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 आंतरिक मानक के साथ पानी के अर्क (~ ३०० µ एल) 10% (vol/ वैकल्पिक रूप से, चरण 1 से पानी और मेथनॉल अर्क गठबंधन तो पानी में resubstitute । ऐसा करने से हालांकि, अस्थिर यौगिकों के कुछ फ्रीज-सुखाने कदम के दौरान खो दिया जा सकता है । विशिष्ट अंतिम नमूना वॉल्यूम १८०-३०० µ l श्रेणी में हैं ।
  2. एक उच्च गुणवत्ता 3 मिमी बाहरी व्यास (ओडी) borosilicate ग्लास एनएमआर ट्यूब में मिश्रण स्थानांतरण ।
  3. एक 5 मिमी ट्रिपल अनुनाद नमक सहिष्णु ठंड जांच और एक ठंड कार्बन पूर्व एम्पलीफायर के साथ सुसज्जित एक एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर (आदर्श रूप में सबसे कम ६०० मेगाहर्ट्ज) का उपयोग कर स्पेक्ट्रा ले लीजिए.
  4. एक 4 एस अधिग्रहण समय, १.५ एस रीसायकल देरी, ६५,५३६ जटिल अंक, और ५१२ स्कैन के साथ २९८ K पर एक 1 डी परमाणु Overhauser प्रभाव स्पेक्ट्रोस्कोपी (NOESY) संतृप्ति प्रयोग का उपयोग 3 डी 1एच स्पेक्ट्रा लीजिए ।
  5. 2 डी 1एच13सी heteronuclear एकल क्वांटम सहसंबंध (HSQC) और 1एच-1एच कुल सहसंबंध (TOCSY) स्पेक्ट्रा चयापचयों और सत्यापन निर्दिष्ट करने में मदद करने के लिए इकट्ठा ।
  6. प्रक्रिया, निरुपित, और सभी स्पेक्ट्रा विश्लेषण एनएमआर विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें) को आंतरिक मानक के सापेक्ष तीव्रता यों तो । पुस्तकालय के खिलाफ नमूनों में रासायनिक बदलाव, जंमू-युग्मन और तीव्रता जानकारी मिलान करके चयापचयों की पहचान करें ।
    नोट: पुस्तकालय आगे कस्टम लक्षित metabolite मानकों और metabolite एक नियमित आधार पर किए गए जोड़ द्वारा बढ़ाया है । प्रोटोकॉल इस बिंदु पर रोका जा सकता है और सामग्री-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।

8. LC-MS Lipidomics विश्लेषण

  1. Rewet मेथनॉल के २०० μL के साथ चरण २.५ के दौरान उत्पंन सूख क्लोरोफॉर्म निकालें ।
  2. एक अल्ट्रा में प्रत्येक निकालने के 10 μL इंजेक्षन-प्रदर्शन तरल chromatograph एक Orbitrap मास के लिए युग्मित एक उलट चरण का उपयोग कर सतह संकर कॉलम (३.० mm × १५० mm × १.७ माइक्रोन कण आकार) का आरोप लगाया । सेट एक ३४-ंयूनतम ढाल (मोबाइल चरण एक: acetonitrile/एच2ओ (40:60) 10 मिमी अमोनियम एसीटेट युक्त; मोबाइल फेज़ बी: acetonitrile/isopropanol (10:90) जिसमें 10 एमएम अमोनियम एसीटेट) की एक प्रवाह दर पर २५० µ l/नकारात्मक और सकारात्मक दोनों का उपयोग करें उच्च ऊर्जा टक्कर पृथक्करण और टक्कर प्रेरित पृथक्करण के साथ ionization मोड ।
    सावधानी: Acetonitrile एक आंख, त्वचा, और श्वसन अड़चन है । जेवण उपयुक्त पीपीई. इसके अलावा, acetonitrile दहनशील है । ऑक्सीकरण एजेंटों से संपर्क करने की अनुमति न दें, जलने के दौरान विषाक्त धुएं का उत्पादन किया जा सकता है ।
  3. अपलोड रॉ नियंत्रण रेखा-ms/लक्ष्य फ़ाइल (यानी, > २५,००० लिपिड प्रजातियों की सूची) के साथ तरल में एमएस डेटा फ़ाइलें संबंधित ionization मोड के लिए (सकारात्मक या नकारात्मक) । raw फ़ाइल संसाधित है । मैन्युअल रूप से, नैदानिक आयनों की उपस्थिति के लिए एमएस/ms स्पेक्ट्रा का परीक्षण करके परिणामी पहचान को मान्य यदि लागू हो, तो अंश आयनों (जैसे, फैटी acyl चेन), isotopic जुदाई, पुरोगामी की सामूहिक पीपीएम त्रुटि, और अवधारण समय का मिलान करें । एक. tsv फ़ाइल के रूप में विश्वास की पहचान लिपिड के परिणामस्वरूप निर्यात की सूची ।
    नोट: प्रोटोकॉल इस बिंदु पर रोका जा सकता है और सामग्री की दुकान पर-20 ° c ।

9. प्रोटियोमिक् विश्लेषण

  1. मेथनॉल चरण २.४ से जिसके परिणामस्वरूप के शेष से MPLEx प्रोटोकॉल20 के अनुसार प्रोटीन निकालें, 20 बार अतिरिक्त ठंड (-20 डिग्री सेल्सियस) मेथनॉल की मात्रा निकालने के साथ निकालने धोने के द्वारा ।
  2. का प्रयोग करें 1 मिलीलीटर/50 मिलीग्राम सिलिका-आधारित sorbent (देखें सामग्री की तालिका) के लिए शर्त C18 एसपीई कॉलम के साथ 3 मिलीलीटर मेथनॉल, पानी में ०.१% trifluoroacetic एसिड (TFA) की 2 मिलीलीटर, एक दर पर ९.१ से निकालने के अलावा द्वारा पीछा किया 1 मिलीलीटर से अधिक नहीं/
  3. नमूने के अलावा के बाद, कॉलम को धोने के साथ 4 मिलीलीटर की 95:4.9:0.1 पानी: acetonitrile: TFA, तो शुष्क करने के लिए अनुमति देते हैं । एसपीई कॉलम के तहत एक १.५ मिलीलीटर संग्रह ट्यूब प्लेस, और elute 80:19.9:0.1 मेथनॉल: पानी: TFA के 1 मिलीलीटर के साथ नमूना ।
  4. १०० µ एल के लिए निष्कर्षों के तहत ध्यान केंद्रित वैक्यूम सहायता फ्रीज ड्रायर, तो bicinchoninic एसिड द्वारा प्रोटीन एकाग्रता उपाय (बीसीए) वर्णमिति परख26 ५६२ एनएम के एक तरंग दैर्ध्य पर ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १०,००० x g पर अर्क केंद्रापसारक । जिसके परिणामस्वरूप supernatant और सूखी शेष गोली के लिए निर्वात के तहत 5 min. resuspend पानी में प्रोटीन गोली ०.१ µ जी पेप्टाइड प्रति µ एल की एक अंतिम एकाग्रता के लिए
  6. 5 मिमी के अंतिम एकाग्रता के लिए dithiothreitol जोड़ें और 30 मिनट के लिए ६० ° c पर मशीन । पतला 10-१०० मिमी के साथ गुना एनएच4HCO3/8M यूरिया समाधान और 1 मिमी CaCl2 और सुअर का trypsin की उपस्थिति में 3 एच के लिए ३७ ° c पर एक 1:50 प्रोटीन के लिए एंजाइम पर मशीन अनुपात.
    नोट: प्रोटोकॉल इस बिंदु पर रोका जा सकता है और दुकान सामग्री पर-20 ° c ।
  7. तरल क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से अलग अर्क पानी मोबाइल चरण में एक ०.१% फार्मिक एसिड की एक घातीय ढाल का उपयोग कर (एक) और एक ०.१% acetonitrile मोबाइल चरण (ख) में 10 kpsi और ५०० nL मिन-1में फार्म का अंल ।
  8. एक ईएसआई में परिणामी eluent परिचय-युग्मित जन स्पेक्ट्रोमीटर से स्पेक्ट्रा का संग्रह 400-2000 m/z १००,००० संकल्प के साथ एक रैखिक आयन ट्रैप (LTQ) Orbitrap मास स्पेक्ट्रोमीटर में एम/जेड ४०० ।
  9. msConvert या ProteoWizard का उपयोग कर सभी डिफ़ॉल्ट पैरामीटर स्वीकार mzML प्रारूप करने के लिए रॉ स्पेक्ट्रा फ़ाइलों को परिवर्तित । का प्रयोग करें यूनिवर्सल डेटाबेस खोज उपकरण MSGFPlus प्रोटीन अनुक्रम प्रासंगिक metagenome इकट्ठे जीनोम से भविष्यवाणी की एक लक्षित प्रोटीन डेटाबेस के खिलाफ परिणामस्वरूप proteomes खोज करने के लिए ।
  10. आम दूषित पदार्थों (जैसे, trypsin, केरातिन, एल्ब्युमिन) जोड़ें और सभी वास्तव में डुप्लिकेट प्रोटीन अनुक्रम को हटाने के लिए पेप्टाइड-to-जन स्पेक्ट्रम मैच के आँकड़े में सुधार होगा । जो पेप्टाइड-टू-मास-स्पेक्ट्रम मिलान सबसे अच्छा है यह निर्धारित करने के लिए परिणामी MSGF वर्णक्रमीय प्रायिकता स्कोर का मूल्यांकन करें । पूरे डेटा पाइल को 1% false डिस्कवरी दर (एफडीआर) पर फ़िल्टर करने के लिए MSGFPlus से Q-मान का उपयोग करें ।

10. Metabolomics विश्लेषण और चयापचय नेटवर्क का निर्माण

  1. नमूने में मौजूद चयापचयों के एकल डेटाबेस में चरण 3, 6, 7 और 8 में पहचाने गए सभी metabolite आणविक सूत्र संकलित करें । एंजाइम आयोग (ईसी) या KEGG Orthology (KO) चरण 9 में पहचान की एंजाइमों की संख्या के साथ इन चयापचयों गठबंधन । KEGG27 डेटाबेस, चयापचय मार्ग अनुभाग के विरुद्ध इस संयुक्त dataset खोज ।
  2. मैन्युअल रूप से सबसे संभावित रास्ते की पहचान और एक चयापचय मॉडल में एकीकृत करने के लिए परिणामों का मूल्यांकन.

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Representative Results

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हम वर्णित पूरक विश्लेषण प्रोटोकॉल प्रदर्शन किया और गहराई के साथ पीट तुलना में एस. ए. बदलते वातावरण (सजाना) मिनेसोटा, संयुक्त राज्य अमेरिका में साइट के तहत सजाना और Peatlands प्रतिक्रिया में दलदल । इन परिणामों के एक permafrost दलदल से उन लोगों की तुलना में और उत्तरी स्वीडन से फें कैसे साइटों metabolite और एंजाइम गतिविधियों में भिंन हो सकते है दिखाने के लिए कर रहे हैं । हम प्रोटियोमिक् विश्लेषण में ३,३१२ एंजाइमों की पहचान की । गहराई के साथ एंजाइमों गतिविधियों का विश्लेषण से पता चलता है कि एंजाइमों की संख्या में तेजी से 15 सेमी और सजाना दलदल में ४५ सेमी के बीच में गिरावट आती है (चित्रा 1) ।

जबकि प्रोटियोमिक् परिणाम संकेत मिलता है जो प्रोटीन व्यक्त कर रहे हैं, चयापचय डेटा शो जो प्रतिक्रियाओं वास्तव में होने वाली हैं । कुल मिलाकर, हम FTICR के संयोजन से पीट नमूनों के सभी में ६७,०४० चयापचयों (लिपिड सहित) की पहचान की-ms, एनएमआर, जीसी-ms, और नियंत्रण रेखा-एमएस विश्लेषण । इनमें से, हम १५,३८५ यौगिकों (चित्रा 2) को आणविक फार्मूला आवंटित कर रहे थे । संयुक्त चयापचय डेटा ऑक्सीकरण राज्यों, आम जनता, और यौगिक वर्गों की एक सीमा तक फैला है ।

यह आमतौर पर एक वान Krevelen आरेख के उपयोग के माध्यम से visualized है जिसमें पहचाने गए सूत्र के परमाणु एच/सी अनुपात उनके परमाणु ओ के खिलाफ साजिश रची जाती है/ हम ठेठ 2 डी प्रारूप के लिए एक जोड़ा आयाम शामिल किया है, रंग के माध्यम से NOSC चित्रण अलग सूत्र (चित्रा 3 और चित्रा 4) का प्रतिनिधित्व प्रतीकों कोडिंग । सजाना दलदल में गहराई बढ़ाने के साथ, वहां बड़े माध्यमिक FTICR द्वारा की पहचान की चयापचयों की कुल संख्या में वृद्धि हुई है-MS, विशेष रूप से अत्यधिक गाढ़ा में (वान Krevelen भूखंड के निचले बाएं) और हाइड्रोजनीकृत सूत्र (भूखंड के ऊपर) (4 चित्रा ). एक ही गहराई पर छोटे अत्यधिक ऊर्जावान जीसी-MS द्वारा और लिपिड में (5 चित्रा) की पहचान यौगिकों की संख्या में कमी है । यह सुझाव है कि या तो लिपिड और छोटे चयापचयों गहरी गहराई तक पहुंचने से पहले सतह पीट में भस्म हो रहे है या कि गहरी पीट में अपघटन दरों सतह की तुलना में तेजी से कर रहे है इस तरह की है कि नीचे advecting यौगिकों तेजी से भस्म हो सकता है । इन दो प्रतिस्पर्धी परिकल्पनाओं के बीच अंतर साइट पर सी साइकिल चालन के एक प्रक्रिया स्तर को समझने की आवश्यकता है । इस तरह के एक प्रक्रिया स्तर समझ केवल metabolomics और प्रोटियोमिक् डेटासेट युग्मन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । हम पार से यह पूरा-संयुक्त FTICR-ms, जीसी-ms, नियंत्रण रेखा-ms, और KEGG डेटाबेस के खिलाफ चयापचयों की पहचान की एनएमआर मांय । ऐसा करने में, हम पाते है कि यौगिकों हम पहचान tricarboxylic एसिड (टीसीए) चक्र, glycolysis, और चीनी चयापचय के रूप में आम चयापचय रास्ते में शामिल हैं । के बाद से व्यक्तिगत चयापचयों एंजाइमों के साथ कई रास्ते पुष्टि में शामिल किया जा सकता है रास्ते निर्दिष्ट (चित्रा 6) में हमारे आत्मविश्वास बढ़ जाती है ।

इस मानचित्रण के माध्यम से हम सतह पीट में सुक्रोज और स्टार्च चयापचय के सबूत मिल जाए, जबकि गहरी गहराई में पाइरूवेट और अंय किण्वन उत्पादों का निर्माण (6 चित्रा) । ये परिणाम पहली परिकल्पना के अनुरूप हैं कि शर्करा और अन्य ऊर्जावान चयापचयों सतह पीट में नीचा हैं और गहरी पीट गहराइयों तक नहीं पहुँच पाते हैं. के रूप में चित्रा 5में देखा जा सकता है, शर्करा (NOSC = 0) और एमिनो एसिड (0 < NOSC < 1) सतह पीट में सेवन कर रहे हैं, जबकि लिपिड (-2 < NOSC <-1) गहराई के साथ जमा दिखाई देते हैं । यह NOSC मूल्यों है कि उच्च NOSC यौगिकों और अधिक आसानी से नीचा दिखा रहे हैं, जबकि कम NOSC यौगिकों उच्च anaerobic (यानी, चाय-सीमित) उपसतह पीट की स्थिति में जारी रहती है पर आधारित अपेक्षाओं के अनुरूप है । इस दृष्टिकोण भी सफलतापूर्वक अलग वातावरण से मिट्टी प्रकार के बीच भेद । उदाहरण के लिए, बोर peatland से मिट्टी कार्बनिक बात को permafrost peatland से संरचना अलग प्रतीत होता है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह के भीतर फें और permafrost क्षेत्र के भीतर दलदल । इन परिणामों के एक पिछले अध्ययन है कि इन निवास29के बीच साइट geochemistry में मतभेद दिखाया के साथ संगत कर रहे हैं, सुझाव है कि साइट geochemistry सी जमीन के नीचे सी के माइक्रोबियल क्षरण पर एक बड़ा प्रभाव है ।

Figure 1
चित्रा 1 : प्रोटियोमिक् विश्लेषण एंजाइमों की संख्या में मजबूत गहराई स्तरीकरण को इंगित करता है । पट्टियां इंगित औसत और त्रुटि पट्टियां बहुतायत के एक मानक विचलन का संकेत देती हैं । यह पता चलता है कि सूक्ष्मजीवों पीट सतह में सबसे अधिक सक्रिय हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : प्रत्येक पर्यावास की सतह पीट (< 30 सेमी) में प्रत्येक तकनीक द्वारा पहचाने गए यौगिकों की संख्या के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मध्य (४५ सेमी) और गहरा (८७ सेमी) पीट सजाना दलदल से । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : वान Krevelen आरेख (परमाणु एच/सी बनाम ओ/प्रत्येक की पहचान आणविक फार्मूला) सतह के लिए (15 सेमी) सजाना गहराई दलदल प्रत्येक तकनीक द्वारा विशेषता यौगिकों के कवरेज का प्रदर्शन करने के लिए । FTICR-ms हमें यौगिकों (छोटे हलकों) की सबसे बड़ी संख्या की पहचान करने के लिए अनुमति देता है, जबकि जीसी-एमएस (त्रिकोण) अंतर और शर्करा की पहचान के लिए अच्छा है (एच/सी = 2 और ओ/ एनएमआर (चौकों) स्पेक्ट्रोस्कोपी जैसे शर्करा, अमीनो एसिड, पाइरूवेट, आदिके रूप में ऊर्जावान महत्वपूर्ण यौगिकों पर मात्रात्मक जानकारी प्रदान करता है । LC-MS (हीरे) लिपिड के बारे में जानकारी प्रदान करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : वान Krevelen आरेख (परमाणु एच/ एक की पहचान की आणविक फार्मूला के सी बनाम ओ/दीप के लिए (८७ cm) सजाना गहराई दलदल प्रत्येक तकनीक द्वारा विशेषता यौगिकों के कवरेज का प्रदर्शन करने के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : विभिन्न रासायनिक वर्गों की पहचान के सापेक्ष अंश वाया विभिंन गहराई में विभिंन तकनीकों । सलाखों के प्रत्येक गहराई ± एक मानक विचलन के लिए औसत के रूप में रची जाती है । वर्ग प्लॉट किए गए अमीनो एसिड, sphingolipids (Cer), glycerophosphocholines (पीसी), phosphoethanolamines (पीई), diacylclyceroltrihomoserine (DGTSA), diacylglycerol (डीजी), triacylglycerols (टीजी), और शर्करा शामिल हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

Figure 6
चित्रा 6 : एक चयापचय नेटवर्क बनाने के लिए परिणाम का मेल । एनएमआर द्वारा की पहचान की चयापचयों की गहराई वितरण (a) और GC-MS (b), और एक सरलीकृत चयापचय नक्शा () सजाना दलदल पर पहचान की एक चयन संख्या दिखा । हरे बक्से चयापचयों संकेत मिलता है कि गहराई के साथ कम, भूरे रंग के बक्से चयापचयों संकेत है कि गहराई से वृद्धि हुई है । ग्रीन कनेक्टिंग तीर हमारे डेटासेट में पहचाने गए एंजाइम को इंगित करते हैं जो इंगित ट्रांस्फ़ॉर्म (एंजाइम ईसी संख्याओं को तीरों के आगे इंगित करता है) की मध्यस्थता करते हैं. धूसर जोड़ने वाले तीरों का संकेत ट्रांस्फ़ॉर्म करता है जिसके लिए एंजाइम हमारे डेटासेट में पहचाने नहीं गए थे. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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एकल-प्रवाह, पूरी तरह से युग्मित विश्लेषण चयापचयों और proteome को चिह्नित करने के लिए उपयोग किया गया मार्ग जो सी सायक्लिंग एक जटिल पारिस्थितिकी तंत्र में होने वाली है में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है । मिट्टी और पीट विषम मैट्रिक्स हैं, और इसलिए, इस विधि के महत्वपूर्ण चरणों में से एक यह सुनिश्चित करना है कि प्रारंभिक पीट या मिट्टी सामग्री अत्यधिक समरूप है में जल्द चरणों में होता है । यह अच्छी तरह से नमूना पीसने के रूप में समुच्चय निष्कर्षण दक्षता कम कर सकते है बेहतर है । यह कम सी और उच्च खनिज सामग्री है कि एक स्टेनलेस स्टील गेंद चक्की के उपयोग के लिए पर्याप्त रूप से homogenize की आवश्यकता हो सकती है के साथ एकत्रित मिट्टी और मिट्टी के लिए एक विशेष समस्या है । क्योंकि एक प्रयोगात्मक साइट के भीतर मिट्टी और पीट के स्थानिक विविधता उच्च हो सकता है, जैविक प्रतिकृति अत्यधिक की सिफारिश कर रहे हैं ।

इस विधि तीन सॉल्वैंट्स का उपयोग करता है: पानी, मेथनॉल, और क्लोरोफॉर्म, जो यह संभव है यौगिकों के प्रकार पूर्वाग्रह निकालने के लिए । सिद्धांत रूप में, इस अनुक्रमिक निष्कर्षण विधि एक व्यापक ध्रुवता रेंज को कवर यौगिकों solubilize चाहिए । हालांकि, इन सॉल्वैंट्स organo-खनिज परिसरों या उच्च स्थिर परिसरों को निकालने के लिए अनुकूलित नहीं हैं । यदि इस तरह के यौगिकों ब्याज की हैं, कठोर सॉल्वैंट्स जैसे मजबूत एसिड और कुर्सियां पसंद कर रहे हैं, लेकिन कठोर निष्कर्षण प्रक्रियाओं नमूनों के रसायन विज्ञान बदल सकता है । निष्कर्षण अनुक्रम के अंत में ऐसे सॉल्वैंट्स को शामिल इस प्रभाव को कम कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, क्लोरोफॉर्म नैदानिक महत्वपूर्ण मिट्टी और पीट बैक्टीरियल और वायरल रोगजनकों निष्क्रिय होगा, और अंय रोगजनक रोग-कोशिका झिल्ली लिपिड भंग द्वारा जैविक एजेंटों के कारण । इस प्रकार, निष्कर्षण प्रोटोकॉल में शामिल क्लोरोफॉर्म के नमूने संभावित दुनिया के विभिंन क्षेत्रों से रोगजनकों द्वारा संक्रमित के जीव विज्ञान के अध्ययन में शामिल जोखिम कम हो जाएगा । मृत माइक्रोबियल कोशिकाओं के बारे में चिंताएं हैं, मलबे, या निकासी के बाद कण, एक ०.२ µm ग्लास फाइबर फिल्टर के माध्यम से अर्क फ़िल्टरिंग की सिफारिश की है ।

प्रक्रिया को कारगर बनाने के लिए, पानी और मेथनॉल निष्कर्षों ४.१ कदम के दौरान जीसी-एमएस विश्लेषण के लिए जोड़ा जा सकता है । हालांकि, इन निष्कर्षों FTICR-एमएस ईएसआई स्रोत के साथ ionization दक्षता मुद्दों के कारण विश्लेषण के लिए अलग रहना चाहिए । जीसी-MS पर संयुक्त उद्धरण चलाने का लाभ यह है कि अधिक चयापचयों (ध्रुवीयता की एक बड़ी रेंज को कवर) की पहचान की जाएगी । इस बिंदु पर अर्क के संयोजन के नुकसान यह है कि प्रमुख चयापचयों में से एक कार्बनिक पदार्थ के माइक्रोबियल प्रसंस्करण में महत्वपूर्ण मेथनॉल है । मेथनॉल के निशान हमेशा संयुक्त नमूने में रहना होगा, सुखाने के बाद भी, इसलिए यदि मेथनॉल ब्याज की एक metabolite है, पानी निकालने अलग से चलाया जाना चाहिए । कोई analytes के साथ अच्छा नियंत्रण होने के नमूनों में संभावित संदूषण की पहचान करने में भी मदद मिलेगी ।

एनएमआर विश्लेषण के लिए अर्क की तैयारी के चरण ७.१ में, के रूप में जीसी-एमएस विश्लेषण में, या तो अकेले पानी निकालने या संयुक्त पानी और मेथनॉल अर्क इस्तेमाल किया जा सकता है । ऐसा करने के नुकसान पूर्ववर्ती अनुच्छेद में गणना करने वालों के समान हैं । मेथनॉल और पानी के अर्क के संयोजन का लाभ यह है कि मेथनॉल अंश में solubilized जाने वाले कम ध्रुवीय चयापचयों में से कुछ की पहचान की जाएगी. हालांकि, फ्रीज-सुखाने कदम के कारण, कई और अधिक अस्थिर यौगिकों खो जाएगा । यह एक विशेष नुकसान अगर अस्थिर फैटी एसिड बढ़ाता है प्रयोग का एक महत्वपूर्ण घटक है ।

प्रोटियोमिक् की पहचान करने के लिए इस प्रक्रिया में, केवल पूरी तरह से tryptic पेप्टाइड्स खोजे जाते हैं, इस प्रकार अंतर्जात peptidase गतिविधि और इन-सोर्स अंशों को याद किया जाएगा । दूसरी ओर, ऑक्सीकरण methionine के रूप में इस संशोधन सामांयतः नमूना प्रसंस्करण और हैंडलिंग के दौरान होता है के रूप में पेप्टाइड उंमीदवारों के लिए एक के बाद अनुवाद संशोधन माना जा सकता है । पेप्टाइड रेफरेंस क्षेत्रों का उपयोग एंजाइमों के ठहराव किया जा सकता है, लेकिन इस परियोजना के दायरे से बाहर है ।

NOM और माइक्रोबियल मापदंडों के विश्लेषण में कई हाल के अग्रिमों कार्बनिक सी साइकिल चालन को समझने के लिए तकनीक का खजाना प्रदान कर रहे हैं । एक सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल में इन तकनीकों के संयोजन से, हम प्रक्रियाओं है कि जगह ले जा रहे है की एक उपंयास को देखने के लाभ । चयापचय विश्लेषण के साथ प्रोटियोमिक् विश्लेषण युग्मन संमोहक corroborative सबूत है कि एक प्रतिक्रिया वास्तव में होने वाली है प्रदान करता है । चयापचय अकेले विश्लेषण में सीमित है कि यह हमें बताते है जो चयापचयों उच्च या साइटों के बीच की तुलना में एकाग्रता में कम या एक उपचार प्रभाव के बाद कर रहे हैं, लेकिन विचार उन परिवर्तनों के लिए कारणों को नहीं कर सकते । उदाहरण के लिए, हम दलदल में गहराई के साथ गिरावट चीनी सांद्रता की पहचान की है, लेकिन आगे की जानकारी के बिना यह स्पष्ट नहीं है कि गहराई के साथ गिरावट धीमी जानकारी या गहरी पीट में तेजी से क्षरण के कारण है । proteome और गहराई के साथ गिरावट एंजाइम अभिव्यक्ति का विश्लेषण हमें दूसरी परिकल्पना को अस्वीकार करने की अनुमति देता है । बल्कि हमारे परिणाम सतह पीट गहरी गहराई के आदानों को सीमित करने में तेजी से चीनी गिरावट के साथ संगत कर रहे हैं । इन विशेष अंतर्दृष्टि ही संभव है जब सभी तकनीक मिलकर में माना जाता है के रूप में हर एक एक अद्वितीय प्रदान करता है, लेकिन सी सायक्लिंग पहेली का महत्वपूर्ण टुकड़ा

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम Kolton नमूने एकत्रित करने के साथ सहायता के लिए जेपी Chanton, J.E. Kostka, और M.M. पीट शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इस काम के भाग पर्यावरण आणविक विज्ञान प्रयोगशाला, विज्ञान उपयोगकर्ता जैविक और पर्यावरणीय अनुसंधान के कार्यालय द्वारा प्रायोजित सुविधा का एक डो कार्यालय में आयोजित किया गया । PNNL कांट्रेक्ट डे के तहत डीईओ के लिए बैटल द्वारा AC05-76RL01830 का संचालन किया जाता है । यह काम अमेरिका के ऊर्जा विभाग, विज्ञान के कार्यालय, और जैविक और पर्यावरणीय अनुसंधान के कार्यालय द्वारा समर्थित किया गया था (अनुदान: de-AC05-00OR22725, de-SC0004632, DESC0010580, de-SC0012088, और de-SC0014416) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
methoxyamine hydrochloride Sigma Aldrich 226904 derivitization agent
5 mm triple resonance salt-tolerant cold probe  Bruker instrumentation
capillary GC column HP-5MS column (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) Agilent AG19091S-433 instrumentation
reversed phase charged surface hybrid column (3.0 mm × 150 mm × 1.7 μm particle size) ThermoFisher instrumentation
2 mL glass vials VWR International 46610-722 sample vials
autosampler vials VWR International 97055-324; 9467671 sample vials
Chloroform VWR International JT9174-3 solvent
Ethanol VWR International BDH67002.400 solvent
methanol VWR International BDH85681.400 solvent
pyridine VWR International BDH67007.400 solvent
2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulfonate-d6 Sigma Aldrich 178837 standard
C8-C24 fatty acid methyl ester Sigma Aldrich CRM18918 standard
N-methyl-N- (trimethylsilyl)trifluoroacetamide Sigma Aldrich 24589-78-4 standard
Suwanee River Fulvic Acid standard International Humic Substances Society 2S101F standard
trimethylchlorosilane Sigma Aldrich 89595 standard
Tuning Solution Agilent
FTICR-MS analysis software Bruker Compass DataAnalysis 4.1
Formularity Software Pacific Northwest National Laboratory Formularity available for download at: https://omics.pnl.gov/software/formularity
GC-MS Agilent Agilent GC 7890A with MSD 5975C
silica-based sorbent Phenomenex (Torrance, CA) Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)
NMR TUBE 3MM 8 150 CS5 VWR International KT897820-0008 NMR tube
Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer  Varian Inova Varian Direct Drive 600-MHz NMR spectrometer
Chenomx NMR Suite 8.3 Chenomx Chenomx NMR Suite NMR software
ultra-performance liquid chromatograph  waters Aquity UPLC H  liquid chromatograph 
Velos-ETD Orbitrap mass spectrometer  ThermoFisher Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer 

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References

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निस्र्पक जटिल प्राकृतिक कार्बनिक पदार्थ मिश्रण के लिए एकल-प्रवाह पूरक उच्च संकल्प विश्लेषणात्मक तकनीक
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Tfaily, M. M., Wilson, R. M., Brewer, H. M., Chu, R. K., Heyman, H. M., Hoyt, D. W., Kyle, J. E., Purvine, S. O. Single-throughput Complementary High-resolution Analytical Techniques for Characterizing Complex Natural Organic Matter Mixtures. J. Vis. Exp. (143), e59035, doi:10.3791/59035 (2019).More

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